JPH02502547A

JPH02502547A - 抗炎症作用のある化合物および組成物

Info

Publication number: JPH02502547A
Application number: JP63502869A
Authority: JP
Inventors: カリス‐ヒル，デイヴィッド; ゴッシュ，ピーター
Original assignee: アースロファーム　ピーティーワイ．リミティッド
Priority date: 1987-03-19
Filing date: 1988-03-21
Publication date: 1990-08-16
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: CA1327354C; US5145841A; DE3854604D1; AU604542B2; DE3854604T2; AU1545688A; EP0356435A1; EP0356435B1; WO1988007060A1; JP2511829B2; ATE129254T1; US5470840A; EP0356435A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗炎症作用のある化合物および組成物産業上の分野本発明は関節炎およびそれに類似の炎症状態を治療するための化合物およびそれを含む組成物と、その方法とに関するものである。さらに詳細には、本発明は、ポリ硫酸化多糖類の新規な金属錯体に制し、さらには、この化合物と、ヒアルロン酸またはその水溶性塩、コルチコステロイドおよび結合組織、特に関節軟骨の一体性を維持することができる化合物の中から選択された任意の２種の化合物を含む組成物とを含む組成物に関し、さらには、これらの化合物および組成物を用いて関節炎およびそれに類似の炎症状態を治療する方法に関するものである。

背景技術関節炎およびそれ以外の類似の炎症状態は、一般に、かなりの割合のヒトおよびそれ以外の動物の関節を冒す衰弱性の蒲みを伴う病気である。このような疾患に悩む患者が多いため、この疾患に伴う痛みの少なくとも一部を和らげ且つこの疾患を退行させる治療法を見出すために多くの医学的努力がなされてきた。

その結果、多数の化合物がこのような炎症の治療に有効であることが見出されている。これらの化合物によって得られる炎症の痛みを和らげる効果と冒された関節を正常な機能に回復させる効果は様々である。

一定の沈痛効果を有するものとして最初に炎症性疾患の治療に使用された化合物はサリチル酸である。残念なことに、この化合物は胃腸系を過度に刺激するこ止が分かった。そこで、サリチル酸の多くの誘導体について炎症抑制活性が評価され、その結果としてアスピリンが効果的で比較的安全な抗炎症化合物であることが確認された。

アスピリンの発見以来、アスピリンよりも効果的であると主張されている他の多数の化合物が生産されている。その中には、イブプロフェンを始めとするフェニル酢酸や、さらに最近確認された化合物であるナプロクセン、スリンダックが含まれる。

強い炎症抑制能はコルチコステロイド（例えば、ハイドロコーチシン、デキサメタシン、プレドニソロン、メチルプレドニソロン、ベータメタシン、バラメタシン、トリアムシノロン）の　。

水溶性および非水溶性の誘導体で達成されており、これら誘導体も広く処方されている。

しかし、従来のこれら全ての化合物および組成物は、大抵の場合に関節痛をある程度和らげるという点で十分な鎮痛性炎症抑制特性を示すが、関節機能の回復に関する効果は通常は一時的にしかすぎない。

さらに、従来のこれら化合物および組成物は多くの患者の痛みを長期にわたって和らげるとはいえ、これら化合物および組成物を用いて長い間治療を行うと、結合組織、特に関節の軟骨が衰弱し機能不全になることがあり、実際に問題を悪化させる可能性がある。この現象の実例が、二ニーマン（Ｎｅｗｓａｎ）とリング（Ｌｉｎｇ）、“Ｌａｎｃｅｔ”、７月６Ｂ号、１１〜１４頁、１９８５年；ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、”　Ｒｈｅｕａ＋、　Ｒｅｈａｂ、”、第１５巻、２６〜３０頁、１９７６年：マツケンジー（Ｍａｃ−Ｋｅｎｚｉｅ）、ホースバラ　（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ）、ゴッシｓ　　（Ｇｈｏｓｈ）、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）、”Ａｎｎ、　Ｒｈｅｕｍ、Ｄｉｓ、”、第３５巻４８７〜４１７頁、１９７６年；バークハート（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ）とボッシュ（Ｇｈｏｓｈ）、′ 関節炎とりニーマチに関するセミナー−（Ｓｅｍｉｎａｒｓｉｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｎ＋ａｔｉｓｍ）、サブリメント１、第１７巻、１〜３４頁、１９８７年に記載されている。コルチコステロイドは重度の関節症の関節内治療用の抗炎症剤として現在でも広く使用されているが、結合組織の成長、修復および母材組織の生合成を阻害する可能性のある最も強い阻害剤である（シルバーマン（Ｓｉｌｂｅｒｍａｎｎ）達、”Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ ’、第２巻、８７〜１０６頁、１９８７年；リムザ（Ｒｉｍｚａ）、”ＡＭ、　Ｊ、Ｄｉｓ、　Ｃｈｉｌｄ、”、第１３２巻、８０６〜８１０頁、１９７８年：カナリス　（Ｃａｎａｌｉｓ）、′εｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ’第１１２巻、９３１〜９３９頁、１９８３年；　レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）、”ＥＸＰ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、”第４１巻、１７４〜１８９頁、１９６６年；オイカリネン（Ｏｉｋａｒｉｎｅｎ）、”Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　ＰｈａｒｍａｃｏＩ″、第２６巻、８７５〜８７９頁、１９７７年ニジルバーマン達、“Ｇｒｏｗｔｈ”、第４７巻、７７〜９６頁、１９８３年；サアルニ（Ｓａａｒｎｉ）、’Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ”、第２６巻、１９６１〜１９６６頁、１９７７年、オラー（Ｏｌａｈ）とコステンスキー（Ｋｏｓｔｅｎｓｚｋｙ）、”Ａｃｔａ、　Ｂｉｏｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ｌｕｎｇ、’、第２７巻、１２９〜１３４頁、１９７６年を参照のこと）。これらの薬剤を長期にわたって使用することが不適当であるとする多数の臨床報告がモスコヴイッツ（ＭｏｓｋｏｗｉＬｚ）、ハウウェル（Ｈｏｗｅｌｌ＞、ゴールドベルブ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）、マンキン（Ｍａｎｋｉｎ）、ダブり二一、ビー、サウンダーズ（１１，Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ）達編集の１９８４年発行の「骨関節炎、診断、および管理（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、　Ｏｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）」の第１９章にノイシコタット（Ｎｅｕｓｔａｄｔ）によってまとめられている。

最近では、関節炎およびその他の炎症性疾患の原因を明らかにするための研究が多く行われており、正常な関節機能の研究や炎症性疾患に伴う病理学的徴候を見付ける研究が行われている。

これらの研究の結果から、ヒアルロン酸塩が動物の関節の滑液中に存在する主要な非蛋白質成分の１つであることが確認されている。さらに、ヒアルロン酸塩は滑液のレオロジー特性に非常に重要な役割を果たしていることも見出されており、そのレオロジー特性はヒアルロン酸塩の濃度と分子のサイズとに依存している。ヒアルロン酸塩は動物の体内の滑液だけでなく多くの組織に存在している自然にできるグリコースアミノグリカンである。

この発見に基づいて、正常な関節機能におけるヒアルロン酸塩の役割と、疾患のある関節におけるその変化とを確認する研究が進められた。その研究結果により、疾患のない組織から得られたヒアルロン酸塩を疾患のある関節に投与すると、正常な関節機能が回復され、疾患のある関節の痛みが軽減されることがあることが示唆された。

しかし、新たに投与したヒアルロン酸塩自体は炎症を起こしている関節中の細胞の遊離ラジカルや酵素によって急速に破壊され、その好ましい特性を失うので、過去におけるこの治療法の結果は期待に反したものであった。

上記の発見はさらに、たとえ正常な分子サイズの範囲のヒアルロン酸塩を疾患のある関節に投与したとしても、ヒアルロン酸塩を連続的に関節に投与するのでなければ一時的な鎮痛効果しかないであろうことも示唆している。

さらに、本発明の発明者は、関節炎の関節で作られる細胞が合成するヒアルロン酸塩の分子サイズは、通常分泌される分子サイズよりも小さいことをイン・ビトロで見出した。この発見は正常な機能をさらに回復するためには、関節中でのヒアルロン酸塩の生成をコントロールして、生成したヒアルロン酸塩を正しい範囲の分子サイズにしておく必要があるということを示唆している。

以上の発見、すなわち、疾患のある関節中ではヒアルロン酸塩の分子サイズが小さくなり、疾患のある関節に導入するとヒアルロン酸塩は急速に破壊されて正常なサイズでなくなるという発見と、さらには、正しい分子サイズ範囲のヒアルロン酸塩が得られるように合成を制御するのが好ましいという発見とに基づいて、本発明者は、驚くべきことに、ヒアルロン酸塩と炎症を起こしている細胞の関節への移行を抑制する化合物とを組合せることにより、炎症を起こしている細胞からの炎症媒介体、遊離ラジカルあるいは蛋白質加水分解酵素の放８を抑制することができ、従って、関節組織の一体性とヒアルロン酸塩の生合成とを維持することができるということを見出した。

発明の開゛示本発明の第１の観点は関節炎疾患を治療するための組成物を提供することにある。この組成物は薬理学上許容可能な基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩、コーチコステロイド、結合組織（特に関節の軟骨）の一体性を維持することができる化合物によって構成される群の中から選択される少なくとも２種の任意の化合物とで構成される。

本発明の第２の観点は関節炎疾患の治療方法を提供することにある。この治療方法は、疾患のある関節に、薬理学上許容可能な担体と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩、コーチコステロイド、結合組織（特に関節の軟骨）の一体性を維持することのできる化合物によって構成される群の中から選択される少なくとも２種の任意の化合物とで構成される組成物を有効量投与する方法である。

本発明の一実施態様では、本発明の組成物が、薬理学上許容可能な担体と、ヒアルロン酸またはその水溶性塩と、コルチコステロイドと、結合組織、特に関節の軟骨の一体性を維持することのできる化合物とで構成される。

本発明の上記組成物と上記治療方法の利点は、一定範囲の関節炎疾患を有効に治療できるという点にあることは明らかである。

上記の結合組織、特に関節の軟骨の一体性を維持することのできる化合物には、ポリ硫酸塩化多糖類、例えば、キシランポリ硫酸またはアルテバロン（Ａｒｔｅｐａｒｏｎ：デキストラン硫酸に対するルイトポルド（Ｌｕｉｔｐｏｌｃｌ　Ｇｍｂ）ｌ）の登録商標）が含まれる。

最も好ましいコーチコステロイドには水溶性誘導体としてのハイドロコーチシン、プレドニソロン、トリアムシノロンが含まれる。

図面の説明第１図はヒトの滑液繊維芽細胞によるヒアルロン酸のイン・ビトロ生合成における各濃度でのベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４■）とアルテバロン■の効果を示すグラフである。

第２図は、ヒトの滑液繊維芽細胞によるヒアルロン酸（ＨＡ）のイン・ビトロ生合成における（Ａ）ＨＡ単独、（Ｂ）ベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４■）単独、（Ｃ）ＨＡと５Ｐ５４の組み合わせの効果を示すグラフである。

