NO160746B - Fremgangsm te fovisning av okkult blod i fecesproeve - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved påvisning av okkult menneskeblod i ekskrementprøver som angitt i krav l's ingress.

Påvisningen av okkult blod i ekskrementer er en anerkjent metode for tidlig å oppdage carcinomer i tykktarmen. En gam-mel, anerkjent og enkel påvisningsmetode er kjemisk påvis-

ning av okkult blod i avføringen. Her bygger undersøkelses-prinsippet på peroksidase-virkningen til hemoglobin, idet indikatoren (benzidin, o-toluidin, guajak) oksyderes i nær-

vær av hydrogenperoksyd og man får en blåfarging. Det dreier seg her imidlertid om en uspesifikk reaksjon, da i tillegg til hemoglobin også andre avføringskomponenter har peroksi-daseaktivitet, så som næringsmidler, fremfor alt blodpølse,

rødt kjøtt, plantebestanddeler og tarmbakterier. Ved kommer-sialiserte prøver for påvisning av skjult blod i avføringen,

som kan fåes i form av små prøvebrev, bes da også pasienten tre dager før forsøkets begynnelse og under forsøksperioden å gi avkall på å spise rått, halvrått kjøtt så som pølsevarer (f.eks. tartar, stek, lever, salami, blodpølse).

Disse forsiktighetsregler er omstendelige for pasientene og

kan ikke helt utelukke falske, positive resultater, hvilket nødvendiggjør tidkrevende og kostbare etterfølgende undersøk-elser, så som koloskopi-, eller rektoskopi.

Av denne grunn er det tidligere foreslått (Songster, CL.

et al. i American Cancer Society 1099 ff, 1980) å anbringe et ytterligere prøvested ved et vanlig prøvebrev som er impre-gnert med guajak, og hvis innhold i tilfelle av en positiv guajakprøve blir undersøkt ved hjelp av en immunologisk metode på nærvær av humanhemoglobin.

Denne fremgangsmåten har imidlertid den ulempe at denne ytterligere avføringsprøve ikke ubetinget er identisk med de av-føringsprøver som undersøkes med guaj.akprøven, idet de f.eks. kan være tatt under en annen avføring, hhv. på et annet sted i avføringen, hvilket igjen kan føre til usikkerhet.

Følgelig foreligger et behov for å undersøke samme avførings-prøver som ble underkastet peroksidaseprøven på nærvær av komponenter av human opprinnelse som normalt ikke forekommer i menneskeekskrementer.

Da peroksidasemetoden utføres ved hjelp av en etanolisk peroksydløsning, var man tidligere av den oppfatning at denne metoden ødela de immunologiske egenskapene til slike komponenter.

I motsetning til dette har man nå overraskende funnet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse at dette ikke er tilfelle, men at det uten videre er mulig i en ekskrementprøve som forut ble underkastet peroksidasemetoden å: utføre en immunologisk påvisning av komponenter av human opprinnelse, hvilke komponenter normalt ikke forekommer i menneskeekskrementer .

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte ved påvisning av okkult menneskeblod i avføringsprøver fra mennesker ifølge peroksidasemetoden, hvilken er karakterisert ved at etter' gjennomføring av denne metoden påviser immunologisk i samme avføringsprøve human hemoglobin, human albumin eller et humanglobulin som angitt i kravets karakteriserende del.

Som tidligere nevnt, kommer de fremgangsmåter i betraktning ved peroksidasemetoden hvori benzidin, o-toluidin eller guajak anvendes som indikator.

Som komponenter av human opprinnelse-, som skal bestemmes immunologisk, hvilke normalt ikke forekommer i menneske-avføring, er f.eks. humanhemoglobin, humanalbumin eller humanglobulin egnet. Som human globulin kommer immunglobulin G, immunglobulin M eller immunglobulin A i betraktning.

