JPH0132947B2 - - Google Patents

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JPH0132947B2
JPH0132947B2 JP57123753A JP12375382A JPH0132947B2 JP H0132947 B2 JPH0132947 B2 JP H0132947B2 JP 57123753 A JP57123753 A JP 57123753A JP 12375382 A JP12375382 A JP 12375382A JP H0132947 B2 JPH0132947 B2 JP H0132947B2
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stool
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globulin
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JP57123753A
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Garatsutei Hararudo
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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    • G01N33/721—Haemoglobin
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description

【発明の詳細な説明】
当該発明は人の糞便標体中の人潜血を検出する
ための方法に関する。 大便中の潜血の検出は結腸癌の早期診断法とし
て認められた方法である。大便中の潜血の化学的
検出は、古くすでに試みられている単純な検査方
法である。この場合、試験の原理は、ヘモグロビ
ンのペルオキシダーゼ作用に基いており、それに
よれば、過酸化水素の存在下に指示薬（ベンジジ
ン、オルト―トルイジン、グアイアクム）が酸化
されて青い発色をみる。これはもちろん非特異的
反応である。なぜならば、ヘモグロビン以外に食
物、主として豚の血をまぜたソーセージ、赤味の
肉ならびに野菜の構成分のごときその他の大便成
分や腸内細菌もまたペルオキシダーゼ作用をもつ
からである。テストスライドの形で入手できる大
便中潜血検出用の市販の諸テストでは患者はテス
ト開始前３日間とテスト期間中に生肉および半生
肉ならびにソーセージ（たとえばタルタル、ステ
ークレバー、サラミ、血液入りソーセージ）の消
費をやめる必要がある。 これらの諸注意は患者にとりわずらわしく、ま
た必ずしも完全に偽のポジテイブ反応を除外する
ことができず、そのため、結腸鏡あるいは直腸鏡
のような時間と費用のかかる検査をその後に必要
とする。 この理由から、グアイアクムを飽和させた従来
のテストスライドの場合に、グアイアクムを充満
させていない附加的なサンプル受容部位を用い
て、グアイアクムがポジテイブのサンプルの場合
にこの附加的サンプル受容部位の内容について免
疫学的方法を用いてヒトのヘモグロビンの存在を
検索することもまたすでに提案されてきた
（Songster、C.L.ら、アメリカ癌学会
（American Cancer Society）1099頁以下参照、
1980）。 しかしながら、この方法は、附加的大便サンプ
ルが、グアイアクムテストに用いられた大便サン
プルと絶対的に同一ではなく、たとえば、それは
別の排便からとられたものかあるいは、その大便
の別の部分からとられたものであるために、再び
不確実性にみちびくという欠点をもつている。 したがつて、ペルオキシダーゼテストに用いら
れた大便のサンプルについて、正常では人糞中に
存在しない人体起源の成分、たとえばヒトヘモグ
ロビンまたはヒトグロブリンが存在するか否かを
検査する必要がある。 過酸化法は、エタノール性過酸化物溶液を用い
で実施されるので、これまでこの方法は、それら
人体起源成分の免疫学的性質を破壊すると考えら
れていた。 これに反し、本発明によつてこの考えは正しく
なくて、以前にペルオキシダーゼ法にかけられた
大便サンプルにおいてその中に存在する人糞中に
正常では存在しない人体起源の成分を免疫学的に
検出することが容易に可能であることが今やおど
ろくべきことに発見されたのである。 したがつて、当該発明は、ペルオキシダーゼ法
を実施した後の同一大便サンプルにおいて、ヒト
