JPH02283289A - コハク酸の製造及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、嫌気性醗酵、電気透析及びイオン交換による
コハク酸の製造及び精製法の改善に間する。

〈従来の技術） コハク酸及びその誘導体は、ポリマー、食品、医夏及び
化粧品用途のスペシャルティケミカルズ（ｓｐｅｃｉａ
ｌｔｙ　ｃｈｅｍｉｃａ！ｓ）として広く使用されてい
る。更にコハク酸は、１．４−ブタンジオール、テトラ
ヒドロフラン及びガンマ−ブチロラクトン製ｊｈに有用
な価値ある４−炭素中間体である。

コハク酸塩イオンは何種かの嫌気性微生物の代謝経路で
はありふれた中間体であるが、コハク酸塩を大量乃至高
収率で製造する醗酵に関しては先行技術にその例を見な
い０例えば、コハク酸塩はプロピオン酸塩産生バクテリ
アによる嫌気性醗酵の重要な中間体であるが、低収率か
つ低濃度でし、か製造されない。

醗酵によりコハク酸を製造する商業的に魅力ある方法の
開発には、醗酵及び生成物のＶｒ製に関する幾つかの重
要な基準を確立する必要がある。醗酵は、安価な原料及
び栄養分を用いて高収率（重、１）かつ、高生成物濃度
を与えるものでなければならない。嫌気性醗酵は中性乃
至中性ｐＨ付近で行われるので生成物は有機酸自身でな
く、その塩となる。醗酵培地は、細胞、蛋白及びその他
の望ましくない物質も含有している。該法からの所望生
成物は、スペシャルティケミカル（ｓｐｅｃｉａｌｔｙ
　ｃｈｅｍｉｃａｌ）又はコモデイティーケミカル（ｃ
ｏｍｍｏｄ　ｉ　ｔｙｃｂｅｍｉｃａｌ）の製造に使用
可能な精製された酸である。従って、高収率の経済的醗
酵法を効率的な回収・精製法と統合する必要がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の主たる目的は、経済的に魅力あるコハり酸の製
造及び精製の改善方法を開示することである。

本発明者等は、低コスト醗酵媒体から高濃度のコハク酸
を産生ずる嫌気性のコハク酸塩−産生微生物の強壮法を
用いた醗酵法を包含するコハク酸製造の改善法並びに細
胞及び含窒素不純物を含有する培地全体（ｗｈｏｌｅ　
ｂｒｏｔｈ）からコハク酸塩を回収・濃縮する通常の電
気透析；得られたコハク酸塩をコハク酸と塩基に転化す
る水分解電気透析（ｗａｔｅｒ−ｓｐｌｉｔｔｉＢ　ｅ
ｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）　　；及びコハク酸か
ら荷電不純物を除去するイオン交換処理を使用する精製
方法を知見したのである。

この知見の結果、含窒素物質（蛋白）１％未満及び汚染
硫酸塩イオンｌＯｐｐｍ未満のコハク酸生成物の製造が
可能になった。この生成物は約２０％までの酢酸を含有
してもよい。

本発明の好適実施態様として、醗酵器内の炭水化物；そ
の他の栄養分たとえばコーン浸漬液ニトリブトファン；
及びナトリウムイオンを含む媒体上、約０．１気圧以上
のＣＯ２分圧下、約５．８乃至約６．６にｐＨを調節し
て、炭水化物の重量基準でコハク酸塩の収率が約７５重
量パーセントになり、醗酵培地が約２０ｇ／（１以上の
コハク酸塩基を含有するに至るまで、エイ・サクシニシ
プロデューセンス（Ａ、５ｕｃｃｉｎｉｃｉ　ｒｏｄｕ
ｃｅｎｓ）ＡＣＴＴ　５３４８８の実質的に純粋な培養
菌を嫌気的に成育した。

本発明のこの実施態様で使用する炭水化物は、使用した
細菌株で醗酵される炭水化物ならばいずれも使用可能で
ある。　Ａ、５ｕｃｃｉｎｉｃｉ　ｒｏｄｕｃｅｎｓ用
の炭水化物源にはデキストロース、スクロース、フルク
トース、ラクトース、可溶性デンプン及びコーンシロッ
プが包含される。醗酵は、トリプトファン、ナトリウム
イオン及び溶存二酸化炭素を含む水性媒体中で行われる
。使用微生物の成長及び再生産に必要なその他の栄養分
及び成長因子も媒体に添加される。

媒体中の炭水化物の濃度は約２０ｇ／ｊ！乃至約１ＣＯ
ｇ／βであって、約４０ｇ／（ｌ乃至約８０ｇ＃である
ことが好ましい、炭水化物濃度が約１ＣＯｇ　／ρを超
えると、該微生物が十分成長できなくなるほど高浸透圧
の溶液となる。該微生物は２０ｇ＃’未満の炭水化物を
含有する溶液内でも成長するが、生成物の濃度は　回収
が通常は実際的でなくなるほど低くなる。

