JPH0290041A - 分光分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、液体等の被検体中に含まれる被検物質の濃度
を測定するための新規な分光分析方法及び装置に関する
。

さらに詳細には、被検体に光等の電磁波を照射して被検
体を透過した透過光等の電磁波又は被検体から発生した
反射光等の電磁波の強度を測定することによる分光分析
方法及び装置であって、被検物質の濃度の広範囲にわた
る安定した分析が容易で、ざらには被検物質の種類に応
じた精度の高い分析が容易な汎用性に冨む分析方法及び
分析装置に関する。特に、酵素免疫測定法（以下ＥＩＡ
ともいう）のごとく、活性な酵素を基質に対して作用さ
せることによって生じる発色物の濃度を分析することに
よりその酵素の１の測定する場合笠に適した分析方法及
び装置を提供するものである。

［従来技術］ 一般に分光分析においては、例えば被検液に・光を照射
して（７られる透過光の強度を吸光度として測定する吸
収分光光度法の如く、あらかじめ特定された測定波長の
光りについての強度を測定することによって分析が行わ
れる。

これまでの分光分析では、濃度を測定すべき物質の分析
に適した測定波長の選定として、測定者が前もって標準
液を調製して濃度と吸光度の関係等の検品線を波長伯に
評価して最適と思われる波長をその都度選ぶ手作業によ
る工程を必須としていた。

尚、被検物質の濃度の領域に応じて、例えば高濃度ダ１
域と低濃度領域とで、吸光度測定のための測定波長を変
えて分析する方法も知られている（例えば、特開昭６１
−２０２１４４号公報参照）。

従来の方法における測定波長は、被検物の種類に応じて
、測定者等がその都度前もって選定しておく必要があっ
た。

また、２種以上の被検物質を含む被検液を用いて、それ
ら２種以上の被検物質の濃度を定量する吸収分光光度法
も知られているが、その場合にも核被検物質に対応した
吸光度測定のための測定波長の選定を、前もってその都
度測定者が行わねばならなかった。この場合には、各々
の被検物質の吸収スペクトルが合成されて１ｑられるの
で、最適な測定波長の選定が特に困難であって、そのた
めに効率的に精度よく分析することが容易ではなかった
。

例えば、これまでのＥＩＡでは、ハロゲンランプを光源
として用い、発色物を含む被検液に光を照射して得られ
た透過光を、あらかじめ選定された測定波長の光のみを
透過するような色フィルターに透過せしめることによっ
て吸光度の測定が行われていた。前記の如く、あらかじ
め選定された別の測定波長での測定を行う場合には、前
もって準備しておいた色フィルターを別の測定波長のみ
を透過するものに交換したりすることが必要であった。

［発明が解決しようとする課題１ 本発明は、被検物質を含む被検体に光等の電磁波を照射
して被検体を透過した電磁波又は被検体から発生した電
磁波に関する測定波長の電磁波の強度を測定する分光分
析において、被検物質の測定に適した測定波長を選定す
る操作を簡略化することを目的としている。

即ち被検物質を標準濃度で含有する液状等の標準検体を
調製し、その標準検体に電磁波を照射して透過又は標準
検体から発生した電磁波のスペクトルパターンを測定し
、かかるスペクトルパターンを用いて計測に必要な精度
を確保しかつ広い測定レンジとするように自動的に測定
波長を選定することを可能にした分光分析法及び装置を
提供することを目的とするものである。

特に、ＥＩＡ等において、酵素と基質１発色剤の組合せ
が変った場合や濃度領域が変った場合でも、その都度に
前もって測定波長を選定して早漏しておいた色フィルタ
ーの交換等を行うのではなくて、自動的に測定波長を選
定してその測定波長での電磁波の強度の測定を自動的に
行うことを可能にした分光分析方法及び装置を提供する
ことを目的とするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、かかる課題を解決するために鋭意研究した
結果、標準検体を透過し又は標準検体から発生した多数
の波長をもつ電磁波の実質上全波長についての強度のス
ペクトルパターンを測定し、そのスペクトルパターンを
記憶手段に記憶し、その記憶手段に連結された演算手段
によってかかるスペクトルパターンから測定波長を自動
的に選定することが有効であることを見い出し、本発明
に到達したものである。