Den immunologiske påvisning av disse komponenter kan fore-tas ved hver kjent metode innenfor immunologien. En særlig foretrukket metode har vist seg å være sandwich-metoden. Denne metode.bestemmer komponentene som skal påvises ved hjelp av to spesifikke antistoffer, hvorav ett kan være bundet på en fast fase og den andre er utstyrt med en markør. De anvendte antistoffer kan fremskaffes fra forskjellige dyresera, men også forskjellige monoklonale antistoffer kan anvendes. Særlig kunststoffsmåkuler har vist seg egnet som fast fase. Som markør kommer alle kjente markører innenfor immunologien i betraktning, hvorunder imidlertid enzymer er særlig egnet. Fortrinnsvis anvendes som enzym peroksidase.

Den immunologiske påvisning av disse komponenter kan imidlertid også skje med en lateks-agglutineringsprøve.

De etterfølgende eksempler belyser oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Menneskeavføring blandes med 0 ml, 1 ml, 2 ml, 4 ml, 8 ml og

16 ml menneskeblod pr. 100 g frisk avføring og homogeniseres. Fra disse avføringsprøver påføres en spatelspiss hver i de to fordypninger av et prøvebrev "Colo-Rectal-Roche-test ®', brevene lukkes og oppbevares to dager ved romtemperatur.

For påvisning av okkult blod i avføringen fjernes nå klaffen "skal bare åpnes av lege" og deretter settes først en dråpe av en løsning av 0,1 M citratpuffer med 20% etanol (pH 5)

og deretter 1 dråpe av en 3%ig t^C^-løsning i etanol på av-føringsprøven og etter 30 sek. vurderes den dannede fargeintensitet (0 - 4+).

For den etterfølgende enzym-immunologiske påvisning av human globulin i avføringen, skjæres en 9 mm bred strimmel med de to avføringsflekker av fra prøvebrevet og denne imkraberes i 5 ml 0,1 M NaHC03 med pH 9,5 i 30 min. ved 37°C. Etter grunding blanding pipeteres deretter fra det klare, luktfrie, brungul-fargede ekstrakt 0,1 ml i et kunststoff prøverør (0=1 cm), 0,1 ml 0,2 M natriumfosfatpuffer med pH 6,5 tilblandes, en polystyrenikule iø =■ 6,35 mm) sensibilisert med (saue)anti-human globulin tilsettes og mai inkuberer 1 time

ved 37°C.

Etter fjerning av det ikke-bundne materiale på kj ent måte, inkuberes kulen igjen 1 time ved 37°C med 0,2 ml (geite)anti-humanglobulin-peroksidase, oppløst i 0,2 M natriumfosfatpuffer med pH 6,5 med 20% geiteserum og 2 g/l storfeserum albumin.

^-'Kommersiell kilde: Hoffmann-La Roche AG

Diagnostica

D-7889 Grenzach-Wyhlen

Etter 3 gangers vask med destillert vann inkuberes kulen for påvisning av immunologisk bundet peroksidase i 30 min. ved romtemperatur i 0,5 ml substratpuffer (0,1 M citratpuffer med pH 5,0 med 6mM H_Op og 50 mM o-fenylendiamin) . Etter avstopping av den enzymatiske reaksjon gjennom tilsetning av 2 ml av en IN HC1 bestemmes adsorpsjonsforskjellen for å måle inneholdet av menneskeglobulin ved bølgelengden 492 nm (a<A>492 nm/RT/30 min,) fotome^risk.

Resultatene er sammenfattet i tabell I.

Sensitiviteten til det enzym-immunologiske okkulte blod-forsøket fremgår av tabell I, da absorpsjonsforskjellen stiger signifikant avhengig av menneskeblodkonsentrasjonen.

Eksempel 2

Menneskeavføring blandes med 4 ml a) menneskeblod, b)geite-blod, c) storfeblod, d) kaninblod, e) hesteblod samt med 10 mg pepperrot-peroksidase pr. 100 g frisk avføring og homoaeni-seres. Fra disse avføringsprøver bringes en spatelspisa i de to fordypninger i prøvebrevet "Colo-Rectal-Roche-Test , brevet lukkes og oppbevares 1 dag ved romtemperatur.

