JPH04335884A - ヒドロキシル化した複素環式化合物を製造するための微生物学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、２，５−ジメチルピラジンで成
長し、一般式Ｉ，ＩＩ

【０００２】

【化９】

【０００３】

【化１０】

【０００４】のピラジンまたはキノキサリンをヒドロキ
シル化する微生物、ならびにヒドロキシル化したピラジ
ンまたはキノキサリンの製造方法に関する。

【０００５】ヒドロキシル化したピラジンは、たとえば
メトキシアルキルピラジン製造のための重要な中間体で
ある。　　メトキシアルキルピラジンは、芳香物質の重
要な構成要素である〔マガおよびサイザー、Ｊ．Ａｇｒ
ｉｃ．Ｆｏｏｄ　　Ｃｈｅｍ．，２１，１９７３，ｐ．
２２−３０〕。　　ヒドロキシル化したキノキサリンは
、たとえば重要な医薬用中間体である〔ＵＳ−ＰＳ　　
４８１４４４４〕。

【０００６】これまで、ヒドロキシル化したキノキサリ
ンおよびヒドロキシル化したピラジンを製造するための
方法は、化学的方法しか知られていない。　　たとえば
、ＵＳ−ＰＳ　　４８１４４４４は、６−クロロ−２−
ヒドロキシキノキサリン−４−オキシドを触媒の存在下
で６−クロロ−２−ヒドロキシキノキサリンに還元する
方法を開示している。　　しかし、この方法には、工業
規模で実用性がないという欠点がある。　　ヒドロキシ
ル化したピラジンの化学的製造方法は、たとえばカルマ
スおよびスポエリによりＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．，７
４，１９５２．ｐ．１５８０−１５８４に記載されてい
て、そこでは、たとえばメチルグリオキサールおよびグ
リシンアミド塩酸塩から出発して２−ヒドロキシ−５−
メチルピラジンが合成されている。　　しかし、この方
法には、生成物がひどく汚染されているという欠点があ
る。

【０００７】さらに、２−ヒドロキシピラジンの生物学
的分解に関する研究が、マトレーおよびハルレ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，４，１９７６，ｐ．
４９２−４９３に、２−ピラジンカルボキサミドの研究
がソイニおよびパカリネン、ＦＥＭＳ　　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９８５，ｐ．１６７−１７１に
記載されている。　　しかし、一般式ＩまたはＩＩのピ
ラジンまたはキノキサリンをヒドロキシル化し、これを
成長培養基中に蓄積する微生物は知られていない。

【０００８】本発明の目的は、一般式ＩまたはＩＩの置
換したピラジンまたはキノキサリンを簡単な様式でヒド
ロキシル化することができる微生物の新種を発見するこ
と、ならびにヒドロキシル化したピラジンおよびキノキ
サリンの製造方法を開発することである。　　この目的
は、請求項１の方法により達成される。これらの微生物
は、２，５−ジメチルピラジンを唯一の炭素、窒素およ
びエネルギーの供給源として成長し、基質として一般式
Ｉのピラジン

【０００９】

【化１１】

【００１０】または一般式ＩＩのキノキサリンを、

【０
０１１】

【化１２】

【００１２】〔式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基また
はハロゲン原子をあらわし、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ
５は同じかまたは異なるものであって、水素原子、Ｃ１
〜Ｃ４アルキル基またはハロゲン原子をあらわす。〕一
般式ＩＩＩのヒドロキシル化したピラジン

【００１３】

【化１３】

【００１４】または一般式ＩＶのヒドロキシル化したキ
ノキサリン

【００１５】

【化１４】

【００１６】〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ
５は上記の意味を有する。〕に変換することができ、そ
の際、それらのヒドロキシル化したピラジンまたはキノ
キサリンは成長培養基中に蓄積される。

【００１７】浄水場、大地、蟻塚および堆肥の山から採
取した土壌試料による調査からわかるように、２，５−
ジメチルピラジンを分解する微生物は、一般式Ｉまたは
ＩＩのピラジンまたはキノキサリンをヒドロキシル化す
ることができる。　　本発明では、２，５−ジメチルピ
ラジンを唯一の炭素、窒素およびエネルギーの供給源と
して利用し、通常の微生物学的技術により選択される、
すべての品種がこのヒドロキシル化に使用できる。

【００１８】好都合なことに、２，５−ジメチルピラジ
ンを分解し、基質として一般式ＩまたはＩＩの複素環式
化合物を一般式ＩＩＩ　またはＩＶの複素環式化合物に
ヒドロキシル化して成長培養基中に蓄積する、すべての
グラム陽性およびグラム陰性菌を使用することができる
。

