JPH03504800A - 茎頂による植物の形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 茎頂による植物の形質転換方法 これは１９８８年６月１日に出願された特許出願第２０１，５６８号の一部継続 出願である。

本発明は、高水準の迅速な再生及び低リスクの組織培ＩＩ誘導遺伝的変異でもっ て植物を形質転換する方法に関する。詳細には、その方法は形質転換のため及び 植物の再生に於けるその後の使用のための標的組織として幼植物！織から分離さ れた茎頂または無傷の植物のえき芽を使用する。

農業上重要な作物に関して植物細胞培養系からの日常的な反覆可能な再生を欠く ことは、植物への遺伝子工学技術の通用の際の重大な障害である。更に、ラーキ ン（Ｌａｒｋｉｎ）及びスコウクロフト（Ｓｃｏｗｃｒｏｆ　ｔ）著、Ｔｈｅｏ ｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　６０Ｓ、　１９７頁（１９８１年）に報告されて いるように、植物が試験管内で不定に再生される場合には、ツマクローナル（Ｓ ｏｍａｃｌｏｎａｌ）変異の可能性がある。

ツマクローナル変異体がＡ、ツメファシェンス（ｔｕｌｌｅｆａｃｉｅｎｓ）　 媒介遺伝子伝達に続いて生じ得る。ツマクローナル変異は、カルス中間体から誘 導される植物中に観察される遺伝的変異性である。

形質転換された植物のもとの遺伝的完全性を維持することが必須である場合には 、この現象は望ましくない。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｗｔｕａ＋ ｅｆａｃｉｅｎｓ）は、遺伝子伝達のための共存培養系中の築盛、表皮果皮また はその他の外植に関して好ましいベクターであった。Ａ。

ツメファシェンス媒介遺伝子伝達は、培養中のソラナセアス（Ｓｏｌａｎａｃｅ ａｓ）科の操作の容易なこと及びこの科に対するアグロバクテリウム種の感染力 のためにこの科の構成員を用いて展開されていた。多くのその他の双子葉種がア グロバクテリウムに通した宿主であると知られているが、少数のこれらの種のみ からの植物が主として再生系の欠如のためにうまく形質転換されていた。

ホルシュ（Ｈｏｒｓｈ）らによる築盛形質転換系の開発（Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３８巻、４６７頁（１９８７年）を参照のこと ）が、外来遺伝子物質の殆どの慣例の伝達を可能にしたが、限られた数の植物種 への伝達のみを可能にした。このモデル系は葉外植物質から再生するのに比較的 容易であるソラナセア工科の構成員：ペチュニア、タバコ及びトマトを使用して 実証された。築盛技術はプロトプラスト形質転換系に固有の多くの問題、特に必 要とされる延長された培養期間及びプロトプラスト植物の制限された再生を解決 した。

しかしながら、築盛系は極めて制限される。最も重大な制限は、少数の植物種を 葉Ｍ織から再生し得ることである。幾つかの培養ペチュニア品種に関してさえも 、築盛からの再生が困難である。

築盛系の別の制限は、不定茎分裂組織が表皮の葉＆Ｉｌ織及び皮下の葉ｍ織から 分化することである０築盛法の派生法が、体細胞胚形成の誘導と組合せた幼植物 ＆１１ｍの使用、並びにカルスの使用、その後の茎誘導を含むように開発された 。しかしながら、これらの場合の夫々に於いて、胚並びに茎分裂組織は不定に発 達する必要があるので、ツマクローナル変異の可能性がある。

植物形質転換の別の系がトリノ（Ｔｒｉｎｎ）らにより開発された（　５　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０８１頁（１９８７年）を参照のこと）。

この系はタバコ表皮果皮系の使用及びアグロバクテリウムによる共存培養を伴な う、゛この系の利点は、８週間で花及び種子の直接生産であった。再度、この系 の重大な関心は、作物種へのこの技術の制限された適用及びソ毎クローナル変異 の可能性である。何となれば、植物が不定の器官形成により生じるからである。

本発明は、遺伝子伝達を受ける組織として茎頂組織を使用することにより、前記 の技術により呈された障害に取り組むものである。このような組織の使用は、形 質転換される植物の特異的なりローン特性及び遺伝子特性を永続化するとともに 、植物の早い繁殖を可能にする。茎先端培養及びえき芽増殖を含む、茎分裂組織 が本発明の実施に好ましい、茎頂は植物形質転換に最も好ましい外植である。何 となれば、殆どの草本双子葉植物及び単子葉植物がこの外植源を用いて無傷植物 に生殖し得るからである。また、茎培養物が根づき植物（ｒｏｏｔｅｄ　ｐｌａ ｎｔｓ）に直接かつ迅速に発育する。茎頂の他に、えき芽の如きその他の非不定 組織が本発明の実施に使用し得る。