二酸化炭素は、種々の方法で醗酵媒体に供給可能である
１例えば媒体にＣＯ□ガスでとして散布することができ
る。醗酵は、大気圧を超える圧力の二酸化炭素を含有す
る圧力器内で実施することができる。ＣＯ□は、使用微
生物の成長と代謝を妨害しないものならば、その他のガ
スと混合することもできる。二酸化炭素は、醗酵条件下
で二酸化炭素ガスを発生する炭酸塩又は炭酸水素塩の添
加により醗酵媒体に供給することもできる。媒体は、最
小的０．１気圧の二酸化炭素分圧と平衡する溶存ＣＯ２
を含有しなければならない、好適実施態様では、媒体は
二酸化炭素で飽和され、かつ、雰囲気は約０．３気圧以
上の二酸化炭素分圧を有する。

コハク酸を良好に製造するため、媒体のｐＨは約５．８
乃至約６．６の範囲に維持される。　ｐＨがこの範囲よ
り高いと、主生成物はコハク酸塩ではなく乳酸塩となり
、一方ｐＨがこの範囲より低いと醗酵は禁止される。　
ｐＨの維持は、炭酸アルカリ金属塩、アルカリ土類金属
水酸化物又はそれらの混合物の添加による方法が便利で
ある。

本発明の醗酵法は、約２０℃乃至約４９℃の温度で実施
される。　Ａ、５ｕｃｃｉｎｉｃｉ　ｒｏｄｕｃｅｎｓ
の最適成長温度は約３９℃である６本菌は厳格な嫌気性
菌なので、該菌を用いる醗酵は、加熱その他醗酵技術分
野で周知の方法により殺菌された媒体中、嫌気性条件下
で実施される。

細胞を含むコハク酸塩含有培地全体を、醗酵器から移し
て電気透析に付し、水流中のコハク酸塩を回収・濃縮す
る。生存細胞は醗酵器に再循環される。コハク酸塩含有
水流は水分解電気透析に付され、コハク酸水溶液と塩基
を形成し、塩基は醗酵器に戻すことができる９次にこの
コハク酸水溶液をイオン交換仕上げ精製に付し、最初カ
チオン交換体で、次にアニオン交換体で処理して正荷電
不純物及び負荷電不純物を除去し、高純度形態のコハク
酸を形成する。最終生成物は、約７０乃至約９５％のコ
ハク酸、３０％まで、普通約５％乃至約２０％のＩ￥１
：酸、１％未満の含窒素不純物及び１０ｐｐｍ未満の硫
酸イオン又はその他の汚染イオンを含有することが好ま
しい。

水沫に使用可能な微生物の代表例は、アナエロビオスビ
リルム・サクシニジプロデユーセンス（Ａｎａｅｒｏｂ
ｉｏｓ　ｉｒｉｌｌｕｍ　５ｕｃｃｉｎｉｃｉ　ｒｏｄ
ｕｃｅｎｓ）、ビー・アミノフィルス（Ｂ、、すｖ上と
彷１月」−）及びビー・ルミニコラ（Ｂ、ｒｕｍｉｎｉ
ｃｏｌａ）の諸株である。

好適１孜生物のＡ、５ｕｃｃｉｎｉｃｉ　ｒｏｄｕｃｅ
ｎｓ（ＡＴＣＣ５３４８８）は、炭水化物、好ましくは
デキストロース；コーン浸漬液を含むその他の栄養分；
ナトリウムイオン；及び約１０ｐｐ１１以上のトリプト
ファンを含有する媒体上、０．１気圧以上のＣＯ２分圧
下、約３９℃の温度で良好に成長することを示した。こ
の株は、高；農度（３５−５０ｇ／　ｆ　）かつ高生産
性（１，５乃至２゜０ｇ／β時）でコハク酸を産生ずる
ことができる。

本法は、細胞個体数に比べて高濃度のコハク酸塩を産生
ずることも可能であり、従って細胞を含まぬ清澄培地の
場合と同様に、細胞含有培地全体に特殊イオン交換膜を
用いる電気透析を適用し、巧くコハク酸塩を精製・濃縮
して精製塩にすることができる。培地全体に対する分離
法の実施要領は、清澄培地に対する場合と同じである。

驚くべきことに、全培地中の細胞は電気透析膜を汚さな
い。

このため、！Ｉ胞金含有培地濾過や遠心分離などの前処
理を施さずとも、直接電気透析系に注入することができ
る。

醗酵培地からコハク酸塩及び酢酸塩を電気透析した際に
も予期されぬ知見、すなわちコハク酸塩及び酢酸塩共に
回収されるもののコハク酸が優先的に回収されるという
知見を得たのである。この知見は、非常に特異な電気透
析回収法を更に選択的にする。これに対して考えられる
説明は、酢酸が一価であるのに対してコハク酸塩が二価
だということであるが、優先移動は期待されなかったし
、との文獣にも記載されていなかった。

以前の実務専門家は、電気透析膜を細胞含有醗酵培地全
体と接触させることを推奨しなかった。

細胞をＥＤ膜と接触させぬようにするため、限外濾過、
ミクロ濾過、遠心分離又は複雑な細胞固定化の諸法が使
用されていた。しかしながら、この好適微生物と好適電
気透析系とを用いた結果は、細胞除去前に培地全体を直
接処理できることを示している。このため、生成物の損
失を伴わずに醗酵器から生成物を連続的に抜き取ること
が可能となる。

電気透析によりコハク酸塩を精製・回収した後、水分解
電気透析を用いてナトリウムイオン又はその池の適当な
カチオンを除去することができる。

大部分の塩カチオンを取り除いて純粋な酸流と醗酵器へ
再循環する塩基流を形成するには、エネルギー効率の良
い双極膜（アクアチック−アライドシグナル、Ａｑｕａ
ｔｅｃｈ−Ａｌｌｉｅｄ　Ｓｉｇｎａｌ）が使用される
。