第３図には＋ａＣのＮＭＲのデータから得られたベントサン・ポリ硫酸と亜鉛原子［Ａ）とカルシウム原子［Ｂ］とで形成された錯体中での亜鉛原子［Ａ］とカルシウム原子［Ｂ］の位置が黒い球で示されている。亜鉛錯体［ＡＥ中では金属がベントサン環の間のくぼみに存在し、（Ｂ）ではカルシウムが糖の環のＣ−３の位置とＣ−５の位置を横断し且つ硫酸基に近い位置を占めている。

第４図はｐＨ７，０のヘペス（Ｉ（ＥＰＥＳ）　Ｍｋ液（５０ナノモル）を用いて行ったＤＨ４０Ｇのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５りＴｉ５ｓｕｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、第９巻、２４７〜２４９頁、１９８２年）を用して分析した。また、Ｚｎは原子吸光分光分析により決定してｕｇ／−の単位で示している（−）。

第５図は、ベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４■）（・）、ＤＨ４０Ｊ　（ム）　、ＤＨ４０Ｙ　（△）によるヒトの顆粒球エラステーゼ（ＨＧＥ）の阻害効果を示すグラフである。これら３種の薬剤に対するＩ　Ｃｓｎ　（ｕｇ／ｍｊりが示されている。

第６図は、ベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４■）（■）、ＤＨ４０Ｊ（・）、Ｚｎ５Ｏ＝　　（ロ）、Ｚｎ５Ｏ，＋　Ｓ　Ｐ５４■を（１：　０．１８）の割合にしたもの（○）によるヒトの顆粒球エラステーゼ（ＨＧＥ）の阻害効果を示すグラフである。

第７図は、モルモットの血漿に対するヘパリン（腸）、ベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４■）（・）　、ＤＨ４０Ｊ　（ム）、ＤＨ５０（Δ）　、ＤＨ８０（Ｘ）の抗凝固効果を示すグラフである。

第８図は、モルモットの血漿に対するヘパリン（◆）、ベントサンポリ硫酸（ＳＰ５４■）（・）　、ＤＨ４０Ｇ　（■）、ＤＨ４０Ｊ（ム）の抗凝固能を示すグラフである。

第９Ａ図は、正常なヒトの血漿の凝固時間に対するヘパリン（ム）、５Ｐ５４■ （・）　、５Ｐ５４＠＋　Ｚｎ　”を（１：０．１７６）または（１：０．２２）の割合にしたもの（○）　、ＤＨ４０Ｊ　（◆）、Ｄ８４０Ｙ　（■）またはＺｎ５Ｏａ　　（Ｘ）の効果を示すグラフである。

ｊｌＥｓＢ図は、モルモットの血漿に対するヘパリン（◆）、ベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４＠）（ム）、デキストラン・ポリ硫酸（ＤＳ５０００）　　（・）、デキストラン・ポリ硫酸（ＤＳ５０００）十Ｚｎ５Ｏ＜を（１：　０．４７）の割合にしたもの（０）、デキストラン・ポリ硫酸（ＤＳ５０００）とＺｎキレートの錯体（鑓）、Ｚｎ５Ｏ。

（φ）の抗凝固効果を示す図である。

第１０図は、（マクロファージ上澄み液中の＞ＩＬ−１を媒介とする軟骨のイン・ビトロでの分解に対する薬剤の阻害効果を評価するのに使用した方法の概略図である。ウサギの関節の軟骨内のプロテオグリカンを標識するのに”ＳＡを使用した。ウサギの腹腔内に活性化されたマクロファージを蓄積するのを促進するためにチオグリコレートを使用した。

第１１図は、ＩＬ−１を媒介とするウサギの軟骨組織のイン・ビ）ｏでの分解に対するＤＨ４０Ｇまたは対照である生理食塩水の効果を示すグラフである。対照群では、（■）＝培養された軟骨組織のみ、（ロ）＝軟骨＋５Ｘ　１０’マクロフアージ、（−）＝軟骨＋マクロファージ媒地をｌ：１０に希釈したものである。

ＤＨ４０Ｇの群では実験条件が対照群と同じであったが、２００ｕｇ／ｒＲ１，の薬剤が使用された。

第１２図は、ラットの空気腔に移植した関節の軟骨を（１）生理食塩水（■）、（２）ペプトン（ロ）　、（３）ペプトン＋ＤＨ４０Ｊ　（ロ）を１０ａ＋ｇ／ｋｇ／日の割合で使用して７日間処置したちのプロテオグリカンの含有量（ウロン酸により決定された）を示すグラフである。＊＊は薬剤で処置しなかった群（２）とは統計的に異なることを示している（ｐ＜　０．００１）。

第１３図は、（１）生理食塩水（■）、Ｃ）ペプトン（ロ）　、（３）ペプトン＋ＤＨ４０Ｊ　（ロ）を１０ｍｇ／ｋｇ／日の割合で使用して７日間処置したラットの空気腔から取り出された関節の軟骨から４．０モルのＧｕＨＣ１プロテオグリカンを抽出する能力を示すグラフである。＊＊は薬剤で処置しなかった群（２）とは統計的に異なることを示している（　ｐ　＜　０．００５）。

第１４図は、ラットの空気腔に移植した関節の軟骨を（１）生理食塩水（■）、（２）ペプトン（−）　、（３）ペプトン＋ＤＨ４０Ｊ　（ロ）を１０＋ｎｇ／ｋｇ／日の割合で使用して７日間処置したものから抽出されたプロテオグリカンの凝集度（全体の存在量の％表示）を示すグラフである。＊＊は薬剤で処置しなかった群（２）とは統計的に異なることを示している（ｐ＜　０．００１）。

第１５図は、骨関節炎の滑液から得られたヒトの繊維芽細胞系によるＤＮＡ合成に対するベントサンポリ硫酸（ＳＰ５４＠）（・）、ＤＨ４０Ｊ　（■）　、Ｚｎ５Ｏ，（ロ）　、Ｓ　Ｐ　５４＠＋　ＺｎＳＱ、を（１，Ｏ：　０．２）の割合にしたもの（０）の効果を示すグラフである。

第１６図は、ウサギの関節の軟骨によりプロテオグリカンをイン・ビトロで合成する際のベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４＠）（・）　、ＤＨ４０Ｊ　（ム）　、ＤＨ４０Ｙ　（△）の効果を示すグラフである。示されている数値は、平均± 標準偏差であり、ｎ＝４である。本は５Ｐ５４＠から統計的に有意に異なる値であることを示している（ｐ＜　０．００１）。

第１７図は、骨関節炎の滑液から得られた繊維芽細胞によるヒアルロン酸のイン・ビトロ生合成での各種濃度（モル）におけるハイドロコーチシンの効果を示すグラフである。

口＝平均、　口＝標準偏差。

第１８図は、骨関節炎の滑液から得られた繊維芽細胞によるＤＨ４０Ｊのイン・ヒト、口生合成での各種濃度（υｇ／ｍｌりにおけるハイドロコーチシンの効果を示すグラフである。

−＝平均、　口＝標準偏差。

（注）：ＤＨ４０Ｊは０．１０ｕｇ／ｒｄでは同じ濃度の５Ｐ５４■よりも約２倍の刺激性がある。

第１９図は、骨関節炎の滑液から得られた繊維芽細胞によるイン・ビトロでのヒアルロン酸生合成でのハイドロコーチシン（１０−＠モル）と各種濃度のベントサン・ポリ硫酸（ＳＰ５４■）の相乗効果を示すグラフである。

口＝平均、　口＝標準偏差。

（注）：ハイドロコーチシンにより抑制されるＨＡの生合成は０．２５ｕｇ／　＋ａｌｌ’で完全にではないが、はとんど対照値に回復する。

第２０図は、骨関節炎の滑液から得られた繊維芽細胞によるイン・ビトロでのヒアルロン酸生合成でのハイドロコーチシン＜２０−”モル）と各種濃度のベントサン・ポリ硫！（ＳＰ５４■）　。

の相乗効果を示すグラフである。

口＝平均、　口＝標準偏差。

（注）：５Ｐ５４＠の濃度が０．１〜１．　Ｏｕｇ／　ｔａｌｌでは、たとえハイドロコーチシンが存在していても生合成の値が完全に対照値に回復する。

第２１図は、骨関節炎の滑液から得られた繊維芽細胞によるイン・ビトロでのヒアルロン酸（ＨＡ）の生合成におけるハイドロコーチシン（１０１モル）と各種濃度のＤＨ４０Ｊの相乗効果を示すグラフである。

旺＝平均、　口＝標準偏差。

（注）：ＤＨ４０Ｊの濃度が０．２５ｕｇ／−で、ＨＡの生合成の値が対照値に回復する。

ヘパリンや、コンドロイチン、デルマタン、キチン、デキストラン（ポリグルコース）、キシラン（ポリペントース）、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチン、イヌリン、ヒアルロン酸から誘導されるポリ硫酸多糖類が種々の生物学的活性を有することは確認されている。ヘパリンは自然に生成される唯一のポリ硫酸多糖類である。最も広く研究されている活性は、酸性または中性のブロティナーゼ（例えばヒトの顆粒球エラクターゼ、ＨＧＥ　）およびリソームヒドロラーゼ（例えばヒアルロニダーゼ）の抑制効果、抗ウィルス活性（例えば単純庖疹）、抗炎症活性、抗凝固活性である。

特定のポリ硫酸化多糖類の生物学的活性の効果が商業的な開発に結びつくこともある。その−例は主としてポリ硫酸化コンドロイチンのみで構成されるアルテパロン（ルイトポルドーヴエルク社の登録商ａりである。この化合物は抗関節炎剤として使用されている。

別の例は、ベントサン・ポリ硫酸のナトリウム塩である５Ｐ５４（ベネヒエミー　ゲーエムベー／’　−（ＢｅｎｅｃｈｅＩＩ＋ｉｅ　ＧｍｂＨ））の商標）である。この化合物は抗血栓症剤、動脈硬化症抑制剤、高脂肪血症抑制剤として広く応用されている。

５Ｐ５４（ベネヒエミー　ゲーエムベーハーの商標）は、平均分子量が約６０００ドルトンでイオウの含有量が約１６％である半合成キシロシドポリ硫酸のナトリウム塩である。この化合物は、１９６０年代の初期から、合成ヘバリノイドおよび血栓症抑制剤と、　して知られている。構造式は以下の通りである：その特性は、「ポリ硫酸化多糖類−酸性エステルによるフィブリノリーゼとトロンボリーゼの活性化（Ａｋｔｉｖｉｅｒｕｎｇ　Ｄｅｒ　Ｆｉｂ−ｒｉｎｏｌｙｓｅ　Ｌｌｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｅ　Ｄｕｒｃｈ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｓｃｈｗｅｆｅｌ−Ｓａｕｒｅｅｓｔｅｒ）」、Ａｒｚｎｅｉｍ、−Ｆｏｒｓｃｈ　、　第１２巻、５７４頁、　（１９６２年）というタイトルの論文にハルセ　テーバ−（Ｈａ　Ｉｓｅ、　Ｔｈ）が記載している。この化合物は、カルブヘン　デーア−（Ｋａｌｂｈｅｎ、　ＤＡ）が’Ｐｈａｒｎ＋ａｃｏ１ｏｇｙ″、第９巻、７４頁、’（１９７３年）に報告しているように抗炎症特性も有することが知られている。