本発明の方法を茎頂（ｓｈｏｏｔ　ａｐｉｃｅｓ）に適用するに際して、選択さ れた植物から切除された茎頂が適当な培地中で培養される。

茎頂が切除され、または数日間培養された後、茎頂はアグロバクテリウム・ツメ ファシェンスの如き好適なベクターに曝露される。

その後、接種茎頂が数日以上にわたっても培養される。培養後、茎頂は非形質転 換植物＆ＩＩ織から形質転換植物組織を分化するための選択培地に移される。そ の後、形質転換組織が選択され発根培地中で再培養される。その後、根づき植物 は通常の条件下で成長させることができる。

この方法は形質転換植物の早い再生を可能にする。例えば、ペチュニアを用いた 実験は６週間以内に成果を生じた。上記の方法により生産された植物は自活され 、得られた種子が無菌発芽した。

生産された幼植物の９０％が新しい挿入遺伝子をもつことが判明し、これは新し い遺伝情報の有性伝達を実証した。

アグロバクテリウム属からの細菌が本発明の実施に好ましいが、植物中で遺伝子 形質転換し得るその他のベクターが使用でき、その他の細菌、プラスミド、ウィ ルス、及びＤＮＡフラグメントを含む。

第１図は、５時間にわたるＧＵＳ活性の経過を示す形質転換植物の螢光光度法Ｇ 　Ｕ　Ｓ分析の結果を示す。生産されたメチルウンベリフェロンの量がコントロ ン（ｋｏｎｔｒｏｎ）分光型光計で定量化された。これは本発明の方法を用いる ペチュニアの成功した形質転換を示す。

以下の説明及び実施例は、本発明を実施するのに最善であるよ知られた方法を詳 しく説明する。この方法の変化は標的植物種及び標的植物に伝達すべき形質に応 じて異なる培地または異なるベクターを含み得ることが認められる。以下の実施 例に於いて、ペチュニア、大豆、ムラサキウマゴヤシ、ヒマワリ、綿、小麦及び トウモロコシを標的植物として選んだが、以下に説明される方法は、有意な実験 をしないで、また本発明の精神及び範囲から逸脱しないで、茎頂またはえき茎か ら再生し得るその他の植物に適用し得る。

以下の実施例は本発明の性質を単に説明する。この方法は、茎頂から再生でき且 つアグロバクテリウムにより形質転換し得るあらゆる双子葉植物に使用し得るこ とが当業者に明らかである。また、その方法は、本発明の範囲及び精神から逸脱 しないで単子葉植物種を形質転換するように変更し得る。

カナマイシン抵抗性を用いる選択が好ましいが、０４１８、ネオマイシン、ハイ グロマイシンまたはチオラムフェニカル（ｃｈｉｏｒａｍρｂｅｎｉｃａｌ）の 如きその他の抗生物質またはグリフォセート（、ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）の如き 除草剤に対する抵抗性を暗号化する遺伝子配列の挿入並びに当業者に知られてい るその他の選択遺伝子が使用し得る。更に、草種の充分な感染を促進するための 或種の添加剤が使用されてもよい。これらはアセトシリンボン並びにオクタビン 、ツバリン及びロイジノビンの如き成極のオピンを含むが、これらに限定されな い。

市販のペチュニア品種“ローズ・フラッシュ（Ｒｏｓｅ　Ｆ１ａ５ｈ）”、即ち シングル・グランジフロラ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｇｒａｎｄｉｒｌｏｒａ）とディー プ・ローズのＦ、雑種の種子をザ・ボール・シード・カンパニイ（むｈｅ　Ｂａ １ｌ　５ｅｅｄ　Ｃｏ、　、ウェスト　シカゴ、イリノイ州）から入手した。ト ゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０の如き湿潤剤または皿洗浄用洗剤を添加した２０ ％（ｖ／ｖ）の市販漂白剤中で種子を３０分間表面滅菌した。その後、種子を無 菌水で５回すずいだ。滅菌した種子を、その後、３０％の蔗糖（ｗ／ｖ）を含む ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｇｅ）とスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）の塩で無菌発芽さ せた。ムラシゲとスクーグの塩は、以下のようにして調製した。下記の塩の原液 を調製した（成分の数値は原液Ｉｌ当りのｇ数を示す）。

