JP2009180745A - 蛍光検出方法、検出装置及び蛍光検出プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光検出において、煩雑な濃度調整や検出操作のやり直しを無くすこと。
【解決手段】蛍光体または、該蛍光体を有する試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する方法であって、該蛍光発光を発光領域の波長帯における複数の波長で同時に検出し、該複数波長の中から検出範囲内で検出された波長を採用し、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することを特徴とする蛍光検出方法。本発明はまた、蛍光検出装置及びコンピュータ用プログラムを開示する。
【選択図】図１

Description

本発明は蛍光検出法、検出装置及び蛍光検出プログラムに関し、特に蛍光測光方法及び蛍光測光装置の自動化技術に関する。

従来の蛍光検出装置では蛍光体を標識した試料に対して、標識した蛍光体に最適な励起波長の励起光を照射し、標識した蛍光体固有の発光領域の波長帯において最も高い蛍光強度を取る波長において蛍光発光を検出することで、試料の検出・定量等を行っていた。また、未知の蛍光体の検出において、検出範囲内で試料を検出する場合、特許文献１に示されるような、増幅器の感度を変えることにより検出可能範囲内での解析方法がある。

特開昭５８−２１１４３号公報

濃度が未知の蛍光体、または蛍光体を標識された試料に対して蛍光検出を行う場合、特許文献１に示されるように励起光波長の波長帯または増幅器の感度を変える、もしくは、試料の濃度を測定し、濃度に応じて希釈または濃縮することにより検出範囲内における検出を可能としていた。しかし、検出範囲に収めるために増幅器の感度を変えた場合、図１１に示すように検出波形が変形する、または、標準試料と検査試料の検出感度が異なる等の問題が生じる。例えば、検出した波形の面積から検査試料の濃度を標準試料との相対値から求める場合、その面積を正しく求めることは困難である。また、検出した蛍光強度から検査試料の濃度や標準試料との相対値を求める場合、ベースライン（バックグラウンド）を決定する際に、検出値の上昇前後のポイントが増幅感度の切換え前後で異なるため、正確性に欠ける問題がある。

また、試料の濃度を調整する場合には、試料の濃度を検出する工程および試料の濃度を調整する工程、さらに、検出後、検出範囲から外れた試料に対して濃度の再調整を行う工程が必要であり、操作が煩雑な面とスループットの面で問題があった。加えて、濃度の異なる多数の試料を検出する装置の場合、多数の試料に対して異なる濃度調整が必要となり、自動化した場合、機構として濃度を検出するシステム、各々の試料に対して別々に調整できる分注システム、希釈や濃縮を行うためのスペースが必要になる等、装置のコスト増大、スループット悪化、大規模化に繋がる数々の問題があった。

本発明は、蛍光体又は該蛍光体を標識した試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する方法であって、該蛍光発光を発光領域の波長帯における複数の波長で同時に検出し、該複数の波長の中から検出範囲内で検出された波長を採用し、該波長の蛍光強度を検出結果として出力する蛍光検出方法を提供する。上記方法において、検出結果が検出範囲外にある蛍光波長を含む場合は、その蛍光波長を除いて、その他の蛍光波長を採用して、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することができる。また、採用する波長は、検出範囲内にある最大の波長であることができる。しかし、採用する波長は、最大の波長に限らず、検出範囲内にある任意の強度の波長であることができる。

更に本発明によれば、複数種類の蛍光体又は該蛍光体を有する試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する方法であって、該蛍光発光を発光領域の波長帯における複数の波長で同時に検出し、該複数の波長の中から検出範囲内で検出された波長を採用し、該波長の蛍光強度を検出結果として出力する蛍光検出方法が提供される。上記方法において、検出結果に検出範囲外にある蛍光波長が含まれている場合は、その蛍光波長を除いて、その他の蛍光波長を採用して、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することができる。また、それぞれの蛍光体について採用した蛍光波長が異なってもよい。更に本発明は上記検出方法に有用なコンピュータプログラム及び蛍光検出装置を提供する。

本発明によれば、試料の準備たとえば濃度調整を省略し、あるいは簡略化し、検出回数を増やすことなく簡単に目的の検出信号を精度よく取得できる。従って、本発明によれば、例えば、各種蛍光検出技術の自動化が可能となる。

