JPH0448413B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、バチルス属微生物を用いて干し草を
処理し、その品質を保持する方法に関する。 （従来の技術と解決すべき課題） アメリカ合衆国では、毎年約１億5000万トンの
干し草が収穫されている。その生産損失は、恐ら
く他のどんな穀物よりも大きいだろう。これらの
損失は、好ましくないムラサキウマゴヤシ
（alfalfa）の成長、降雨損傷、牧草地での刈入れ
損失、および貯蔵損失によるものである。これら
損失は、典型的には20〜40％であるが、天候状態
が好ましくない場合、70％程も高くなることがあ
る。これらの損失は、植物の絶えざる呼吸、機械
的損傷による葉の破砕、および雨による浸出から
生じる。正常な水分（25〜30％）より高い水分の
干し草を梱（こり）にすると、降雨損傷、および
機械的な葉損失の危険性は最小になるだろう。し
かし、20％以上の水分で梱にすると、酸化および
かび化による貯蔵損失の危険性が非常に高まる。 貯蔵損失は、栄養素損失ほ主要原因ではある
が、管理可能な原因でもある。水分含有量20％未
満の建物内部で貯蔵された干し草には、５〜10％
の通常の乾燥物損傷が有るであろう。水分がより
高いと、好気性酸化微生物の活性が高まり、その
結果、熱が発生する。過剰の熱により、CO₂およ
び水を生成する呼吸作用の結果、乾燥物損失が生
じる。熱はまた、非酵素的褐変反応によつて栄養
素損失も引き起こす。発生する熱量は、干し草の
水分濃度、周囲温度、存在する微生物固体数、並
びに梱の大きさおよび密度に依存する。 過剰な熱による損傷は、蛋白質消化率および利
用可能なエネルギーを減少させる。熱により損傷
した蛋白質は、繊維の窒素含有量を酸洗浄性繊維
窒素（ADINまたはADF−Ｎ）と定めて測定す
る。通常の条件下では、総窒素の７％以下が繊維
中に存在すべきである。過剰の熱による損傷は、
この値が15％に達することに生じている。 貯蔵中のかびによる損傷もまた、顕著な損失を
引き起こすことがある。かびの約５％しかマイコ
トキシンを生じないけれども、それらは、風味お
よび飼料摂取に悪い影響を与える。かびの生えた
干し草を動物に与えると、乾燥物摂取の顕著な低
下、体重増加の減少、および飼料転化の劣化が生
じる。これらの損失は、かびの生えていない対照
と比べて、25％程になることがある。 貯蔵干し草は、天然生起の日和見寄生菌を有し
ている。これらの寄生菌は、干し草の品質に有益
であり、また有害でもあり、寄生菌相互間で、貯
蔵干し草中の生態学的優位性を競うものと思われ
る。これら寄生菌は、細菌かまたは真菌かのどち
らかであろう。通常の細菌性腐敗生物は、スポロ
サルシナ（Sporpsarcina）、およびバチルス
（Bacillus）属のものである。真菌類による腐敗
は、しばしばアスペルギルス（Aspergillus）、ペ
ニシリウム（Penicillium）およびムコール
（Mucor）のものによつて引き起こされる。 農産物の腐敗の原因となるこれら寄生菌の増殖
を制限するために種々の試みがなされてきた。１
つの簡単な試みは、貯蔵時に、例えばプロピオン
酸のようなかび阻止剤を、農産物に噴霧すること
であつた。この試みの主な短所は、農産物を適切
に処理するには大量の酸を使用しなければならな
いので、その費用である。加えて、プロピオン酸
のような本来的に毒性で、かつ腐食性の酸では、
この酸を取扱う人を保護するために、農業者が特
別の取扱い技術を使用することが必要である。更
に、この酸に接触する装置は全て、腐食損傷を避
けるため、完全に清浄化しなければならない。も
う一つの試みに関する更なる詳細については、
1986年７月28日に出願された、干し草保存剤とい
う名称の同時係属中で共通に譲渡された本発明者
の出願（米国出願番号第891260号）になる明細書
を参照。この発明は、酸化亜鉛、酸化マグネシウ
ム、および水溶性銅イオン源の無機塩混合物を酸
性酸、プロピオン酸またはソルビン酸のような有
機酸と組合わせて、使用することに関する。 としかし乍ら、農産物接種剤として使用する種々
の製品の開発に向けられた広範囲の研究にも拘わ
らず、干し草の腐敗は、依然として持続している
問題である。 従つて、腐敗生物の増殖を妨げ、そして一方高
水分の干し草での熱を減少させる値で、天然生起
の生物だけを干し草に加える干し草保存剤組成物