（１）　　硝酸塩：硝酸アンモニウム（Ｎ１１４ＮＯ３）　、１６５　；硝酸カ リウム（ＫＮ口、）、＋９０； （２）硫酸塩：硫酸マグネシウム（ＭｇＳ０．７１１□０）、３７；硫酸マンガ ン（ＭｎＳＯ，Ｉｌ、口）、１．６９０；硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ−７１１２０）、 ０．８６０；硫酸第二銅（ＣＬＩＳＯ４５１１２０）、０．００２５；（３）　 　ハロゲン化物：塩化カルシウム（ＣａＣｊ２２２１１Ｊ）　、４４　；ヨウ化 カリウム（Ｋｌ）、０．０８３；塩化コバルト（ＣｏＣＩｌｚ６１１．０＞　、 ０．００２５　； （４）　　ＰＯ４，１１１０ｓ　、ＭＯＵ４　ニリン酸カリウム（ＫＩｌ、ＰＯ ，）　、１７　；ホウ酸（Ｉｌ、ＢＯ，）、０．６２０；モリブデン酸ナトリウ ム（Ｎａ２Ｍｏ０４２１１２０）　　、　０．０２５； （５）　　Ｎ　ａ　、Ｆ　ｅε口ＴＡ：硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ，７１１−０）　 、２．７８４　；エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩（ＮａＪＤＴＡ） 、３、７２４ 上記の原液の夫々１０ｍｆを調製培地１１に添加した。

の　　　　　び 発芽の１週間後に、茎頂を上記の操作により発芽した植物から切除した。茎頂は 大きさ０．３　Ｘ　０．６　＋ｏであり、頂端半球体（ａｐｉｃａｌｄｏｓｅ） と二枚の始原葉からなっていた。その後、切除した茎頂を下記の添加成分を含む 上記のムラシゲとスクーグの塩で培養した。

０．１■／ｌのＮ６−ベンジルアデニン、３０，０００■／７！の蔗糖及び２． ０００　ｚ／　ｊ！のＫＣバイオロジカル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　％カンサス シティ、ミズーリイ州）から得られたゲル−ライト（Ｇｅｌ−ｒｊｔｅ）　、細 菌を保存培養液中で培養した場合には寒天を培地溶液に添加し、懸濁培養液また は液体培養液に関しては、寒天を省いた。その後、培地溶液を２５分間高圧加熱 滅菌し冷却した。その後、塩溶液及び培地溶液を合わせ、カナマイシン５０■を 培地に添加した。Ａ。

ツメファシェンスＬＢＡ４４０４　（ｐＲＧＵｓ２）を培地３懺ｌで２日間増殖 させた。その後、培地及び培養Ａ、ツメファシェンスを使用して上記の方法で茎 頂を接種した。

ノ　−　　　の゛　　びクローニング 接種及び培養に続いて、茎頂を０．】■／ｌのＮ６−ベンジルアデニン、３０． ０００■／ｌの蔗糖及び２，０００■／ｌのゲル−ライトを含む上記のムラシゲ とスクーグの塩を含む新鮮な培地に移し更に２日培養した。その後、上記のムラ シゲとスクーグの塩；０．１■／ｌのＮ６−ベンジルアデニン、３０，０００■ ／ｌの蔗糖、２．０００■／１のゲル−ライト、２００■／ｌのカナマイシン及 び５００■／ｌのカルベニシリン（これはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社（セントルイ ス、ミズーリイ州）から入手した）を含む培地で継代培養した。

培養３週間後に、全ての外植が生長した。未形質転換組織は２００■／１のカナ マイシン培地の存在下で漂白を示した。形質転換茎は漂白された葉の下部で緑色 の領域として現われた。その後、漂白された茎を除去し、緑色の組織を１００■ ／ｌのカナマイシンを含む培地で再度培養した。単一の緑色の茎が１週間後に外 植から発育し、これをムラシゲとスクーグの塩、３％の蔗糖、１００■／１のカ ナマイシン及び５００■／１のカルベニシリンを含む発根培地に移した。全ての 外植が根生産を示した。

その後、根づき植物を、以下のようにしてＧＵＳの存在に関して測定した。植物 組織約５０■をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ）管中で２００μＥ中５０ −ＨのＮａＰＯ５、ｐＨ７，０、１０ｄのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、。

０．１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００、（シグマケミカル社）、 ０．１％のサルコシル）、（シグマケミカル社）、１０ｓ＋Ｍのβ・メルカプト エタノールと乳棒で均一にした。そのエキス１００μｌを、同緩衝液に溶解され た２＋＋Ｈの４−メチルウンベリフェリルグルクロニド１００μｌに添加した。

その反応を３７℃で５時間保温し０．２　ＭのＮＪ１２ＣＯｓ　１　ｍ　Ａで停 止した。メチルウンベリフェロンの生産をコントロン分光螢光計で１時時間隔で 定量化した。測定の結果が第１図に見られる。

大施阻衾−茎頂培養系と築盛培養系の比較築盛培養法と本発明の茎頂法との比較 を行なった。

ペチュニア雑種Ｃ１■“ローズ・フラッシュ”からの１１３個の茎頂をＡ、ツメ ファシェンスと共存培養し上記の選択培地で培養した。緑色の下部を有する茎を 分離しく表１を参照のこと）、１００■／ｌのカナマイシンを含む培地に１週間 移し、続いて上記の発根培地に移した。