この純粋な酸流はナトリウムイオン及び硫酸イオンその
他のアニオンを含有するが、それらは仕上げイオン交換
塔を用いてプロセス流から容易に除去することができる
。酸流を先ずは強酸性イオン交換体で処理し、次ぎに弱
塩基性イオン交換体で処理して（Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗｘ
８及びロームアンドハース（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａ
ｓ）ｔＲＡ−９４）　、ナトリウムその他のカチオン及
び続いてＫｎイオンその他のアニオンを除去する。この
処理は、残留する汚染アミノ酸も若干部除去する。その
結果得られる生成物は、スペシャルティケミカル及びコ
モデイティケミカルの製造に好適な精製コハク酸／酢酸
混合物である。

第１図にコハク酸の製造及びＭ製の概念的プロセスフロ
ーダイアグラムを示す、第一工程は、高収率・高生産性
の醗酵である。炭水化物、栄養分及び二酸化炭素は、醗
酵器内でコハク酸塩及び酢酸塩に転化される３次にこの
培地全体を通常の電気透析装置に供給する。！気透析装
置でコハク酸塩は費消され、細胞含有培地は醗酵器へ再
循環されるか、或いは系外に排出される。この通常電気
透析ユニットからの精製・濃縮（３乃至４倍）コハク酸
塩は、直接に或いは好ましくは蒸発又はその池の膜ベー
スのプロセスにより更に濃縮されたあと、水分解電気透
析装置に供給される。この水分Ｐｉ￥電気透析ユニット
は、はとんどカチオンを含まぬコハク酸流と、醗酵器に
再循環するための塩基、たとえば水酸化ナトリウムや水
酸化アンモニウムを製造する。残存するカチオン及び硫
酸イオンその他のアニオンを含有するコハク酸流は、二
本のイオン交換仕上げ塔に通される。酸形態の強酸性イ
オン交換体による最初の処理は、ナトリウム及びその他
のカチオンを除去し、次の遊離形態にある弱塩基性イオ
ン交換体は、コハク酸を流から除去することなく、硫酸
及び硫酸塩不純物を除去する。このプロセスの生成物は
、含窒素不純物含量が１％未満（乾量基準）で、硫酸イ
オンその他の汚染イオンが１０ｐｐｍ未満のコハク酸及
び酢酸である。斯くしてコハク酸を効率的・経済的に製
造及び精製する方法が得られる。

第２図に、電槽スタック１１．　醗酵器１２、篩１３、
供給液の注入、再循環及び除去系１４、濃縮物の再循環
及び除去系Ｉ５、陽極液ゆすぎ系１６及び陰極液ゆすぎ
系１７を包含する電気透析装置１０を示す。

図に示した装置は説明用のものであって、本発明の範囲
から逸脱することなく、変更が可能なることは当業者の
了解するところであろう。

電槽スタック１１は、複数の適当に孔を穿たれた流れ分
配ガスゲット１８が、一連の平行な電動２１及び端部電
槽２２と２３を形成するよう平行に間隔をあけた複数の
アニオン透過膜１９とカチオン透過膜２０との周辺を支
持・密封するような板と枠組み等既知タイプ膜組立装置
ならば、どのようなものであってもよい、各電槽２１は
、膜対１９と２０及びガスケット１８にて定められる。

′４４部電槽２２及び２３は、夫々膜１９と膜２０及び
端部キャップ２４によって定められる。端部電槽２２内
には、適当なアノード２５が配置され、対向する端部電
槽２３内にはカソード２６が配置される。アノード２５
とカソード２６は、リード線２７及び２８を通して適当
な電源（図示していない）の正端子及び負端子に夫々接
続される。電槽スタック１１は、各電槽２１への液の導
入及びそれから液を除去するための適当なカップリング
（図示していない）も包含する。を槽スタックの諸部品
は、適当なりランプ又は連結棒（図示していない）にに
より隣接関係に保持される。

ＪＩｉ１９はアニオン透過性かつカチオン不透過性の膜
であり、Ｍ２Ｏはカチオン透過性かつアニオン不透過性
の膜である。ｐＡＩ９及び２０用に好適な材料には、夫
々活性なイオン捕捉部位を持つアニオン及びカチオン交
換樹脂が包含される。好適な膜１９は、布はく強化され
たミクロ不均一な共重合体膜、たとえば旭硝子社製のア
ニオン交換膜ＳＥＬＥＭＩＯＮ　Ａ１４Ｖ膜であり、好
適なＷＡ２０は同社製のＳＥＬＥＭ　ＩＯＮ型ＣＭＲカ
チオン交換膜である。これらの膜は米国特許第４．６７
８，５５３号他に記載されている。この両膜の諸性質を
第１表に示す。

