JPH0259647A - 自動蛍光光度計を用いる分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、自動蛍光光度計に係り、特に臨床検査用自動
分析装置の検出計として用いるに好適な自動蛍光光度計
に関する。

〔従来の技術〕

血液中の微量成分、例えば病原体、薬物、ホルモン、免
疫成分等を分析測定する場合には、蛍光光度計を測定器
として用いることがしばしば行われる。蛍光光度計は、
励起光を被検試料に照射しそこから発せられる二次光を
測定するものである。

それ故被検試料が液体の場合は検出される蛍光がどうし
ても微弱となるため、光検出器および光源には特定のも
のが使用される。このような蛍光光度計は、吸光光度計
に比して安定度が劣るため、従来は１例えば特開昭５９
−１２５０４３号に示されているように、蛍光側光学系
の光検出器と共に励起側光学系に励起光監視用モニタ光
検出器を設けて安定度を向上する工夫がなされている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の蛍光光度計は、測定濃度領域が２桁程度であり、
それ以上の濃度範囲を測定したい場合には検出器である
ホトマルチプライヤ−の高圧電源値を変えることによっ
て検出感度を変えて再測定しなければならないという面
倒さがあった。このようなダイナミックレンジの狭さは
測定原理上解決することが困難な問題の１つである。

また、蛍光光度計は、ノイズが大きく、ドリフトの影響
が大きいため、未知試料を次々と反応させて反応液を測
定する臨床用自動分析装置の検出計として組込むには、
充分な副室精度が得られ難いという問題があった。

本発明の目的は１反応液の連続的な自動測定に適した自
動蛍光光度計を提供することにある。

本発明の他の目的は、適正な濃度領域での蛍光測定を迅
速に行い得る自動蛍光光度計を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、蛍光測定値へのドリフトの
影響を低減し得る自動蛍光光度計を提供することにある
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明では、一連の反応容器を所定時間毎に測光位置に
自動的に位置づける反応容器列移送装置と、励起側光学
系および蛍光側光学系とを組み合わせている。１つの課
題解決手段は、蛍光用光検出器からの出力信号を基準信
号と比較する比較器と、その蛍光用光検出器からの出力
信号を異なる利得で増幅し得る複数の増幅器と、これら
複数の増幅器のそれぞれに対応して設けられたスイッチ
と、前記比較器からの信号に応じてスイッチを選択して
適正な増幅器を動作せしめる制御装置とを設けることに
よって、測定時間を短縮できるようにした。

もう１つの課題解決手段は、励起側光学系に励起光路を
遮断し得るシャッタを設け、反応容器列の間欠移送運動
毎にシャッタを励起光路遮断状態と励起、光路開放状態
とに維持させるシャッタ駆動装置を設け、かつ励起光路
が遮断されている間に得られる蛍光用光検出器の第１の
出力信号値を記憶しておき、励起光路が開放されている
ときに得られる蛍光用光検出器の第２の出力信号値を記
憶していた第１の出力信号値で補正する制御装置を設け
たことを特徴とする。

〔作用〕

蛍光用光検出器の出力は通常前置増幅器（プリアンプ）
に導かれる。プリアンプと制御装置であるコンピュータ
の間にはアナログ・デジタル変換器を設けるが、ビット
数の少ないものを採用するのが得策である。１０５のダ
イナミックレンジを実現するために、プリアンプとアナ
ログ・デジタル変換器の間に利得（ゲイン）の異なる複
数の増幅器（アンプ）を並列配置し、検出された蛍光強
度に応じてスイッチでアンプを選択するようにした。蛍
光測光時間は長くとれないので、アンプの選択は迅速に
行わねばならない。そこで、蛍光潤定開始にあたってプ
リアンプの出力を比較器に導き、そこで基準電圧と比較
し、比較結果を制御装置に伝えるようにした。制御装置
はそれを受けてスイッチを駆動し測定レベルに適合した
アンプを選択する。このように、アナログ・デジタル変
換器を介さずに適正な感度のアンプを自動的に選択でき
るので、迅速に動作させ得る。

