JPH0336517B2 - - Google Patents

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JPH0336517B2
JPH0336517B2 JP54140409A JP14040979A JPH0336517B2 JP H0336517 B2 JPH0336517 B2 JP H0336517B2 JP 54140409 A JP54140409 A JP 54140409A JP 14040979 A JP14040979 A JP 14040979A JP H0336517 B2 JPH0336517 B2 JP H0336517B2
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JP
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beggiatoa
water
hours
culture
biomass
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Miraaru Furansowa
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Nestle SA
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Publication date
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Publication of JPH0336517B2 publication Critical patent/JPH0336517B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は静菌活性を有する物質の製造方法に関
する。 ヨーロツパにおける多くの硫黄温泉は微生物を
含み、それらは水流の弱い場所に集まる場合、ピ
レネーのフランス温泉、バレージユ（Bareges）
の温泉水に関連して「バレージヤン（baregine）」
の名を与えられた白〜淡灰色のゼラチン状物質を
形成する。バレージヤンは硫化水素を固定し、高
温に耐えることができる種々の細菌叢として規定
することができる。これら細菌のあるものは全体
として細菌叢を被覆する粘質物を分泌することが
できる。バレージヤンは生存菌と同じ位の死滅菌
を含む。 バレージヤンの治療性はしばらくの間認めら
れ、マツサージによるリユーマチ病の治療に対
し、そして或る種の皮膚病の治療に対しごく初期
段階で使用された。化粧用皮膚保護生成物の組成
分である。 その製造および集取は、自然条件で温泉水を使
用する種々の滴下方法により、特にその培養に関
する特許の主題であつた。同様の方法は現在フラ
ンスのThermes Nationaux d′ Aix−les−
Bainsで使用している。使用装置は頂部に溝を備
えた直立コンクリート壁より成る。きわめて近く
に位置する温泉からパイプラインによつて引いた
温泉水は溝を流れ、側壁をしたたり落ちる。１cm
の大きさのバレージヤンフレークはコンクリート
の粗い部分に付着する。バレージヤンのゼラチン
状フイルムは付着フレークから生長し定期的に硬
いブラシで壁をかき取ることにより集められる。
水およびこの壁の設置される建物の温度は温泉に
おける湧出温度すなわち43〜47℃の温度に近い。
生産収量は非常に低い。１月当り１m2につき約５
ｇの乾燥重量のバレージヤンにまでなる。更に気
象条件による多くの因子により変化し易い。 バレージヤンは微生物学および生化学研究の主
題であつた。これらの研究はH2Sおよび含硫化合
物の新陳代謝を示したが、バレージヤンの治療性
の原因は明らかにしなかつた。バレージヤン中で
同定された多数の微生物のうちBeggiatoaはしば
しば挙げられる。しかし刊行物から知られる
Beggiatoaの珍しい分離は決してバレージヤンか
らはなされず、その代りにスラツジおよび使用水
からなされている。更にこれらの分離は労多く且
困難であることがわかつた。分離微生物の培養で
はとりわけその脆さおよびその非常に高水分含量
のため非常に僅かな収量しか生産されなかつた。
２ｇの酵母エキス、0.1ｇの酢酸ソーダおよび活
性カタラーゼを含む１の培養基につき28℃で48
時間撹拌せずに生産した微生物新鮮重量1.2ｇの
公表値は特徴的とみなすことができる。 本発明の目的はバレージヤンと同じ静菌活性を
有する物質を工業規模で経済的に生産を可能にす
ることである。 本発明方法はBeggiatoaタイプの微生物が水性
栄養培地中で好気条件で撹拌しながら培養される
ことおよびバイオマスおよび／もしくは培養培地
を集めることを特徴とする。 Beggiatoaタイプの微生物のバイオマスおよび