５Ｐ５４がＰＭＮエラスターゼとそれ以外の酵素を阻害することが少し前から知られている。また、ＰＭＮエラスターゼが、関節の軟骨を含む結合組織を多く分解させることも知られている。従って、研究者は、阻害のメカニズムを明らかにして、炎症とりニーマチを抑制する薬のブロティナーゼ指向の阻害剤としての可能な機能を発見しようと試みている。このような研究の一例がバイチ（Ｂａｉｃｉ）他によって＝ＢｉｏｃｈｅｌＩ、　Ｐｈａｒｇａｃｏｌ、’第３０巻、７０３頁、（１９８１年）に報告されている。この論文では、５Ｐ５４■が蛋白質分解酵素および加水分解酵素の強力な阻害剤であることが示されている。

さらに、アントリユース（Ａｎｄｒｅｗｓ）達は”ＣｈｅＩＩｌ、Ｂｉｏｌ、　Ｉｎｔｅｒ−ａｃｔｉｏｎｓ”、第４７巻、１５７頁、（１９８３年）において５Ｐ５４＠が関節の軟骨と結合組織に結合することを明らかにした。

本発明者は、理論にとられれることなく、関節の軟骨とそれ以外の結合組織が疾患状態で分解されるのが５Ｐ５４■によって保護され、しかも、正常機能への修復および回復を促進する機能を有する可能性があると考えている。

アルテパロン■はルイトポルド　ゲ　エム　ペ　バーが製造しているムコ多糖類・ポリ硫酸のエステルである。さらに詳細には、アルテバロンはヘテロな半合成グリコースアミノグリカンポリ硫酸塩であり、主成分（約９３％）のジサッカライドの繰り返し単位はガラクトースアミンにグリコシド結合したヘキスロン酸である。アルテパロンのジサッカライドの繰り返し単位の約４個の自由なヒドロキシル基がサルフェート基によってエステル化されて、イオウの含有量が約１３．０重量％になっている。

市販されている製品は分子量が約１０．０００ドルトンである。

この効果を示しているのが第１図のデータであり、このデータから、５Ｐ５４とアルテパロン■がヒトの関節炎（ＯＡ）の滑液の繊維芽細胞内でのヒアルロン酸（ＨＡ）の生合成が濃度とともに促進されることがわかる。アルテパロンはＨＡの生合成を促進する効果を有することが知られている（フェルブルッゲン（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ）とヴエイス（Ｖｅｙｓ）、’Ａｃｔａ、　Ｒｈｕｏ＋ａｔｏｌ　Ｂｅ１ｇ、”、第１巻、７５〜９２頁、１９７７年）が、５Ｐ５４のこのような効果は今まで報告されていないことに注意されたい。スミス（Ｓ＋ｎ１ｔｈ）とボッシュが最近の出版物である”Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ’第７巻、１１３〜１２２頁、１９８７年において、高分子量（＞　３．０Ｘ１０６　ドルトン）のＨＡも滑液繊維芽細胞によってノボＨＡの合成を促進することを示した。本発明者は、この効果が、Ｔルテバロン■または５Ｐ５４■を高分子量のＨＡ調製物に添加することにより増大することを見出した。この様子が第２図に示されている。この図から、高分子量のＨＡと５Ｐ５４を組み合わせて培養中の結合組繊細胞に添加すると、いずれかの物質を単独で使用した場合と比べてＨＡの合成量が多くなるということが分る。

アルテバロン■または５Ｐ５４■は関節結合組織を破壊するプロテアーゼの強力な阻害剤である。これらの物質は、先に述べたようにヒアルロン酸塩の分解に関与するＰＭＮ細胞のように、炎症を起こしている関節の細胞への侵入を抑制する。このように、本発明者は、５Ｐ５４とアルテバロンの両方が関節のヒアルロン酸塩と関節の軟骨の正常化を保護かつ促進し、しかも、効果的な生体機能に必要なレオロジー特性を与える高分子量のヒアルロン酸塩と組み合わさって作用するものと考えている。

本発明の第１と第２の観点である上記のポリ硫酸化多糖類には多数の治療の用途があることは知られているが、直線状のポリアニオンとしての基本的構造の類似性からいえるのは、この化合物群の大部分に共通の生物学的活性のみである。当然ながら、各化合物で生物学的活性は異なり、それを予測することはできない。

さらに、１つの化合物の種々の生物学的活性が競合する場合には、その各生物学的活性の種類が科学的には興味があるが、そのような化合物は治療の目的で使用する薬剤としては有害である可能性が多い。

一例を挙げると、関節炎の治療においては、患者は一般に毎日適切な量の薬を数箇月または数年にわたって投与されので、使用する薬は溶血液凝固の無いもの、すなわち血栓活性、線維素溶解活性または血小板減少活性を持ち、鋭い傷や痛みに伴う出血が起こる可能性の無いものでなければならない。

ポリ硫酸化多糖類の場合には、多数の化合物が抗血栓活性または抗凝固特性を有することが知られている。従って、このような化合物は、上記のような長期の治療では使用が特に限定される。

ポリ硫酸化多糖類の生物的作用にはある程度の選択性があることが望ましく、この選択性は多糖類の溝内の硫酸基の置換の程度と位置を変えることによって実現４にしでいる。

ポリ硫酸化多糖類の分子量は生物学的活性の重要なファクターであることも知られている。例えば、リケッツＣＲｉｃｋｅｔｔｓ）は’Ｂｉｏ−ｃｈｅｗ、　Ｊ、”、第５１巻、　１２９〜１３３頁、（１９５２年）で、デキストランポリ硫酸の場合には高分子類縁体が低分子類縁体よりも毒性が大きいことを報告している。また、硫酸化の程度が抗凝固活性を決定する重要な因子であることも見出されている。

さらに、ヘパリンのＦＬ凝固活性は使用する分画の分子サイズに依存することも知られている（カス　ビー（Ｃａｓｕ、　Ｂ）、＝Ａｄｖａｎｃｅｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、第４３巻、５１〜１３４頁、１９８５年）。

最近、”Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｓ　ｄｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙａｎａｍｉｅ　ｄｅＴｈｅｒａｐｉｅ”　、第２８２巻、２号、１９６〜２０８頁、（１９８６年）に発表された論文で、著者は５Ｐ５４＠の高分子類縁体（ＳＲ２４７５１）と５Ｐ５４＠が細胞外マ）　ＩＪフックスの蛋白質グリカンの取込みを改良するイン・ビトロで活性があることを示した。しかし、５Ｐ５４＠の低分子量の分画（ＳＲ２５４９１）とアルテバロン■（ルイトボルドーヴエルク社の登録商標）は不活性である。

上記の組合せで用いるヒアルロン酸塩は、その分子サイズが処理する動物の関節中で見出される正常なサイズ範囲に収まっていることが好ましい。ヒトの治療の場合の好ましいヒアルロン酸塩の供給源はディー　カリスーヒルのＰＣＴ出願であるＰＣＴ／Ａ　Ｕ３６１００１２９に開示された方法によりウシの滑液から得られたものである。

既に述べたように、コーチコステロイドは獣医学および医学の両方で広く応用されている極めて強い炎症抑制剤であるが、その弱点は、この薬剤が結合組織の新陳代謝を抑制することであり、治療しようとする関節および組織にとって極めて有害なことである。これに対して、本発明者は、炎症抑制用のコーチコステロイドと、ポリ硫酸化多糖類であるキシランポリ硫酸、アルテパロン０、デキストラン硫酸、デルマタンポリ硫酸、キトサンポリ硫酸などとを組み合わせて使用することにより、コーチコステロイドの上記抑制作用を減らすことができるということを見出した。

例えば、ハイドロコーチシンを８週間にわたって毎週関節に投与すると、治療したウサギの関節からプロテオグリカン（ＰＧｓ）が失われることが知られているしエーゲマ（Ｏｅｇｅｍａ）とベーレンス　（Ｂｅｈｒｅｎｓ）、”Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ゛Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ−ｉｃｓ”、第２０６巻、２７７〜２８４頁、１９８１年〕。しかし、本発明者は、このグルココルチコイドを本発明のポリ硫酸化多糖類と組合わせて用いた場合には、関節の軟骨からのプロテオグリカンの劣化と損失が回避できることを見出した。

ハイドロコーチシン（５０＋ａｇ）と、ベントサンポリ硫酸（５ｍｇ）をウサギの関節中に投与した場合の結果が、ハイドロコルチゾン＜５０ｍｇ）単独の場合と比較して、第１表に示されている。この表かられかるように、ハイドロコルチゾンと５Ｐ５４＠の組合わせにより、ヘキスロン酸塩の損失が減少しくブロテオグリカされたＰＧｓマトリックスのノボ生合成（比活性）が大きくなることがわかる。

本発明で効果的に治療可能な関節の炎症には関節炎、腿鞘炎、滑液包炎が含まれる。効果的な治療とは病気に伴う痛みが軽減され且つ正常な関節機能が回復するということを意味する。

本発明の組成物の好ましい投与法は、適当な病理組織、例えば関節炎の滑液空腔に直接に注入を行うことである。このような場合の基剤は通常殺菌生理食塩水である。しかし、本発明者は本発明の高濃度の組成物を全身（筋肉内、皮下、静脈内への局所）投与することができることも見出した。

上記のヒアルロン酸塩と、コーチコステロイドと、結合組織の一体化を維持することのできる化合物の実際の投与量は、被治療動物の種類、大きさ、被治療組織または関節の病状に応じて広い範囲で変えることができる。

本発明の一実施例では、外傷性関節炎または炎症性関節炎を患っているイヌ科の動物に、５ｍｇのヒアルロン酸ナトリウムと、５Ｈの５Ｐ５４とを殺菌生理食塩水１ｍｌに溶解させた注射液を、後膝関節または掌関節に注入したところ、投与後５日間のうちに機能の回復が見られた。

ウマの場合には、２−の殺菌生理食塩水中に２５ｍｇのヒアルロン酸塩と、注射する関節または組織に応じて２５．５０または１００　　、Ｈの５Ｐ５４とを組み合わせて溶解させたものを用することができた。

コーチコメテロイド／ペントサンポリ硫酸の組合わせで、足を悪くしたレース用グレーバウンドの疾患のある関節に５．　ｈｇのベントサンポリ硫酸と２０ｍｇのフルチコステロイドとを一度だけ注射しただけで、優れた治療結果が得られた。筋肉内に投与する場合には５０ｍｇのベントサンポリ硫酸と８０ｍｇのハイドロコーチシンまたはメチルプレドニソロンアセテートとを用いた。

当然、ナトリウム塩（ＳＰＳ’ｌ）以外のアルカリ金属塩も同様な効果を有することが期待される。

本発明者は、本発明の第１の対象であるポリ硫酸化多糖類き、コーチコステフイドあるいはヒアルロン酸またはその水溶性塩とを含む組成物が有用であることを見出したが、さらに、ポリ硫酸化多糖類が特定の錯体として存在している場合には、このポリ硫酸化多糖類による血液凝固機構が大幅に抑制されると同時に、抗関節炎活性および抗炎症活性が向上することを見出した。有効なポリ硫酸化多糖類はデキストラン、キシラン、コンドロイチン、デルマタンおよびヒアルロン酸からなる群から選択された多糖類であると考えられ、効果的な錯体はこれらのポリ硫酸多糖類と、多価金属イオン、Ａｇ”およびＡｕ・および第四アンモニウム化合物との間に形成される錯体である。