名称 １４Ｒ １４Ｖ 備考 数 溶液、２５℃ 測定した。

厚み　龍 ０．１３−０．１５ ０．１２−０．１５ ＊処理後 本発明の好適実施態様では、培地全体を醗酵器１２から
篩１３を経由してポンプ輸送する。篩は、細胞より大き
な寸法のものを除去する。培地全体からこれら粒子を除
いたものを系１４を経て電槽２１に輸送し、そこで電流
を通すと、コハク酸イオンが透過膜１９を経て移動して
濃厚コハク酸塩溶液となり、酸液は膜１９の別面の系１
５に循環する。第１図に示すように、コハク酸塩富化溶
液（コンセントレートとも称される）は、水分解電気透
析装置に移されてコハク酸塩をコハク酸に転化する。供
給溶液からコハク酸液を除き、但し生存細胞を含んだ液
は、醗酵器に戻される。電気透析の進行の間、電極は適
当な電解質溶液たとえばＮａＳＯ４又はコハク酸塩水溶
液でゆすがれ、該電解質溶液はゆすぎ系１６及び１７に
て循環される。該法は回分法又は、連続法により操４％
可能である。

以下の実験にて本発明を更に説明する。

２ｇのニューブランズウィックマルチゲン（Ｎｅｗ　Ｂ
ｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｍｕｌｔｉ４ｅｎ）ベンチトップ（
ｂｅｎｃｈｔ、ｏｐ）醗酵器内で嫌気性醗酵試験を実施
した。最初の培地容量は１．０リツトルであった。媒体
成分は、特記無い限り、以下に記すものである。

デキストロース　５０ｇ／ｊｉ コーン浸漬液　　１０ｇ＃　（乾量基準）媒体溶液を醗
酵器内に配置し、オートクレーブ処理した。オートクレ
ーブから取り出したあと、醗酵器にＣＯ２ガスを散布し
、ナトリウムイオン添加用の３Ｍ炭酸ナトリウム又は３
．５ｇ／　Ｊ塩化ナトリウム１（ｌｄ、トリアドファン
２５ｐｐｍ　、及びシスティンＨＣＩ／硫化ナトリウム
１２５ｐｐ■を醗酵器に添加した。

出口ホースをクラン１で止めてＣＯ２流を停止した。

媒体と醗酵器を一時間放置した９次に５％（容／容）接
種物を用いて醗酵器に接種した。全実験共、特記無い限
り、二酸化炭素をｌＯ−／分の速度で流した。

パイロットプラントのｇｏ！Ｉｍ酵器を用いて、コハク
酸ナトリウムの電気透析回収用供給材料を製造した。

酬酵器内３９℃、初期容量５５１ｇで２９時間にわたり
嫌気性醗酵を実施した。使用法醗酵器は、８（Ｂ？の二
ューブランズウィックサイエンティフィックパイロット
プラントファーメンターであった。媒体は約３５ｇ＃ｉ
のデキストロース、　１０ｇ＃ｌのコーン浸漬）α、３
．５ｇ／ｌのＮａＣｌ及び２５ｐｐｇＩのトリプトファ
ンを含有した。５％の接種物を使用した。炭酸ナトリウ
ムを必要量添加してｐＨを６．１−６．３に維持した。

撹拌速度は１１ＣＯｒｐであった。

醗酵培地内に細胞が存在したときには、該培地を孔径０
．２ミクロンの中空繊維カートリッジを有する限外濾過
ユニットに通して処理し、細胞を除去した。

培地全体の実験では、同一醗酵から新たに調製した培地
全体（生存細胞を含有）を使用した。培地全体を２ＣＯ
メツシユワイヤーの篩を通して、電気透析系に仕込む前
に大粒子を除去した。

次にこの醗酵生成物を、先ずはアニオン及びカチオンに
選択性ある膜を備えた通常の電気透析ユニットに通して
１ｎＷＪした。

電気透析スタックは、流れ分配ガスゲットで金屑され交
互に配置された一連のアニオン選択膜及びカチオン選択
膜から構成される。膜の一端部は陽極液室とアノードに
固定され、もう一方の端部は陰極液室とカソードに固定
されている。第２図を参照されたい、このスタックバッ
クは下記のものを包含した。

電槽　１０対 アニオン膜−ＡＭＶ カチオン膜−ＣＭＲ 有効面積−１７８ｃｉｄ 電解質−１１１Ｉコハク酸ナトリウム水溶液このユニッ
トは、電解透析スタックバックに通ずる三つの独立な流
路がら構成される。この電流は１）希薄流−供給材料、
培地 ２）濃厚流−生成物 ３）電解質−コハク酸ナトリウム又は硫酸ナトラム 原料は、各貯蔵器からバルブ、ロータメータ、圧力ゲー
ジを経由して、該スタックバックにポンプ輸送されたあ
と、また貯蔵器に戻る。五個の１９４？（５ガロン）容
器の別組を、収り出し目的で各貯蔵器の下部に配置する
。

調整されたＤＣ電源により電流を供給した。電源は膜ス
タックのアノード及びカソードに接続され、０−２０ア
ンペア、０−５０ボルトで送電できるものであった。フ
リューク（Ｆｌｕｋｅ）Ａ７５マルチメータを用いて、
ｌ１１（電極を除く）を横切る電圧降下を測定した。二
本の白金線をへ対の電槽股間に挿入し、電圧計に接続し
た。

二基の双極膜スタックを用いて、有機塩を有機酸と対応
塩基にした。この目的で設計されたスタックは、カチオ
ン透過膜と双極膜が互いに交代するものから構成された
。アノード室とカソード室は下記のものを包含した。