生産された培地さえも静菌活性を示すことがわか
つた。微生物の脆さは烈しく撹拌される培地の烈
しい培養の障害ではないことおよびたとえ形成す
るフイラメントが多数の砕片に破壊されようとも
繁殖することもわかつた。従つて培地に接種前に
Beggiatoaタイプの微生物の接種材料を均質化す
ることが有利でさえある。 本明細書では、「Beggiatoa属の微生物」なる
表現よりむしろ「Beggiatoaタイプの微生物」な
る表現を使用する。Beggiatoa属は「滑走細菌
（glidingbacteria）」鋼、ミキソバクテラル
（myxobacterales）目、ベギアトアシエ−
（Beggiatoaceae）科のメンバーに属する
（Bergeys′Manual of Determinative Bacteri
ology、8th Edition、Waverly Press、
Baltimore、U.S.A.、1974、112〜114頁参照）。
当業界の権威であるこの著作からわかるように、
この属の微生物の分類は信頼できる報文が不足し
ているので非常に不確実である。当該微生物の不
確実性のために「属（genus）」のような正確な
科学術語を採用することは不適当であろう。従つ
て本発明に関しては、「Beggiatoaタイプの微生
物」なる表現は無色の繊維状細菌が滑走して移動
し、Beggiatoa属として分類されるような、細胞
鎖によつて形成される硫黄土壌および水の繊維状
細菌特性を網羅するものと理解される。 Beggiatoaタイプの微生物はバレージヤンから
分離して得ることが好ましい。このような分離は
或る方法を採用することにより可能であり、それ
を産生する菌株は培養することができ、且実際に
静菌活性を有することがわかつた。最後にその保
存問題さえ満足できるように解決できることがわ
かつた。 菌株を分離するためにバレージヤンの試料はゲ
ロース含有培地上におき、25〜50℃の温度で５〜
36時間インキユベートすることができる。その後
Beggiatoaタイプの微生物フイラメントの汚染物
を含まぬ帯を切り取り、初めのものと同じゲロー
ス含有栄養培地上に置かれる。インキユベーシヨ
ン、切取りおよびサブカルチヤー操作は２もしく
は３回反復することができる。 この方法は８菌株を分離するために使用されそ
れらは1978年７月12日にNational Collection of
Industrial Bacteria（NCIB）、アバデイーン、ス
エツトランドに寄託されそしてNCIB11418〜
11425番を与えられた。従つて本発明方法はたと
えばこれら８菌株の少くとも１種を使用して行な
うことができる。 分離に使用されるゲロース含有栄養培地は水１
につき１〜４ｇの酵母エキスおよび10〜20ｇの
寒天より成ることが好ましい。 同様に、微生物の培養に使用される水性栄養培
地は水１につき１〜４ｇの酵母エキス、0.1〜
0.3ｇの塩化カルシウムおよび0.2〜１ｇの酢酸ソ
ーダもしくはアンモニウムを含むことが好まし
い。使用水は硫黄温泉水であることが好ましい。
培養物を保護するためにカタラーゼもたとえば１
mlにつき５〜20国際単位（IU）の量で培地に添
加することができる。微生物は20〜50℃の温度で
５〜36時間６〜８のPH値で培養することができ
る。30〜40℃の温度で８〜10時間、中性PH値で培
養することが好ましい。 本発明方法により得た静菌活性物質はそれだけ
で皮膚マツサージに、もしくはたとえば皮膚用化
粧品の成分として使用することができる。バイオ
マスは乾燥形で保存することができる。その脆さ
およびその低乾物含量のために凍結乾燥により乾
燥することが好ましい。 説明のために供される次例は本発明の特徴およ
び範囲を一層良く理解させるであろう。次例にお
いて、「Beggiatoa」なる名称が組成物に代りに
使用されるが、「Beggiatoaタイプの微生物」な
る表現と同意語であると理解される。 例 １（菌株の分離） Thermes Nationaux d′ Aix−les−Bainsか
ら採取した新鮮バレージヤンのフレークを次の処
方により製造した20mlのゲロース培地を含むペト
リ皿の中心におく： 酵母エキス（Difco） ２ｇ 寒天（Bacto−Difico） 15ｇ Aixからの過温泉水 100ml 蒸溜水 900ml 皿は30℃で30時間オーブンの上部に入れる。次
にBeggiatoaの、そして滑走することによりこれ
ら微生物の運動の原因となる螺旋構造特性の存在
を検知するために顕微鏡（低倍率）下に検査す
る。あるものは肉眼でさえ見ることができる。顕
微鏡検査はBeggiatoaのフイラメントが汚染物を
含まぬ帯をも示す。これら帯のうち１個は殺菌メ
スを使用して切り取り、最初のものと同じ組成を
有する新寒天プレート上におく。新寒天プレート
の清浄表面にBeggiatoaのフイラメントを含む表
面を適用するために注意する。次に全体を30℃で
