JPH01222791A - アカネ色素の収得方法 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(イ)産業上の利用分野
本発明は植物組織培養による赤色天然色素の製造方法に
関するものである。
関するものである。
(ロ)従来の技術
植物由来のアントラキノン系の色素の原料としてムラサ
キ、アカネ等があり、これらの植物を栽培あるいは、カ
ルス培養によって得られた原料から色素を抽出すること
が知られている。
キ、アカネ等があり、これらの植物を栽培あるいは、カ
ルス培養によって得られた原料から色素を抽出すること
が知られている。
(ハ)発明が解決しようとする課題
栽培植物から得たアカネ色素は水に難溶であるため使用
分野が限定されている。栽培する場合は、その期間が長
く高価であるので一般にはほとんど使用されていない。
分野が限定されている。栽培する場合は、その期間が長
く高価であるので一般にはほとんど使用されていない。
また組織培養によって得ろ方法は栽培よりも生育期間が
早く、天候に左右されず大量の生産が可能であるがまだ
高価であり、染料、使用色素等へ利用する為には培養期
間を短くし、生産効率を上げる必要がある。
早く、天候に左右されず大量の生産が可能であるがまだ
高価であり、染料、使用色素等へ利用する為には培養期
間を短くし、生産効率を上げる必要がある。
本発明は、これら天然物、カルス培養法の欠点を解決(
すなわち、配管体が多い水易溶性色素の生産、培養速度
向上によるコストダウン)したものである。
すなわち、配管体が多い水易溶性色素の生産、培養速度
向上によるコストダウン)したものである。
(ニ)課題を解決するための手段
本発明では植物にアグロバクテリウム・リゾジェネス(
Agrobacterium rhizogenes)
を接種し、誘起してきた毛状根を培養する方法を採取し
た。
Agrobacterium rhizogenes)
を接種し、誘起してきた毛状根を培養する方法を採取し
た。
この方法は次の原理に基づくものである。すなわち、ア
グロバクテリウム・リゾジェネスを植物の菫・葉・根な
どに接電すると、感染部域から毛状根と呼ばれる不定根
が発生する。この根はアグロバクテリウム・リゾジェネ
スのRiプラスミドの遺伝子の一部が植物の遺伝子に組
み込まれることにより発生し、通常のlfl物の根に比
べて生育が非常に速く、または二次代謝産物の生産量が
同等以上であることが知られている。
グロバクテリウム・リゾジェネスを植物の菫・葉・根な
どに接電すると、感染部域から毛状根と呼ばれる不定根
が発生する。この根はアグロバクテリウム・リゾジェネ
スのRiプラスミドの遺伝子の一部が植物の遺伝子に組
み込まれることにより発生し、通常のlfl物の根に比
べて生育が非常に速く、または二次代謝産物の生産量が
同等以上であることが知られている。
本発明では原料とするアカネは、西洋アカネ(Rubi
a tinctorum L、)、日本アカネ(Rub
iaakane Nakai)、アカミノアカネ(Ru
biacordiroria L、)、オオアカネ(R
ubia hexaphyllaMakino)などの
アカネ科又はその他近縁植物が挙げられる。これらの中
で西洋アカネが好ましい1列である。
a tinctorum L、)、日本アカネ(Rub
iaakane Nakai)、アカミノアカネ(Ru
biacordiroria L、)、オオアカネ(R
ubia hexaphyllaMakino)などの
アカネ科又はその他近縁植物が挙げられる。これらの中
で西洋アカネが好ましい1列である。
本植物に毛状根を作らせるために利用できるアグロバク
テリウム・リゾジェネス菌としてはアグロバクテリウム
リゾジェネスATCC15834アグロバクテリウム
リゾジェネスATCC43057(A4)アグロバク
テリウム リゾジェネスATCC13332アグロバク
テリウム リゾジェネスATCC13333アグロバク
テリウム リゾジェネスATCC25818などが挙げ
られる。これらの菌は、アカネを形質転換さ仕、毛状根
を発育されろRiプラスミドを保持しているものである
。
テリウム・リゾジェネス菌としてはアグロバクテリウム
リゾジェネスATCC15834アグロバクテリウム
リゾジェネスATCC43057(A4)アグロバク
テリウム リゾジェネスATCC13332アグロバク
テリウム リゾジェネスATCC13333アグロバク
テリウム リゾジェネスATCC25818などが挙げ
られる。これらの菌は、アカネを形質転換さ仕、毛状根
を発育されろRiプラスミドを保持しているものである
。
上記したアカネに、アグロバクテリウム、リゾジェネス
菌が接種される。この接種に当り、アカネは、その菫、