また、築盛をペチュニア雑種Ｃ■“ローズ・フラッシュ”から採取し、ホルシュ らにより記載された操作（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７巻、１２２９頁（１９８５年 ）を参照のこと）に従って形質転換した。

選択培地は１．　Ｏｒｎｇ／　ＩｔのＮ６−ベンジルアデニン、０．１ナフタレ ン酢酸、１１００ＩＩＩ／ｌ、２００■／１または３００■／Ｉｌのカナマイシ ン及び５００■／ｌのカルベニシリンを含むＭＳ培地を含んでいた。表１は得ら れた結果を示す。

カルス生産　　　　　　１３／２８’　（４６％＞　２５／２５（１００％＞　 ３／１１３（３％）茎生産　　　　　　　　１３／２８　　（４６％）　　０／ ２５　　（０％）　？／１１３（６％）茎発根　　　　　　　　　２／１３　　 （１５％）　　　−５／７（７１％）植物ＧＵＳ陽性　　　　　２／２　　（１ ００％）　　　−５１５（１００％）−もとの外植の数 築盛外植からのカルス生産は１１００ＩＩＩ／ｌ及び３００Ｗｇ／ｊ’のカナマ イシンでは高く　（４６％及び１００％）、茎頂外植からのカルス生産は非常に 話限されていた（３％）。カナマイシンで培養された茎頂外植からの茎生産は、 築盛の茎生産（４６％）と較べて低かった（６％）。しかしながら、茎頂外植か ら形成された茎は築盛外植を用いて形成された茎（１５％）よりも多く形質転換 することができた（７１％）。

このデータかられかるように、二つの技術の重要な差異は茎頂からの植物の殆ど 全体の再生である。同様の結果を、側芽外植を用いて得ることができる。

キメラ植物が茎頂外植法を用いて生産されたか否かについて調ベるために、上記 の型のＧＵＳ分析をＧＵＳ陽性植物の種々の領域からの葉、花弁、子房、及び胚 珠組織に関して行なった。測定した全ての組織はＧＵＳ遺伝子形質発現を示した 。

ス」１例」−一移入の安定性 植物形質転換に於いて重要なことは、生殖系中の形質の安定な移入及び子孫中の 形質発現である。これが起こる場合・−次形質転換体のキメラの性質の問題はそ れ程重要ではない。

形質が実施例２の次の世代にうまく入れられたが否かを調べるために、ＧＵｓ陽 性植物の花を自殖した。４種の異なるＧＬＩＳ陽性植物の２０の花からの３０７ 個の種子を上記のように発芽させ、幼植物をＧＵＳ活性に関して測定した０表２ に示されるように、幼植物の約９０％がＧＵＳ陽性であった。

表２ １　　１　　　１５　　１４　　１　　　９３．３　　　　（７３−１００）２ 　１５　１４　１　９３．３　　（７３−１００）３　　　１５　　１．４　　 １　　　９３．３　　　　（７３−１００）４　　　１５　　１３　　２　　　 ８６．７　　　　（６０−９８）５　　　　１５　　　１５　　　　０　　　　 　１００．０　　　　　　＜７８−１００）合計　７５　　７０　　５　　　Ｘ ＝９３．３２　　　］　　　　１５　　１４　　１　　　　９３．３　　　　（ ７３−４００）２　１５１３　２　８７．０　　（６０−１００）３　２３２０ 　３　８７．０　　（６５−１００＞４　１６　１４　２　８７．５　　（６１ −１００）５　１３　１２　１　９２．０　　（５８−１００）合計　８２　　 ７３　　９　　　　Ｘ＝８９３　１　１５　１３　２　８６．７　　（５８−９ ８）２　１５　１５　０　１００．０　　（７８−１００）３　１５　１４　１ 　９３．３　　（７３−１００＞４　１５　１４　１　９３．３　　＜７３−１ ００）合計　７５　　６９　　６　　　　Ｘ＝９２４　１　１５　１０　５　６ ６．６　　（３７−８８）３　１５　１１　４　７３　　（４３−９３＞表３を 参照して、一つの植物の子孫中のＧＵＳ遺伝子に関して計算されたＣｈｉ二乗値 は、単一染色体に関する挿入を示す一遺伝子雑種の３：１分離パターンを示した 。植物のうちの３種に関するＣｈｉ二乗値は、二つの独立の染色体に関するコピ ーの挿入を示す重複優性二遺伝子雑種分離の１５：１分離パターンを示した。