ヘモグロビンまたはヒトグロブリンを免疫学的に
検出することを含むペルオキシダーゼ法にしたが
うヒトの大便サンプル中の人潜血の検出法に関す
るものである。 すでに述べたように、ペルオキシダーゼ法の場
合には、たとえばベンジジン、オルト―トルイジ
ン、グアイアクムが指示薬として用いられる方法
が考慮される。 正常では人糞中に存在しない人体起源の免疫学
的成分で分析されるべきものとしては、ヒトのヘ
モグロビンあるいはヒトのグロブリンが適してい
る。ヒトのグロブリンとしては免疫グロブリン
Ｇ、免疫グロブリンＭ、または免疫グロブリンＡ
が考えられる。 これらの成分の免疫学的検出は、免疫学で既知
のいかなる方法にしたがつても実施できる。サン
ドウイツチ法は、特に選ばれる方法であることが
発見された。この方法では、検出されるべき成分
が、固体相に結合された特異的抗体と標識化され
ている特異的抗外との２種の特異的抗体の助けに
より測定される。この用いられる抗体は、ことな
る動物の血清から得ることができるが、ことなる
単クローン性抗体を用いることもできる。合成物
質のビーズは、固体相として特に適していること
が示された。標識としては、酵素が特に適してい
るが、免疫学において既知のすべての標識化手段
が考えられる。 しかしながら、これらの諸成分の免疫学的検出
はラテツクス凝集反応テストを用いて実施するこ
ともできる。 以下の例は本発明を例証する。 例 １ ヒトの大便を、100ｇの新鮮な便につき０ml、
１ml、２ml、４ml、８ml、16mlの人血液で処理
し、均質化させる。これらの大便サンプルの各各
をへらの先にとり、テストスライド「Colo―
Rectal―Roche―Test*」の２つの室に入れ
て、このスライドを封じ、室温で２日間保存す
る。 大便中の潜血を検出するために、「医師のみが
開封すべきこと」というたれぶたをとりのぞき、
まず最初に20％のエタノール（PH５）を含む
0.1Mクエン酸緩衝溶液を１滴、続いてエタノー
ル中３％のH2O2溶液を１滴大便サンプルへ添加
し、30秒後に生ずる色彩の強度（０から4+）を測
定評価する。 引き続く、大便中ヒトグロブリンの酵素―免疫
学的検出のために、２点の大便のしみをつけた９
mm巾の細片をテストスライドからきりとり、この
細片を37℃でPH9.5の0.1M NaHCO3 ５ml中にて
30分間保温培養する。よく混合したのち、澄明で
無臭、黄褐色の抽出液を合成試験管（φ＝１cm）
の中へピペツトでとり入れ、PH6.5の0.2M燐酸ナ
トリウム緩衝溶液を0.1mlを混和し、抗ヒトグロ
ブリン（ヒツジ）で感作したポリスチレンビーズ
（φ＝6.35mm）を加え、その混合物を37℃で１時
間保温培養する。結合しない物質を分離したの
ち、このビーズを再び37℃で１時間20％のヤギ血
清および２ｇ/のウシ血清アルブミンとともに
PH6.5の0.2M燐酸ナトリウム緩衝溶液中に溶解さ
せた（ヤギ）抗ヒトグロブリンペルオキシダーゼ
0.2mlと共に保温培養する。 蒸溜水で３重に洗滌後、免疫学的に結合したペ
ルオキシダーゼを検出するために、このビーズを
室温で30分間0.5mlの基質緩衝溶液（0.1MのPH5.0
のクエン酸緩衝溶液と6mMのH2O2および40mM
のＯ―フエニレンジアミン）中で保温培養する。
1NHClを２ml加えることによつて酵素反応を中
止させたのちに、ヒトグロブリン含量を確かめる
ために、波長492nm（△A492nm/RT30分）で吸
収差を測光学的に測定する。その結果は第１表に
集めてある。 ＊供給源 ホフマン ラ ロツシユ社、デイア
グノステイカ、Ｄ―7889グレン ツア
ツハーヴアイレン（Hoffmann―La
Roche AG Diagnostica Ｄ―
7889Grenzach―Wyhlen）
【表】
【表】 酵素免疫学的潜血テストの感度は、第１表から
明らかである。なぜならば、吸収差は人血液濃度
に依存して有意に増加しているからである。 例 ２ 人糞を100ｇの新鮮な大便につき10mgの西洋わ
さびのペルオキシダーゼおよび各例とも４mlの(a)
人血、(b)ヤギの血液、(c)ウシの血液、(d)ウサギの
血液、(e)ウマの血液で処理し、均質化する。これ
らの大便サンプルをへらの先にとり、テストスラ
イド「Colo―Rectal―Roche―Test 」の２つ
の室に入れて、スライドを封じ室温で１日保存す
る。 大便中の潜血を検出するために、「医師のみが
開封すべきこと」とあるたれぶたを取りのぞき、
先ず最初に、20％のエタノール（PH５）を含む
0.1Mのクエン酸緩衝溶液の１滴を、次にエタノ
ール中の３％H2O2溶液の１滴を大便サンプル中