８対の電槽 一カチオン膜 一双極膜 有効面積１０２．４　ｃｎｌ 電解質（２，５Ｎ　ＮａＯＨ） このユニットは、電気透析スタックに通ずる三つの独立
な流路から構成される。

この電流は、 １、酸流（最初はコハク酸ナトリウム塩流）２、塩基流
（実験進行につれて次第に濃厚になる） ３、電極ゆすぎ流（２−５Ｎ　ＮａＯＨ）実際に実験を
行なう前に、許容される電流密度（ＰＣＤ）を測定して
、安全な操作電流密度の範囲を定めた。

このユニットを低電流で操作し、３０分乃至２時間にわ
たって３０秒毎に電圧を記録した。電圧が時間に対して
一定に留まったならば、この手順を更に高い電流で繰り
返した。この手順は、電圧が時間と共に増大し始めて分
極の開始（ｏｎｓｅｔ　）又はファウリング（ｆｏｕｌ
ｉｎｇ　）を示す点まで継続された。この点の電流密度
が、その操作条件（塩濃度、ｐｔｉ、濃度及び線速度）
でのＰＣＤであった。このＰＣＤに基づいて初期の操作
電流密度、（８アンペア、４５＋Ａ　／　ｃｎｆ　）を
選択した。

系の操作は回分法で行った。すなわち、コハク酸塩培地
を次第に脱塩した。この電気透析法は、溶液が所望度に
脱塩されるまで継続した。

水分解電気透析後の酸生成物は、残留ナトリウム及びＦ
ｉＬ＃！ｉその他のアニオン）を含有する。イオン交操
体を用いて、ナトリウムイオン（Ｄｏｖｅｘ５０１１ｘ
８）と硫酸イオン（ロームアンドハースＩＲＡ−９４）
を除去した。５．１ＣＩｌ（２インチ）のガラスカラム
を用いて水分解ＥＤからの生成物流をイオン交換仕上げ
した。

この二基の操作は連続流方式で実施した。メーカの指示
通りにイオン交換樹脂を充填、逆洗及び調製した。床容
積（上記条件下での樹脂容積）をこの時点で測定した。

吸着工程では、０．０１床容積／分の流速を用いた。コ
ハク酸／酢酸溶液は約ＩＮであった。ナトリウム濃度は
０．２乃至０．３Ｎであった。カチオン交換ＩＭ脂の床
面積は、Ｄｏｗｅｘ　５０ｗｘ８の容量１．８ミリ当量
／　ｍＱを基準として要求量の二倍であった。

アニオン交換樹脂の床面積は、溶液の硫酸塩含量基準で
の所要イオン交換容量の二倍であった。

ＩＲＡ−９４のイオン交換客員は０．３ミリ当ｉ　／　
ｐｔ９であつた。

ポータプル伝導度計（コールバーマー Ｃｏ１ｅ　Ｐａｒｍａｒモデル１４８４−１０）を用い
て伝導度を測定した。

報告するコハク酸及び酢酸の濃度はアニオン濃度であっ
て、適当に希釈・酸性化後、３０．５Ｃ１１（１フイー
ト）長のＨＰＸ８７Ｈ”カラムを用いたＨＰＬＣ法によ
り測定した。

全蛋白含量は、ケルダール装置で測定したものであって
、窒素Ｘ６．２５％として報告した。

硫酸塩濃度は、＠酸バリウム沈殿の重量分析により測定
した。

ナトリウム濃度は、オリオン（ＯＲＩＯＮ）　５Ａ７２
０イオン選択メータとナトリウム電極を用いて測定した
。

Ｘ施１巳二二！ Ａ、５ｕｃｃｉｎｉ　ｒｏｄｕｃｅｎｓ醗酵を行って高
収率・高生産性でコハク酸塩を得た。ｒＩ３酵は２１の
ニューブランズウィックマルチゲンフアーメンター（Ｎ
ｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｍｕｌｔｉｇｅｎ　Ｆｅｒｍ
ｅｎＬｏｒ）内でｐＨを種々の値に調節し、ＣＯ７濃度
を種々変更し、炭酸塩緩衝条件を採用又は採用せずに、
各種の一価カチオンのアルカリを用いて実施した。

各調節ＰＨ値での酊肚肛り組阻鎮阻旺醗酵の結果を第２
表に要約する。　ｐＨは５．５乃至７．２範囲の値に調
節された。ｐＨ５，５ではこの微生物は成長せず、基質
を消費しなかった。高いコハク酸塩を得る為のＲ’１ｌ
ｐＨ範囲は５．８乃至６．６である。コハク酸塩生産性
に関する最適ｐＨは５．９乃至６．３である。コハク酸
塩の最大収率は、消費デキストロース基準で８７乃至９
０重量パーセントである。　ｐＨ値が６．６より高いと
、コハク酸塩収率は低下して乳酸塩が生成する。　最ａ
ｐＨ（５，８−６，０）　条件下テｔ７）　ニアハク酸
塩以外の主要副生成物は乳酸塩である。