【００１９】好ましい微生物は、ＤＳＭ番号６１３８の
ロードコッカス・エリトロポリスおよびＤＳＭ番号６１
３７のアートロバクターｓｐ．である。

【００２０】ＤＳＭ番号６１３８およびＤＳＭ番号６１
３７の微生物の正確な確認は、これらの登録の優先日の
後に行われたので、以下、以前の表示がロードコッカス
・エクイハイダ（ＤＳＭ番号６１３８）である微生物は
現在ロードコッカス・エリトロポリス（ＤＳＭ番号６１
３８）、以前の表示がミクロコッカスｓｐ．ＹＶＧ（Ｄ
ＳＭ番号６１３７）である微生物は現在アートロバクタ
ーｓｐ．（ＤＳＭ番号６１３７）と表示する。

【００２１】これらの品種は、１９９０年９月７日にド
イチェン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニズメン
（ＤＳＭ）・ウント・ツェルクルトゥーレンＧｍｂＨ、
マシェローダーヴェク　　１ｂ，３３００　　ブラウン
シュバイク／ＢＲＤに寄託してある。

【００２２】アートロバクターｓｐ．（ＤＳＭ番号６１
３７）の科学的説明 特徴：若い培養菌では多形態性、老培養菌では球状から
球菌、グラム陽性、強い好気性、グルコースから酸形成
しない。 可動性　　　　：− 胞子　　　　　　：− カタラーゼ：＋ 細胞壁内のメソ−ジアミノピメリン酸：なしペプチドグ
リカン種：Ａ３α、Ｌｙｓ−Ａｌａ２−３、ペプチド下
位単位のＤ−グルタミン酸のα−カルボキシル基がグリ
シン基により置換されている。

【００２３】ロードコッカス・エリトロポリス（ＤＳＭ
番号６１３８）の科学的説明 　　ペプチドグリカンのアミノ酸：ジアミノピメリン酸
（ＤＡＰ）　　　　　　＋　　全細胞加水分解物から得
られる糖類：　　　　アラビノース（ＡＲＡ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋　　　　ガラクトース（ＧＡＬ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　＋　　　　マドゥロース（
ＭＡＤ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　キシロ
ース（ＸＹＬ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　
　　グルコース（ＧＬＵ）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　＋　　　　リボース（ＲＩＢ）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　＋脂肪酸：枝別れしていない、飽和お
よび不飽和脂肪酸ならびにツベルクロステアリン酸が１
５〜３０％存在。

【００２４】ミコール酸：鎖長Ｃ３５〜Ｃ４０のミコー
ル酸が存在 メナキノン：タイプＭＫ−８（Ｈ２）９３％　　ミコー
ル酸を有する微生物の品種を確認するための生理学的試
験：　　　　Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　Ｄ−グルコサミン酸（ＧＡＴ）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−　　　　Ｄ−ツラノース（ＴＵＲ）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　−　　　　２−ヒドロキシ吉草酸塩（ｏ２Ｖ）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　＋　　　　Ｌ−アラニン（ＡＬＡ）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　＋　　　　Ｌ−プロリン（ＰＲＯ）　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−　　　　チラミン（ＴＹＲ）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　４−アミ
ノ酪酸塩（ｏ４Ｂ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　２−
デスオキシチミジン−ｓ−ｐｕｐ−リン酸塩（ＣＤＰ）
　　　　　　＋　　　　ガラクトース（ＧＡＬ）　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−　　　　Ｌ−ラムノース（ＲＨ
Ａ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−　　　　アラリット（Ａ
ＲＡ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　２−
オキソ−グルタル酸塩（ｏ２Ｇ）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　４−アミ
ノ酪酸塩（ａ４Ｂ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　Ｌ−
セリン（ＳＥＲ）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　
　　　アセトアミド（ＡＴＡ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　＋　　　　キナ酸塩（ＱＵＩ）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　＋　　　　Ｄ−グルカル酸塩（ＧＣＴ
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−　　　　Ｄ−リボース（ＲｉＢ
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　イノシット（
ＩＮＯ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　ピ
メラス（ＰＩＭ）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＋　　　　Ｌ−アスパラギン酸塩（ＡＳＰ）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−　　　　Ｌ−バリン（ＶＡＬ）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋　　　　安息香酸塩（ＢＥＮ）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−　　　　ｐＮＰ−ベータ−Ｄ−
キシロシド（ＣＸＹ）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋　　　　グルコン酸塩（ＧＤＴ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋　　　　スクロース（Ｄ−サッカ
ロース：ＳＵＣ）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋　　　　クエン酸塩（ＣＩＴ）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　＋　　　　コハク酸塩（ＳＡＴ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　Ｌ−ロイシ
ン（ＬＥＵ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　プ
トレシン（ＰＵＴ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　３−ヒドロキシ安息香酸塩（ｏ３Ｂ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　
　　ｐＮＰ−ホスホリル−コリン（ＣＣＨ）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋コリネ形生
物のコロニーに対する色コード：ザイラー（１９８３）
によるタイプ番号６０。