好ましい多糖類はキシラン・ポリ硫酸であり、最も好ましいのは５Ｐ５４＠である。

上記の特定の錯体は、Ａｇ＋、Ａｕ”、Ｃａハ、Ｍｇ２−１Ｂａ　２　＊、Ｐｂ ”、Ｃｕ　２　＊、Ｚｎ”、Ａ　ｕ　２　＊、Ｐｄ”、Ｐｄ”″、Ｐｔ”、Ｐｔ ”、３価金属イオンおよびに第四アンモニウム化合物の錯体からなる群の中から選択される。第四アンモニウム化合物の例としては塩化ピリジニウム、テトラアルキルアンモニウムクロライド、塩化コリン、塩化セチルピリジニウム、Ｎ−セチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−）リアルキルアンモニウムクロライドまたはこれらの誘導体がある。

これらのうちで最も好ましいものは亜鉛錯体である。

本発明者はオーストラリア特許出Ｈ’Ｓ、　２４４１２／８４号（サノフィ（Ｓａｎｏｆｉ）達）を知っている。この特許出願には、ヘパリンよりも大きな抗血栓活性と抗凝固活性とを持つ特定のキシラン硫酸がが開示されている。この発明の要点は特定の分子量分画と硫酸塩化度を有する５Ｐ５４を選択したことにある。この発明者、　は、この発明の組成物がリューマチ性関節炎、関節症、骨関節炎の治療に有効であると述べているが、これらの特性は全く定量化されておらず、しかも５Ｐ５４がそのような活性を持つことは知られているので、この発明の組成物が上記の治療に有用であるという主張は驚くべきものではない。

本発明者はさらに、アメリカ合衆国特許第４４６５６６６号（ルカス　（Ｌｕｋａｓ）達）とヨーロッパ特許第１２１１５号（ルカス達）も知っている。これら特許には亜鉛イオンと、ヘパリンデキストラン硫酸およびポリビニル硫酸から選択した酸性の硫酸化多糖類またはポリマーとを含む組成物が開示されている。また、これ以外の酸性硫酸化多糖類であるコンドロイチン硫酸、カラギナン、ポリベントサン硫酸、デキストラン硫酸、ポリグルコース硫酸などを使用することも開示されている。さらに、薬理学上許容可能な塩であるこれら酸性硫酸化多糖類のカリウム塩およびす）　＋Ｊウム塩も有効であると記載されている。

しかし、この従来技術は本発明の化合物を開示しておらず、また、これらの化合物が本発明者によって見出された効果を持つことを示唆もうしていない。

本発明者は、本発明の錯体中の金属が多糖類の炭水化物環に存在する特定の硫酸エステルと酸素原子に対して異常に強い親和性を有することに起因して、上記金属がポリマー鎖のコンホメーション（形！Ｉｓ）と剛性とを変化させて、その生物学的活性に影響を与えることを示した。

この生物学的活性は、上記錯体を本発明で説明する方法またはそれと等価な方法で製造した場合にのみ得られる。この錯体は、そのマイクロ分析とＩ３０のＮＭＲ分析結果から分るように極めて明瞭に定義されている。また、単に亜鉛イオンを硫酸化多糖類と種々の割合で混合（これは、抗ウィルス活性を与える手段としてアメリカ合衆国特許第４４６５６６６号とヨーロッパ特許第１２１１５号（ルカス達）に記載されている）したとしても、以下で説明する３つの実施例に示すような本発明の金属錯体の生物学的活性を再現することはできない。

ルカス達が作った混合物が抗ウィルス活性を有する理由は、高分子量のポリマー、例えば、分子量が８Ｘ１０’〜２Ｘ１０“のデキストラン硫酸を用いたためと考えられる。これに対して、本発明では分子量が３０．０００以下のポリマーが使用される（例えば５〜１０．０００ドルトンのデキストラン硫酸および３〜１０．０００ドルトンのキシランポリ硫酸）。また、ルカス達は、亜鉛に対してポリ硫酸多糖類を非常に高い割合で用いているが、こうすると、大抵の場合、特許請求の範囲に記載の純粋な化合物中に存在するポリ硫酸多糖類が過剰になることに注意されたい。

本発明者はＡｇ”、Ａｕ”、二価金属の（ａ　２　＊、Ｍｇ２＋、１３　ａ　２　ｉｖ、Ｐｂ’◆、Ｃｕ”、Ｚｎ”、Ａｕ１、Ｐｄ”、ｐｔ”、三価金属のＰｄ ”、ｐｔ”の錯体とは第四アンモニウム錯体とは新規化合物であると考えている。

また、亜鉛錯体は関節炎およびそれに関連した関節炎症の治療にのみ有効であることも見出した。本発明者は他の錯体も同様の特性を有するものと考えている。

本発明者は、また、二価金属および三価金属とのキレ−ジョンによって得られた上記のポリ硫酸化多糖類の独特な生物学的活性は、この置換基が置換可能なサイトを１００％置換したものに限定されないということも見出した。すなわち、多価金属、特に二価金属または三価金属で一価のイオンを重量１モルの単位で１％〜１００％の範囲で置換したものも、ポリ硫酸多糖類のコンホメーションを変化させて、生物学的活性に影響を与えるということも見出した。この典型的な実例としては、キシラン硫酸塩のナトリウムイオンを亜鉛イオンで８．５％、８３％、１００％置換した例が挙げられる。

亜鉛がベントサンポリ硫酸に侵入した３種の錯体、すなわちＺｎが８．５％のもの（ＤＨ４０Ｇ）　、Ｚｎが８３％のもの（ＤＨ４０Ｊ）およびＺｎが１００％のもの（ＤＨ４０Ｙ）から得られたＩＩＣのＮＭＲのデータは、キレート化した亜鉛の量が増加するにつれて結合が増加することを示している。このことから、錯体のコンホメーション（体配座）の剛性はＤＨ４０Ｇ　（Ｚｎが８．５％）　、ＤＨ４０Ｊ　（Ｚｎが８３％）　、ＤＨ４０Ｙ　（Ｚｎが１００％）の順番で大きくなると推論することができる。また、生物学的データからは、全てのＮａ ’″が亜鉛で完全に置換されると非常に剛性の強いコンホメーションになることは明らかである。

この結果から、これらのポリ硫酸化多糖類のメタロ錯体を形成することによって、選択された金属を体内組織に移動させる有効な手段が提供される。すなわち、ナトリウム、カリウム、アンモニウムなどの水に溶かしたときにそれぞれのイオンに解離する公知のポリ硫酸化多糖類の塩とは異なり、本発明の錯体は水性媒体または生物的媒体中で解離しない。

１ｓＣのＮＭＲスペクトルの分析結果から、亜鉛およびそれよりも少量のＭｇ” はそのイオン半径と電子配置が異なるため、それより大きな原子であるＣａす、Ｃｕ←、Ｂａ”″、Ｆｅすなどとは全く異なるポリ硫酸多糖類鎖中のサイトを占めることが分る。これら錯体の各々が取るコンホメーション（立体配置）が第３図Ａと第３図Ｂに示されている。この図から、ベントサン・ポリ硫酸錯体の場合には、グリコシド結合の酸素と、隣接する毒の２と３°の位置にあるイオウエステルの酸素とが効果的に亜鉛と相互作用する位置を占めるということは明らかである。これらの錯体をエネルギ的に有利にし、従って安定化させるような各層の間の空間にするのは、亜鉛が複数のサイトへと相互作用できるためである。この亜鉛錯体の生物学的活性が他の金属との間に形成された金属錯体とは異なるということは重要なことである（生物学的活性の項を参照のこと）。

本発明の化合物は、ＩＪ、−マチ性関節炎、骨関節炎、それに関連する関節疾患の状態の治療のほか、癌や傷の回復に特に有効である。この化合物には抗ウイルス性も期待できる。

これらの効果は、本発明の化合物がセリンプロテイナーゼ、例えばヒトの顧粒球エラスターゼ（ＨＧＥ）、プラスミノーゲン活性化因子および腫瘍の出すエラスターゼの放出とその作用を阻害する能力を有するために得られるものと考えられる。骨関節炎やリューマチ性関節炎においては、関節結合組織のプロテオグリカンがブロテ、イナーゼによって過度に分解されて不足しているので、この阻害能は重要である。なお、細胞外マトリックスのプロテオグリカンは組織に弾性を与え、従って、組織の生体機構の完成にとって重要なものである。

全ての組織において、癌細胞の転移は、細胞外マトリックスの分解して、腫瘍性細胞が他のサイトに増殖、移動するか否かによって決まる。増殖する癌細胞が生存を続けるためには良好な血液の供給を必要とし、また、癌が宿主の組織内で発育するためには、マトリックスが分解して血管中に侵入することが必要である。

毛細血管の癌細胞と活性化された内皮細胞は、細胞外マトリックスを直接、間接に分解することのできる酵素を放出することによってこの目的を達成する。特に重要なものは、癌細胞が血液起源のチモーゲン、例えばプラスミノーゲンを活性化するのに使うセリーンプロテイナーゼ（プラスミノーゲンアクティベータやエラスターゼ様酵素などの）と、正常な結合組繊細胞の潜在的酵素、例えばメタロプロテイナーゼ（コラーゲン、プロテオグリカナーゼなど）と、細胞外マトリックスを直接、間接に分解することのできるセリンプロテイナーゼチモーゲンである。本発明のメタロ多糖類ポリ硫酸は、哺乳類の癌細胞系の生成するセリンプロテイナーゼの強力な阻害剤であり、従って抗癌剤／抗転移剤としての潜在的な効果を有する。効果的である金属イオンはＡｇ”、Ａｕ”、Ａ　ｕ　２０、Ｐｄ” 、Ｐｄ”″、Ｐｔ”、Ｐｔ”である。

さらに、本発明者は、本発明の化合物は、錯体状態でない場合よりも抗凝固性が少ないことを確認した。上記のような炎症性関節病の治療が長期にわたる場合には、この抗凝固活性が低いことは重要な利点となる。

また、本発明の化合物は、各種の結合組繊細胞（例えば繊維芽細胞、軟骨細胞、繊維軟骨細胞）における有糸分裂およびＤＮＡ合成を促進させることも分かっており、さらに、マトリックス要Ｓ（プロテオグリカン、ヒアルロン酸塩、コラーゲン）の生合成を活性化する能力を有しているので、損傷を受けた組織の回復および修復に非常な効果がある。以下、有効な生物的特性の例を示す。

ポリ硫酸化多糖類と金属錯体の製造この錯体はポリ硫酸化多糖類から作られる。ポリ硫酸化多糖類は、市販の原料である例えばアメリカ合衆国、ミズーリ、サン　ルイのシグマ　ケミカル社（Ｓｉｇｓ＋ａ　Ｃｈｅ＋１ｉｃａｌ　Ｃｏ、）のデキストラン硫酸ＭＷ５０００または５ｏｏｏや、ドイツ連邦共和国、ミュンヘン、アルッナイミッテルのベネヒエミー社のベントサンポリ硫酸（Ｓ、Ｐ　５４■）として入手可能である。