蛍光光度計のドリフトの原因の主なものは、光源のドリ
フトの他に、光検出器である光電子増倍管（ホトマルチ
プライヤ−）の暗電流のドリフト、およびプリアンプの
オフセット電圧、電流である。

光源のドリフトについては従来行われていたように、励
起光の１部をドリフトの少ない半導体光検知器によりモ
ニターし、その出力と、蛍光側の検知器ホトマルチプラ
イヤ−の出力との比をとることにより補正することがで
きる６またホトマルチプライヤ−の暗電流及びプリアン
プのオフセットについては、測定していない時に励起光
路をシャッタで遮断することを利用することによって対
策できる。

すなわち、励起光路を遮断している間に得られる信号は
、光検出器の暗電流、迷光に基づく信号。

プリアンプのオフセット信号を含む。そこで、各被検試
料の反応液の蛍光測定の都度、あらかじめシャッタで励
起光路を遮断したときの出力信号を測定して記憶してお
き、蛍光測定時に得た信号値から記憶値を差引くことに
より、実質的にドリフト分を排除できる。この動作は各
測定サイクル毎に行われるので、ドリフトによる影響を
極めて低減できる。シャッタは、光源と励起側分光器の
間に設けるのが好ましい。

光源によるノイズの影響を低減することも大切である。

この場合、励起光の一部を半導体光検知器で受けた出力
信号と、蛍光を測定するホトマルチプライヤ−の出力信
号を別のアナログ・デジタル変換器２台を使用して同時
に取込み、その比を取ることにより、照射時間を短くし
ても光源のノイズの影響を少なくする。

〔実施例〕

本発明を適用した免疫自動分析装置の構成を第２図に示
す。

第２図において、回転型円板状の反応ディスク２の円周
上に複数個の反応容器１を配列し、反応ディスク２を駆
動軸３を中心にして駆動機構によ、り間欠的に回転する
。反応ディスクは５反応容器列を１ピツチずつ進ませた
り、数ピッチ−気に回転される。蛍光測光用の反応容器
１は、透光性材料であるガラス又はアクリル樹脂からな
る。蛍光光度計６の測光位置は、反応恒温槽５の内部に
ある。

光度計６は、複数検知器を有する多波長同時測光形であ
り、反応容器１と相対し、反応ディスク２上の測光位置
にある反応容器が、光源ランプからの励起光に照射され
るように構成されている。

所定波長の励起光は反応容器の上方又は底面から反応容
器内の液に照射され、液から発光された蛍光は反応容器
側面から取り出され所定波長が選択されて光電検出器で
ある光電子増倍管により検出される。このような光度計
の光学系自体は周知の構成である。反応ディスク２の移
送動作により、次々と反応容器が測光位置に位置づけら
れ、光度計６によって各試料に基づく蛍光強度が測定さ
れる。光度計６の出力は、マルチプレクサにより現在必
要な測定波長の信号が選択され、Ａ／Ｄ変換器を介して
中央処理装置に取り込まれて、ＲＡＭに記憶される。

試薬容器１２は特定の分析項目に対する第一試薬、第二
試薬等をグループとした試薬容器群１１として配置する
。試薬ディスク１０及び試料ディスク７を駆動軸９の周
りに回転し、試薬容器１２及び試料容器８を１ピツチま
たは指定したピッチ数だけ回転するように構成する。ま
た試薬容器１２及び試料容器８をそれぞれ別個に分析対
象に対応して取り付け、取り外し可能にしてセットする
。また試料容器８の列を試料恒温槽に、試薬容器群１１
の列を試薬保冷槽１３に別個に配置して所定温度を保つ
。

試料あるいは標準試料液又は試薬のそれぞれを試料容器
８又は試薬容器１２から１反応容器１に分注する為にピ
ペッティング機構１４を設ける。

ピペッティング機構１４は回転アーム１４ａの先端にプ
ローブ１５を設け、プローブ１５により試料又は試薬を
吸引し、プローブ１５を回転移動させて試料および試薬
分注位置Ａにある反応容器１に吐出する。その際、分注
される試料容器８又は試薬容器１２を、ピペッティング
機構１４のプローブ１５の移動軌跡上に配置するように
し、かつ駆動軸９により試料ディスク７又は試薬ディス
ク１０を回転して移動軌跡上に該当する容器が停止する
ようにする。