１種類の蛍光体から得られた複数の蛍光強度から、出力に用いる蛍光強度の選択フロー図。 複数の蛍光体から得られる複数の蛍光強度から、出力に用いる蛍光強度の選択フロー図。 本発明が適用される検出装置の構成を示す概略図。 本発明が適用される検出装置の検出構成を示す概略図。 ６００ｎｍに励起波長を持つ蛍光体の一般的な蛍光発光スペクトル図。 本発明の実施例において複数同時検出したときの蛍光強度出力画面であって、検出範囲を越えた蛍光強度を含む複数の蛍光強度出力図。 本発明の実施例において複数同時検出したときの検出画面で、検出結果が検出範囲を越えない例を示す複数の蛍光強度出力図。 （ａ）本発明実施例において３種類の試料を同時に測定したときの蛍光強度出力図。（ｂ）本発明実施例において２種類の検査試料と１種類の標準試料を検出後、各試料のピークに対して選択された波長における蛍光強度のみで出力した図。 ５００、５２０、５５０、６００ｎｍに励起波長を持つ一般的な蛍光発光スペクトル図。 （ａ）本発明実施例において３種類の検査試料と１種類の標準試料を複数の波長で検出した蛍光強度出力図。（ｂ）本発明実施例において３種類の検査試料と１種類の標準試料を複数の波長で検出後、各試料のピークに対して選択された波長における蛍光強度のみで出力した図。 特許文献１に示される従来技術による、増幅器の感度を変えた場合の蛍光強度出力図。

本発明は、ＤＮＡシーケンサー、液体クロマトグラフィー装置、分光光度計などのように、蛍光発光を検出する技術を対象とする。蛍光検出では、如何なる検出器においても検出範囲に上限があるため、高濃度の蛍光体または蛍光体を標識した試料の蛍光強度を測定した場合、検出した蛍光強度が検出範囲を越えてしまい、再度、濃度を検出範囲内に収まるように調整するか、予め検出範囲に収まるように濃度を調整する必要があり、操作が煩雑になる問題があった。加えて、濃度の異なる多数の該試料を検出する装置の場合、多数の試料に対して異なる濃度調整が必要となり、自動化した場合、装置のコスト増大、スループット悪化、大規模化に繋がる数々の問題があった。また、増幅器の感度を切り換える特許文献１の方法においては、蛍光強度や検出されたピークの面積を求める際に、精度が低下する問題があった。

本発明は、蛍光体に励起光を照射することにより発生する蛍光発光が、蛍光体固有の発光領域において検出波長の違いで蛍光強度が異なる現象を利用して、蛍光体固有の発光領域全域における複数の波長で同時に検出し、検出範囲内で検出できた波長の蛍光強度、好ましくは最も高い蛍光強度を採用することで、あらゆる濃度の試料を濃度調整なしでも検出範囲内で検出できるようになった。

本発明によれば、蛍光体より励起された蛍光発光の蛍光強度を検出する方法において、あらゆる濃度の蛍光体を検出範囲内で検出できる。検討結果によれば、濃度が１：２０という大きな開きがあっても、検出波長の選択によって、検出範囲内の蛍光強度が得られる。特に、蛍光体または蛍光体の標識された複数の試料を相対的に定量する方法において、濃度調整をしないでも、あらゆる濃度の試料について蛍光強度または蛍光波形面積を精度良く測定することが可能となり、試料の濃度を決定することができる。

さらに、蛍光検出の自動化において、試料の濃度を検出する工程、試料の濃度を調整する工程、さらに、検出後、検出範囲から外れた試料に対して濃度の再調整を行う工程を省略して、試料を検出範囲内で検出できる。これにより、濃度の異なる多数の試料をルーチン処理できるようになり、装置化した場合、機構として濃度を検出するシステム、各々の試料に対して別々に調整できる分注システム、希釈や濃縮を行うためのスペース等を省略でき、装置のコスト低下、スループット向上、小規模化を実現できる。