葉、根ならびにそれらのプロトプラストの何れを用いて
もよい。本発明で接種とは、換言すればアグロバクテリ
ウム、リゾジェネス菌の保持するR1プラスミドを上記
のアカネに導入することである。具体的には次の方法で
行うことができる。
菌が接種される。この接種に当り、アカネは、その菫、
葉、根ならびにそれらのプロトプラストの何れを用いて
もよい。本発明で接種とは、換言すればアグロバクテリ
ウム、リゾジェネス菌の保持するR1プラスミドを上記
のアカネに導入することである。具体的には次の方法で
行うことができる。
1、植物固体への直接接種法
2、葉切片や菫切片を用いた共存培養法(リーフ・ディ
スク法) (R,B、Horsch et al、、5cienc
e、227.1229(1985))3、植物体のプロ
トプラストを利用した共存培養法(Z、M、Wei e
t al、、Plant Ce1l Rep、、5.9
3−96(1986))4、植物体のプロトプラストと
アグロバクテリウムリゾジェネスのスフェロプラスト法 (R,)lain et al、、Plant Ce1
l Rep、、3.60(1984))5、アグロバク
テリウム・リゾジェネス菌のRiプラスミドをマイクロ
インジェクションなどの方法で直接細胞内に抽出する方
法。
スク法) (R,B、Horsch et al、、5cienc
e、227.1229(1985))3、植物体のプロ
トプラストを利用した共存培養法(Z、M、Wei e
t al、、Plant Ce1l Rep、、5.9
3−96(1986))4、植物体のプロトプラストと
アグロバクテリウムリゾジェネスのスフェロプラスト法 (R,)lain et al、、Plant Ce1
l Rep、、3.60(1984))5、アグロバク
テリウム・リゾジェネス菌のRiプラスミドをマイクロ
インジェクションなどの方法で直接細胞内に抽出する方
法。
Riプラスミドを上記1〜4の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス菌の除菌が必
要で、その方法としては下記の方法がある。
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス菌の除菌が必
要で、その方法としては下記の方法がある。
1、高温処理(40℃、数時間〜ta間)2、抗生物質
処理(例えば、カルベニシリン、グラフオラン) 3、毛状根先端の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方法
を単独あるいは組み合わせて処理して得られた毛状根の
培養方法としては以下の方法がある。
処理(例えば、カルベニシリン、グラフオラン) 3、毛状根先端の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方法
を単独あるいは組み合わせて処理して得られた毛状根の
培養方法としては以下の方法がある。
本発明では、従来、植物の組織培養に用いられている培
地を用いることかできる。例えば、ムラシゲ・スクーグ
培地(M S培地)、ガンボルダB5培地、ホワイト培
地、その他が挙げられる。培地には、無機成分及び炭素
源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類
及びアミノ酸類から選ばれる少なくとも1種類以上の成
分を添加し、必要に応じてその池の成分も添加した培地
を用いることができる。
地を用いることかできる。例えば、ムラシゲ・スクーグ
培地(M S培地)、ガンボルダB5培地、ホワイト培
地、その他が挙げられる。培地には、無機成分及び炭素
源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類
及びアミノ酸類から選ばれる少なくとも1種類以上の成
分を添加し、必要に応じてその池の成分も添加した培地
を用いることができる。
上記培地中の無機成分としては窒素、亜鉛、鉄、銅、モ
リブデン、ホウ素、リン、コバルト、カリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、塩素、ナトリ
ウム、ヨウ素、その他がある。
リブデン、ホウ素、リン、コバルト、カリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、塩素、ナトリ
ウム、ヨウ素、その他がある。
具体的には硝酸アンモニウム、リン酸2水素アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カルシウム、硝酸カルラム、硫酸亜鉛、硫酸
第1鉄、硫酸第2鉄、エチレンジアミン四酢酸鉄、硫酸