植物２　　　９．８４　　　＜０．０１　　　３．１２　　　＞０．０５植物３ 　　　１１．５６　　　＜０．００１　　　０．３９　　　＞０．５ｌ隻斑互 更に２種のペチュニア栽培品種、即ちＴ、ゲラソツ（Ｇｅｒａｔｓ）からのＶ２ ３ＸＲ５１及び“ホワイト・フラッシュ（１＋１ｈｉｔｅ　Ｆ１ａ５ｈ　”（Ｆ ｌ雑種：グランジフロラ（Ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）　Ｘピュア・ホワイト・ポ ール・シード（Ｐｕｒｅ　Ｗｈｉｔｅ　Ｂａ１ｌ　５ｅｅｄ）　、カンパニイ、 シカゴ、イリノイ州）を、上記の茎頂法を用いて形質転換した０表４に示される ように、これらの株の形質転換は表１に見られた結果と同様の結果を得た。これ は、その操作が同様の成功でもってその他の植物品種に使用し得ることを示す。

形質転換ペチュニア雑種株Ｖ２３ＸＲ５１を自殖させ、種子を集め培養した０表 ５に示されるように、子孫の７０％〜９０％がＧＵＳ活性を示し、遺伝子が次の 世代にうまく伝達されたことを示した。

表４ 実施例１に記載された築盛系及び茎頂系を用いるペチュニア雑種ＣＶ、“Ｖ２３ ＸＲ５１”及び“ホワイト・フラッシュ“の形−の　　六 呈ｌ　　　茎１ 外植の数　　　　　　　　２６　　　　　３４　　　　　１８住産されたカルス 　　　　　Ｘ”　　　　　１４　　　　　０生産された茎　　　　　　　　　　 　　１４８茎発根　　　　　　　　　　　　　　　０８外植の数　　　　　　　 　３０　　　　　３３　　　　１０２生産されたカルス　　　　３０　　　　　 １２　　　　　０生産された茎　　　　　　０　　　　　１１　　　　　１０茎 発根　　　　　　　　　　　　　　　１１　　　　　４表５ 自己受粉ＧＵＳ十実施例２に記載されたＣＶ、”Ｖ２３ｘＲ５１”■櫃上Ω王！ 　のＧＵＳ゛　−に　　る植物　種子の数　　ＧＵＳ（＋）　　　ＧＵＳ（−） 　　形質発現、％１　　　４０　　　　２８　　　　　１２　　　　’７０．０ ２　　　４０　　　　３６　　　　　４　　　　　９０．０このデータは、実施 例３に示されたデータと対になって、本発明の方法の重要な特徴の−っ、即ち将 来の世代による新しい形質の遺伝を可能にする標的植物の発芽細胞並びに体細胞 の形質転換を強調する。ほかの人により使用された技術は不ねん植物を生産し、 発芽細胞を形質転換するのに失敗し、または発芽細胞の形質転換が非常に低い比 率で起こり、所望の形質を発現する少数の子孫を生じる。

形質転換“Ｖ２３ｘＲ５１”植物の子孫中のＧＵＳ遺伝子の形質発現に関するＣ ｈｉ二乗値は、単一染色体に関する挿入を示す一遺伝子雑種の３：１分離を示し た。その他の植物に関するＣｈｉ二乗値は、二つの独立の染色体に関するＧＵＳ 遺伝子のコピーの挿入を示す重複優性二遺伝子雑種分離の１５：１分離パターン を示した。

表６ ＣＶ、　　“Ｖ２３ｘＲ５１″の形質転換植物の子孫中のＧＵＳ形のノ　パ　− ンの１゛ 植物　　　ｘ”　　　　　ｐ　　　　　　ｘ”　　　　ｐｌ　　　　　０．５３ ３　　　　＞ｏ、３０　　　３８．５　　　＜０．０１４．８　　　　　＜０． ０５　　　　０．９６　　　＞０．３０データは、ｄｆ＝１でもって、９５％の 信頼限界で計算した。

実ｍ また、茎頂による形質転換を綿、特にゴシピウム・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉ ｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）　、ｖａｒ、コーカー（Ｃｏｋｅｒ）　３１２、タム コツト（Ｔａｍｃｏｔ）　ＣＡ　Ｂ　−ＣＳ　、及びゴシピウム・バルバデンス （Ｇｏｓｓｙｐｒｕｔｎ　ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）　、ｖａｒ、ピマ（Ｐｉｍａ ）　　５　６とともに使用した。使用した工程は、以下の変化でもって上記と同 様であった。

種子を蒸留水で１０分間すすぐことにより種子を消毒し、ついで１滴のトウイー ン２０を含む２０％の市販漂白液で１５分間浸軟した。その後、種子を無菌水で ３回すすいだ。

消毒後、種子を、カラザの端部−（ｃｈａｌａｚａｌ　ｅｎｄ）を下にして滅菌 ベトリブレートに移した。５つの種子を夫々のプレートの上に置いた。プレート はＭＳハロゲン化物を含む溶液を含んでおり、０．８％の寒天で固化した。プレ ートを暗所で３０℃でシールしないで４日間保温した。その後、プレートを、分 離前の１日につき１６時間の昼間の養生にかけた。