また、測定対象から検出された蛍光強度が低いほど、ベースラインとのＳ／Ｎ比が低下し正確な蛍光強度の検出が困難になるが、本発明の場合、検出範囲内で最大の蛍光強度を選択することで試料を常に最大感度で検出することが可能であるため、Ｓ／Ｎ比精度の高い分析又は検出が可能となる。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して具体的に説明する。本発明は、蛍光体または、試料に標識された蛍光体の励起に最適な励起光を用いて、試料に照射し、該照射による蛍光体からの蛍光発光を複数の波長帯より同時に測光し、検出範囲内で検出できた波長の蛍光強度を検出結果とすることを特徴とする蛍光検出方法および蛍光検出装置である。

本発明のシステム構成の概観を図３に示した。本構成は、蛍光体または、試料に標識された蛍光体を励起させる光源、励起された蛍光発光を複数の波長で同時に測光できる検出器、複数の波長から得られた各蛍光強度を保存できる記憶装置、記憶した蛍光強度から検出範囲内の蛍光強度を選択するプログラム、および、選択された蛍光強度を表示する出力部を最低限保持する。これらの関係図を図４（ａ）および図４（ｂ）に示した。これは、１の励起光源から励起光を２の蛍光体を標識した試料に照射し、蛍光発光を複数の波長帯で同時に測光できる３の検出器を用いて複数波長における蛍光強度を検出し、これらの蛍光強度を４の記憶装置に記憶し、５の演算処理部により最適な波長における蛍光強度を選択し、６の出力部に出力する構成である。また、５の演算処理部にも一時的な記憶素子が含まれることは言うまでもない。本システム構成は、蛍光発光を複数の波長で同時に測光できる検出器と、検出器より得られた複数の波長に由来する蛍光強度から検出範囲内の蛍光強度を選択するプログラムがあればよく、上述の具体例に限定されない。

本発明で用いられるプログラムとしては、たとえば、蛍光検出装置の出力の演算を行うコンピュータを、蛍光検出器に複数の検出波長を設定する手段、蛍光体又は蛍光体を有する試料に励起光を照射する手段、励起された蛍光体からの蛍光を検出する手段、検出された蛍光強度が検出範囲外の蛍光強度が含まれているか否かを判定する手段、及び検出範囲外の蛍光強度が含まれている場合には、その蛍光強度を除いて検出範囲内に収まった複数の蛍光強度を用いて演算する手段、又は検出範囲外の蛍光強度が含まれていない場合は、検出範囲内の複数の蛍光強度から最大の蛍光強度を選択する手段として機能させるための蛍光検出プログラムが含まれる。更に具体的には、複数種類の蛍光体又は複数種類の蛍光体を有する試料に励起光を照射する場合に適用される上記プログラムである。

検出する蛍光体または、試料に標識する蛍光体としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、加えて、金属化合物と有機化合物の複合体で、様々な光源で蛍光発光可能なクウォンタム・ドット等を用いることもできるが、該蛍光体に最適な励起光により蛍光発光を検出できれば如何なる物質を用いても良い。

励起光源としては、例えば、アルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンイオンレーザー、半導体レーザー等が挙げられるが、目的の蛍光体の蛍光発光を得ることが可能であれば如何なる光源を用いてもよい。好ましくは、検出する蛍光体を発光させるのに最適な光源を用いる。

励起光源により励起された蛍光体による蛍光発光の発光領域全域を複数の波長で同時に測定できる検出器としては、例えば、半導体センサであるＣＣＤや、フォトダイオードをアレイ状に並べた検出器、プリズムやグレーティングを用いて分光させて受光器で検出する検出器や励起分光器、蛍光分光器等が挙げられるが、本システムでは励起された蛍光発光を複数波長で同時に検出できればよく、上記の例に限定されない。