【００２５】ヒドロキシル化したピラジンまたはキノキ
サリンの製造方法では、微生物により、一般式Ｉのピラ
ジン

【００２６】

【化１５】

【００２７】または一般式ＩＩのキノキサリンを、

【０
０２８】

【化１６】

【００２９】〔式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基また
はハロゲン原子をあらわし、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ
５は同じかまたは異なるものであって、水素原子、Ｃ１
〜Ｃ４アルキル基またはハロゲン原子をあらわす。〕一
般式ＩＩＩ　のヒドロキシル化したピラジン

【００３０】

【化１７】

【００３１】または一般式ＩＶのヒドロキシル化キノキ
サリン

【００３２】

【化１８】

【００３３】〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ
５は上記の意味を有する。〕に変換し、濃縮された生成
物を分離する。

【００３４】ヒドロキシル化すべきピラジンまたはキノ
キサリンとしては、一般式ＩまたはＩＩの化合物を使用
する。

【００３５】好ましくは、これらの微生物により、Ｒ１
がメチル、エチル基または塩素原子をあらわし、Ｒ２お
よびＲ３が同じか、または異なるものであって、水素原
子、メチル基または塩素原子をあらわす、ピラジン誘導
体またはキノキサリン誘導体をヒドロキシル化する。

【００３６】通常、微生物は本来の方法（基質変換）の
前に、成長基質を含む培養基中で培養する。

【００３７】成長基質２，５−ジメチルピラジンは、培
養基に対して０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）　、好まし
くは培養基に対して０．００１〜５％（ｗ／ｖ）　の量
で使用するのが有利である。

【００３８】微生物の、ヒドロキシル化を行なう酸素は
、有利なことに、２，５−ジメチルピラジンにより誘発
される。　　この誘発に使用する化合物は、複素環式基
質の変換の際に存在してもよいし、あるいは変換の際に
この化合物の供給を止めてもよい。　　好ましくは、誘
発に使用する化合物の供給は、複素環式基質の変換時に
、供給停止、またはたとえば細胞の遠心分離により停止
する。

【００３９】基質を加える前に、細胞を、光学密度が６
５０ｎｍで１００になるまで、好ましくは光学密度が６
５０ｎｍで１０〜６０になるまで濃縮するのが有利であ
る。

【００４０】微生物のための栄養媒体としては、培養に
も、本来の方法にも、この専門分野で一般的な栄養媒体
を使用することができるが、表１にその成分を示す媒体
を使用するのが好ましい。

【００４１】次いで、本来の方法（基質変換）を通常の
方法で、静止した細胞で行なう。

【００４２】一般式ＩまたはＩＩのピラジンまたはキノ
キサリンは、好ましくは培養基中の基質濃度が２０％（
ｗ／ｖ）　を超えないように、一度に、または連続的に
細胞分散液に加えることができる。　　とくに基質濃度
は、培養基中で５％（ｗ／ｖ）　を超えないようにする
。

【００４３】変換は、４〜１０、好ましくは６〜８のｐ
Ｈ領域で行なう。

【００４４】通常、変換は０〜５０℃、好ましくは２０
〜４０℃で行なう。

【００４５】変換後、ヒドロキシル化した複素環式化合
物は、既知の方法、たとえば塩素化炭化水素で抽出する
ことにより、分離することができる。

【００４６】〔実施例１〕 ２，５−ジメチルピラジン代謝性微生物の分離好気性の
２，５−ジメチルピラジン代謝性微生物を、Ａ＋Ｎ−媒
体（表１）中で、唯一の炭素、窒素およびエネルギーの
供給源として０．１％（ｗ／ｖ）　の２，５−ジメチル
ピラジンを加えて濃縮した。　　微生物を分離するため
の一般的な技術は、たとえば、Ｇ．ドリュウス『微生物
学の実習』第４版，シュプリンガー出版（１９８３）に
記載されている。

【００４７】接種物として、大地、浄水場、堆肥の山お
よび蟻塚から得た試料を使用した。濃縮は、３０℃で振
とうフラスコ中で行なった。新しい培地に３回過剰接種
した後、１リットルあたり１６ｇの寒天を加えた同じ培
地に濃縮物を塗り付け、３０℃で培養した。　　寒天培
地に軟度も塗り付けた後、純粋な培養菌が得られた。