を提供することが、本発明の第１の目的である。 本発明のもう一つの目的は、非天然干し草添加
物を加える必要なしに、高水分干し草の熱を効果
的に減少させるように驚く程作用する改良された
干し草保存剤を提供することである。 本発明の更にもう一つの目的は、環境を汚染す
る危険性の全くない干し草保存剤組成物を提供す
ることである。 本発明の更にもう一つの目的は、温度、乾燥物
回収、窒素プロフイール、色並びに酵母およびか
びを含めた微生物数で測定するとき、良質の干し
草製品を提供する干し草保存剤を提供することで
ある。 本発明の更にもう一つの目的は、干し草を保存
する値で、干し草にバチルス・パミラス
（pumilus）微生物を加える、干し草保存剤並び
に干し草保存法を提供することである。 本発明の尚もう一つの目的は、干し草に適用す
るとき、熱分解の危険性を減少させ、同時にアス
ペルギルス・フラーブス（flavus）のような腐敗
生物の増殖を妨げる干し草保存剤組成物を提供す
ることである。 これらの目的並びに他の目的の各々を達成する
方法および手段は、以下に続く本発明の詳細な説
明から明らかであろう。 （課題を解決するための手段） 本発明では、干し草の品質を保存するために、
干し草をバチルス・パミラスで処理する。バチル
ス・パミラスは、長期間貯蔵した干し草の品質低
下の原因となる腐敗生物を阻止することができ
る。 かくして、本発明は、干し草に有効量のバチル
ス・パミラス、またはその突然変異株若しくは均
等物を適用することからなる、干し草の保存を強
化するための干し草処理法を提供する。 本発明はまた、バチルス・パミラスを含有する
干し草処理組成物を提供する。該組成物は、固形
または液体であることができる。 （発明の詳細な説明） 腐敗生物の増殖により引き起こされる品質低下
による干し草の腐敗は、農業界の主要な問題であ
る。典型的な腐敗生物には、アスペルギルス属お
よびアスペルギルス・フラーブス種、並びにペニ
シリウムおよびムコール属がある。 約25％以上の水分で梱にされている干し草は、
野外調査で示されているように、熱を発生し、そ
して約97％でかびが生える。これらの熱くなつた
梱は、極端に色が悪くなり、栄養価が低下し、そ
して目に見える多くのかびを有している。 バチルス・パミラス株は、干し草の品質を保つ
ことが見い出されている。何らかの操作可能性理
論に拘束されることは望まれないが、バチルス・
パミラスは、真菌、および更には単離された細菌
性スポロサルシナのような細菌の増殖を阻止する
阻止化合物を産生するものと考えられる。スペロ
サルシナは、僅か貯蔵２、３日後に、干し草の幹
に観察される望ましくない白粉（white bloom）
の原因となる。これらの生物は、典型的には非常
に熱い梱中で観察される。これらの生物はまた、
真菌の増殖と同時にか、またはより後の段階でか
のいずれかで真菌の増殖を促進するように作用す
ると思われる。 微生物の相互作用を理解することが、貯蔵干し
草の品質改良において、この株を使用する本質的
な要素である。干し草を梱にすると、初期には微
生物の一つのクラスの大きな白粉（bloom）が生
じる（グラム陰性群）。これは、最初の１〜３日
後に観察される。この後、これは、別の群（グラ
ム陽性群）に取つて代わられる。バチルス・パミ
ラスは、この群、即ちグラム陽性群に属する。選
択されたバチルス・パミラスが、以下で定義する
ように多数存在する場合、この段階では、干し草
は熱くなるか、またはかびが生えたりはしない。
その後、バチルス・パミラスの固体数が減少する
につれて、他の群の微生物叢が優位になる。干し
草を給餌する貯蔵期間の終わりには、バチルス
は、微生物叢の一部となるであろう。更に、出願
人は何らかの理論に拘束されることは望まない
が、バチルスは、存在する他の生物と栄養素を競
合することによつてだけ、干し草の品質に影響を
与える可能性がある。 本発明による方法では、干し草の保存性を高
め、品質を維持し、そしてまた、腐敗生物の増殖
を減少させるために、干し草の保存に有効量のバ
チルス・パミラス、またはその突然変異株若しく
はその均等物で干し草を処理する。 本発明の方法は、本発明の生物が非病原性であ
り、低い値で干し草中に天然に生じ、そしてそれ
故、保存された農産物を消費する動物に疾病を引
き起こさないという点で殊に有益である。高価で
しばしば有害な化学品を適用する多くのタイプの
保存とは違つて、本発明の方法は、その代わり
に、アスペルギルス・フラーブスのような天然生