上述の検出器を用いて、蛍光発光の発光領域全域を複数の波長で同時に検出する場合、該検出器の感度は、微量の検出も可能にするために、好ましくは設定範囲における最大感度にするのが望ましい。また、検出に用いる波長は、２波長以上であれば如何なる波長を用いてもよいが、蛍光体の蛍光発光スペクトルは図５に示すように、一般的に立ち上がりの傾きが強く、減衰の傾きが緩やかになる性質を持つことから、検出に用いる波長は蛍光体に最適な波長に加えて、該波長よりも長波長側に設定するのが好ましい。より具体的には、検出ピークの蛍光強度の大きさに拘わらず、ＳＮ比精度良く検出するために、試料に標識した蛍光体に最適な波長と、最適な波長において検出される蛍光強度に比べ７５％以上１００％未満の蛍光強度が検出可能な波長と、５０％以上７５％未満の蛍光強度が検出可能な波長と、２５％以上５０％未満の蛍光強度が検出可能な波長と、０％より大きく２５％未満の蛍光強度が検出可能な波長の５種類の波長を設定するのが好ましい。より好ましくは、試料に標識された蛍光体の持つ波長帯全域を含んで可能な限り多数の波長を検出するのがよい。

また、電気泳動法や液体クロマトグラフィーのように、分離しながら蛍光体または蛍光体が標識された試料を検出する場合、図９に示すように異なる複数の蛍光体が標識された複数の試料を用いることもできる。この場合、各蛍光体に対して、上述のような波長を選択することにより、異なる複数の蛍光体が標識された複数の試料において、検出に用いる波長がそれぞれ異なることで各試料を区別することが可能となる。なお、該試料を測定する際に、蛍光強度の重複を避けるために、異なる試料の検出時間が相互に重ならないことが望ましい。

また、図９のように異なる複数の蛍光体または蛍光体を標識した試料の濃度を濃度既知の標準試料を元に相対的に定量する場合、標準試料に標識する蛍光体は検査試料に標識する全ての蛍光体に最適な検出波長と僅かでも重なることが好ましい。例えば、図９における蛍光体Ｄの５２０ｎｍの蛍光スペクトルのように、試料に標識する、異なる複数の蛍光体と最も多く蛍光スペクトルが重なる蛍光体を採用するのが望ましい。より好ましくは、図９を例に示すと、検査試料の蛍光体Ａ，Ｂ，Ｃの最適波長における標準試料の蛍光体Ｄの蛍光強度ａ，ｂ，ｃがａ＞０，ｂ＞０，ｃ＞０であり、かつａ＋ｂ＋ｃが最大となる条件の波長域を持つ蛍光体を標準試料に標識することで、必要最小限の標準試料で複数の検査試料の検出が可能となる。また、標準試料の数が複数あってもよいならば、検査試料に標識した複数の蛍光体のそれぞれと同じ蛍光体を標識した複数の標準試料を準備すると、検査試料に標識した蛍光体に対して常に最大蛍光強度となる標準試料のピークが得られ、Ｓ／Ｎ比精度が向上するため、より望ましい。

上述の方法により、複数の波長から同時に得られた蛍光強度の検出データは図１又は図２に示したフローにより、演算部処理部（コンピュータ）において処理され、蛍光強度の検出データは記憶部に格納され、必要に応じて出力部へ出力される。図１においては、検出範囲を越えない最大の蛍光強度を選択することを示しており、通常はこれが最も合理的である。しかし、場合によっては最大の蛍光強度が得られる波長以外の蛍光強度を用いても良いことは当然である。図２においても同様である。

本発明の実施例を説明するにあたり、まず図面を説明する。図１は、１種類の蛍光体から複数の波長を用いて検出した複数の蛍光強度から結果に用いる蛍光強度を選択するフロー図である。準備された蛍光体または蛍光体を標識された試料を、電気泳動法などで分離し、その蛍光体より発せられた蛍光発光を図３又は図４に示す装置により連続的に検出する。本発明においては試料の濃度調整をしないでも、あるいは濃度未知の試料でも、そのまま分析に供することができる。

従来方法ならば、検出結果が所定の検出波長の検出範囲に入るように熟練した技術による濃度調整が必要であり、もし検出範囲外の結果が得られた場合、試料の濃度を再調整する必要がある。または特許文献１に示された方法のように、検出器の感度を切り換える必要がある。本発明で最も重要な要件の１つは、図６、図７、図８（ａ）、図１０（ａ）に示すように、蛍光検出器たとえばＣＣＤ検出器に、複数の検出波長を予め設定しておくことである。そして、蛍光体より発せられた蛍光発光を予め設定した複数の波長について、同時に検出する。これによって、例えば図６の試料Ａのように、６００ｎｍと６１０ｎｍにおける蛍光強度が検出範囲を逸脱した場合でも、６５０ｎｍ以上の波長については、検出範囲を逸脱しない蛍光強度が同時に得られる。これらの詳細については実施例１で詳細に説明する。