まず、試料ディスク７上の試料容器８からピペッティン
グ機構１４により所定量の・試料をプローブ１５で吸引
し、反応ディスク２上の指定された位置Ａにおいて反応
容器１に吐出する。吐出後、ピペッティング機構１４の
プローブ１５をプローブ洗浄装置１６で十分に洗浄し、
試料液のキャリーオーバによる汚染を防ぐ。４は反応容
器洗浄部である。

次に反応ディスク２を時計方向に１容器分（１ピツチ）
歩進回動する。また、試料ディスク７を次のピペッティ
ング位置に回転する。この操作を順次くり返すことによ
り、始めに試料液を必要数だけ反応容器１の列に移送分
注する。次に試薬液を試薬容器群１１の試薬容器から同
様にピペッティング機構１４で吸引し１反応容器１に分
注する。

分注サイクルにより試薬容器群の試薬系列の第１試薬か
ら順次移送分注する。このようにして反応ディスク２に
指定した回転を行わせ、試料と試薬とを反応容器１にバ
ッチ分注する。

このようにして反応ディスク２は所定の回転をして分析
動作を続ける。分析の最後には呈色試薬が試薬容器群１
１の試薬容器１２からピペッティング機構１４で吸引さ
れた反応容器１に分注位置Ａ点で分注される。これによ
り呈色反応が進行する。蛍光光度計６の位置まで反応容
器１が進行すると反応容器１の底面より励起光を照射し
、反応容器側面より蛍光を取り出し測定するようになっ
ている。

蛍光光度計６を第１図により詳細に説明する。

メタルハライドランプからなる光源１７より発する光は
、レンズ１８．励起側分光器の入射スリット１９を通り
凹面回折格子２０により分光される。

分光された光はミラー２１より反射され、出射スリット
２２より単色光が選択される。その光の約１％は半透過
ミラー２３により反射され、励起光のモニター用半導体
光検出器２４に受光されるようになっている。半透過ミ
ラー２３で透過した大部分の光はトロイダル凹面ミラー
２５により直角に曲げられ、駆動機構３ａにより回転さ
れる反応ディスク２の円周上に配列された反応容器１の
中に入っている被測定試料２６に励起光として照射され
る。

被測定試料の反応液２６より２次光として発生する蛍光
は、反応容器１の側面よりレンズ２７より集光され、干
渉フィルタ２８により単色光にされレンズ２９によりホ
トマルチプライヤ−３０の光電面に集光される。ホトマ
ルチプライヤ−３０の出力の光電流はプリアンプ３１に
より電流を電圧に変換され、プリアンプ３１の出力は、
１０倍に増幅するアンプ３２と１００倍に増幅するアン
プ３３、及び電圧の異なる２つの基準電圧３４゜３５と
比較するコンパレータ３６の入力となる。

感度選択部５０におけるプリアンプ３１．アンプ３２．
３３の出力は各々に対応するアナログスイッチＳｌｌ　
３２．Ｓ３で構成されるマルチプレクサ３７に入力され
、その出力はアナログ−デジタル変換器（以下ＡＤ変換
器という）３８によりデジタル化されコンピュータ４３
に取込まれる。

一方励起光モニタ用の半導体光検出器２４の出力の光電
流はモニター用のプリアンプ３９により電流−電圧に変
換され専用のＡＤ変換器４０によりデジタル化されコン
ピュータ４３に取込まれる。

一方、コンパレータ３６は、プリアンプ３１の出力電圧
のレベルを各基準電圧３４．３５と比較し、大小関係を
示す信号をコンピュータ４３に送る。

コンピュータ４３は大小関係の判断結果によりマルチプ
レクサ３７のアナログスイッチＳＬ、　５２１８３のい
ずれかを選択動作させるようになっている。コンピュー
タ４３は、機構駆動用インターフェース４１を介して反
応ディスク２の駆動機構３ａを駆動することもできる。