24時間再インキユベートする。切り取り、サブカ
ルチヤーおよびインキユベーシヨンの操作は２回
以上反復する。Beggiatoaの純粋培養物を得る。 例 ２（菌株の保存） 10菌株は例１記載の方法で分離する。それらは
相互にそのフイラメント、滑走速度および寒天上
のコロニー形が異る。それらは短期、中期もしく
は長期保存を要するかどうかにより３つの異る方
法で保存に成功する。 ２(1) 短期：プレートは４℃の冷蔵庫に保存す
る。ペトリ皿の密封に注意する。菌株は寒天が
乾燥する傾向があるので10日毎に移す。 ２(2) 中期：次の組成を有する半液状培地を調製
する： 酵母エキス ２ｇ CaCl2 0.1ｇ 酢酸ソーダ 0.5ｇ 寒 天 ２ｇ 過温泉水 1000ml 培地の殺菌後、黴カタラーゼを101u／mlの
量でそれに添加する。カタラーゼ溶液は直径
0.22μの顕微鏡的孔を有するミリポアフイルタ
ーで冷過して予め殺菌する。 Beggiatoaを含む寒天の小立方体を10mlの培
地を含む管に入れ、30℃でインキユベートす
る。Beggiatoaは管の上部で発育する。管は30
℃に３週間そのまゝおく。次に培養物は管当り
0.1mlの量で移す。 ２(3) 長期：24時間培養物を例３記載と同じ方法
で撹拌培地で生産させる。遠心分離後沈積物は
細菌リンゲル溶液で洗浄する。沈積物を凍結し
凍結乾燥する。固く密封した容器に入れ冷蔵庫
で数ケ月間保存する。再水和によりフイラメン
トの砕片は発育することができる。 例 ３（菌株の培養） ３(1) 接種材料 寒天の小立方体（５mm3）を例１の記載の方法
で得たプレートから切り取る。100mlの次の培
地を入れた500ml瓶に入れる： 酵母エキス ４ｇ 塩化カルシウム 0.2ｇ 酢酸アンモニウム １ｇ 過温泉水 1000ml この培地は6.6のPH値を有する。瓶は１分間
150回転で1.25cmの回転半径で回転する軌道撹
拌機に入れ30℃で160時間そのまゝおく。得た
培養物はソルバル オムニミキサー（Sorvall
Omnimixer）で無菌条件下に15〜30秒間均質
化する。均質培養物は接種材料を構成する。 ３(2) 培養 ５mlの上記接種材料を接種材料の調製に使用
したものと同一の培地100mlを入れた500ml瓶に
入れる。瓶は30℃で24時間軌道撹拌機でインキ
ユベートする。培養物１につきBeggiatoaの
乾物0.8ｇを得る。種々の菌株について操作を
反復し、そして既述の限定内で条件を変更する
ことにより、培養物１につき12.5〜２ｇの乾
燥Beggiatoaの収量を得る。 ３(3) 生育の測定 細菌培養に適用する比濁法の通例方法はその
フレーク様生育のためにBeggiatoaに対し使用
することができない。特別の場合に適応させ
る。培養物試料は２時間毎に採取し、ソルバル
オムニミキサーを使用し、均質化する。600n
ｍにおけるそれらの光学密度は分光光度計を使
用して測定する。均質化試料はごくゆつくり沈
澱し、信頼できる読みを得ることができる。生
育の示度はこうして細胞数に直接関連して得ら
れる。 ３(4) 乾燥重量の決定 オーブンでの通例乾燥はBeggiatoaの場合に
は再現性のある結果を与えない。これは恐らく
きわめて高い水分含量に基づくものであろう。
再現性のある結果を得るために400mlより決し
て少なくない培養物量が凍結乾燥により乾燥さ
れるのはこのためである。 ３(5) 静菌活性の測定 Public Health Loboratory Service
Comitteeが開発しBritish Med.J.408（1965）に
記載の静菌活性を評価する通例方法は、試験が
管内で行なわれるためにBeggiatoaの特別の場
合には満足できる結果を示さない。Beggiatoa
は厳密に好気性であるので試験管内で利用でき
る酸素濃度では不十分である。従つて方法は適
応化され、酸素の移動を増加させるために撹拌
瓶を使用する。 18mlの栄養ブロス（Nutrient Broth Difco）
を含む各50ml瓶の３シリーズを調製する。第１
および第２シリーズの瓶は病原性菌株の24時間
培養物0.4mlをそれぞれ接種する。病原性３菌
株、すなわちPsendomonas aeruginosa
ATCC10145、Escherichia coli ATCC11755
およびStafhylococcus aureus ATCC12600
を使用する。 静菌性生成物試料は例３(2)記載の方法である
が８時間だけで得た培養物を遠心分離して調製
する。遠心分離バイオマスは均質化し、遠心分
離後に残つた上澄相の容積に等しい容積の生理
的溶液に再サスペンドする。バイオマスを含む
生理的溶液および上澄相は各２ml試料に分割す
る。 均質化バイオマスを含む２mlの生理的溶液は
第１シリーズの瓶に加える。２mlの生理的溶液
のみを第２シリーズの瓶に加える。均質化バイ
オマスを含む２mlの生理的溶液は病原性菌を接