また、同じ蛍光体を標識した、異なる２つ以上の試料を同時に検出する際に、各試料の蛍光強度に大きな違いがある場合や、各試料の蛍光強度が一部重なったり、近接していたりして、弁別が困難な場合は、各試料について異なる蛍光強度を用いて検出すると、各試料の蛍光強度のＳ／Ｎ比を高く保ち、かつ明確・容易に弁別することができる。これらの詳細については実施例２で説明する。

図２は複数の蛍光体または蛍光体を標識した試料に対して、各蛍光体に対して複数の蛍光強度を検出し、複数の蛍光強度から結果に用いる蛍光強度を選択するフロー図である。
例えば、図１０（ａ）に示すように複数種類における試料の蛍光強度が弁別困難な場合がありうるので、図１０（ｂ）に示すように、試料ごとに異なる検出波長を選択する方法を示したものである。これらの詳細については実施例３で説明する。

図３は本発明が適用される検出装置の配列構成を示す概略図で、試料を励起光源からの励起光により励起し、その蛍光発光をＣＣＤなどの検出器により検出する。この場合、ＣＣＤ検出器には、複数の検出波長で検出が行われるように、記憶部又は演算処理部に記憶されているプログラムにより、予め設定されている。蛍光強度は、演算処理部に取り込まれ、所定の処理を行って、出力部に出力される。必要に応じて、その結果を記憶部に記憶する。

図４（ａ），（ｂ）は本発明が適用される検出装置の検出構成例を示す概略図で、１は光源、２は試料、３は検出器、４は記憶部、５は演算処理部、６は出力部、７は入出力部である。

図５は、６００ｎｍに励起波長を持つ一般的な蛍光体における、従来一般に使用されている検出方法を用いて得られた蛍光発光スペクトル図である。

図６は本発明の実施例において複数同時検出したときの検出画面であって、検出範囲を越えた蛍光強度を含む複数の波長由来の蛍光強度を出力した図である。

図７は複数同時検出したときの検出画面で、蛍光強度が検出範囲を越えない例を示す複数の波長由来の蛍光強度を出力した図である。

図８（ａ）は本発明実施例において３種類の試料を同時に測定したときにおける、複数の波長由来の蛍光強度を出力した図である。（ｂ）は本発明実施例において２種類の検査試料と１種類の標準試料を検出後、各試料のピークに対して選択された波長における蛍光強度のみで出力した図である。

図９は５００、５２０、５５０、６００ｎｍに励起波長を持つ一般的な蛍光体における、従来一般に使用されている検出方法を用いて得られた蛍光発光スペクトル図である。

図１０（ａ）は本発明実施例において３種類の検査試料と１種類の標準試料を複数の波長で検出した場合の蛍光強度を出力した図である。（ｂ）は本発明の実施例において３種類の試料と１種類の標準試料を複数の波長で検出した後に、検出に用いた蛍光強度の各試料のピークのみを結果として出力した図である。