４２は試薬ディスク、ピペッティング機構等の他の機構
系である。

レンズ１８と励起側分光器の入射スリット１９との間に
はソレノイド４４の駆動によって光路を開閉する動作を
するシャッタ４５が設けられている。また、この分析計
は、分析条件、依頼項目選択情報などを入力するキーボ
ードパネル４６２分析結果等を表示及び出力するＣＲＴ
デイスプレィ４７、プリンタ４８を備えている。

第１図の蛍光光度計の測定タイミングを第３図を参照し
て説明する。この実施例の装置は１サイクル１８秒単位
で動作している。先ず反応ディスク２がサイクルの最初
から１秒経過後に１秒間で１ピッチ回転する。試薬ディ
スク１０は６．５秒経過後、試薬ピペッティングの位置
まで必要な試薬を回転移送し、ピペッティング機構１４
は第３図に示すタイミングで回転及び上下して試薬を反
応ディスク２上の反応容器１の中に分注する。

蛍光光度計６内のシャッタ４５は、各サイクルの１６秒
から１８秒の期間だけ光路を開けてあすその他の時間は
励起光路を遮断している。シャッタ４５が閉じている状
態の時マルチプレクサ−３７はスイッチＳｌ、ｓ２．Ｓ
ａの順序でＯＮし、ＡＤ変換器３８は、プリアンプ３１
の出力、アンプ３２．アンプ３３の出力をそれぞれ取り
込んでデジタル信号に変換し、ＣＰＵ４３は、これらの
信号を順次取込み、ＣＰＵ４３内に組込んであるメモリ
にそれぞれ記憶しておく。これらの値はシャッタ４５が
閉じているタイミングのため、光検出器の暗電流及び各
アンプのオフセット、装置かられずかに洩れて光検出器
に入って来る迷光分の総和である。ここでは、それぞれ
のＡＤＣ変換値を丁０５１　？　Ｉ　ｏｓ４．　Ｉ　ｏ
ｓ３とする。また励起光のモニタ検出器のＡＤ変換器４
０での取込みの値をＩ　ｓｏｓ　とする。この値は励起
光のモニタ側の検出器の暗電流、迷光、アンプ３９のオ
フセット分の総和である。

次に、１６秒経過した時点でシャッタ４５を開くと、Ｃ
ＰＵ４３は、コンパレータ３６の出力を読み取り、プリ
アンプ３１の値のレベルがどの範囲にあるか、すなわち
マルチプレクサ３７のＳｔ。

ＳＺ、Ｓａのどのスイッチを選択してＡＤ変換すればよ
いかを判断し、それによりＳｌｅ　Ｓ２ｙ　Ｓａに対応
するアンプを選択するようになっている。

Ｓｌを選んだ時（すなわち蛍光量が大きい時）の値をＩ
ＳＩとし、ＳＺ、及びＳａを選ん、だ時の値をそれぞれ
Ｉ　５！、　Ｉ　ｓｓとする。励起光のモニタ側のプリ
アンプ３９の出力をＩＭとすると、マルチプレクサ３７
のスイッチｓｔ、ｓ２．ｓａを選択した時の被測定量の
蛍光量に比例した出力Ｆｌ、Ｆ２．Ｆ３は次のように計
算する。

Ｆ　１＝　（Ｉ　ｓｘ−Ｉ　ｏｓｔ）／　（Ｉ　ｓ−Ｉ
　ＭＯＳ）Ｆｚ＝（Ｉｓｚ　−ｌ０３２）／（ＩＮ　−
ＩＭＯ８）・（１０）Ｆａ＝（Ｉｓａ　　Ｉｏｓ３）／
（ＩＭＩＭｏｓ）・（１００）このようにして被測定試
料の蛍光量を測定する。

自動分析の場合、最初に既知濃度の試料を測定し上記の
ような計算をして、それをメモリーの中に記憶しておき
、それを検量線として、未知濃度試料を測定して濃度を
得るようになっている。

第４図は、本実施例の分析装置に通電開始してから３０
分経過以降の装置のドリフトの状態を示す図である。第
４図における曲線Ａのデータは、蛍光側の信号のみを経
時的にプロットしたものである。すなわち、曲線Ａは、
光源のドリフト、検出器の暗電流および感度のドリフト
、プリアンプのオフセットのドリフト等をすべて含む。