茎頂を発育の同様の段階で植物から切除することを確実にするために、幼植物の 最も均一な集団を使用した。遅い発芽性の幼植物または汚染幼植物を廃棄した。

茎頂を、解剖顕微鏡の助けにより、５日たった幼植物から分離した。成る場合に は、プラスチックシリンジケーシングに取り付けた滅菌皮下ニードル（２２ゲー ジ及び２７ゲージ）を使用して解剖を行なった。

茎頂は、まずその基部で二つの子葉のうちの一つを除去することにより切除した 。その後、茎領域を幼植物から除去した。その後、茎領域の基部をトリミングし て茎頂分裂組織の基部表面を露出した。

また、この技術の改良法を使用して茎頂分裂組織の側面及び基部表面を露出する 最大の葉及び下層の組織を除去した。

３〜４日たった幼植物から分離した茎頂は分裂組織の半球体及び二枚の始原葉か らなっていた。幼植物がより多くの日数（５〜７日）を経ている場合、茎頂はし ばしば２枚より多い葉始原体を含んでいた。

その後、分離した茎頂を、ホルモンを含まない基本ＭＳ培地（後記される）で１ ６時間の光周期で２８〜３０℃で培養した。

５０μＥ／ｍ’秒でグローラックス（Ｇｒｏ−Ｌｕｘ　、商標）の光及び白色螢 光の継続を使用して光を与えた。茎頂を新鮮な培地で再培養した。

その培地は、下記の添加物とともに、ムラシゲとスクーグにより記載されたＭＳ 基本塩配合（ムラシゲとスクーグの著作文献、１９６２年を参照のこと）を含ん でいた。蔗糖、１５．０００■／ｌ；チアミン６、４　ｍｇ／　ｌ　；　ＴＣ寒 天、８．００（ｌ　ｍｇ／　ｌ　、使用の前に、培地を通常の高圧加熱滅菌法に より滅菌し、滅菌ぺ）　ＩＪプレート中に５１量分配した。

茎頂を、切除の２日以内に、アグロバクテリウム・ツメファシェンスで接種した 。接種は、その細菌を培養プレートからかき取り、このプラークを皮下ニードル またはトウース・ビック（ｔｏｏＬＩ＋−ρ１ｃｋ）を用いて茎頂の切断表面に 適用することにより行なった。

茎頂をＡ、ツメファシェンスの一種もしくは二種の株で接種した。第一の株は上 記の株ＬＢＡ４４０４　“Ｇ　ｔＪ　Ｓ　２″である。第二の株は、Ｇ　ｔＪ　 Ｓ　２の場合と同様のＴｉプラスミドを含む株ＥＨＡ１である。このプラスミド は、テキサスＡ＆Ｍ大学の１゛、マツフナイト（ＭｃｋｎｉｇｈＬ）博士により ＥＨＡ　１株に挿入され、”ＧＵＳ３″と命名された。株ＥＨＡＩはＡ、ツメフ ァシェンスの宿主範囲を増大する高毒性の部位を含むと考えられる。

Ａ、ツメファシェンス株ＥＨＡ　ｌの使用に加えて、下記の添加剤を使用して、 好結果の感染を促進した。アセトシリンボン、１０〜３０μＭ；及びツバリン、 １０〜１００μＭ（ベルサンビ（ＶｅｌｕＬｂａｍｂＩ）らにより提出された） 。

Ａ、ツメファシェンスと２日間接触した後、外植を５００ｎＩｇ／ｌのカルベネ シリンを含む培地に１週間移した。その後、外植を７、５　ｍｇ／　１のカナマ イシン及び５００ＩｌＩｇ／ｉ！のカルベネシリンを含む培地に更に１週間移し た。最後に、外植を５００ｍｇ／４２のカルベネシリンを含む培地に１週間移し た。

茎が４枚以上の葉を含んでいた場合、茎基部を滅菌ルートン（ｒｏｏｔｏｎｅ） 中に浸漬し、３インチ（７，６ＣＩｌ）のクレーポット中の滅菌バーミキュライ トに移し、カバーをかけた。

外植及び小植物を上記のＧＵＳ遺伝子に関して測定し、ＧＬＪＳ陽性であること がわかった。

実施例６ ヒマワリ、ヘレアンサス・アヌス（ＩＩｅｌｅａｎｔｌ＋ｕｓ　ａｎｎｕｓ）　 、ｖａｒ。

トリウムフ（Ｔｒｉｕｍｐｈ）　５６０　ｏ種子を発芽させ、茎を分離し、下記 の変更でもって綿に関して記載された操作を使用してＡ、ツメファシェンスＥｌ −ＩＡＩ、アセトシリンゴン及びツバリン（１）ａ共に培養した。種子を、茎分 離の前に、２〜３日間培養した。綿に関して記載された基本培地に１■／ｌのＩ ＡＡ　（インドール酢酸）を補充した。