図１１は従来技術である特許文献１による蛍光画像イメージを示し、増幅器の感度を変えた場合の蛍光強度出力図である。

以下、実施例を用いて詳細に説明するが、以下の実施例は例であり、用いる波長、蛍光体の種類、検出する波長域、スペクトル表示方法、検出した波長から濃度を定量する方法等、限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例は、分析試料の濃度検出に関するものである。本発明の実施例として、６００ｎｍに最適な励起波長を持つ蛍光体を標識した核酸を定量的に検出する場合を例に、以下図面を用いて具体的に説明するが、本発明は蛍光体からの蛍光発光を複数同時に検出し、検出範囲内の蛍光強度を検出結果とすればよく、以下の具体例に限定されるものではない。
１．試料の準備
６００ｎｍに励起波長を持つ蛍光体を標識した濃度不明の検査試料Ａ、検査試料Ｂと当該蛍光体を標識した濃度２０ｎｇ／μｌの標準試料Ｃを用意した。そして、検査試料Ａと標準試料Ｃを等量混ぜて測定試料ＡＣを作成し、検査試料Ｂおよび標準試料Ｃを等量混ぜた測定試料ＢＣを作成した。また、６００ｎｍに励起波長を持つ当該蛍光体の蛍光発光スペクトルを図５に示した。図５より、ＣＣＤ検出器において検出される波長を６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍの４波長に設定し、以下の実験を行った。
２．蛍光の複数波長同時検出
測定試料ＡＣと測定試料ＢＣに対して電気泳動を行い、試料を分離しながら、励起光を照射し、ＣＣＤの検出器を用いて６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍの４波長における蛍光強度を同時に測定し、測定試料ＡＣに対しては図６に示す各波長における蛍光強度の経時変化を得、測定試料ＢＣに対しては図７に示す各波長における蛍光強度の経時変化を得た。
３．検出データの選択
測定試料ＡＣ（図６）における複数の蛍光強度は、図７に示されるように６００ｎｍおよび６１０ｎｍで検出された試料Ａにおけるピーク（以下、本文内において、時間軸に従って得られた蛍光強度に対して、Ｘ軸に時間、Ｙ軸に蛍光強度をプロットした時の検査試料の存在を意味する波形をピークと定義する。）の上端が水平となっており、検出範囲を越えていたため、６５０ｎｍで取得された蛍光強度を選択した。一方、測定試料ＢＣ（図７）は最適な検出波長である６００ｎｍでも検出範囲を越えなかったため、６００ｎｍで取得された蛍光強度を選択し、選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度と標準試料Ｃの濃度から換算して測定試料ＡＣ中の検査試料Ａと測定試料ＢＣ中の検査試料Ｂの濃度を数１の方法を用いて算出した結果を表１に示す。

上記の６００ｎｍの蛍光体を用いた例のように、蛍光体に最適な波長では、検出範囲を越えて、検出不可となる試料においても、複数の異なる波長を同時に検出することで、濃度を再調整する必要なしに検出することができるようになった。

なお、本実施例では濃度の測定に蛍光強度における蛍光強度を用いたが、試料のピーク面積を用いてもよいことは言うまでもない。
（実施例２）
本実施例は、分析試料の濃度検出に関するものである。本発明の実施例として、６００ｎｍに最適な励起波長を持つ蛍光体を標識した核酸を定量的に検出する場合を例に、以下図面を用いて具体的に説明するが、本発明は蛍光体からの蛍光発光を複数同時に検出し、検出範囲内の蛍光強度を検出結果とすればよく、以下の具体例に限定されるものではない。
１．試料の準備
６００ｎｍに励起波長を持つ蛍光体を標識した濃度不明の異なる検査試料Ａ、検査試料Ｂと当該蛍光体を標識した濃度３０ｎｇ／μｌの標準試料Ｃを用意した。そして、検査試料Ａと試料Ｂと標準試料Ｃを等量混ぜて測定試料ＡＢＣを作成した。また、６００ｎｍに励起波長を持つ当該蛍光体の蛍光発光スペクトルを図５に示した。図５より、ＣＣＤ検出器において検出される波長を６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍの４波長に設定し、以下の実験を行った。
２．蛍光の複数波長同時検出
測定試料ＡＢＣに対して電気泳動を行い、試料を分離しながら、励起光を照射し、ＣＣＤの検出器を用いて６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍの４波長における蛍光強度を同時に測定し、図８に示す各波長における蛍光強度の経時変化を得た。
３．検出データの選択
測定試料ＡＢＣの測定により得られた複数の蛍光強度は、図８（ａ）に示されるように６００ｎｍおよび６１０ｎｍで検出された検査試料Ａのピークの上端が水平となっており、検出範囲を越えていたため、試料Ａ、Ｂ、Ｃにおいて６５０ｎｍで取得された蛍光強度を選択し、選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度を検出した。そして、標準試料Ｃの濃度から換算して検査試料Ａと検査試料Ｂの濃度を式１の方法を用いて算出した結果を表２に示す。