に添加し、30秒後に生成する色彩の強度（０から
4+）を測定評価する。 大便サンプル中のヒトグロブリンのその後の酵
素免疫学的検出のために、２点の大便のしみをつ
けた９mm巾の細片をテストスライドから切り出
し、この細片を37℃でPH9.5の0.1M NaHCO3の
５ml中で30分間保温培養する。よく混合したのち
0.1mlの澄明で赤褐色の抽出液を試験管中にピペ
ツトでとり、PH6.5の0.2M燐酸ナトリウム緩衝液
の0.1mlと混和し、（ヒツジ）抗ヒトグロブリンで
感作したポリスチレンビーズを加えて、その混合
物を37℃で１時間保温培養する。結合しない物質
を分離した後に、このビーズを20％のヤギ血清と
２ｇ/のウシ血清アルブミンを含むPH6.5の燐酸
ナトリウム緩衝溶液0.2M中に溶解させた（ヤギ）
抗―ヒト―グロブリンペルオキシダーゼと37℃で
１時間保温培養する。結合しない物質を分離し、
ビーズを蒸溜水で３回洗滌し、続いて、免疫学的
に結合したペルオキシダーゼの定量分析のために
室温で30分間、0.5mlの基質緩衝溶液（6mMの
H2O2と40mMのＯ―フエニレンジアミンを含む
PH5.0の0.1Mクエン酸緩衝溶液）の中で保温培養
する。２mlの1NHClを加えることにより酵素反
応を中止させた後に、ヒトのグロブリンの含量を
確かめるために波長492nmで吸収差を測光学的に
測定する。その結果は第表に集められている。
【表】
【表】 酵素免疫学的潜血テストの特異性は第表から
明白である。なぜならば、人血液を含むサンプル
のみが吸収差の有意の増加を示しているのに対
し、動物の血液またはペルオキシダーゼ（人血液
を含まぬ）を含むサンプルは、そのような増加を
示さず、それでも色調上の強度だけは示している
からである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼ法による人糞標本中のヒト
    潜血の検出方法であつて、糞便標本に対してペル
    オキシダーゼ法を実施した後に、同一糞便標本中
    のヒトヘモグロビンおよびヒトグロブリンを免疫
    学的に検出することを特徴とする上記ヒト潜血の
    検出方法。 ２ ペルオキシダーゼ法を指示薬としてベンジジ
    ン、Ｏ―トルイジン、あるいはグアイアクムを用
    いて実施する、特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。 ３ ヒトグロブリンが免疫グロブリンＧ、免疫グ
    ロブリンＭあるいは免疫グロブリンＡである、特
    許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ ヒトヘモグロビンまたはヒトグロブリンの免
    疫学的検出をサンドウイツチ法にしたがつて実施
    する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一
    つに記載の方法。 ５ サンドウイツチ法において、異なる動物を免
    疫することにより得られた２種の特異的抗体を用
    い、その１つは固体相に結合しており、他の１つ
    は標識化されている、特許請求の範囲第４項に記
    載の方法。 ６ 固体相が合成物質のビーズからなる、特許請
    求の範囲第５項に記載の方法。 ７ 抗体が酵素で標識化されている、特許請求の
    範囲第５項に記載の方法。 ８ 酵素がペルオキシダーゼである、特許請求の
    範囲第７項に記載の方法。
JP57123753A 1981-07-16 1982-07-15 人潜血の検出方法 Granted JPS5823796A (ja)

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CH4673/81-6 1981-07-16

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JPS5823796A JPS5823796A (ja) 1983-02-12
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EP (1) EP0070366B1 (ja)
JP (1) JPS5823796A (ja)
AT (1) ATE15229T1 (ja)
AU (1) AU541099B2 (ja)
CA (1) CA1212024A (ja)
DE (1) DE3265794D1 (ja)
DK (1) DK155750C (ja)
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