起の腐敗生物と競合する能力を改良することによ
つて、望ましい天然生起の生物によりコロニー化
を増進させることに依拠している。保存された農
産物の腐敗に関係する生物の多くは、マイコトキ
シンを産生することが知られている真菌であるの
で、これらの有害な生物を制御することが、主要
な考慮事項である。これらのマイコトキシンは、
これらの真菌で汚染されている飼料を消費する動
物に疾病や、更には死を引き起こすことが知られ
ている。 単離され本発明の組成物中で最も好ましいとみ
られる或る好ましいバチルス・パミラスの株があ
る。これらの株は譲受け人による要求によつて入
手可能であり、株番号288、289、290、296、299、
302、305および307として確認されている。これ
らの株は、米国メリーランド州ロツクビルのアメ
リカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に寄託
されており、更に、それぞれ、ATCC登録番号
53682、53683、53684、53685、53686、53687、
53688および53689として確認されている。これら
好ましい株の満足のゆく混合物、若しくはそれら
のより少ない任意の組合わせ、または単に一つの
株を使用することができる。 バチルス・パミラスは、当該技術分野で良く知
られ、そして一般的に上記した技術を使用して、
貯蔵干し草から単離した。他のバチルス・パミラ
スは、干し草の品質保持におけるバチルス・パミ
ラスの効能を評価するために、定型的な実験によ
つて単離し、試験することができる。 用語「その効果的な突然変異株」は、本願株、
またはその実質的な均等物の所望の真菌阻止特性
を示すバチルス・パミラスの任意の、および全て
の突然変異株を意図する。このような変異株は、
親株と機能的に均等であると考えられる。自然発
生的な突然変異は、微生物では通常生起し、そし
て突然変異はまた、種々の既知技術によつても意
図的に作られ得ることは、当該技術分野の通常の
伎倆を有する者に良く知られている。例えば、突
然変異体は、化学的技術、放射性技術および組替
え技術を使用して誘導することができる。 突然変異が誘導される方法に関係なく、決定的
な問題点は該突然変異体が、親株について記載し
たのと同じく、農産物を保存するように作用する
ということである。換言すれば、本発明は、例え
ば、或る種の糖発酵のように些細な分類学的変更
のような些細な変化が生じている突然変異物を包
含する。 本発明は、特に好ましいバチルス・パミラス
種、およびその或る特定の株に関して記載してい
るが、本発明は、遺伝学的に密接に関係のあるバ
チルス属の他の生物を使用できることを意図して
いるものと了解すべきである。それ故、バチルス
属の他の種、例えばバチルス・サブチリス
（subtilus）およびバチルス・セレウス（cereus）
で、本発明の目的の全てではないとしても、その
大部分を達成することが可能である。バチルス・
パミラスは、干し草の通常の生理的寄生菌である
ので、特に好ましい。 用語「干し草」は、農業で通常使用される用語
どおり、全ての形態の干し草を意味する。干し草
は、最も普通には、ムラサキウマゴヤシ、牧草、
またはムラサキウマゴヤシと牧草との混合物であ
る。本発明の干し草保存組成物は、貯蔵牧草の腐
敗を減少させるのに効果的な貯蔵牧草接種剤とし
て使用することもできる。もう一つの別個の可能
性は、該組成物が、トウモロコシ、小麦、米およ
び大豆のような穀物を保存するのに有効に作用す
ることである。 本発明では、干し草腐敗の原因となる生物の阻
止は、干し草を、バチルス属の生物、特にバチル
ス・パミラス、またはバチルス・パミラス若しく
は密接に関連した生物を含有する組成物で処理す
ることによつて、そしてまた、バチルス・パミラ
スの有効な突然変異株または均等物、およびこれ
らを含有する組成物で処理することによつても、
達成することができる。 本発明による方法で使用される組成物は、液体
かまたは乾燥形態のどちらかであり、そして更に
細菌株を含有することができる。固形の処理形態
では、組成物は、バチルス・パミラス並びに担体
からなることができる。担体は、水性若しくは非
水性液体、または固形のものであることができ
る。固形物形態では、該組成物は、固形担体また
は物理的増量剤を含有することができる。このよ
うな固形担体、固形希釈剤または物理的増量剤の
例には、麦芽デキストリン、澱粉、炭酸カルシウ