また、上述のように異なる検査試料Ａと検査試料Ｂと標準試料Ｃを同時に同じ波長で検出する際に、図８（ａ）のように検査試料Ａと検査試料Ｂの蛍光強度が一部重なったり、近接していたりして、弁別が困難な場合や、検査試料Ｂのように同時に検出するピークの蛍光強度が小さくなりＳ／Ｎ比精度が低下するような場合は、検査試料Ａは６５０ｎｍで検出、検査試料Ｂは６００ｎｍで検出という具合に、それぞれ異なる蛍光強度を検出結果として用いると、図８（ｂ）のようにＳ／Ｎ比精度高く、両者を明確かつ容易に弁別することができる。

上述の例の場合は、標準試料Ｃの蛍光強度は、それぞれの試料を検出した波長を用いる。より具体的には、上記実施例において検査試料Ａに対する標準試料Ｃの波長は６５０ｎｍの蛍光強度を、検査試料Ｂに対する標準試料Ｃの波長は６００ｎｍの蛍光強度を選択し、それぞれ選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度を検出した。そして、標準試料Ｃの濃度と検出した蛍光強度から換算して検査試料Ａと検査試料Ｂの濃度を式１の方法を用いて算出した結果を表３に示す。

表３のように表２とは異なる６００ｎｍの波長から検出された蛍光強度を用いても、検査試料の濃度は同じ値になる。このようにして、各検査試料の検出波長と標準試料の検出波長を一致させることで、全て同じ波長で検出した濃度と一致した結果を得ながら、複数の試料の弁別を容易に行うことができる。
（実施例３）
図２に示す方法において、複数の蛍光体検出法の具体例を、異なる３種類の蛍光体を標識した濃度未知の異なる核酸を定量的に検出する場合を例にとり説明する。
１．試料の準備
それぞれ異なる蛍光体を標識した濃度が未知の検査試料Ａ、Ｂ、Ｃと、濃度４０ｎｇ／μｌの標準試料Ｄをそれぞれ等量混ぜ、測定試料ＡＢＣＤを調整した。試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに標識された蛍光体は、図９に示すように５００、５５０、６００、５２０に最適波長を持つ。図９より、ＣＣＤ検出器において検出される波長を５００ｎｍ、５２０ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍの６波長に設定し、以下の実験を行った。
２．蛍光の複数波長同時検出
測定試料ＡＢＣＤに対して電気泳動を行い、試料を分離しながら、励起光を照射し、励起された蛍光を５００、５２０、５５０、６００、６５０、７００（ｎｍ）の６波長における蛍光強度を同時に測定した。この結果、図１０（ａ）に示すように、検査試料Ａのピークにおいては、波長５００ｎｍ、５２０ｎｍで検出範囲を逸脱し、５５０ｎｍで蛍光強度が最大となる検出範囲内のピークが得られた。検査試料Ｂのピークにおいては、検出した全ての波長において検出範囲内でピークを検出でき、波長５５０ｎｍで最大蛍光強度となるピークを得た。検査試料Ｃにおいては、波長６００ｎｍで検出範囲を逸脱し、６５０ｎｍで蛍光強度が最大となる検出範囲内のピークが得られた。標準試料Ｄにおいては、検出した全ての波長において検出範囲内でピークを検出でき、波長５２０ｎｍで最大蛍光強度となるピークを得た。
３．検出データの選択
測定試料ＡＢＣＤの測定により得られた複数の蛍光強度は、図１０（ａ）に示されるように５００ｎｍおよび５２０ｎｍの蛍光強度において、検査試料Ａのピークの上端が水平となり検出範囲を越え、６００ｎｍの蛍光強度において、検査試料Ｃのピークの上端が水平となり検出範囲を越えていた。

このため、検査試料Ａでは５００ｎｍおよび５２０ｎｍの蛍光強度を除いた最大蛍光強度である５５０ｎｍで取得された蛍光強度を選択した。また、標準試料Ｄについては検査試料Ａと同じ波長である５５０ｎｍの蛍光強度を選択し、それぞれ選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度を検出した。そして、標準試料Ｄの濃度から検査試料Ａの濃度を式１の方法を用いて算出した。