曲線Ｂのデータは、励起光のモニタ側信号と蛍光側信号
の比を計算した後のドリフト量である。また、曲線Ｃの
データは、１８秒毎に１．５秒シャッタを開き、残り１
６．５秒はシャッタを閉じ、さらにシャッタを閉じてい
る間に検知器の暗電流、プリアンプのオフセットを測定
して補正し、励起光と蛍光の比を計算したもの、すなわ
ち本発明を適用した測定方式で測定したドリフト量であ
る。この結果、Ａは１時間あたり約２％のドリフト量で
あり、Ｂは１時間あたり約０．８　％のドリフト量であ
り、Ｃは１時間あたりのドリフト量を０．５　　％以下
におさえることができた。

第５図は、励起光モニタ側ａと蛍光側すの出力信号をア
ナログ記録計で記録したものである。ａとｂの記録を比
較すると周波数の高いノイズと。

１〜２秒周期のゆっくりしたノイズがあることがわかる
。蛍光側信号すに見られる速いノイズは蛍光側の光検知
器のホトマルチプライヤ−のノイズによるものであり、
ａ、ｂ両方に見られる１〜２秒のノイズは、励起光、蛍
光側共、同じ周期で変化しており、このノイズは、光源
が放電管であるための「ゆらぎ」と考えられる。この信
号を１つの例えば変換時間１秒のＡＤ変換器で、励起光
。

蛍光側を順次測定する時分割で変換し、その比を計算し
ても速いノイズについては平均化できるが。

１〜２秒の周期すなわち光源のノイズによる影響は何回
か測定するとバラツキがあり取り除くことができない。

本実施例では、励起光モニタ用専用および蛍光用専用の
ＡＤ変換器をそれぞれ設け。

同時に信号を取込み、その比を取ることにより、１〜２
秒の遅いノイズの影響を取り除く、実際の測定結果では
、１秒の変換時間のＡＤ変換器１個で、励起光と蛍光を
順次測定した結果では、０．５％のバラツキがあったも
のが、ＡＤ変換器を２個使用し、同時に取り込むことに
より０．１　％以下におさえることができた。

本装置での蛍光側の光検知器であるホトマルチプライヤ
−のアノードの出力電流範囲は１×１０−δ〜１×１０
″″６Ａである。ｌＸ１０″″♂Ａに相当する濃度では
、その濃度の１　／　１０．０の分解能（Ｓ／Ｎ＝１０
０以上）を必要とする。これは測定濃度範囲を広くする
ため、すなわちダイナミックレンジを１０”倍確保する
ためである。とくに濃度の高い時はホトマルチプライヤ
−に１×１０″″５Ａの電流を流すことになる。第６図
は、この電流に相当する光を連続に与えた時ａと、１８
秒毎に光を１．５秒間ずつ与えたときｂのホトマルチプ
ライヤ−のドリフトを示す図である。連続照射ａでは４
時間に約２％のドリフトであり、１８秒に１．５秒の照
射すのときは４時間で０．３　％におさえることができ
る。この結果によりできるだけ短い時間、すなわち測定
する時だけホトマルチプライヤ−に光を与える方法を取
るとドリフトを小さくすることができる。しかしノイズ
を平均化して安定化するためには約１秒間の平均化が必
要である。

本装置ではシャッタを開いてがら安定するための時間を
含め０．５　秒経過した後にＡＤ変換時間１秒間を確保
し、合計１．５秒間蛍光を照射するだけにし、ホトマル
チプライヤ−のドリフトをおさえている。

１０５のダイナミックレンジを１つのＡＤコンバータで
実現するには２１８ビット以上のＡＤコンバータが必要
であり、このような変換器は市販されていないため、非
常に高価なものとなる。本実施例で使用したＡＤコンバ
ータは一般に市販されている１６ビツトの積分型のＡＤ
コンバータである。この１６ビツトのＡＤコンバータを
使用して。

分解能を上げるために、複数の感度の異なるアンプすな
わち、ゲイン１倍、１０倍、１００倍のアンプを使用し
ている。被測定試料の濃度により、このゲインの異なる
アンプのいずれかを使用する。