４つのヒマワリ植物は、開花し種子を生産した。これらの種子を発芽させ、子孫 幼植物の多くはＧＵＳ陽性であった。

ス】１１灸 大豆、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ）、ｖａｒ、ダウリング・ アンド・プランジ（Ｄｏｗｌｉｎｇ　＆　Ｂｒａｇｇ）＊滅菌した種子を１日間 で発芽させ、ついで幼芽を切除し、上記のように培養した。また、水を１週間吸 収させた種子から茎頂を得た。

使用した培地は、茎培養に使用した培地に茎頂の成長を促進するための０．１■ ／ｌのカイネチンを補充し１．０■／１のカイネチンを添加して不定茎生産を促 進した以外は、綿に関して使用した培地と同じであった。

Ａ、ツメファシェンスＥＨ／ｌ、ツバリン及びアセトシリンボンとの共存培養は 、上記の綿の場合と同じであった。

アグロバクテリウムとの共存培養の２日後に、外植を２５■／ｌまたは５０■／ １のカナマイシン及び５００■／ｌのカルベニシリンを含む培地に１週間移した 。その後、外植を５００■／ｊ２のカルベニシリンを含むホルモン不含の培地に 移した。

カルベニシリンを含む培地で成長させた外植の多くに、自然発根が観察された。

根を示さない外植を滅菌ルートン中に浸漬した。

その後、３インチ（７，６０）中の滅菌バーミキュライトに無菌移植し、カバー をかけた。

かなりの数の根は、培地中で成長させた場合、ＧＵＳ陽性であることがわかった 。土壌への移植に耐えた幼植物の全てがＧＵＳ陽性であった。

１隻斑エ ムラサキウマゴヤシ、メジカゴ・サチバ（Ｍｅｄｉｅａｇｏ　５ａｔｉｖａ）ｖ ａｒ、サザン・スペシャル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　５ｐｅｃｉａｌ）　＊種子を発 芽させ、綿に関して記載したように茎を分離した。組織をＡ、ツメファシェンス ＥＨＡ　Ｉ、アセトシリンボン及びツバリンと共存培養した。

幾つかのＧＵＳ陽性組織を試験管内で生産し、１０本の植物をポット中に定着さ せた。これらのうちの少なくとも４本がＧＵＳに対して陽性であった。

実施例８ トウモロコシ（品種、マックス（Ｆｕｎｋｓ）　６〜９０）及び小麦（品種チャ イニーズ・スプリング（ｃｈｉｎｅｓｅ　ｓｐｒｉｎｇ））を蒸留水で１０分間 すすぎ、１滴のトウィーン２０を含む２０％の市販漂白液中に１５分間浸軟し、 滅菌水中で３回すすいだ。消毒した種子をＭＳハロゲン化物及び硫酸塩を含む培 地に移し、０．８％の寒天で固化させた。種子の胚領域を寒天と接着させて置い た。未シールのプレートを暗所で３０℃で１日間保温した。

茎頂を解剖顕微鏡の助けにより分離した。葉及び下層の組織を切除して茎頂分裂 組織の側面及び基部表面を露出させた。

分離した茎頂を、ホルモンを含まない基本ＭＳ培地で培養した。

組織を新鮮な培地で１週間再培養した。培地は、ＭＳ基本塩配合物（ムラシゲと スクーグ、１９６２年を参照のこと）及び下記の成分（■／１）を含んでいた。

蔗糖１５．０００　、チアミン０．４；ＴＣ寒天、８．０００゜培地を通常の条 件下で高圧加熱滅菌することにより滅菌し、滅菌プラスチックベトリ皿にε１量 分配した。培養物を、グローラックス光及び白色螢光の組合せを５０μＥ　／　 ｍ″秒で使用して２８〜３０℃で１６時間作った。

茎頂外植を分離の日または分離の１日後及び２日後に接種した。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス、即ちトム・マツフナイト博士から提供 された“ＧＵＳ３”構成物を含む株ＥＨＡ　１を使用した。この株は、この株に より感染（及び形質転換）される種の範囲を増大し得る高活性の毒性領域を含む と推測される（トム・マツフナイト、親展の手紙）。適当な成育培地及び抗生物 質を含む２〜３日前に接種した集密プレートからアゲロバクチリアをかき取った 。茎頂の切断表面に滅菌皮下ニードルまたは滅菌トウースビックでアグロバクテ リウムを接種した。

アグロバクテリウム・ツメファシェンスの高毒性’ＧＵ３３″株の使用に加えて 、ツバリン及びアセトシリンボンを接種工程の前にアグロバクテリウムと混合し て毒性を高めて、好結果の感染と関連するその他の応答を誘発した。