即も本発明は、少なくとも１種の被検物質を含有した被
検体にＮ磁波を照射することによって該被検体を透過し
た、又は該被検体から発生した少なくとも１種の測定波
長の電磁波の強度を測定することによって該被検体中の
該被検物質の濃度を測定する分光分析方法において、 （ｉｉｉ）　　該被検物質を標Ｑ濃度で含有する標準検
体を調製し、 （ｉｉ）　　該標準検体に該電磁波を照射して該標準検
体を透過した、又は該標準検体から発生した・多数の波
長をもつ電磁波の実質上全波長についての該電磁波強度
のスペクトルパターンを測定し、（ｉｉ）　　該スペク
トルパターンを記憶手段に記憶し、θ■）該記憶手段に
連結された演算手段によって、該スペクトルパターンよ
り測定に適した該受なくとも１種の測定波長及び参照波
長を自動的に選定する、 ことを特徴とした分光分析方法、及び電磁波発生手段と
、少なくとも１種の被検物質を含有した被検体に電磁波
を照射する照射手段と、該被検体を透過し又は該被検体
から発生した少なくとも１種の測定波長の電磁波の強度
を測定する電磁波強度測定手段を有した分光分析装置に
おいて、（ｉｉｉ）　　該被検物質を標準′ａ度で含有
した標準検体に電磁波を照射して該標準検体を透過した
、又は該標準検体から発生した多数の波長をもつ電磁波
の実質上全波長についての該電磁波強度のスペクトルパ
ターンを測定するスペクトル測定手段と、 （ｉｉ）　　該スペクトルパターンを記憶するスペクト
ルパターン記憶手段と、 （ｉｉｉ）　　該スペクトルパターン記憶手段と連結さ
れて、該スペクトルパターンから測定に適した該受なく
とも１種の測定波長及び参照波長を自動的に選定する演
算手段、 ＧＶ）　　該測定波長において該被検体に関して得られ
た電磁波の強度を濃度に変換する信号処理手段、とを具
備したことを特徴とする分光分析装置を提供するもので
ある。

本発明における被検体は、少なくとも１種の被検物質を
含有したものであって、気体状、液体状又は固体状のも
ののいずれであってもよい。場合によっては、例えば液
体４人のものに微少な固体状のものが分散しでいるもの
等の混相状態のものであってもよいが、分析積項等の点
から混相状態でない被検体が好ましい。中でも気体状又
は液体状がより好ましく、液体状が特に好ましい。

例えば、ＥＩＡの場合にはかかる被検体が液体状であっ
て、酵素を基質及び発色剤に作用させることによって生
じた発色物を被検体として含有するものである。かかる
被検体はいかなる方法によって１ｑられたものであって
もよく、その具体例として以下の方法があげられる。

ＥＩＡでは血清または尿中に含まれる抗原の定量分析を
行う［］的で、その抗原と特異的に反応する抗体に酵素
でラベルをつけておき試薬とする。

この試薬を血清に加えることによって抗原・抗体反応（
免疫反応）を起こした結果請する抗原・抗体複合体の岳
を酵素のυとして測定するものである。この場合の酵素
の間を測定する手段として、Ｗ２Ｎの量に比例して発色
Ｒ度の変化する基質及び発色剤を補助手段として用いる
。該発色濃度はＬａｎｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則にもと
づいて透過定υの変化として測定するのが一般的である
。

本発明における電磁波としては、γ線、Ｘ線等の放射線
、紫外線、可視光線、赤外線、遠赤外線及びマイクロ波
等があげられ、被検物質や被検体の特性に応じて適宜選
択されるものである。

被検体に電磁波を照射して透過した電磁波の強度を測定
する場合は、被検体での電磁波の吸収現象を利用したも
のであり、ブランクに照射されて透過した電磁波と被検
体を透過した電磁波の各々の強度の相違より吸光度とし
て測定してもよい。

また、被検体に電磁波を照射し、被検体から発生する電
磁波の強度を測定する場合としては、被検体で反射、散
乱等を生じて発生した電磁波の強度を測定したり、ある
いは被検体に発生したケイ光等の強度を測定する場合が
あげられる。

尚、場合によっては、特に電磁波を被検体に照射するこ
となく、被検体自体から発生する電磁波の強度を分析す
る際にも、本発明の方法や装置を適用することが可能で
ある。

本発明の分光分析法の特徴は、標準検体を透過した、又
はそれから発生した多数の波長をもつ電磁波強度のスペ
クトルパターンを測定し、そのスペクトルパターンから
測定に適した測定波長を選定することを自動的に行うこ
とにある。