コンドロイチンポリ硫酸は（アルテバロン０、ドイツ連邦共和国、ミュンヘンのルイトポルド　ヴエルク社）として入手可能であり、あるいは、市販の多糖類である例えばキシラン〔アメリカ合衆国、ミズーリ、サン　ルイのシグマ　ケミカル社、スイス国のフル力　ケミカル社（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））や、デキストラン、キチンおよびアミロース〔スウェーデン、ルンドのバイオカーブ　ケミカルズ（Ｂｉｏｃａｒｂ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社〕の硫酸塩化またはウィルキー＜ｌ１ｉｌｋｉｅ）が、“Ａｄｖａｎｃｅｓ　ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓＣｈｅａ＋、　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、”　、第３６巻、２１５〜２６４頁、（１９７０年）に記載の方法、またはホイッスラー（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ）およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）がビグマン（ＰｉｇＩＩｌａｎ）とホートン（）Ｉｏｒｔｏｎ）編、アカデミツク・プレス社のｒ　（）Ｉｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）　Ｊ　、第２版、第■巻Ａ　（１９７０年）に記載の方法と抽畠法と精製法に関する他の文献の方法とを用いて、天然の供給源から単離された多糖類の硫酸塩化により得ることができる。

（Ａ）多糖類の硫酸塩化実施例：キシランポリ硫酸の製造乾燥した市販のキシラン（アメリカ合衆国、ミズーリ、サンルイのシグマ　ケミカル社のカラマツまたはスベルト小麦から得られたもの）またはピグマンとホートン編、アカデミツク・プレス社の上記ｒ（）Ｉｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）」、第２版、第■巻Ａ　（１９７０年）にホイッスラーとリチャーズが記載しているようにして他の供給源から単離したキシランを、リケッツがＢｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、第５１巻、　１２９〜１３３頁、（１９５２年）に記載している一般的な方法を用いて、乾燥ピリジン中の冷却したクロロスルフォン酸に素早く撹拌しながら添加することにより硫酸塩化する。キシラン−クロロスルフォン酸−ピリジンの混合物を６５℃に６時間維持し、冷却し、激しく撹拌しながら粉砕した氷の中に注ぐ。次に、ｐＨが７になるまで濃ＮａＯＨ溶液（４０％ｗ　／　ｖ　）を添加する。この溶液を濾過し、エタノールを加えてシロップ状の粗キシランポリ硫酸を沈澱させる。このシロップを分離し、水中に再度溶解させ、エタノール／水による一連の沈澱操作を行って最終シロップを得る。この最終シロップを水（ｐｉ（＝２．０）に溶解し、水に対して透析する。これによって、透析不能な塩を含まないキシランポリ硫酸が得られ、凍結乾燥によりナトリウム塩となる。この硫酸塩化法は、デキストランポリ硫酸のナトリウム塩を製造するのにリケッツ（上記文献）が記載している方法と同じである。次に、このキシランポリ硫酸を所望の分子サイズにの分画するために、このナトリウム塩をイオン化力の大きな０．５モルのＮａＣ］の緩衝液に溶解させ、この溶液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　　Ｇ　７５　　またはセファクリル（Ｓｅ−ｐｈａｃｒｙｌ）　　０２００カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行う。別の分画方法としては、高性能液体クロマトグラフィー、メンブレン濾過法、例えば１０．　ＯＯＯＭＷのカットオフ・フィルタを有するアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＲＡ２０００システムを用いた中空ファイバ法またはドクター（Ｄｏｃｔｏｒ）とサウルス（Ｓａｕｌｓ）が“Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ″、第３０巻、５７３〜５７８頁、（１９８３年）に記載した方法を用いたイオン交換クロマトグラフィーがある。

（Ｂ）硫酸塩化多糖類の金属キレート錯体への変換ＤＨ４０Ｙ　（亜鉛置換１００％）　、ＤＨ４０Ｊ　（置換８３％）、ＤＨ４０Ｇ　（置換８．５％）の製造側購入）キシランポリ硫酸のナトリウム塩（５（Ｌ　Ｏｇ　）を１００艷の蒸留水に溶解させ、陽イオン交換カラムを通した。このカラムは例えばドウｘ７クス（Ｄｏｗｅｘ）　５０Ｗ−Ｘ　２　（２０〜５０メツシユ）であり、予め酸性の形（Ｈ’″）に変換されている。十分な樹脂を使用して、キシランポリ硫酸のナトリウムイオンがＨ◆によって完全に置換されるようにする。５０．０Ｈの５Ｐ５４■に対しては５００ｇの樹脂で十分であった。分画のｐＨをｐＨ電極を用いてモニタし、キシランポリ硫酸はファーンデイル（Ｆａｒｎｄａｌｅ）、セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）、バーレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）が−ＣｏｎｎｅｃｔｉｖｅＴｉｓｓｕｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ”、第９巻、２４７〜２４８頁、（１９８２年）に記載した方法でモニタした。先ず、カラムから遊離酸を２００ｄｒｓ離し、その分画をプールし、その一部を等モル量の亜鉛塩を用いて直接中和して亜鉛錯体に変換した。この中和の終点は、塩基性亜鉛塩（例えば酢酸亜鉛）を用いて電位差滴定方式で決定することもできる。

上記のキシランポリ硫酸の遊離酸溶液にＺｎ〜とＮａ”イオンを必要な割合で含んでいる適量の溶液を添加することによりナトリウム−亜鉛−キシランポリ硫酸錯体（ＤＨ４０ＧとＤＨ４０Ｊ）の混合物を得た。中和のためのｐＨ変化をモニタし易くするためにこれら金属の酢酸塩を用いた。この方法で、任意の塩を任意の量で組合わせることが可能であるが、場合によってはポリ硫酸化多糖類塩が沈澱することもある。特にキシランポリ硫酸とデキストランポリ硫酸のＢａ−錯体とＰｂ−錯体の場合には沈澱し易く、これとは逆に、Ｚｎ’″°錯体は非常に水に溶けやすかった。

方法２：方法１に記載の方法で製造した遊離酸の形のキシランポリ硫酸を陽イオン交換カラム（例えばドウエックス５０Ｗ−Ｘ２またはデュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ）　Ｃ２５）に通した。この方ラムは予め交換に必要な陽イオンの形（例えばＺｎ −１Ｍｇ”″、Ｃｕ−１Ｃａ’″３など）に変換されている。蒸留水を用いてカラムからキシランポリ硫酸金属錯体を溶離した。各分画は方法１に記載のファーンデイル、セイヤーズ、バーレットの方法でモニタした。

方法３：Ｈ４の形にした陽イオン交換樹脂を、ベッド容積の少なくとも２倍の金属の塩（例えばＺｎ５Ｏ，、Ｃｕ５Ｏ，、Ｍｇ５Ｏａ、Ｃａ５Ｏ−）を用いて平衡させて、金属イオンの形に変換した。カラムからもはやＨ′″が溶離しなくなったときを変換の完了とした。次に、カラムを洗浄して未交換の金属イオンを完全に除去した。この段階では遊離のＨ３の形のものが樹脂中に残っていないようにすることが肝要である。次に、蒸留水で硫酸化多糖類のす）　ＩＪウム塩をカラムから溶離した。その間、硫酸化多糖類と金属とを適当な分析法（上記のファーンデイル達の方法で）を用いてモニタしたく例えばＣｕ’″゛はスペクトロスコピーにより、Ｚｎ”は原子吸光スペクトロスコピーによる）。次に、集つめた分画からのポリ硫酸化多糖類の金属錯体の単離は凍結乾燥またはエタノールによる沈澱行うことができる。しかし、後者の方法では必要な錯体が油状の沈澱となり易いので、結晶化させるためには撹拌して冷却する必要がある。

各種ベントサンポリ硫酸のナトリウム塩（例えば５Ｐ５４■）を予備分析したが、全ての条件下で得られる最大の硫酸塩置換度は１繰り返し単位１当たり平均で１．８エステルであった。この理由は不明であるが、これら分子が天然資源から得られた多分散系であるため、置換可能な水酸基の数が変化するためと考えられる。分析のためには実験式においてこの点を考慮するのが普通であり、従って、亜鉛で十分置換されたベントサンポリ硫酸誘導体であるＤＨ４０Ｙの実験式は下記のようになり、（ＣｓＨ＝Ｏｓ、　＊　Ｓ　３．　＝Ｚｎｏ、　ｓ）　−（ただしｎ＝１７）、実験で決定された平均分子量（Ｍ、）は５、５６４である。

第２表かられかるように、実験的に求められた１７．９％というＺｎＯ値は、上記天然起源の高分子の実験式は完全合成された分子よりも不正確である点を考慮すると、計算値の１７．２％とよく一致している。混合塩（Ｚｎ〜／　Ｎａ　＋　’−）の系であるＤＨ４０ＪとＤＨ４０Ｇを分析し、その値から実験式を計算した（２表参照）。

第３表第３表から明らかなように、キシランポリ硫酸のナトリウム塩である５Ｐ５４■ のペントース環の炭素についてのＩｆｆ（のケミカルシフトは、二価金属の錯体に対して得られた値とは異なっている。この差は、５Ｐ５４■中の特定の炭素とそれと同じ金属錯体の炭素のケミカルシフトとの差として求められるΔＨｚの値を用いるとより簡単に評価することができた（第４表）。完全に亜鉛置換されたＤ　Ｈ４０Ｙの場合には、最大のシフト（ΔＨｚ）が電子がシールドされていない炭素４．２．５０所で起こることがわかる。これとは逆に、炭素１．３は５Ｐ５４■の同じ原子と比べてシールドされている（−ｖｅシフト）。このデータは、ＤＨ４０Ｙ中の亜鉛原子が炭素原子４．２の近くに位置する（く４人）必要があり、炭素５からはそれよりも離れているが、炭素１．３からはさらに離れていることを示唆している。シフトの大きさは、錯体での亜鉛の置換度合いに依存し、第４表に示すように、８３％置換（ＤＨ４０Ｊ）と８．５％置換（ＤＨ４０Ｇ）の場合にはΔＨｚが小さい。この結果から、ベントサンポリ硫酸中のサイトが亜鉛原子でより多く占有されるにつれて、フンファメーション（立体配置）が変化し、結合がより強くなると結論することができよう。

ベントサンポリ硫酸のマグネシウム錯体は亜鉛誘導体と似たケミカルシフトの挙動を示すが、変化はより小さい。このことは、「分子の嵌まり込み」と原子の相互作用がＺｎ″“錯体の場合よりも小さいということを示している。

第４表注：　−Ｖｅシフト＝シールドされた＋Ｖｅシフト＝シールドされていない第４表に記載の情報とペントサンポリ硫酸鎮の一部についての分子モデルとを用いることによって、亜鉛原子とマグネシウム原子とが最も占有し易いサイトを予想することができる。このことは第３図へに模式的に示されており、この図では、隣接した環の位置２と３°に結合している硫酸塩の酸素から与えられる電子と、１〜４酸素グリコシド結合の長い孤立電子対とペントース環の酸素の全てが金属錯体の安定化（キレート化）に寄与している。