アグロバクテリウムとの接触の２日後に、外植を５００■／１のカルベニシリン を含む培地に１週間移し、ついで７．５■／Ｅのカナマイシン及び５００■／ｌ のカルベニシリンを含む培地に１週間移し、最後に５００■／１のカルベニシリ ンを含む新しい培地に１週間間隔で移した。

発育しているトウモロコシ及び小麦の茎は２週間または３週間後に自然に発根し た。

ウリアン（Ｕｌ　１ａｎ）らの文献（１９８８年）に記載されたように、トウモ ロコシ及びその他の単子葉植物はＧＵＳ基質を開裂し弱い陽性反応を生じる酵素 を明らかに含む。それ故、単子葉植物に於けるこの弱いＧＵＳ陽性応答は好結果 の形質転換を示さない、トウモロコシ組織及び小麦組織の幾つかで観察されたよ うな強いＧＵＳ陽性応答が好結果の形質転換を示し得る。

ＤＮＡをロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）及びペンディッチ（Ｂｅｎｄｉｃｈ）（１ ９８５年、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　　５ｔ、６９７７６頁）に従 って抽出し、製造業者の指示に従ってＨｉｎｄｌ［ｌ　（ボーリンガ−・マンハ イム・インコーポレーション（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ＋　Ｉ ｎｃ、））を用いて制限し、電気泳動により一夜で分離した。ゲルからナイロン フィルターへのＤＮＡの転移を、リード（Ｒｅｅｄ）及びマン（？Ｉａｎｎ）　 　（１９８５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　　１３巻、７２０７〜 ７２２１頁）のアルカリ転移改良法を用いてサザン（１９７５年、Ｊ、Ｍｏ１ｅ ｃ、Ｂｉｏｌ、９８巻、５０３頁）に従って行なった。ＤＮＡを２ｊ３プロモー ター、ＧＵＳ配列及び前記のポリアデニル化暗号領域からなる３ｔｐ−ラベルし たＧＵＳプローブにハイブリッドした。

トウモロコシ植物のサザン分析は、好結果の形質転換を確かめた。

ｆ！９ｃＩＡ 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称　　　茎頂による植物の形質転換方法３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ５、補正命令の日付　　自　　　発 国際調査報告 １ｍ５−雫１―電９・−＾紳”’ｌ−”−、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２２５８国際 調査報告 １ｍ６１Ｎｍｌｌ＠Ｍｌ轟帥＠を廖ｈ・ＩＩＮ、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２２５８

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）切除した茎分裂組織を好適な成育培地中で培養し；ついで ｂ）上記の茎分裂組織を形質転換し得る好適なベクターで上記の組織を接種する ことを含むことを特徴とする植物組織の形質転換方法。
2. ２．上記の組織が植物から切除された茎頂である請求の範囲１項記載の方法。
3. ３．上記の茎頂が上記の植物から切除された頂端半球体及び２枚以上の始原葉を 含む請求の範囲２項記載の方法。
4. ４．上記の組織がえき芽である請求の範囲１項記載の方法。
5. ５．上記のベクターがアグロバクテリウム・ツメファシエンスである請求の範囲 １項記載の方法。
6. ６．上記のベクターが選択形質またはレポーター形質の遺伝暗号を含む請求の範 囲１項記載の方法。
7. ７．上記の選択形質が抗生物質抵抗性である請求の範囲６項記載の方法。
8. ８．上記のアグロバクテリウム・ツメファシエンスが株ＬＢＡ４４０４（ｐＲＧ ＵＳ２）である請求の範囲５項記載の方法。
9. ９．上記のアグロバクテリウム・ツメファシエンスが株ＥＨＡ１（ｐＲＧＵＳ３ ）である請求の範囲５項記載の方法。
10. １０．形質転換工程中にアセトシリソゴン及びオピンを添加する追加の工程を含 む請求の範囲５項記載の方法。
11. １１．オピンがノパリンである請求の範囲１０項記載の方法。
12. １２．ａ）形質転換植物組織を選択する工程；及びｂ）形質転換植物組織を培養 して根の成長を誘導する工程を更に含む請求の範囲１項記載の方法。
13. １３．ａ）好適な成育培地中で切除した茎頂組織を培養し；ｂ）上記の茎頂組織 にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種して上記の組織を形質転換し； ｃ）形質転換植物組織を選択し；ついでｄ）形質転換植物組織を培養して根の成 長を誘導することを含むことを特徴とする植物組織の形質転換方法。
14. １４．形質転換中にアセトシリンゲン及びオピンを添加する追加の工程を含む請 求の範囲１３項記載の方法。
15. １５．アグロバクテリウムが株ＬＢＡ４４０４（ｐＲＧＵＳ２）または株ＥＨＡ １（ｐＲＧＵＳ３）である請求の範囲１３項記載の方法。