即ち、１又は複数のレベルの既知の濃度（即ら標準濃度
）で被検物質を含有する１個又は複数の標準検体を調製
し、次いでその標準検体に電磁波を照射して透過した又
は標準検体から発生した多数の波長を有する電磁波の実
質上全波長についての強度のスペクトルパターンを測定
し、そのスペクトルパターンを例えばデジタルメモリー
（ＲＡＭ）等の記憶手段により記憶し、その記憶手段に
連結された演算手段によりかかるスペクトルパクンに適
した測定波長を自動的に選定するものである。

第１図は、本発明の方法における電磁波強度のスペクト
ルパターンを測定する好ましい具体的手段を例示したも
のである。

即ら被検物質を含んだ標準検体４にハロゲンランプ等の
光源２からの光を照射し、標準検体４を透過した光をス
リブ［・部材６に通した後、回折帽子等の回折手段８に
より回折させることによって（７られた光をフォトダイ
オードやアレイ検出器等の検光手段１８によりその光の
強度を測定する。

尚第１図において、モーター手段１０によって回折手段
８を回転させることによって、１本のフォトダイオード
の如くより簡単な検光手段１８によっても透過光の強度
を測定することができる。この光強度はアノログデジタ
ル変換器１７を介してＣＰＵ１９に入力されてメモリー
２０に記憶される。その場合にギヤー手段１２を介して
パルスエンコーダ手段１４によって回折手段８の回転角
を検出し、ディジタルパルス入力インターフェイス１６
を介して、ＣＰＵ１９にその回転角度信号を人力する。

そして、プログラム及びサインバー補正表をあらかじめ
記憶しであるメモリ２１から取り出し比較することによ
り回転角度信号から対応する波長を演算出力する。該波
長における光強度信号をメモリ２０から取り出し、ＣＰ
Ｕ１９で対応させ、ざらに七−タ手段１０を回転させる
ことによって全波長領域での光強度、即らスペクトルパ
ターンを測定することができる。

なお、自動的に波長を選定し、濃度を演算する場合の定
数入力及び操作のためのコンピュータ入力手段（例えば
、キーボード）２２及び表示出力手段２３を具備してい
る。

第２図は、本発明における目的とする被検物質の測定に
適した測定波長を自動的に選定するための好ましい具体
的手段を例示したものである。

即ち第１図に示した如く、回折格子を回転しながら、フ
ォトダイオードにより透過光の強度を測定し、またその
回転角を検出し、その両方の測定結果を用いてサインバ
ー補正の演算を行いながら、波長と透過光の強度の関係
を全波長について各々（ｑ、ｒｊＩＪら光強度のスペク
トルパターンを得てそれを記憶手段により記憶せしめる
。あるいは、標準検体において被検物質を含有しないも
のくブランク）に前記と同様に透過させた光の強度゛を
基準として上記の標準検体の透過光の強度より吸光度を
算出し、かかる吸光度についてのスペクトルパターンを
得てそれを記憶手段に記憶せしめる。透過光による分析
の場合には、通常吸光度が用いられる。

次いで、かかる記憶手段に連結された演算手段によって
、その吸光度のスペクトルパターンでの、ピーク部（山
の最高部）における吸光度とボトム部（谷の最低部）に
お■ブる吸光度を自動的に検出する。

このようにして１ｑられた各ピーク部、ボトム部におけ
る吸光度を用いて、以下のアルゴリズムを満たすような
ｎ個の複数の測定波長λ）ｌｉ（ｉ・１゜・・・、ｎ）
及び参照波長λＲを自動的に選定する。

くアルゴリズム〉 ｓｔｅｐ　１　：濃度変化による吸光度の変化が最も少
い該スペクトルのボトム部の波長を参照波長λＲとして
決定する。参照波長を使用する目的は濃度変化によらず
透過光間が変化するような外乱要因（例えばマクや光路
の汚れ、キズ）を補償するものである。したがって、以
下に定める測定強度からこのλＲの強度ＡλＲを常に差
し引くことにより透過測定強度の補償を行う。

ｓｔｅｐ　２　：　Ｒ低Ｈａの標準検体の該スペクトル
の最大強度を示すピーク部の波長を第一の測定波長λＭ
ｉとして決定する。この測定波長λＭは低濃度において
、濃度変化に対する透過光量変化率を最大にづるもので
ある。

そして各濃度とλＭｉの透過測定吸光度△λ旧から、（
ＡλＭＩ−Ａ２Ｂ）と濃度に関する検量線を求める。

ｓｔｅｐ３：λＭｉの強度ＡλＭ１が光電変換器・増幅
器の線形動作範囲を超える濃度（ＡλＭｉの濃度に関す
る強度の変化率が最少分解能以下になることにより判断
する）を求め、この点において、該スペクトルの第二ピ
ーク部の波長を第二測定波長λＭ２として決定する。一
般に′ａ度変化に対する強度の変化は成長曲線（例えば
四係数ロジスチック曲線）であり、その変化率は濃度が
高くなると小さくなる傾向にあり、このλＭｉからλＭ
２への測定波長の切換はこの傾向を防ぐことにも寄与す
ることができる。