他方、ベントサンポリ硫酸のカルシウム錯体や銅錯体（ＤＨ５０とＤＨ８０）　　（第４表）の場合には、金属によって影響されるペントース患の炭素原子が全く異なっている。これらの金属錯体では、１．２．４の炭素が強くシールドされているのに対し、３と５の炭素はシールドされていない。これは、ＤＨ５０とＤＨ８０の場合には金属原子が３と５の炭素に近い位置（亜鉛とは反対の側）に局在していることを示している。このような状況は第３図Ｂに示すように可能であり、これら錯体の場合には、同じ環のペントースの２と３の位置の硫酸塩エステルとグリコシド環の酸素の電子とがキレート化に関与すると考えられる。ＤＨ５０とＤＨ８０のスペクトルは温度が上昇すると鋭くなるので、キレート化が分子運動とともに促進されることが結論づけられる。

第４表と第３図に示されたデータから明らかなように、硫酸化多糖類との錯体を形成する際に多価元素によって占有される位置は、原子のイオン半径とその電子配置に強く依存する。硫酸化多糖類の立体配座と柔軟性は金属錯体の安定性に寄与するが、このようにして形成されたキレートが一価の塩（例えばＮａ４、Ｋ９、ＮＨ４”等）の立体配座とは異なるより好ましい全体の立体配座を持つ可能性があることを本実験が示していることに注意することが重要である。

こうした酵素および細胞表面上の受容体サイトに対する官能基の立体配置と存在位置との違いが、多価錯体と一価錯体との差となって現れる。この差の例は生物学的活性の項で説明する。

さらに、＋３０のＮＭＨによってベントサンポリ硫酸の亜鉛錯体であるＤＨ４０ＹとＤＨ４０Ｊの結合強度（解離定数）とナトリウム塩（ＳＰ５４＠）との比較をしただ（第５表）。

５Ｐ５４■の水溶液にＮａＣ１を添加すると、ＩＣのケミカルシフトの値が全体として減少した（第５表）。これは分子の立体配置が変化して、柔軟性が増加したことによる。第５表かられかるように、最も顕著な変化は１．２５モルのＮａＣ１で起こる。逆に、Ｄ８４０Ｙのケミカルシフトの変化がＮａＣｌの添加によって影響を受けることははるかに少なく、これは、競合するＮａ”イオンの存在下での立体配置の変化が小さいことを意味している。このことは、たとえ１．２５モルのＮａＣｌでも、亜鉛イオンはポリ硫酸化多糖類上の所定のサイトから容易には移動しないということを示唆している。

この実験の目的は下記の点を決定することである：（１）合成した幾つかのベントサンポリ硫酸金属錯体の相対的抑制活性の決定。

（２）　この錯体によって得られる抑制活性はベントサンポリ硫酸を種々の割合で亜鉛イオンと単に混合した場合には得られないという証明（ルカス達の米国特許第４４６５６６６号およびヨーロッパ特許第１２１１５号を参照のこと）。

第５表実験は以下のようにして行った：（ａ）　　アントリユース達の方法（”Ｃｈｅａ＋、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔ、”、第４７巻、１５７頁、１９８３年）に従って作ったＨＧＥを用いてこの酵素に対する合成基質を分解した［スクシニル　ジアラニル　バリル　ニトロアナリド（ＳＡＡＶＮＡ）　］。抑制能を広範囲の濃度で求め、５０％抑制定数値（ＩＣ，。）を０．２ミ！Ｊモルのリン酸塩７０．１％のＢ　Ｓ　Ａ／　０．０２５５　）リドンＸ　１００／　３７℃でｐＨ７，４の５％ＤＳＯ緩衝液を用いて１．　ＯｕｇのＨＧＥを５０％抑制する薬剤の濃度（ｕｇ／ｍｆ）として求めた。

Ｓ　Ｐ５４”　、ＤＨ４０ＪおよびＤＨ４０Ｙに対するＨＧＥ抑制曲線が第５図に示されている。この図かられかるように、両方の亜鉛錯体は５Ｐ５４■よりも強力であった。このことはＤＨ４０Ｇに対しても当てはまる。しかし、Ｃｕ　（ＤＨ８０）　、Ｍｇ　（ＤＨ７０）、Ｃａ（ＤＨ５０）ベントサンポリ硫酸錯体は、５Ｐ５４■と同程度の強力さであった（第６表）。

これは、ベントサンポリ硫酸の亜鉛錯体の取る立体配置が、５Ｐ５４＠よりもＨＧＥとより効果的に相互作用することができたということを示唆している。ＤＨ４０Ｊは最も強力なＨＧＥ阻害剤であることがわかった（第６表）。

第６表＃ＤＨ４０（Ｊ）は最も効果的なＨＧＥ阻害剤である。

第７表ヒトの顆粒球エラスターゼ（ＨＧＥ）の阻害に対するＤＨ４０゜５Ｐ５４、硫酸亜鉛、−５Ｐ５４＋硫酸亜鉛の効果ら）　　ＤＨ４０Ｊ、ベントサンポリ硫酸（ＳＰ５４＠）　、硫酸亜鉛（Ｚｎ５Ｏ＝）および（ＳＰ５４’　＋Ｚｎ５Ｏ，）混合物のＨＧＥに対する抑制効果この実験では、ＤＨ４０Ｊ、５Ｐ５４”としてのＰＰＳおよび種々の割合の５Ｐ５４■とＺｎ　Ｓ　Ｏａとの混合物を用いてＨＧＨに対する抑制活性を上記（ａ）と同じ条件で調べた。ただし、異なる酸Ｓ調製品を用いた点が（ａ）とは異なる。第６図から分るように、ＤＨ４０Ｊは０．０３％ｇ〜１．Ｏｕ（の濃度範囲においてＰＰＳおよびＰＰ　Ｓ　＋Ｚｎ”を１＋０．１８の割合（これら要素のＤ　Ｈ４ＯＪ中での大体の比）で混合したものよりも強力な阻害剤であった。５Ｐ５４■に対するＺｎ’”の比を種々の値にしてＨＧＥに対する抑制能をテストした。

第７表から明らかなように、検査した比の全範囲である１：０．１から１＝１まででＨＧＥ抑制能は５Ｐ５４＠のみの場合と実質的に異なっておらず、ＤＨ４０Ｊの抑制効果と直ちに比較することはできない。

（Ｂ）ベントサンポリ硫酸金属錯体の血液凝固経路に対する効果ベントサンポリ硫酸（ＳＰ５４■）は血液凝固の強力な阻害剤であり、「合成ヘパリン」すなわちヘバリノイドとして市販されている。本実験の主要な目的は、ポリ硫酸化多糖類の立体配置を変えることによってこの高分子の抗凝固能を小さくすると同時に、他の生物学的特性を維持することにある。第７表から明らかなように、これはポリ硫酸化多糖類の亜鉛錯体で達成することができ、例えば、Ｎａ’″を徐々に亜鉛で置換して抗凝固活性が低下した錯体としたＤＨ４０系列で実証された。ベントサンポリ硫酸のカルシウム錯体（ＤＨ５０）および銅錯体（ＤＨ８０）は、母体の未置換のナトリウム塩と同程度に強力であるため、Ｃａ−と［ｕ　＋　４の錯体が取る立体配置（第８図参照）は凝固機構列のセリンブロテイナーゼと相互作用可能な状態にあると思われる。

ポリ硫酸化多糖類に独特な生物学的活性は上記の合成化合物に起因していて、Ｚｎ′″′″とポリ硫酸化多糖類とを溶液中で単に混合するだけでは得られないということを確認するために、種々の混合物を作って抗凝固剤としてのテストを行った。第９Ａ図かられかるように、正常なヒトの血漿を用いてプロトロンビン時間により決定されたＤＨ４０ＪとＤＨ４０Ｙの抗凝固活性は５Ｐ５４に比べて低い　Ｚｎ　＋　ｆ″と５Ｐ５４をＤＨ４０Ｊ　（０，１７６：　１）およびＤＨ４０Ｙ　（０，２２：　ｌ）と同じ割合で含む溶液は５Ｐ５４と似ているが、ＤＨ４０ＪおよびＤＨ４０Ｙとは極めて異なっていた。同様の結果が対応するデキストランポリ硫酸の亜鉛錯体でも得られた（第９Ｂ図参照）。

（Ｃ）ｒＬ−１を媒介とした軟骨のイン・ビトロ分解に対するＤＨ４０Ｇの効果（第１０図と第１１図）フェル（Ｆａｌｌ）とジャグ（Ｊｕｂｂ）ビＡｒｔｈｒｉｔｉｓ　＆　Ｒｈｅｕｍ、”、第２０巻、１３５９頁、（１９７７年）〕は、軟軟組織と滑液組織の移植片を同時培養したものを用いて、軟骨細胞起源の溝膜からの因子が軟骨組織マトリックスを分解させることを最初に報告した。この因子は「カタボリン」と呼ばれている。この因子は後にサクラヴアラー（Ｓａｋｌａｖａｒａ）とその共同研究者によってで製されて（’Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、 ”、第１９９巻、７０５頁、Ｃｌ９８１年〕）、モノキンのインターロイキン− １族すなわちＩＬ−１族に属することが見出された。また、滑液被覆層のタイプへの滑液細胞は本物のマクロファージであることも確認された。関節滑液細胞がたとえ非常な周辺部であれ刺激を受けてＩＬ−１が生成されるといった状況が関節内部で発生する場合は容易に考えられる。インターロイキン−１は炎症を起こしている関節の滑液内で検出されている。従って、正常なレベルを越えて軟骨組織中に生成した少量のＩＬ−１でも、時間の経過とともに関節軟骨組織の新陳代謝を乱し、ＰＧｓが初期の段階でマトリックスから失われる。その結果、最後には軟骨を冒し且つ退行させて従来の骨関節炎の症状を示すことになる。

そこで、ＩＬ−１を媒介とした関節軟骨の自己分解が骨関節炎の症状の重要な要素であると仮定して、イン・ビトロモデルを開発した。

ウサギの膝関節の軟骨切片をイン・ビボで３ＳＳＱ、を用いて予め標識したものを腹膜から都合よく得られたマクロファージとともに同時培養した。このマクロファージがＩＬ−１を発生させ、このＩＬ−１が軟骨細胞を刺激してそのマ）　ＩＪフックス分解し、５ＳＳ０４で標識されたＧＡＧｓを媒地に放出する。ＤＨ４０などの潜在的な抗関節炎剤について、このモデルを用いてＩＬ−１を媒介とした軟骨の分解を阻止する能力をテストした。

第１０図には使用した方法の原理が示されている。

方法年令が６〜８週間のニューシーラントの白ウサギに３ミリキユリーのＨ，′ｓＳｏ、を屠殺の一週間前に筋肉内注射した。同じ動物に２５−のチオグリコレート媒体を腹膜内注射し屠殺の４８時間前にマクロファージを回収した。典型的な実験では、軟骨の供与体を屠殺してから、膝関節から軟骨を膝蓋骨を含めて＃１１のスケイベルブレード（ｓｃａｐｅｌ　ｂｌａｄｅ）を用いて削り取った。得られた種々のサイズの移植片を１０％のＦｅ２を含むハムのＦ１２媒地内で３日間培養した。次に、移植片を血清フリーの媒質を用いて２回洗浄し、個々に２４ウ工ル組織培養プレートのウェルに移植した。同じ日に、マクロファージ供与体を層殺し、腹膜の洗浄をして遠心分離することによってマクロファージを回収した。テスト用化合物を適当なウェルに添加し、最終的には５Ｘ１０’個のマクロファージをウェル１つにつき添加した。最終体積はウェルごとに血清フリーのハムのＦ１２媒地が２５０ｕｌであった。３日間保温した後、培養を停止した。上澄みを回収し、２００ｕ　］の生理食塩水を添加してウェルを洗浄した。これらサンプル内の”ｓｏ、で標識されたプロテオグリカンの１分間当たりのカウント数は、分解により軟骨マトリックスから失われたＰＧｓを表す。移植片自体はパパイン消化により溶解させ、それぞれの試料をカウントして軟骨マトリックス内にまだ維持されている未分解のＰＧｓを記録した。