銅、モリブデン酸、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、
リン酸、リン酸1ナトリウム、リン酸lカリウム、リン
酸2ナトリウム、リン酸3ナトリウム、塩化コバルト、
塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫
酸ナトリウム、硫酸マンガン、ヨウ化カリウムなどが例
示される。
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カルシウム、硝酸カルラム、硫酸亜鉛、硫酸
第1鉄、硫酸第2鉄、エチレンジアミン四酢酸鉄、硫酸
銅、モリブデン酸、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、
リン酸、リン酸1ナトリウム、リン酸lカリウム、リン
酸2ナトリウム、リン酸3ナトリウム、塩化コバルト、
塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫
酸ナトリウム、硫酸マンガン、ヨウ化カリウムなどが例
示される。
また、炭素源にはショ糖及び他の炭水化物、その誘導体
、脂肪酸などの有機酸、エタノール等のIIアルコール
等が例示される。第1表に培地を例示する。
、脂肪酸などの有機酸、エタノール等のIIアルコール
等が例示される。第1表に培地を例示する。
第1表
N H、N O,1650a9/12
K N Off 1900K)(、P
o、 17GCaCIts 2HtO
440 M g S O4・7H,0370 MnSO4・4HtO22,3 H3B02
6.2Z n S O−・4
HtO8,6 K I Q、83N a tM
oOa ’ 2 F−1tOO,25Cu S O−・
58 to 0.025C,CI 、 −6
8,OO,025 N a t E D T A 37 、
3F e S O4・7 HtO27,8チアミン
1.0ミヨイノシトール
100蔗糖 30000 植物ホルモン類には、インドール酢酸([AA)、ナフ
タレン酢酸(NAA)、p−クロロフェノキシ酸、2.
4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)などのオー
キシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン、
ベンジルアデニンなどのサイトカイニン類が例示される
。
o、 17GCaCIts 2HtO
440 M g S O4・7H,0370 MnSO4・4HtO22,3 H3B02
6.2Z n S O−・4
HtO8,6 K I Q、83N a tM
oOa ’ 2 F−1tOO,25Cu S O−・
58 to 0.025C,CI 、 −6
8,OO,025 N a t E D T A 37 、
3F e S O4・7 HtO27,8チアミン
1.0ミヨイノシトール
100蔗糖 30000 植物ホルモン類には、インドール酢酸([AA)、ナフ
タレン酢酸(NAA)、p−クロロフェノキシ酸、2.
4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)などのオー
キシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン、
ベンジルアデニンなどのサイトカイニン類が例示される
。
ビタミン類には、ビオチン、チアミン(ビタミンBl)
、ピリドキシン(ビタミンB6)、パントテン酸、アス
コルビン酸(ビタミンC)、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。
、ピリドキシン(ビタミンB6)、パントテン酸、アス
コルビン酸(ビタミンC)、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。
液体培地中の成分の濃度は、広い範囲で変えることがで
きる。通常は無機成分を約0.1HM −LOOiM。
きる。通常は無機成分を約0.1HM −LOOiM。
炭素源を約1%〜10%、植物ホルモン類を約0、O1
μM−10HM1 ビタミン類およびアミノ酸類をそれ
ぞれ約0.1j19〜500i9/ L a度とするこ
とができる。
μM−10HM1 ビタミン類およびアミノ酸類をそれ
ぞれ約0.1j19〜500i9/ L a度とするこ
とができる。
毛状根の初期植え付は量は、広い範囲で変えることがで
きる。通常、固型培地では機端から約1〜3cm、また
液体培地では50112の培地に対して毛状根を約11
9〜約19(新!#重量)を植え付Cすることが望まし
い。
きる。通常、固型培地では機端から約1〜3cm、また
液体培地では50112の培地に対して毛状根を約11