ｓｔｅｐ　ｊ：　ｓｔｅｐ　３をさらに次々繰り返すこ
とによって、第（ｊ−２）測定波長λ）ｌｊ−２（ｊ≧
４）を決定する。

ｓｔｅｐ　（ｎ＋２）　：　ｓｔｅｐ　ｊの手続きを、
必要測定１ｒｆｔ範囲が測定できるまで繰り返すことに
よって、ｎ個の複数の測定波長λ）ｌｉ　（ｉ＝１．・
・・ｎ）を選定する。

尚、吸光度のかわりに、例えば標準検体を透過した光又
は標準検体から発生した光の強度を用いる場合には、前
記アルゴリズムにおいてΔλＭ２ＡλＲを各々ピーク部
における光の強度、ボトム部における光の強度として、
前記と同様にして測定波長等を選定すればよい。

かくして得られた測定波長を用いて、少なくとも３垂準
のレベルの濃度にＵＡ製した標準検体についての光の強
度又は吸光度を求めて、被検物物質の濃度対光の強度又
は吸光度の関係より、例えば最少２垂方、折線近似等に
より検量線を絆出し、記憶手段により記憶する。

本発明において、被検物質が複数成分存在する多成分の
分析では、各成分毎に最適の測定波長が異なるようにし
て分析を行うのが通常である。かかる場合でも、本発明
によれば隔世文に就いての測定波長の選択が自動的に能
率よく行うことが可能である。即ら、例えば２成分の場
合には、各々の濃度のレベルを変えた２成分共存の標準
検体を作成し、前記した如く各成分に付いて前記アルゴ
リズムによって測定波長を自動的に選定すること。

ができる。尚各成分の各々の濃度が変った場合にも各々
別々の測定波長を選定することも容易にできる。

このように本発明によれば、被検物質の濃度が大「［」
に変化しても、また多成分系の場合でも、各々の適した
測定波長が自動的に選定されるので、同じ増幅器を用い
て所定の分析粘度を維持した状態での分光分析が非常に
容易にできる。

また本発明の分光分析装置の特徴は、標準検体を透過し
た、又は標準検体から発生した多数の波長をもつ電磁波
強度のスペクトルパターンを測定するスペクトル測定手
段と、そのスペクトルパターンを記憶する記憶手段と、
その記憶手段に連結されてスペクトルパターンから測定
波長を自動的に選定し１ｑる演算手段を具備したことに
ある。

かかるスペクトルパターンの測定手段としては、前記し
た如く、例えば第１図に示されるものがあげられる。そ
のスペクトルパターンの記憶手段としては、例えばＲＡ
Ｍ、フロッピーディスク、固定ディスク、アナログメモ
リー等があげられる。

またスペクトルパターンから測定波長を自動的に選定す
るための演算手段としては、例えばマイクロコンピュー
タ−ソフトウェアやアナログ演算回路があげられる。

また、本発明の装置には標準検体を用いての測定波長の
自動的選定のための諸データ、例えば前記アルゴリズム
における測定波長の切換るべき濃度に対する測定強度の
変化率等の初期値をインプットするための外部入力手段
が具備されており、さらには、スペクトルパターン、検
Ｗ線２分析結果等を出力するためのプリンター等の出力
手段を漏えていることが望ましい。

本発明は、分光分析であって被検体を透過した電磁波又
は被検体からの電磁波の強度を測定するものについて適
用することができるが、特に、測定対象の種類が多くか
つ広い濃度範囲にわたって高い測定精度が要求されるＥ
ＩＡ、化学発光分析。

傾向比色分析等の分析に適している。

く発明の効果〉 本発明によれば、被検体中の被検物質の濃度の広い範囲
にわたって高い分析精度が要求される分析系に対しても
、各濃度領域に適した測定波長の自動選定が容易にでき
る。また多成分についての分析系に対しても、各成分の
分析に適した測定波長の自動選定が可能である。