種しなかつた第３シリーズの瓶に加える。 瓶は軌道撹拌機で37℃でインキユベートす
る。600nｍにおける光学密度は16時間後に測
定する。第１、第２および第３シリーズの相当
する瓶の光学密度測定はそれぞれのパラメータ
ーＡ、ＢおよびＣで表わす。Ｂから差引いた差
Ａ−Ｃを次にＢで割り、100をかけたものはバ
イオマスの静菌活性を阻止％として与える。 上澄相の静菌活性は同じ方法で均質化バイオ
マスを含む生理的溶液２mlの代りに上澄相２ml
を第１および第３シリーズの瓶に加えて決定す
る。 結果は次表に示す： 【表】 例 ４（比較） 天然バレージヤンの静菌活性は例３(5)記載の方
法で比較のため測定する。P.aeruginosa、S.
aureusおよびE.coliそれぞれについて100％、83
％および96％の阻止％が16時間インキユベーシヨ
ン後に観察される。換言すれば、本発明によるバ
イオマスの静菌活性はバレージヤンとほとんど同
じ強さである。これは本発明によるバイオマスが
工業的に高収量で生産でき、一方バレージヤンは
ゆつくりで且非常に少量でしか得ることができな
いことを考えると注目すべき結果である。本発明
による上澄の活性は、より低いけれどもそれにも
拘らず興味がある。 例 ５（NCIB菌株） ８菌株を例１記載の方法で分離した。これらの
８菌株はスコツトランド アバデイーンの
National Collection of Industrial Bacteria
（NCIB）に1978年７月12日に寄託し、上記のよ
うにNCIB11418〜11425番を与えられた。これら
の各菌株はBergey′s Manual、第８版（1974）
の第113頁、第１欄、第８−19行記載の
Beggiatoa属のものと同じ性質、即ち Γ菌体は無色、フイラメント0.9−1.8／3.6−140μ
ｍ、滑走運動をする Γグラム陰性菌 Γ複合培地に生育 Γ硫化水素の存在で生育した時、菌体は硫黄粒子
含有する Γ好気性ないし微好気性 を有することが分つた。これらの菌株はさらにそ
の生育特性、寒天上および液体培地に培養した時
のその形態およびその静菌活性で特徴づけること
ができる。 次表は例３(2)記載の方法でこれらの各菌株を培
養して５、10および24時間後に得た培養物の光学
密度、24時間後に得たバイオマスおよび病原性３
菌株、P.aeruginosa、S.aureusおよびE.coliにつ
いて８時間の培養後に得たバイオマスの静菌活性
を示す。 【表】 形 態 NCIB 114 18 寒天上で：白色中心と半透明ヘリを有する直径８
〜15mmの大きな分離コロニーを形成する。顕微
鏡検査（X100）：コロニーははつきり見える、
固く巻いた螺旋により形成される。 液体培地で：均質培養体。顕微鏡検査（X400）：
長いフイラメントは80×1.8μ、時々短かい明白
な桿菌により形成される。集合せず。屈折性含
有物ほとんどなし。 NCIB 114 19 寒天上で：拡散ヘリを有する直径４〜８mmの白色
分離コロニーを形成する。厚いストランドがコ
ロニーの中心から星形に放射状に伸びるがヘリ
には達しない。顕微鏡検査（X100）：コロニー
のヘリは固く巻いたフイラメントにより形成さ
れる。 液体培地で：均質培養体。顕微鏡検査（X400）：
非常に明白な収縮により分離された3.6×0.9μ
の非常に短かい分離フイラメント。屈折性含有
物なし。集合体を形成。 NCIB 114 20 寒天上で：ふちとりしたヘリを有する直径２〜５
mmの平らな不透明分離コロニーを形成する。顕
微鏡検査（X100）：コロニーは生育不十分の螺
旋形のフイラメント砕片により形成される。 液体培地で：均質培養体。顕微鏡検査（X400）：
フイラメントなし。少量の屈折性含有物を含む
９×1.4μの長い桿菌。 NCIB 114 21 寒天上で：菌株NCIB 114 19に非常に似た拡散
ヘリを有するがより白色の、直径４〜７mmの分
離コロニーを形成する。コロニーのヘリは半透
明である。顕微鏡検査（X100）：見える螺旋な
し。 液体培地で：均質培養体。顕微鏡検査（X400）：
菌株NCIB114 20により提示されたものと同じ
イメージ。フイラメンなく、少量の屈折性含有
物を含む18×1.4μの長い桿菌。集合体なし。 NCIB 114 22 寒天上で：分離コロニーを形成せず。全表面を半
透明ミコイド（mycoid）ストランドがおおう。
顕微鏡検査（X100）：ストランドが数個のフイ
ラメントにより形成される。 液体培地で：均質培養体は６時間後から小数の小
集合体を示す。顕微鏡検査（X400）：90×1.4
〜1.8μの長い分離フイラメント。フイラメント
は明瞭な収縮により長い単位に分割される。屈
折性含有物ほとんどなし。 NCIB 114 23 寒天上で：菌株NCIB114 22に相似。分離コロニ
ーなし。濃密な一層はつきり見えるミコイドバ
ンド。 顕微鏡検査（X100）：きわめて多数のフイラメ