この選択にはＡＤ変換してからどのアンプを使用するか
を決めるのではなく、コンパレータ３６を設けて、瞬時
に選択可能とし、アンプ選択のＡＤ変換時間をはぶくた
め測定時間をできるだけ短くするようにしている。これ
により安価でしがもダイナミックレンジの広い測定が可
能となり、しかもアンプの選択は瞬時にできるため短い
時間で測定可能となる。これは、シャッタを開ける時間
を少なくするのにも役立つ。

〔発明の効果〕

以上説明したように本発明によれば、反応液の自動測定
に適した構成の自動蛍光光度計を実現できるから、その
効果は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は第２図の実施例における蛍光光度計の構成を示
す図、第２図は本発明の一実施例である自動分析装置を
説明するための概略平面図、第３図は第２図の実施例に
おける主要部の動作タイミングを示す図、第４図は蛍光
光度計におけるドリフトの状況を示す図、第５図は蛍光
光度計におけるノイズをアナログ記録計で記録した例を
示す図。 第６図はホトマルチプライヤ−に連続的および断続的に
光を照射したときのドリフトの状況を示す図である。 １・・・反応容器、２・・・反応ディスク、６・・・蛍
光光度計、１４・・・ピペッティング機構、２４・・・
モニタ用検出器、３０・・・ホトマルチプライヤ−１３
１゜３９・・・プリアンプ、３２．３３・・・アンプ、
３６・・・コンパレータ、３７・・・マルチプレクサ、
３８゜４０・・・ＡＤ変換器、４３・・・コンピュータ
。 第 固 羊 固 姓Ａ吟町 〔ｈと〕 ２３４５Ａ Ｂ！ｒ＋”ｌ　　Ｌ−Ｓ） 茅 固 ／２３ 香ＬＡ　吟声ワ　　［ｈト７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一連の反応容器を所定時間間隔で測光位置に自動的
   に位置づける反応容器列移送装置と、上記測光位置に位
   置づけられた反応容器に励起光を照射する励起側光学系
   と、上記測光位置にある反応容器内の反応液からの蛍光
   を蛍光用光検出器で検出する蛍光側光学系とを備えた自
   動蛍光光度計において、上記蛍光用光検出器からの出力
   信号を基準信号と比較する比較器と、上記蛍光用光検出
   器からの出力信号を異なる利得で増幅し得る複数の増幅
   器と、これら複数の増幅器のそれぞれに対応して設けら
   れたスイッチと、上記比較器からの信号に応じて上記ス
   イッチを選択して適正な増幅器を動作せしめる制御装置
   と、を設けたことを特徴とする自動蛍光光度計。 ２、一連の反応容器を所定時間間隔で測光位置に自動的
   に位置づける反応容器列移送装置と、上記測光位置に位
   置づけられた反応容器に励起光を照射する励起側光学系
   と、上記測光位置にある反応容器内の反応液からの蛍光
   を蛍光用光検出器で検出する蛍光側光学系とを備えた自
   動蛍光光度計において、上記励起側光学系に励起光路を
   遮断し得るシャッタを設け、上記反応容器列の間欠移送
   運動毎に上記シャッタを励起光路遮断状態と励起光路開
   放状態とに維持させるシャッタ駆動装置を設け、上記励
   起光路が遮断されている間に得られる上記蛍光用光検出
   器の第１の出力信号値を記憶し、上記励起光路が開放さ
   れているときに得られる上記蛍光用光検出器の第２の出
   力信号値を記憶していた上記第１の出力信号値で補正す
   る制御装置を設けたことを特徴とする自動蛍光光度計。 ３、特許請求の範囲第２項記載の蛍光光度計において、
   上記励起側光学系に励起光監視用モニタ光検出器を設け
   、上記蛍光用光検出器の出力信号をデジタル信号に変換
   する第１のアナログ・デジタル変換器と上記モニタ光検
   出器の出力信号をデジタル信号に変換する第２のアナロ
   グ・デジタル変換器とを設け、両光検出器の出力信号を
   上記第１および第２のアナログ・デジタル変換器へ同時
   に取込むように構成したことを特徴とする自動蛍光光度
   計。