即ら本発明は、広い範囲にわたって高い′＃３度を保持
した、操作が簡単でかつ汎用性に富む分析法及び分析装
置を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明における標準検体の透過光の強度のス
ペクトルパターンを測定するための装置の好ましい実施
態様例を模式的に示したものである。 第２図は、本発明における標準検体を用いた測定波長の
自動選定及び検岳線算出等の操作の好ましい態様を模式
的に例示したものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１種の被検物質を含有した被検体に電
   磁波を照射することによって該被検体を透過した、又は
   該被検体から発生した少なくとも１種の測定波長の電磁
   波の強度を測定することによって該被検体中の該被検物
   質の濃度を測定する分光分析方法において、（ｉ）該被
   検物質を標準濃度で含有する標準検体を調製し、 （ｉｉ）該標準検体に該電磁波を照射して該標準検体を
   透過した、又は該標準検体から発生した多数の波長をも
   つ電磁波の実質上全波長についての該電磁波強度のスペ
   クトルパターンを測定し、 （ｉｉｉ）該スペクトルパターンを記憶手段に記憶し、 （ｉｖ）該記憶手段に連結された演算手段によって、該
   スペクトルパターンより測定に適した該少なくとも１種
   の測定波長及び参照波長を自動的に選定する、ことを特
   徴とした分光分析方法。
2. （２）該標準検体を複数のレベルの該被検物質濃度で調
   製し、各々のスペクトルパターンを測定・記憶し、該被
   検物質の測定すべき濃度範囲において、所定以上の測定
   感度が得られるように該演算手段によって該電磁波の２
   種以上の測定波長を自動的に選定し、該被検体中の該被
   検物質の濃度に対応して、該２種以上の測定波長の中で
   最適の波長を選択して測定する請求項１の分光分析方法
   。
3. （３）該２種以上の被検物質の各々についての１種又は
   ２種以上の測定波長を選定する請求項１の分光分析方法
   。
4. （４）該測定波長の自動的選定が、下記の判断アルゴリ
   ズムを満たすｎ個の複数の測定波長λＭｉ（ｉ＝１、…
   、ｎ）及び参照波長λＲを自動的に選定することによる
   ものである請求項１の分光分析方法。 ｓｔｅｐ１：濃度変化による吸光度の変化が最も少い該
   スペクトルのボトム部の波長を参照波長λＲとして決定
   する、各濃度における強度ＡλＲを求める。 ｓｔｅｐ２：最低濃度の標準検体の該スペクトルの最大
   強度を示すピーク部の波長を第１の測定波長λＭ１とし
   て決定する。各濃度における光強度ＡλＭ１を求め、濃
   度と光強度（ＡλＭ１−ＡλＲ）を両軸とする検量線を
   演算により求める。 ｓｔｅｐ３：λＭ１の強度ＡλＭ１が光電変換器・増幅
   器の線形動作範囲を超える濃度（ＡλＭ１の濃度に関す
   る強度の変化率が最少分解能以下になることにより判断
   する）を求め、この点において、該スペクトルの第二ピ
   ーク部の波長を第二測定波長λＭ２として決定する。さ
   らに、ｓｔｅｐ２と同様にして、各濃度における光強度
   ＡλＭ２を求め検量線を演算する。 ｓｔｅｐｊ：ｓｔｅｐ３をさらに次々繰り返すことによ
   って、第（ｊ−２）測定波長λＭｊ−２（但しｊ≧４）
   を決定し、光強度ＡλＭｊ−２の検量線を求める。 ｓｔｅｐ（ｎ＋２）：ｓｔｅｐｊの手続によつて、必要
   測定濃度範囲を測定できるようにｎ個の複数の測定波長
   λＭｉ（ｉ＝１、…、ｎ）を選定する。
5. （５）電磁波発生手段と、少なくとも１種の被検物質を
   含有した被検体に電磁波を照射する照射手段と、該被検
   体を透過し又は該被検体から発生した少なくとも１種の
   測定波長の電磁波の強度を測定する電磁波強度測定手段
   を有した分光分析装置において、 （ｉ）該被検物質を標準濃度で含有した標準検体に電磁
   波を照射して該標準検体を透過した、又は該標準検体か
   ら発生した多数の波長をもつ電磁波の実質上全波長につ
   いての該電磁波強度のスペクトルパターンを測定するス
   ペクトル測定手段と、 （ｉｉ）該スペクトルパターンを記憶するスペクトルパ
   ターン記憶手段と、 （ｉｉｉ）該スペクトルパターン記憶手段と連結されて
   、該スペクトルパターンから測定に適した該少なくとも
   １種の測定波長及び参照波長を自動的に選定する演算手
   段、 （ｉｖ）該測定波長において該被検体に関して得られた
   電磁波の強度を濃度に変換する信号処理手段、 とを具備したことを特徴とする分光分析装置。