結果典型的な実験の結果が第１１図に示されている。この図から、ＤＨ４０は、直接（マクロファージが適当な状態にされている媒地（ＭＣＭ））　で用イタ場合と、ＭＷＨｌ出細ｍ　（ＰＥＣ）　と−緒に培養した場合のいずれにおいても、ＩＬ−１によって媒介される関節の軟骨からのＰＧｓの損失を抑制するのに効果的であることがわかる。

（Ｄ）関節炎の実験モデルにおける軟骨からのプロテオグリカンの損失に対するＤＨ４０Ｇとベントサンポリ硫酸（ＳＩＰ５４）の相対効果の研究。

緒言このモデルは、シン　エム　ワイ　（Ｓｉｎ、　Ｍ、　Ｙ、　）達が“Ｊ、　Ｐａｔｈ、　”第１４２巻、２３頁、（１９８４年）に、また、セジウィック　エイディー　（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ　Ａ、Ｄ、　）達が’Ａｎｎ、Ｒｈｅｕｔｎ、Ｄｉｓ、”’、第４３巻、４１８頁、（１９８４年）に最初に記載しており、軟骨の新陳代謝に対する薬剤の効果をイン・ビボで評価する便利で再現性のある方法を提供する。このモデルを用いて、ラットの空気腔に５Ｐ５４＠とＤＨ４０Ｊを１０ｍｇ／ｋｇの割合で投与したときに、この空気腔に炎症を起こしている細胞が侵入することにより誘起される軟骨のプロテオグリカン（ＰＧｓ）の損失に対するこれら５Ｐ５４＠とＤＨ４０Ｊの影響を調べるた。

材料と方法空気腔は、オスの２００ｇｍウィスター（ｌｌｈｉｓｔｅｒ）ラットの背中の表面に最初に２０ｒＬｅの殺菌空気を注射することにより生成させた。２日目ごとに注射を行い、空気腔を大きくした。年令１０週間のニューシーラントの白ウサギの膝関節から無菌状態で採取した関節の軟骨（ＡＣ）を、空気腔を形成した年令７日のラットに移植した。生理食塩水に希釈した薬剤（１０ｍｇ／　ｋｇ）を、軟骨の移植を行った日から毎日空気腔に投与した。生理食塩水は対照群にも投与した。軟骨の移植を行った日から２日目ごとに空気腔に殺菌した３％ペプトンを１０−注射することにより、空気腔に炎症が発生した。ラットを７日後に層殺し、空気腔の流体（Ａ　Ｐ　Ｆ）とＡＣを回収して分析した。ＡＰＦ内の細胞は、クリスタルバイオレットで染色し、全細胞数を決定した。別の細胞カウント法は、細胞遠心分離とギームザ染色法により実行された。移植されたＡＣ＜８〜ｌｏｍｇｓ）をパパインで消化してＰＧ含有量をヘキスロン酸と硫酸化グリコースアミノグリカン（ＧＡＳ）の分析により決定した。残留しているＡＣ内のＰＧＳを４モルのＧｕＨＣｌとプロテアーゼ酵素阻害剤を用いて抽出した。ＰＧｓの抽出性と外因性ヒアルロン！ＩＦ（）（Ａ）（２０％）との凝集性を、セファローズＣＬ−２Ｂ上でのクロマトグラフィーにより決定した。サンプルを上級のアセトン内で脱水し、臨界点乾燥させ、金でコーティングした後にＡＣ表面の一部をＳＥＭで検査した。

結果５Ｐ５４■とＤＨ４０Ｇは両方とも、この空気腔モデルにおいて、移植された軟骨からのプロテオグリカンの損失を防ぐのに同じ程度に効果的であるように思われる。しかし、簡単に説明すると、ＤＨ４０Ｇが（ウロン酸により測定されたように）プロテオグリカン（ＰＧｓ）の損失を防ぎ（第１２図）、ＰＧの抽出性を維持しく第１３図）、炎症にかかっている細胞の数が多い空気腔に移植された軟骨の凝集を維持する（第１４図）ことがわかった。

これら薬剤の作用機構に関するヒントが、空気腔から除去された軟骨の組織学的検査により得られる。薬剤で処理されたサンプルの軟骨に付着している炎症細胞の数は対照の軟骨よりもはるかに少ないことが見出された。酵素と軟骨破壊媒体は炎症細胞によって軟骨内に放出されるため、軟骨の表面の炎症細胞の数を抑制することが直接的な有利な効果をもたらすことを考慮する必要がある。

（Ｅ）ヒトの滑液繊維芽細胞系によるイン・ビボでのＤＮＡ合成に対するベントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）　、ＤＨ４０Ｊ。

Ｚｎ　Ｓ　Ｏ４およびＺｎ５Ｏ，＋ＰＰＳの効果骨関節炎（ＯＡ）にかかっている軟骨を含む結合組織の修復には、組織マ）　ＩＪックス内でのＤＮＡの合成と細胞の増殖（有糸分裂）が必要である。多数の非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）とコーチコステロイドがこの重要な細胞プロセスを阻害し、回復を損なわせる。ベントサンポリ硫酸を多価金属と錯体化することによって、非常に低い濃度範囲でＤＮＡの合成を促進することが見出された。

第１５図から明らかなように、ＤＨ４０Ｊは、１１００ｕ／ｍｌ’の濃度まではＯＡ関節から得られた滑液繊維芽細胞内でのＤＮＡのイン・ビトロでの生合成をＰＰＳ　（ＳＰ５４＠）よりも促進する。

さらに、行った他の全ての実験と同様に、上記のよにして作ったポリ硫酸の金属錯体中と同じ程度の割合で亜鉛イオンとベントサンポリ硫酸とが存在するように含んだ溶液では、細胞高分子の合成に対して大きな効果が無かった。

に対する５Ｐ５４＠、ＤＨ４０ＪＳＤＨ４０Ｙの効果既に述べたように、慢性ＯＡおよびそれに類似した状態においては、細胞外マトリックスが過度に異化（物質分解代謝）されるので、組繊細胞は、機能性を残存させかつ維持するためには新しいマトリックスを複製して発生させる必要がある。抗炎症剤を含む多数の薬剤がこのプロセスを阻害するが、ポリ硫酸化多糖類はそうではないことが知られている［バークハード（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ）とボッシュ（Ｇｈｏｓｈ）　、’ Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓ＋＋＋’ 　、第１７巻、予稿集１．３〜３４頁、１９８７年〕。従って、このタイプの薬剤の金属錯体がナトリウム塩よりもプロテオグリカンの合成の強い刺激剤であることを見出したことは重要性である。５Ｐ５４＠、ＤＨ４０Ｊ、ＤＨ４０Ｙに対する結果が実施例きして示されている（算１６図参照）。

コルチコステロイドと組合わせたポリ硫酸化多糖類と金属ポリコルチコステロイドは結合組繊細胞の有糸分裂とマトリックス要素、例えばコラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）の生合成を阻害することが知られている。これら高分子は正常な生体機能と健康にとって重要である。

本研究において、ヒアルロン酸（ＨＡ）がイン・ビトロで滑液繊維芽細胞を生合成する際にハイドロコーチシンの有害な効果を５Ｐ５４”、それ以上にＤＨ４０Ｊが防ぎ得ることがわかった。

得られた結果は下記の図面にまとめられている。

！豆」は、ハイドロコーチシンの濃度が大きくなるにつれてＨＡの生合成が徐々に阻害されることを示している。

第１８図は、滑液繊維芽細胞によるＨＡ生合成に対するＤＨ４０Ｊの濃度効果を示している。

た場合には、５Ｐ５４により対照値に完全に復帰することを示しコーチシンの濃度を１０−６モルにした場合である。

第２２図は、第２０図でＤＨ４０Ｊを代わりに使用し且つハイドロコーチシンの濃度を１０−’モルにした場合である。

以上、本発明の化合物を骨関節炎およびリューマチ性関節炎の治療に使用した場合について説明を行ったが、治療可能な他の病気状態には、滑液包炎、腰炎、臆鞘炎、柔らかい組織の炎症、傷や火傷の回復、皮膚の治療、ニキビやそれ以外の皮膚の急性の不調や、表面の血栓症、血腫、潰瘍、傷の軟化に対する局所的応用、局所的な抗ウィルス、膵臓炎、気腫、過剰な蛋白質加水分解が起こる位置でのバクテリアの侵入が含まれる。

ＨＡの合成の促進（％）Ｆ／Ｃｙ、２ファーンデイル（Ａ５４０ｎｍ） −１，５−１，０−０，５０，０ＬＤｇ［５Ｐ５４／ＤＨ４０１°９４ｍ０ＨＧＥの阻害　％凝血時間（秒）対照　　　　　　　　　　ＤＨ４０Ｇ処置処置賦活　１％）補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）１０国際出願番号　ＰＣＴ／ＡＵ８８１０　ＯＯ７７３、特許出願人代表者　　カリスーヒル、デイヴイッド５、補正書の提出年月日　　１９８８年９月９Ｂ６、添付書類の目録（１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　〔１通〕請求の範囲１、デルマタン、ケラタン、キシラン、くコンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸およびペクチンのポリ硫酸塩で構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類の多価金属、Ａｇ”、Ａｕ’または第四アンモニウムの錯体。

２、上記ポリ硫酸塩化多糖類がデルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のポリ硫酸塩で構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の錯体。

３、上記金属イオンが、Ａｇ”、Ａｕ”、Ｃａハ、Ｍｇ２−１Ｂａ　２４、Ｐｂ ”、Ｃｕ　２４、ｌ　ｎ　２　＋、Ａｕ”、Ｐｄ”、Ｐｄ”、ｐｔ”およびＰｔ ”で構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の錯体。

４、上記金属錯体が所定の割合の一価イオンを含むことを特徴とする請求項３に記載の錯体。

５、上記金属イオンがＺｎ’″であることを特徴とする請求項３または４に記載の錯体。

６、上記第四アンモニウム化合物が塩化ピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、Ｎ−セチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−）リアルキル塩化アンモニウムまたはこれらの誘導体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の錯体。

７、上記ベントサンポリ硫酸がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項５または６に記載の錯体。

８、上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項７に記載の錯体。

９、関節炎と、それに類似した炎症性または退行性の関節疾患の治療に適した組成物であって、薬理学上許容可能な基剤と、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩で構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類と、これらと多価金属、八「、Ａｕ” または第四アンモニウムとの錯体と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩およびコーチコステロイドで構成される群の中から選択された化合物とを含む組成物。

１０、薬理学上許容可能な基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩と、コーチコステロイドと、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸およびペクチンのポリ硫酸塩で構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類と、これらと多価金属、八ｇ”、Ａｕ”または第四アンモニウムとの錯体とを含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。