9〜約19(新!#重量)を植え付Cすることが望まし
い。
毛状根の培養において、光は必須ではなく、通常、暗所
で培養できる。培養温度は約lO℃〜35℃、特に約2
3℃〜28℃が適している。
で培養できる。培養温度は約lO℃〜35℃、特に約2
3℃〜28℃が適している。
このようにして得られた毛状根からアカネ色素の抽出精
製を行う。すなわち毛状根を培養液から分離採取後、エ
タノール、メタノール、アセトン、クロロホルムなどの
有機溶媒あるいはこれらの混合液、または水酸化ナトリ
ウムあるいは硫酸を含有するアルカリ性あるいは酸性の
水溶液で抽出をくり返した後、この抽出液を減圧下加熱
濃縮する。
製を行う。すなわち毛状根を培養液から分離採取後、エ
タノール、メタノール、アセトン、クロロホルムなどの
有機溶媒あるいはこれらの混合液、または水酸化ナトリ
ウムあるいは硫酸を含有するアルカリ性あるいは酸性の
水溶液で抽出をくり返した後、この抽出液を減圧下加熱
濃縮する。
撹拌時間、抽出温度などの抽出条件は適宜選択すること
ができるが、通常1回の抽出に要する撹拌時間は、20
分ないし2時間程度である。この抽出液をろ紙あるいは
セライトなどのろ過助剤を用いて濾別後、メンブランフ
ィルタ−(0,2〜0.8ミクロン)を用いる精密ろ過
あるいは、吸着樹脂、イオン交換樹脂、ケイ酸などの無
機物質などの吸着剤を用いる公知の方法により精製する
ことにより、目的とするアカネ色素を得ることができる
。
ができるが、通常1回の抽出に要する撹拌時間は、20
分ないし2時間程度である。この抽出液をろ紙あるいは
セライトなどのろ過助剤を用いて濾別後、メンブランフ
ィルタ−(0,2〜0.8ミクロン)を用いる精密ろ過
あるいは、吸着樹脂、イオン交換樹脂、ケイ酸などの無
機物質などの吸着剤を用いる公知の方法により精製する
ことにより、目的とするアカネ色素を得ることができる
。
本発明によると、西洋アカネの毛状根から得られたアカ
ネ色素はアントラキノン系色素の配糖体の生産が親植物
から得られたアカネ色素に比較して非常に多いので、天
然のアカネから得られるものよりも水に可溶である色素
を大量に短時間に収得できる。
ネ色素はアントラキノン系色素の配糖体の生産が親植物
から得られたアカネ色素に比較して非常に多いので、天
然のアカネから得られるものよりも水に可溶である色素
を大量に短時間に収得できる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例1
西洋アカネ(Rubia tinctorum)の種子
を次亜鉛素酸ナトリウム溶液で殺菌した後、ムラシゲ・
スクーグ(以下MS)固型培地上に播種し、無菌植物体
を得た。この無菌植物体を上記と同じ組織の固型培地で
継代培養したのち、リンスマイヤー・スクー、グ培地(
LS培地)にシュクロース3%、NAA5xlO″7モ
ル、カイネチン1O−7モルを加え、pH4,2とした
1012の液体培地で2週間(14日間)振盪培養した
。振盪培養の条件は25℃、旋回回転数100回/分、
振幅数30xz、暗所で培養を行った。その結果、新鮮
重量で増殖率6 、22 @の毛状根が得られた。この
毛状根にl:l(v / v )の割合でメタノールを
加え、細胞を破砕後濾過し、残渣についてはさらに同量
のメタノ−ルで抽出した。抽出液をエバポレーターで濃
縮し、159のアカネ色素を得た。
を次亜鉛素酸ナトリウム溶液で殺菌した後、ムラシゲ・
スクーグ(以下MS)固型培地上に播種し、無菌植物体
を得た。この無菌植物体を上記と同じ組織の固型培地で
継代培養したのち、リンスマイヤー・スクー、グ培地(
LS培地)にシュクロース3%、NAA5xlO″7モ
ル、カイネチン1O−7モルを加え、pH4,2とした
1012の液体培地で2週間(14日間)振盪培養した
。振盪培養の条件は25℃、旋回回転数100回/分、
振幅数30xz、暗所で培養を行った。その結果、新鮮
重量で増殖率6 、22 @の毛状根が得られた。この
毛状根にl:l(v / v )の割合でメタノールを
加え、細胞を破砕後濾過し、残渣についてはさらに同量
のメタノ−ルで抽出した。抽出液をエバポレーターで濃
縮し、159のアカネ色素を得た。
実施例2
実施例1で得られた西洋アカネの無菌植物の菫に、Ri
プラスミドを保持するアグロバクテリウムリゾジェネス
(ATCC13332)菌を接種した。2〜5週間後に
接種部域に形成した毛状根を切取り、グラフオラン0.
59/Lを添加したMS固型培地上に移植し、1〜2週
間で同一組成の新しい培地に移植した。2〜3回この操
作を繰り返して、除菌された毛状根を得た。
プラスミドを保持するアグロバクテリウムリゾジェネス
(ATCC13332)菌を接種した。2〜5週間後に
接種部域に形成した毛状根を切取り、グラフオラン0.