ｌｌ民 各ｐＨ値テノＡ、５ＵＣＣ［ＮＩＣＩＰＲＯＤＵＣＥＮ
Ｓａ！ｉ酵生成物（最終）　　ｇ／＋　　　１．９　０
．０　０．５　１．６　１．８募３」１立耽り 醗酵時間、時間　２４ ２２．５　３８ 酢酸塩、ｇ　　　１３．６　１１．３　１１．５　５．
４　４．３ギ酸塩、ｇ　　　　１．３　０．６　０．５
　２．１　１．７乳酸塩、ｇ　　　　０　　０　　０．
０　２０．６　３９．６乳酸収率、垂蓋％０　　０　　
０　　３７．０６８．９注：　ｐＨ５，５では少量のグ
ルコースしか消費されず実は実施例の略記 及１匠６−８ 散布ガス中の二酸化炭素濃度を種々変更して、二酸化炭
素圧が醗酵に対して如何なる影響を与えるかを測定した
。結果を第３表に要約する。低ＣＯ□分圧下ではコハク
酸塩の収率は低く、醗酵は遅くて完結まで進行しない、
すなわち、高収率かつ高速度でコハク酸塩を製造するに
は、０，１気圧以上のＣＯ２分圧が必要である。

箸！ Ａ、５ＵＣＣ［ＮＩＣＩＰＲＯＤｔＪＣＥＮＳ醗酵に及
ぼすＣＯ，分圧の効果ＣＯ□分圧（ａｔ、ｍ）” 実施医立 ０％” 火旌赳Ｌ Ｏ，１％ 実施己１ １．０％ デτ姦縫丁、１．　　　　　４０・Ｏ デ１恭鯉丁２　　　　　１７・５ 醗酵時間、時間　　　　　４０ コバクラ源の生産性　　　０．Ｏ１ ｉｌｌ 生成物、ｇ コハク酸塩　　　　　　　０．６ 酢酸塩　　　　　　　　０．８ ギ酸塩　　　　　　　　　１．５ 乳酸塩　　　　　　　　１３．５ エタノール　　　　　　　１，２ コハク酸収率、重Ｉ（％）２．６ 乳酸収率、重量（％）６０ ｐＨ６，２ ４９，４ ３２，９ ，２７ １１，６ ４，４ ４１，２ １１，５ ０，５ ０，０ ０，０ ８７，８ ６，２ 犬ＪＪＩと トリプトファンの濃度効果を第３図のグラフに示す、こ
のグラフからデキストロース基質を高水準で消費するた
め必要な最適基準はトリプトファン約２５ｐｐ園である
ことが判る。それより少量例えばｔｏｐｐ■のトリ１ト
フアンの使用は有利ではあるが、基質を高水準で完全に
使用しない。

及１１匪 中和用の塩基はナトリウムイオンに限定されるわけでは
ない、第４表は、中和剤として水酸化アンモニウムを使
用した結果を示している９醗酵収串は８８％であった。

４全ガス流速１０ｃｎｌ／分 爪Ａ」（ 水酸化アンモニウム中和によるＡ、５ＵＣＣＩＮＩＣＩ
ＰＰＯＤＩＪＣＥＮＳ醗酵醗酵時間、時間 生産性、ｇ／、Ｌ／時 生成物 コハク酸塩、ｇ 酢酸塩、ｇ 乳酸塩、ｇ ギ酸塩、ｇ コハク酸塩収率、％ 乳酸塩収率、％ ｐＨ １，１ ４１，１ １０，７ ０，８ ６，０ これらの実験の結果は、高収率・高生産性のコハク酸塩
醗酵は、醗酵条件のｐＨ，ＣＯ□分圧、栄養分及びアル
カリ添加を注意深く調節したもとで生起することを示し
ている。

え１匹比 電気透析回収プロセスは、２リツトル試験醗酵よりも大
容量の培地を必要とする。この理由からと大規模醗酵試
験を行うために、８０リツトル醗酵を実施した。

これらの醗酵に用いた手順及び材料については前述しな
、媒体の初期還元には、硫化システィンの代わりにシス
ティン−ＨＣｌを使用した。ＣＯ□をゲージ圧３４ｋＰ
ａ（Ｓｐｓｔｇ）で供給すると、コハク酸塩収率はほぼ
９０パーセントであり、Ｃ０２分圧が高いはどコハク酸
塩収率も高くなることを示している。

結果を第５表に要約する。

箸Ｕ 醗酵容積、　ｆＩ５５ 醗酵時間、時間　　　　　　　　２８ 生産性、ｇｉｌｌ１時　　　　　　　１．１生成物 コハク酸塩、ｇ　　　　　　　　１６９６．２酢酸塩、
ｇ４６２ 乳酸塩、ｇ ギ酸塩、ｇ　　　　　　　　　　４６ コハク酸塩収率、％　　　　　　８９．７ｐＨ６，２ 実１１１■二じ− 全基質の消費後、培地全体ｌＯリットルを直ちにコハク
酸塩の電気透析に用いた。０．２ミクロン孔径カットオ
フ値の限外濾過中空繊維膜を用いて残りの培地を清澄に
した。この細胞を除去したコハク酸塩含有培地を用いて
、電気透析回収及びｔ＊Ｗ！Ｊの比較試験を行った。

細胞を含有する培地全体及び清澄にした培地を、通常の
電気透析膜スタックを用いて処理した０分離能は、細胞
含有培地でも清澄培地でも同一であった。稀薄室内の培
地濃度は、最初２０−２５ｇ／　ｉＩの範囲であった。

最終コンセントレート（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は９
０−９５ｇ／　ｆのコハク酸塩を含有した。稀薄室内の
最初の酢酸濃度は約６．０ｇｉであった。コンセントレ
ート中の最終酢酸塩濃度は約１３ｇ＃であった。