１１、薬理学上許容可能な基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩と、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩で構成される群の中から選択されたポリ硫酸化多糖類と、これらと多価金属、Ａｇ’、Ａｕ”または第四アンモニウムとの錯体とを含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。

１２、薬理学上許容可能な基剤と、コーチコステロイドと、デキストラン、テルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩で構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類と、これらと多価金属、Ａｇ′、Ａｕ’または第四アンモニウムとの錯体とを含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。

１３、上記ヒアルロン酸の分子量が比較的大きいことを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

１４、上記コーチコステロイドが水溶性の誘導体としてハイドロコルチゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンで構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項９．１０．１２または１３のいずれか一項に記載の組成物。

１５、上記ベントサンポリ硫酸がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

１６、上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。

１７、上記ポリ硫酸塩化多糖類がヘテロな半合成グリコースアミノグリカンポリ硫酸であり、その約９３％の二糖類繰り返し単位はガラクトースアミンにグリコシド結合したヘキスロン酸であり、そのイオウ含有量が約１３．０％であり、その分子量が約１００００ドルトンであることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

１８、上記金属イオンが、Ａｇ”″、Ａｕ”、Ｃａ”、Ｍｇ　２　＋、Ｂａ　２　＋、ｐｂ”、（ｕ　２＋、Ｚｎ”、Ａｕト、Ｐｄ”、　Ｐｄ”、Ｐｔ”およびＰｔ”で構成される群の中から選択されるこ止を特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

１９、上記金属錯体が所定の割合の一価イオンを含むことを特徴とする請求項１８に記載の組成物。

２０、上記金属イオンがＺｎ１であり、上記ポリ硫酸塩化多糖類がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項１８または１９に記載の組成物。

２１、上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項２０に記載の組成物。

２２、病気の関節に請求項９〜２１のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与する操作を含む、関節炎と、それと類似した炎症性または退行性の関節疾患の治療法。

２３、病気の関節に請求項１〜８のいずれか１項に記載の錯体の有効量を投与する操作を含む、関節炎と、それと類似した炎症性または退行性の関節疾患の治療法。

２４、腫瘍を持つ動物に請求項１〜８のいずれか１項に記載の錯体の有効量を投与する操作を含む、腫瘍の治療法。

２５、ウィルスに請求項１〜８のいずれか１項に記載の錯体の有効量を接触させる操作を含むウィルスの不活性化法。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願番号　ＰＣＴ／ＡＵ　８　ｇｌｏ　００７７３、特許出願人代表者　　力リスーヒル、デイヴイッド６、添付書類の目録（１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　〔１通〕請求の範囲１．デルマタン、キシラン、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のポリ硫酸塩によって構成される群の中から選択されるポリ硫酸塩化多糖類の多価金属、Ａｇ’ 、Ａｕ“または第四アンモニウムの錯体。

２、上記金属イオンが、Ａｇ”、Ａｕ”、Ｃａ”、Ｍｇ２′″、Ｂ　ａ　２　＊、Ｐｂ”、（ｕ　２４、ｚｎ　２　＊″、Ａｕ”″、Ｐｄ”、Ｐｄ”、Ｐｔ”およびＰｔ”によって構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の錯体。

３、上記金属錯体が所定の割合のｍ個イオンを含むことを特徴とする請求項２に記載の錯体。

４、上記金属イオンがＺｎ２＋であることを特徴とする請求項２または３に記載の錯体。

５、上記第四アンモニウム化合物が塩化ピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、Ｎ−セチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−）リアルキル塩化アンモニウムまたはこれらの誘導体によって構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の錯体。

６、上記ベントサンポリ硫酸がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項４または５に記載の錯体。

７、上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項６に記載の錯体。

８、関節炎と、それに類似した炎症性または退行性の関節疾患の治療に適した組成物であって、薬理学上許容可能な基剤と、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩によって構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類と、これらと多価金属、Ａｇ” 、Ａｕ”または第四アンモニウムとの錯体と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩およびコーチコステロイドによって構成される群の中から選択された化合物とを含む組成物。

９、薬理学上許容可能な基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩と、コーチコステロイドと、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩によって構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類と、これらと多価金属、Ａｇ’、Ａｕ″″、または第四アンモニウムとの錯体とを含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。

１０、薬理学上許容可能な基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性の塩と、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩によって構成される群の中から選択されたポリ硫酸塩化多糖類と、これらと多価金属、Ａｇ＋、Ａｕ”または第四アンモニウムとの錯体とを含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。

１１、薬理学上許容可能な基剤と、コーチコステロイドと、デキストラン、デルマタン、ケラタン、キシラン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチンのポリ硫酸塩によって構成される群の中から選択されたポリ硫酸化多糖類と、これらと多価金属、Ａｇ’、Ａｕ’または第四アンモ丹つムとの錯体とを含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。

１２、上記ヒアルロン酸の分子量が比較的大きいことを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。

１３、上記コーチコステロイドが水溶性の誘導体としてヒドロコルチゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンによって構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項８．９．１１または１２のいずれか一項に記載の組成物。

１４、上記ベントサンポリ硫酸がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

１５、上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。

１６、上記ポリ硫酸多糖類がヘテロな半合成グリコースアミノグリカンであり、その中の約９３％の二糖類繰り返し単位はガラクトースアミンにグリコシド結合したヘキスロン酸であり、そのイオウ含有量が約１３．０％であり、その分子量が約１０．０００ドルトンであることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

１７、上記金属イオンが、Ａｇ’、Ａｕ’″、（ａ　２　＊、Ｍｇ２−１Ｂ　ａ　２　＊、ｐｂ”、［ｕ２゛、Ｚｎ　２　＊、Ａｕ”、Ｐｄ”、Ｐｄ”、Ｐｔ” 、Ｐｔ”からなるグループから選択されることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

１８、上記金属錯体が所定の割合のｍ個イオンを含むことを特徴とする請求項１７に記載の組成物。

１９、上記金属イオンがｌ　ｎ　２−であり、上記ポリ硫酸塩化多糖類がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項１７または１８に記載の組成物。

２０、上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。

２１、病気の関節に請求項８〜２０のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与する操作を含む、関節炎と、それに類似する炎症性または退行性の関節疾患の治療法。

２２、病気の関節に請求項１〜７のいずれか一項に記載の錯体の有効量を投与する操作を含む、関節炎と、それに類似する炎症性または退行性の関節疾患の治療法。

２３、腫瘍を持つ動物に請求項１〜７のいずれか一項に記載の錯体の有効量を投与する操作を含む、腫瘍の治療法。

２４、ウィルスに請求項１〜７のいずれか一項に記載の錯体の有効量を接触させる操作を含むウィルスの不活性化法。

国際調査報告ｗｌ−９−−ｍ□−１−−−−，ＰＣＴ／ＡＬＩ８８１０００７７ＥＰ　　　　　２３９３３５　　　　　　　　　　ＡＩＪ　６９５５８／８７　　　　　　　　　　口Ｋ　　　　１４４９／８フ　　　　　@　　エＬ　　　　Ｉｎ９４５ＪＰ６２２９５９０１　　　　　　Ｎｏ　　　８７１１３７　　　　　ＺＡ　　８７（ｎ７４８＾ＩＪ　３９９２９／６１１テ　　１４０７８１　　　　　　正　２５５３２８７　　　　　ＪＰ　　６０１１５５δｒ　２２５８２／８３　　　　　ｏ、１２２６８１６　　　　　ＥＸ　　５８４４／８３　　　　ＥＰ　　１１４５８９ＪＰ　５９１７６２１３２３轄３９／ソ

Claims

【特許請求の範囲】

１．デキストラン、キシラン、コンドロイチン、デルマタンおよびヒアルロン酸からなる群の中から選択されたポリ硫酸化多糖類の多価金属、Ａｇ＋、Ａｕ＋または第四アンモニウムの錯体。
２．上記金属がＡｇ＋、Ａｕ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｕ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｄ４＋、Ｐｔ２＋およびＰｔ４＋からなる群の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の錯体。
３．上記金属錯体が一価イオンを所定の比率で含むことを特徴とする請求項２に記載の錯体。
４．上記金属がＺｎ２＋であり、ポリ硫酸化多糖類がキシランポリ硫酸であることを特徴とする請求項２または３に記載の錯体。
５．上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウ含有量が約１６％であることを特徴とする請求項４に記載の錯体。
６．上記の第四アンモニウム化合物が、塩化ピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアンモニウムクロライドまたはこれらの誘導体の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の錯体。
７．薬理学上許容される基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性塩、コーチコステロイドおよび結合組織、特に関節の軟骨の一体性を維持することができる化合物によって構成される群の中から選択される少なくとも２種の化合物とによって構成される関節炎、それに類似した炎症性または退行性の関節疾患を治療するための組成物。
８．薬理学上許容される基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性塩と、コーチコステロイドと、結合組織、特に関節の軟骨の一体性を維持することのできる化合物とによって構成されることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
９．薬理学上許容される基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性塩と、コーチコステロイドとによって構成されることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
１０．薬理学上許容される基剤と、ヒアルロン酸またはその水溶性塩と、結合組織、特に関節の軟骨の一体性を維持することができる化合物とによって構成されることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
１１．薬理学上許容される基剤と、コーチコステロイドと、結合組織、特に関節の軟骨の一体性を維持することができる化合物とによって構成されることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
１２．上記ヒアルロン酸またはその水溶性塩の分子量が比較的大きいことを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１３．上記コーチコステロイドが、水溶性の誘導体としてのハイドロコーチゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンによって構成される群の中から選択されることを特徴とする請求項７〜９または請求項１１のいずれか一項に記載の組成物。
１４．結合組織の一体性を維持することができる上記化合物が、キシランポリ硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリンおよびコンドロイチン、ケラタン、デルマタン、キチン、澱粉、アミロペクチン、セルロース、アミロース、アルギニン酸、ペクチン、インシュリンおよびヒアルロン酸から誘導されるポリ硫酸塩によって構成される群の中から選択されるポリ硫酸化多糖類であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
１５．上記ポリ硫酸化多糖類がキシランポリ硫酸またはデキストラン硫酸であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
１６．上記キシランポリ硫酸の平均分子量が６０００ドルトンであり、そのイオウの含有量が約１６％であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
１７．上記ポリ硫酸化多糖類がヘテロな半合成グリコースアミノグリカンであり、その約９３％のジサッカライド繰り返し単位がガラクトースアミンにグリコシド結合したヘキスロン酸であり、そのイオウ含有量が約１３．０％であり、その分子量が約１０，０００ドルトンであることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
１８．結合組織の一体性を稚持することができる上記化合物が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
１９．請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を病気の関節に投与する操作を含むことを特徴とする関節炎およびそれに類似した炎症性または退行性の関節疾患の治療方法。
２０．請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の有効量を病気の関節に投与する操作を含むことを特徴とする関節炎およびそれに類似した炎症性または退行性の関節疾患の治療方法。
２１．請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の有効量を腫瘍を持つ動物に投与する操作を含むことを特徴とする腫瘍の治療方法。
２２．請求項１〜６のいずれか一項に記載の錯体の有効量をウイルスと接触させる操作を含むことを特徴とするウイルスの不活性化方法。