次に、検査試料Ｂのピークは、最適波長である５５０ｎｍの蛍光強度において検出範囲を逸脱していないが、検査試料Ａを検出した波長と同一波長を出力すると、検査試料の弁別が困難となる。したがって、より好ましくは、残った波長の中から最大感度で検出できる５２０ｎｍで蛍光強度を選択する。また、標準試料Ｄについては検査試料Ｂと同じ波長である５２０ｎｍの蛍光強度を選択し、それぞれ選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度を検出した。そして、標準試料Ｄの濃度から検査試料Ｂの濃度を式１の方法を用いて算出した。

検査試料Ｃのピークは、上述したように最適波長である６００ｎｍにおいて検出範囲を逸脱していた。したがって、その他の波長において最大感度で検出可能な６５０ｎｍの蛍光強度を選択した。また、標準試料Ｄについては検査試料Ｃと同じ波長である６５０ｎｍの蛍光強度を選択し、それぞれ選択した蛍光強度における各試料のピークの蛍光強度を検出した。標準試料Ｄの濃度から検査試料Ｃの濃度を式１の方法を用いて算出した。上述の各試料において波長選択後のイメージ図を図１０（ｂ）に示し、検査試料Ａ，Ｂ，Ｃの測定値と標準試料Ｄに対する相対濃度を表４に纏めた。

目的のピークが全て検出範囲を逸脱していなければ、全て同じ波長で検出できることは言うまでもないが、上述したように検出範囲内にある複数種類の蛍光体から得られた波長信号を、同一波長ですべて出力した場合は各検査試料の弁別が困難となる場合がありうる。しかし上述のようにそれぞれ異なる検出波長を選択することによりこれを回避することができ、図１０（ｂ）に示すように複数種類の蛍光強度を明確に区別して検出することができる。

１…光源、２…試料、３…検出器、４…記憶部、５…演算処理部、６…出力部、７…入出力部。

Claims (7)

1. 蛍光体を有する複数種の検査試料及び蛍光体を有する濃度既知の標準資料を分離しながらこれらの試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する方法であって、
   該蛍光発光を発光領域の波長帯を含む複数の波長で同時に検出し、
   該複数の波長の中から検出範囲内で検出された複数の波長を検査試料毎に選択し、
   選択された全ての波長を標準試料に対して選択し、
   それぞれの試料に対して選択された波長の蛍光強度を検出結果として時間軸と関連づけて出力し、
   各検査試料の蛍光強度と標準試料の蛍光強度との比率を算出することを特徴とする蛍光検出方法。
2. 検出結果が検出範囲外にある蛍光波長を含む場合は、その蛍光波長を除いて、その他の蛍光波長を選択して、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することを特徴とする請求項１記載の蛍光検出方法。
3. 選択する波長は、検出範囲内にある最大の波長である請求項１記載の蛍光検出方法。
4. 選択する波長は、検出範囲内にある任意の波長である請求項１記載の蛍光検出方法。
5. 検出結果に検出範囲外にある蛍光波長が含まれている場合は、その蛍光波長を除いて、その他の蛍光波長を採用して、該波長の蛍光強度を検出結果として出力することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光検出方法。
6. それぞれの蛍光体について選択した蛍光波長が異なることを特徴とする請求項５記載の蛍光検出方法。
7. 蛍光体を有する複数種の検査試料及び蛍光体を有する濃度既知の標準試料を分離しながらこれらの試料に励起光を照射し、該照射により発生する蛍光発光を検出する装置であって、
   該蛍光発光を複数の波長で同時に検出できる検出器を備え、該試料の蛍光発光が大きく、該蛍光体に最適な波長で検出範囲を越える場合は、最適な波長以外から得られた蛍光強度が検出範囲に収まる波長を選択し、選択された全ての波長を標準試料に対して選択し、それぞれの試料に対して選択された波長の蛍光強度を検出結果として時間軸と関連付けて出力し、各検査試料の蛍光強度と標準試料との蛍光強度との比率を算出することを特徴とする蛍光検出装置。

Images