ム、セルロース、乳漿、粉砕トウモロコシ穂軸お
よび二酸化ケイ素がある。要するに、担体は、有
機または無機の物理的増量剤であることができ
る。固形組成物は、軽く粉末を散布する態様で干
し草に直接適用することができ、または液状担体
中に分散している場合には、干し草上に首尾良く
噴霧することができる。 本発明に従つて干し草を処理するのに有益な典
型的な組成分は、１グラム当たり10²〜10¹²個の
生育可能な生物、好ましくは１グラム当たり10⁴
〜10¹⁰個の成育可能な生物、更に好ましくは１グ
ラム当たり10⁵〜10⁷個の生存可能な生物を含有し
ている。 干し草の処理範囲は、典型的には、１トン当た
り成育可能な生物10⁵〜10¹⁵個、好ましくは１ト
ン当たり成育可能な生物10⁷〜10¹³個、更に好ま
しくは１トン当たり成育可能な生物10⁸〜10¹⁰個
である。 本発明の組成物は、バチルス・パミラス、また
は該生物の突然変異株若しくは均等物に加えて、
例えばラクトバシラス（Lactobacillus）、ストレ
プトコツカス（Streptococcus）およびペジオコ
ツカス（Pediococcus）のような他の通常の農産
物保護生物並びに真菌、または細菌から得られる
或る種の酵素を含有することができる。 当該技術分野で通常の技倆を有する者は、他の
適当な担体および投与形態を知つており、または
定型的な実験を使用してこのようなものを確認す
ることができよう。更に、種々の組成物の適用
は、当該技術分野で通常の技倆を有する者に普通
の標準的技術を使用して実施することができる。 （実施例） 上記の記載は本願発明を一般的に開示したもの
である。下記の特別な実施例を参照して更に完全
に理解することができる。本実施例は説明の目的
のためだけに提供するものであり、そうでなけれ
ば、特に言及していない限り制限しようとするも
のではない。 実施例 干し草は、バチルス・パミラス株番号288、
289、290、296、299、302、306および307の混合
物で調製した接種物で処理した。 干し草の品質は、温度、微生物叢および栄養素
分析を試験して決定した。肉眼による得点は、全
ての処理で、色、白色薄片およびかび胞子を含め
て決定した。 ムラサキウマゴヤシは、刈取り機−付属品
（conditioner）で刈取り、そして、通常の牧草地
条件下で牧草地で乾燥させた。刈取つた干し草は
列に並べて置き、梱にする前に１度だけ熊手で平
らにした。乾燥速度、成熟および天候データを記
録した。干し草は全ての試験を通じて、22〜34パ
ーセントの水分で梱にしたが、処理梱と対照梱間
で２〜５パーセントしか変動していない一定の試
験的干し草水分以内であつた。 小さい四角の梱実験では、次のプロトコールに
従つた。干し草は、スプレーを使用して、干し草
保存剤の水可溶性処理物で処理した。より大きい
牧草地での実験では、該処理物は、15〜20個の
100ポンド梱に適用した。対照の非接種梱も同様
にして調製した。総計15〜20個の梱を対照用に調
製した。干し草は、牧草地から運び、積み重ね、
そして囲いをした倉庫内のセメント床上に木製パ
レツト上に貯蔵した。温度プロープ（probe）は
各積層の中心に入れ、温度を１時間毎に記録し
た。 より小さいモデル系もより大きい梱の研究を模
擬するために開発した。453ｇ（１ポンド）の干
し草は、概ね14.2cm×25.4cm×14.2cm（６インチ
×10インチ×６インチ）の寸法のスチロフオーム
（styrofoam）製積み出しコンテナー（壁厚5.1cm
（２インチ））に詰めた。干し草塊の中心にサーミ
スターを入れた後、干し草の頂部に煉瓦をおいて
干し草を圧縮した。スチロフオーム製の蓋を頂部
に緩く置き、コンテナー全体を37℃のインキユベ
ーターに入れて加熱を開始した。処理物は、ガラ
ス製のTLCスプレーで噴霧して干し草に適用し
た。 梱の標本採取は、ペン・ステート・フオレー
ジ・サンプラー（Penn State Forage Sampler）
を用いて標本採取時当たり６個のコア標本を取り
出して行つた。各積層内で２個の低部、２個の中
位部そして２個の頂部梱を採取して積層内部の変
動を最小にした。標本コアを回転パク（pak）滅
菌バツグに入れ、各処理物内で集め、そして実験
室に運ぶため氷上で貯蔵した。モデル梱のスチロ
フオーム製コンテナーの標本採取は、各コンテナ
ーの中心から１個の標本を取り出して行つた。標
本採取時間は、概ね０、２、７、14、21、30およ