ントにより形成されるため一層明瞭なストラン
ド 液体培地で：大きなフレーク（集合体）を形成す
る。顕微鏡（X400）：非常に明かな収縮により
分節に分割される。菌株NCIB114 22のものよ
りはるかに短かいフイラメント。長さ９〜10×
1.8μ。屈折性含有物は５時間後に非常に急速に
現れる。 NCIB 114 24 寒天上で：菌株NCIB114 23に相似。分離コロニ
ーなし。ミコイド ストランド。顕微鏡検査
（X100）：ストランドはきわめて多数のフイラ
メントにより形成される。 液体培地で：長いフレーク（集合体）を形成す
る。顕微鏡検査（X400）：長い束を形成する
140×1.8μの長いフイラメント。可視収縮なし。
屈折性含有物遅く発生（10時間後）。 NCIB 114 25 寒天上で：直径２〜６mmの不透明分離コロニーを
形成する。顕微鏡検査（X100）：コロニーは分
離細胞より成り、そして固い螺旋を形成するフ
イラメントにより形成される。 液体培地で：均質培養体。顕微鏡検査（X400）：
４×14μの短かい均質フイラメント。屈折性含
有物微量。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 静菌活性を有する物質の製造方法において、
    １種又はそれ以上のBeggiatoa属の菌株
    NCIB11418〜11425を水性栄養培地中PH６〜８の
    条件下に20〜50℃で５〜36時間培養し、ついでバ
    イオマスおよび／もしくは培養物を集取すること
    を特徴とする、上記製造方法。 ２ ゲロース栄養培地は水１につき１〜４ｇの
    酵母エキスおよび10〜20ｇの寒天より成る、特許
    請求の範囲第２項記載の方法。 ３ 微生物を30〜40℃の温度で８〜10時間そして
    中性PHで培養する、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 ４ 水性栄養培地は水１につき１〜４ｇの酵母
    エキス、0.1〜0.3ｇの塩化カルシウムおよび0.2〜
    １ｇの酢酸ソーダもしくは酢酸アンモニウムを含
    む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 水は硫黄温泉水である、特許請求の範囲第４
    項記載の方法。
JP14040979A 1978-11-01 1979-10-30 Production of antiibacterial active substance Granted JPS56109589A (en)

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CH1123078A CH634877A5 (fr) 1978-11-01 1978-11-01 Procede de preparation d'une substance presentant une activite bacteriostatique.

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JPS56109589A JPS56109589A (en) 1981-08-31
JPH0336517B2 true JPH0336517B2 (ja) 1991-05-31

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CS (1) CS213399B2 (ja)
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DK (1) DK149781C (ja)
ES (1) ES485566A1 (ja)
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HU (1) HU180030B (ja)
IL (1) IL58451A (ja)
IT (1) IT1164025B (ja)
LU (1) LU81771A1 (ja)
MX (1) MX5937E (ja)
MY (1) MY8400264A (ja)
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SE (1) SE443996B (ja)
SG (1) SG34583G (ja)
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CA1123355A (fr) 1982-05-11
HK11384A (en) 1984-02-17
FR2440403A1 (fr) 1980-05-30
IL58451A0 (en) 1980-01-31
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