For å påvise okkult blod i avføringen, fjernes nå klaffen "bare åpnes av lege" og først settes en dråpe av en løsning av 0,1 M citratpuffer med 20% etanol (pH 5) og deretter en dråpe av en 3%ig I^G^-løsning i etanol på avføringsprøven og etter 30 sek. observeres den oppnådde fargeintensitet (0-4+) ..

For eten etterfølgende enzym-immunologiske påvisning av menneskeglobulin i avføringsprøvene skjæres en 9 mm bred strimmel av med de to avføringsflekkene fra prøvebrevet og denne inkuberes i 5 ml 0,1 NaHC03 med pH 9,5 i 30 min. ved 37°C. Etter god blanding pipetteres 0,1 ml i et prøverør fra det klare, rødbrun-fargede ekstraktet, 0,1 ml 0,2 M natriumfosfatpuffer med pH 6,5 tilblandes, en (polystyrenkule sensibilisert med (saue)anti-menneskeglobulin tilsettes og inkuberes 1 time ved ved 37°C. Etter separasjon av ikke bundne materiale på kjent måte inkuberes kulen med (geite)anti-menneskeglobulin peroksidase oppløst i 0,2 M natriumfosfatpuffer med pH 6,5 med 20% geiteserum og 2 g/l storfeserum-albumin i 1 time ved 37°C. Det ikke bundne materiale felles fra, kulen vaskes 3 ganger med destillert vann og inkuberes deretter for kvantitativ bestemmelse av den immunologisk bundne peroksidase i 0,5 ml substratpuffer (0,1 M citratpuffer med pH 5,0 med 6 mM H_0 2 og 40 mM o-fenylendiamin)

i 30 min. ved romtemperatur. Etter å ha stoppet den enzymatiske reaksjon ved tilsetning av 2 ml av en IN HC1, måles adsorpsjonsforskjellen ved bølgelengden 492 nm fotometrisk for å bestemme innholdet av menneskeglobulin.

Resultatene er sammenfattet i tabell II.

Fra tabell II fremgår det spesifikke ved det enzym-immunologiske okkultblodprøve-forsøket, da bare prøven med et innhold av menneskeblod viser en signifikant stigning av absorpsjonsforskjellen, mens prøver med dyreblod eller med peroksidase (dog uten menneskeblod) ikke viser noen slik stigning, men likevel en fargeintensitet.

Eksempel 3

Behandlingen av "Colo-Rectal-Roche-Test ble utført som i eksempel 1 og 2, men med ekstraksjon i 5,0 ml 0,1 mol pr. liter NaHC03 buffer med pH 9,5 i løpet av en time ved 37"C.

Til 50 /ti av dette ekstrakt ble 200 jul fortynnet geiteanti-human IGG POD (Nordic) (fortynnet i 0,2 mol pr. liter

natriumfosfatbuffer pH 6,0 med 10% geiteserum) og en med saueantihuman iGG-koblet kule tilsatt. Etter to timers

inkubering ved romtemperatur ble kulen vasket tre ganger med dobbeldestillert vann. Deretter ble kulen overført i 0,5 ml o-fenylendiaminsubstratoppløsning og oppbevart i 30 min ved romtemperatur. Enzymreaksjonen ble derpå stoppet ved

tilsetting av 2,0 ml 1 N HC1. Til slutt fulgte fotometrisk måling.

Claims (1)

1. Immunologisk fremgangsmåte ved påvisning av okkult menneskeblod i menneskefecesprøver som forut er undersøkt ved peroksydasemetoden med benzidin og toluidin eller guajak som indikator, karakterisert ved at man etter gjennomføring av en slik peroksydasemetode i samme fecesprøve påviser human hemoglobin, human albumin eller human globulin immunologisk ved hjelp av en sandwich-metode eller en lateks agglutineringsmetode.