培地内のコハク酸塩／酢酸塩（Ｓ／Ａ”）重量比は、最
初３．７であった。１２０分後にこの比は２．４となっ
た。各バッチ共８０％に近いコハク酸塩が回収された。

酢酸の回収は各実験とも６０％に過ぎなかった。

培地から生成物コンセントレートに移動したコハク酸塩
と酢酸塩の物質収支は、これらの条件下ではコハク酸塩
が選択的にこの好′ａ膜を通過−移動することを示して
いる。この事実は培地から望ましいコハク酸塩を選択的
に回収し、生成物中のその濃度を増大させて望ましくな
い酢酸塩を費消された培地に残すので、非常に重要かつ
予期され得ぬ知見である。

移動全有機酸基準の電流効率は、細胞を含む培地全体及
び清澄培地共に約８０％であった。

稀薄原料培地及びコンセントレート内の蛋白質を、ケル
ゾール総窒素法を用いて測定した。総ケルダール窒素値
を基準として、全含窒素化合物の８５乃至９０％が稀薄
流中に保持された。

及１匠Ｕユし 常法による電気透析からの濃縮・精製されたコハク酸塩
を、双極の水分解膜スタックを用いて更に処理した。前
記の双極膜スタックを用いて得られた結果を第６表に示
す、実施例１４は、常法によるＥＤから直接きた材料を
用いて実施した。実施例１５は、双極膜スタックで処理
する前に蒸発・濃縮した常法によるＥＤからの流で実施
した。

第６表 ナトリウム除去、％ ７８．９ ８１．２ 電流 最初のコハク酸塩濃度、ｇＨ 最後のコハク酸塩濃度、ｇｉｌｌ 最初のｅ酸塩濃度、ｇｉｌｌ 最後の酢酸塩濃度、ｇｉｌｌ 実験時間、分 温度、℃ 電流効率、％ ７６．２ コハク酸基準 全有機酸基準 ０．５７ ０．４８ ０．５１ ０．４２ 初期コハク酸塩濃度を低くした場合と高くした場合との
主な違いは、所要電気エネルギーと残留ナトリウム濃度
で示される。初期のコハク酸塩濃度が高いと電力消費が
少なく、残留ナトリウム濃度ら低い、すなわち、常法に
よるＥＤからの生成物を単純蒸発で濃縮することは、電
力消費並びにナトリウムイオンの除去に伴う費用の低減
に望ましいことである。特に、コハク酸生成物濃度を常
法によるＥＤ回収にて得られるものより高める要ある場
合にそうである。

及１匠胆 水分解ＥＤ後のコハク酸流は、若干の残留ナトリウムイ
オン、アミノ酸及び硫酸塩イオンを含有する。先ずはナ
トリウムイオンを、次に′ｆｊＬ酸イオンを除去するな
め、仕上げイオン交換系が開発された。ナトリウムイオ
ン及び硫酸イオンの除去と同時に、若干部のアミノ酸も
除去された。

コハク酸流からナトリウムを除去するため、酸形態の強
酸性カチオン交換体（Ｄｏｗｅｘ　５０ｗｘ８　）を使
用した０次に遊離塩基形態の弱塩基アニオン交換樹脂（
ロームアンドハース　ＩＲＡ−９４）を用いて、コハク
酸流から硫酸塩を選択的に除去した。ナトリウムと硫酸
塩の濃度は５ｐｐｍ未満に低下した。イオン交換樹脂と
くにカチオン交換砺脂は、生成物中のアミノ酸低下を助
ける。イオン交換処理後のコハクｆｉ／酢酸生成物の純
度は、乾量基準で９９．５％であり、含窒素不純物の含
有率は０．５％未満であった。すなわち、処理工程を注
意深く選択することにより、含窒素不純物を１％未満、
硫酸塩及びナトリウムその他のカチオンを１０ｐｐｍ未
満含有する生成物を、本発明の醗酵及び精製法にて製造
することが出来る。

Ａ、５ｕｃｃｉｎｉｃｉ　ｒｏｄｕｃｅｎｓという特殊
法と布はく強化ミクロ不均一共重合膜（旭硝子ＡＭＶ及
びＣＭＲ’）を組み合わせて用いると、醗酵器又は電気
透析分離装置内で、効率損失を伴わずに、電気透析と培
地全体からの細胞の再循環を同時に達成できることは、
当業者には明らかであろう、成熟細胞を生きたまま醗酵
器に再循環し、そこで炭水化物と栄養分を添加して醗酵
を続ける。電気透析装置がらの精製・濃縮されたコハク
酸塩は水分解電気透析系に供給され、そこでコハク酸塩
をコハク酸と対応塩基に転化することができる。得られ
た塩基は中和用に醗酵器に再循環され、精製・濃縮され
たコハク酸はイオン交換体で更に精製されてスペシャル
ティーケミカル又はコモデイティーケミカル中間体に供
される。

醗酵器からのコハク酸塩流を先ず通常の電気透析で処理
してコハク酸塩を回収し、かつ、含窒素不純物を除去す
ること；次にそれを水分解電気透析で処理してコハク酸
塩をコハク酸に転化すること：及び得られたコハク酸流
を先ず強酸性イオン交換体で処理したあと弱酸性イオン
交換体で処理して所望生成物を得ることが極めて重要な
のである。この順序に従わない限り、満足な生成物を得
ることはできない。