び60日であつた。 干し草試料に噴霧して適用したバチルス・パミ
ラスの微生物数は、干し草１グラム当たり、10⁶
個の生物数であつた。この数は、干し草１トン当
たり、10⁹個の生物数に相当する。該生物は、バ
チルス・パミラスの株番号288、289、290、296、
299、302、306および307の同量割合に基づく混合
物であつた。バチルス・パミラス処理物は、８種
の株を個々に、37℃で24時間、トリプシン消化性
大豆ブロス中で増殖させて調製した。細胞は、４
℃で遠心して取り出し、この細胞ペレツトを、
0.04Mのりん酸緩衝液に再懸濁した。細胞は、直
ちに適用するために氷上で牧草地に運ぶか、また
は将来使用するため−70℃に冷凍した。 干し草へ使用するに先立ち、細胞を分取し、そ
れを約20（５ガロン）の水に加えた。次に、梱
機に取り付けられたスプレー装置を用いて、干し
草１トンに対し20（５ガロン）の割合で施与し
た。コロニー形成単位／処理は、施与する時点で
決めた。 標本は、乾燥物、ADF、ADF−Ｎ、NDFおよ
びＮ含量について分析した。温度は、±0.2℃まで
正確な温度サーミスターを使用して、１時間毎に
モニターした。共変関係の乾燥物（DM）と、０
日目の温度を使用して分析した。 干し草は、試験中、および貯蔵期間の終わり
に、かびおよび白色の腐敗微生物叢の微候を目て
見て観察した。干し草は、かびおよび白色腐敗を
１から10の等級（10が最も品質が劣る）で評価し
た。色の違いは、比較用の着色片を用いて貯蔵期
間の終わりに測定した。色は、１の縁から23の褐
色までの範囲であつた。 より小さいモデル系では、実験間の温度差は、
サーミスターが±0.2℃までの精度であり、１時
間毎に読取りを行つたので、最も有益な結果を示
す。これは、約500のデータ点／処理／実験をも
たらした。実験モデル全体で最も顕著に冷たい処
理は、バチルスであつた（表１および２）。この
処理は、より少ない酵母およびかび固体数を有す
る傾向があつた。バチルス処理はまた、顕著に、
より高い栄養素値（ADFがより低い）であつた。
NDF、ADF−Ｎ、WSC、Ｎおよび利用可能な蛋
白質の測定は、またより高い栄養素値を示す傾向
があつたが、これらの差異は有意ではなかつた。
バチルス処理はまた、顕著により良好な観察得点
数を有しており、これは、目に見えるかびがより
少ないことを示した。色の得点は、これらの小さ
なモデル梱での処理間に差異はなく、より一致は
していなかつた。

【表】

【表】 表１および表２のモデル系で示されたのと同一
の傾向が、次の表３、４および５で示される、よ
り大きい規模の干し草梱で観察された。即ち、バ
チルス処理した干し草は、対照処理より冷たかつ
た。酵母およびかび数は、全ての梱で類似してい
たが、目に見えるかび発生は、バチルス・パミラ
ス処理で減少し、色はより緑色であつた。栄養素
分析もまた、第１および２で示されたモデル系で
観察されたものと類似の傾向を示した。利用可能
な蛋白質（AP）は、バチルス処理した梱の方が
より高く、ADFおよびNDF値は、バチルス処理
梱で最も高い栄養素的品質を示した。 干し草のバチルス・パミラス株処理によつて非
接種対照梱より冷たく、かびがより少なく、かつ
より緑色の梱がもたらされた。バチルス・パミラ
ス処理はまた、利用可能な蛋白質の摂取、消化性
総栄養素摂取、および毎日のエネルギー摂取がよ
り高い梱も生じさせた。

【表】

【表】 示された実施例のスプレー適用を粉末適用に替
えて、生物値が示された特定の実施例で特定され
た範囲内にあるとき、類似の結果が得られ、その
際、梱はより冷たく、即ち熱の減少があり、微生
物叢内での腐敗生物の増殖が阻止されており、そ
して、干し草の栄養価増加の証拠がある。 それ故、本願発明は、少なくとも上述した目的
の全てを達成していることが明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少量ではあるが干し草の品質を保持しうる量
   の好気性微生物バチルス・パミラスで新鮮な干し
   草を処理することからなる、干し草の品質保持方
   法。 ２ 好気性バチルス・パミラスを、生物のコロニ
   ー増殖を高める条件下で新鮮な干し草に添加し、
   そして上記生物を著しくコロニー増殖させてその
   結果天然生起腐敗生物のコロニー増殖を前以て防
   ぐことにより該腐敗生物のコロニー増殖をさせな
   いことからなる、干し草の品質保持方法。