【００４８】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表１　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ＋Ｎ−培地　　　
　　　　　　　　　　　成　　分　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃　　度（ｍｇ
／ｌ）　　　　　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０００　　　
　　　　　Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２０００　　　　　　　　
ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１０００　　　　　　　　ＮａＣｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３０００　　　　　　　　ＭｇＣｌ２・６Ｈ
２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
００　　　　　　　　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４．５　　
　　　　　　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８　　　　　
　　　ピリドキサール塩酸塩　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１０・１０−３　　　　　　　　
リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５・１０−３　　　　　　
　　ニコチン酸アミド　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５・１０−３　　　　　　
　　チアミン塩酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２・１０−３　　　　　
　　　ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２・１０−３　
　　　　　　　パントテン酸　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５・１０−
３　　　　　　　　ｐ−アミノ安息香酸塩　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　５・１０−３　
　　　　　　　葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
・１０−３　　　　　　　　ビタミンＢ１２　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５・１０−３　　　　　　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００・
１０−３　　　　　　　　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０・１
０−３　　　　　　　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０
０・１０−３　　　　　　　　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２００・
１０−３　　　　　　　　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０・１
０−３　　　　　　　　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０・１０
−３　　　　　　　　Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３０・１０−３　
　　　　　　　ＥＤＴＡＮａ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５・１０−３　　　　
　　　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２・１０−３　　　　　
　　　（溶液のｐＨは７．０に調節した。）〔実施例２
〕 ２，５−ジメチルピラジンを２，５−ジメチル−３−ヒ
ドロキシピラジンに変換 ロードコッカス・エリトロポリス（ＤＳＭ番号６１３８
）を、発酵器中で、０．１％（ｗ／ｖ）　２，５−ジメ
チルピラジンを含むＡ＋Ｎ−培地中で、ｐＨ７および温
度２５℃で培養した。　　続いて細胞を遠心分離し、Ａ
＋Ｎ−培地中に再分散させ、光学密度を６５０ｎｍで１
０に調節した。　　この細胞分散液を振とうフラスコ中
に入れ、１リットルあたり９２ｍｍｏｌの２，５−ジメ
チルピラジンを加えた。

【００４９】振とう装置上で２５℃で４時間培養した後
、１リットルあたり８３ｍｍｏｌの２，５−ジメチル−
３−ヒドロキシピラジンが確認された（収量９０％に相
当）。

【００５０】〔実施例３〜９〕実施例２に準じて行なっ
た。　　結果を表２に示す。

【００５１】

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　２，５−ジメチルピラジンを唯一の炭
   素、窒素およびエネルギーの供給源として成長し、基質
   として一般式Ｉのピラジン 【化１】 または一般式ＩＩのキノキサリンを、 【化２】 〔式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基またはハロゲン原
   子をあらわし、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５は同じかま
   たは異なるものであって、水素原子、Ｃ１〜Ｃ４アルキ
   ル基またはハロゲン原子をあらわす。〕一般式ＩＩＩ　
   のヒドロキシル化したピラジン 【化３】 または一般式ＩＶのヒドロキシル化したキノキサリン【
   化４】 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５は上記の意
   味を有する。〕に変換することができ、その際、それら
   のヒドロキシル化したピラジンまたはキノキサリンは成
   長培養基中に蓄積されることを特徴とする微生物。
2. 【請求項２】　　ＤＳＭに番号６１３８で寄託してある
   、ロードコッカス・エリトロポリスの名称を有する請求
   項１の微生物、およびその子孫および突然変異体。
3. 【請求項３】　　ＤＳＭに番号６１３７で寄託してある
   、アートロバクターｓｐ．の名称を有する請求項１の微
   生物、およびその子孫および突然変異体。
4. 【請求項４】　　ヒドロキシル化したピラジンおよびキ
   ノキサリンの製造方法において、請求項１〜３のいずれ
   かの微生物により、一般式Ｉのピラジン 【化５】 または一般式ＩＩのキノキサリンを、 【化６】 〔式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基またはハロゲン原
   子をあらわし、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５は同じかま
   たは異なるものであって、水素原子、Ｃ１〜Ｃ４アルキ
   ル基またはハロゲン原子をあらわす。〕一般式ＩＩＩの
   ヒドロキシル化したピラジン 【化７】 または一般式ＩＶのヒドロキシル化したキノキサリン【
   化８】 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５は上記の意
   味を有する。〕に変換し、濃縮された生成物を分離する
   ことを特徴とする方法。
5. 【請求項５】　　微生物の有効酵素が２，５−ジメチル
   ピラジンにより誘発されることを特徴とする請求項４の
   方法。
6. 【請求項６】　　培養基中の基質濃度が２０％（ｗ／ｖ
   ）　を超えないように、基質を一度に、または連続的に
   加えて変換を行なうことを特徴とする請求項４または５
   の方法。
7. 【請求項７】　　変換をｐＨ４〜１０で行なうことを特
   徴とする請求項４〜６のいずれかの方法。
8. 【請求項８】　　変換を０〜５５℃の温度で行なうこと
   を特徴とする請求項４〜７のいずれかの方法。