スペシャルティーケミカル及びコモデイティーケミカル
用として十分に経済性あるコハク酸及びその誘導体を製
造できる醗酵プロセスにするには、該プロセスが低費用
の栄養分を使用して高い生産性で高濃度生成物を製造す
ること及び該プロセスを経済的な精製プロセスと統合す
ることが必要なことも当業者には明らかであろう０本発
明の新規プロセスは、この要求に合致するものである。

本発明の範囲は、特許請求の範囲によるのばか制限され
ない。

４、　　〔図面の簡単な説明〕 第１図は１本発明の方法を示すフローシートである。

第２図は、好適な電気透析の概要図である。

第３図は、醗酵速度に及ぼすトリプトファンの効果を示
すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）醗酵器内の炭水化物及びその他の栄養分を含
   有する基質上で、コハク酸塩を産生し得る微生物を醗酵
   培地内の大部分の炭水化物がコハク酸塩に転化されるま
   で成育すること； （ｂ）該コハク酸塩含有培地を先ず常法による電気透析
   に付し、水流中のコハク酸塩を選択的に回収及び濃縮し
   、かつ、含窒素不純物を除去すること； （ｃ）該濃コハク酸塩を含有する水流を水分解電気透析
   に付し、該コハク酸塩を対応する塩基流及びコハク酸流
   に転化すること； （ｄ）該コハク酸流を酸形態の強酸性イオン交換体で処
   理し、該流からコハク酸を除去することなくナトリウム
   又はその他のカチオンを除去すること；及び （ｅ）斯く処理されたコハク酸を遊離塩基形態の弱塩基
   性イオン交換体で処理し、該流からコハク酸を除去する
   ことなく硫酸又は硫酸塩不純物を除去して、精製された
   コハク酸生成物を得ること； を包含するコハク酸の製造及び精製方法。 ２、該微生物がエイ・サクシニシプロデューセンス（￥
   Ａ￥．￥ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ￥）Ａ
   ＣＴＴ５３４８８の同定特性を有する微生物である請求
   項１記載の方法。 ３、該微生物を０．１気圧以上のＣＯ＿２分圧下で培養
   する請求項２記載の方法。 ４、コハク酸塩を除去した培地内の生存細胞を醗酵器内
   に再循環する請求項１記載の方法。 ５、水分解電気透析により得られた塩基を醗酵器に戻す
   請求項１記載の方法。 ６、コハク酸、酢酸、１％未満の含窒素不純物及び１０
   ｐｐｍ未満の硫酸イオンを含有する請求項１記載の方法
   にて調製されたコハク酸生成物。 ７、水流中のコハク酸塩を蒸発にて濃縮し、そのあと水
   分解電気透析に付して該コハク酸塩を塩基流とコハク酸
   流に転化する請求項１記載の方法。 ８、（ａ）エイ・サクシニシプロデューセンス（￥Ａ￥
   ．￥ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ￥）ＡＣＴ
   Ｔ５３４８８の同定特性を有する微生物を醗酵器内のｐ
   Ｈ約５．８乃至約６．６の炭水化物、その他の栄養分、
   ナトリウムイオン及びトリプトファンを含有する基質上
   、０．１気圧以上のＣＯ＿２分圧下で醗酵培地内の炭水
   化物の大部分がコハク酸塩に転化されるまで培養するこ
   と；（ｂ）該醗酵培地を電気透析にて処理し、 含窒素不純物を除去し且つ水流中に該コハク酸塩を単離
   すること； （ｃ）該水流を水分解電気透析にて処理し、塩基流及び
   コハク酸流を形成すること； （ｄ）該コハク酸流を酸形態の強酸性イオン交換体で処
   理し、該流からコハク酸を除去することなくナトリウム
   又はその他のカチオンを除去すること；及び （ｅ）その結果得られたコハク酸流を遊離塩基形態の弱
   塩基性イオン交換体で処理し、コハク酸を除去すること
   なく硫酸又は硫酸塩不純物を除去して、コハク酸、３０
   ％未満の酢酸及び１％未満の含窒素不純物を含有するコ
   ハク酸生成物を得ること； を包含する高度に精製されたコハク酸生成物を製造する
   方法。 ９、トリプトファンが１０ｐｐｍ以上存在する請求項８
   記載の方法。 １０、該水流中のコハク酸塩を蒸発で濃縮したあと水分
   解電気透析に付し、該コハク酸塩を塩基流とコハク酸流
   に転化する請求項８記載の方法。 １１、３０％未満の酢酸と１％未満の含窒素不純物を含
   有する請求項８記載の方法で得られたコハク酸生成物。 １２、コハク酸、酢酸、硫酸、硫酸イオン、ナトリウム
   イオン及びその他のカチオン性不純物を含有するコハク
   酸溶液を精製する方法であって、（ａ）コハク酸を除去
   することなくナトリ ウム又はその他のカチオンを除去する酸形態の強酸性イ
   オン交換体で先ず該溶液を処理すること；及び （ｂ）該コハク酸を除去することなく硫酸イオン及び硫
   酸を除去する遊離塩基形態の弱塩基性イオン交換体で斯
   く得られた溶液を処理すること： を包含するコハク酸溶液の精製方法。