59/Lを添加したMS固型培地上に移植し、1〜2週
間で同一組成の新しい培地に移植した。2〜3回この操
作を繰り返して、除菌された毛状根を得た。
100iQの三角フラスコにMS液体培W!!50xQ
を入れ、120℃・15分間滅菌した。この培地に上記
の毛状根を移植し、25℃、2週間(14日間)、振盪
培養(旋回回転数100回/分、振幅数30xx)t、
た。増殖した毛状根から実施例1と同様にして0.2g
のアカネ色素を得た。
を入れ、120℃・15分間滅菌した。この培地に上記
の毛状根を移植し、25℃、2週間(14日間)、振盪
培養(旋回回転数100回/分、振幅数30xx)t、
た。増殖した毛状根から実施例1と同様にして0.2g
のアカネ色素を得た。
実施例3
実施例!で得た西洋アカネの無菌植物の葉(511翼角
)と!!!(長さ3〜5xi)を調整し、MS液体培地
(20+++2培地/100m(7三角フラスコ)L:
))値する。Riプラスミドを保持するアグロバクテリ
ウム・リゾジェネス(ATCC15834)菌をYEB
液体培地で約20時間培養し、菌数を約106@/村に
なるようにして、先の組織片の入った三角フラスコに一
定量を加え、′25℃、暗所で2′E3間、旋回回転数
100回/分・振幅数30zmで振盪培養した。
)と!!!(長さ3〜5xi)を調整し、MS液体培地
(20+++2培地/100m(7三角フラスコ)L:
))値する。Riプラスミドを保持するアグロバクテリ
ウム・リゾジェネス(ATCC15834)菌をYEB
液体培地で約20時間培養し、菌数を約106@/村に
なるようにして、先の組織片の入った三角フラスコに一
定量を加え、′25℃、暗所で2′E3間、旋回回転数
100回/分・振幅数30zmで振盪培養した。
アグロバクテリウム・リゾジェネス菌と共存培養した組
織片はグラフオラン0.59/l、を含むM S固型培
地上に移植し、約2〜6週間培養した。形成した毛状根
は実施例2と同様に除菌操作を繰り返し、無菌の毛状根
を得た。
織片はグラフオラン0.59/l、を含むM S固型培
地上に移植し、約2〜6週間培養した。形成した毛状根
は実施例2と同様に除菌操作を繰り返し、無菌の毛状根
を得た。
以下、実施列2と同様にして振盪培養を行って得られた
毛状根をLS液体培地!O12を入れた1512容ジャ
ーファーメンタ−に移し、25℃、撹拌数50回転/分
、通気量IO量/分の条件で2週間通気撹拌培養を行っ
た後、増殖した毛状根を実施例!と同様に処理して2.
2gのアカネ色素を抽出した。
毛状根をLS液体培地!O12を入れた1512容ジャ
ーファーメンタ−に移し、25℃、撹拌数50回転/分
、通気量IO量/分の条件で2週間通気撹拌培養を行っ
た後、増殖した毛状根を実施例!と同様に処理して2.
2gのアカネ色素を抽出した。
実施例で得られたアカ・ネ色素についてHPLC分析(
条件、カラム: Nucleosil 5CK4.6X
200xi。
条件、カラム: Nucleosil 5CK4.6X
200xi。
西独のナーゲル社製)、溶媒A:メタノール70%、H
,020%、0.2Mリン酸酸液l形、溶媒B:メタノ
ール40%、H,050%、0.2Mリン酸酸液l形、
流速: L、0xQ1分濃度勾配条件B→A:30分)
を行ったところ、図1に示されるような結果となり、天
然アカネ抽出液のそれ(図2)と比較して配糖体が多い
ことが認められた。
,020%、0.2Mリン酸酸液l形、溶媒B:メタノ
ール40%、H,050%、0.2Mリン酸酸液l形、
流速: L、0xQ1分濃度勾配条件B→A:30分)
を行ったところ、図1に示されるような結果となり、天
然アカネ抽出液のそれ(図2)と比較して配糖体が多い
ことが認められた。
第1図と第2図は、この発明によって得られたアカネ色
素および天然アカネ抽出液について、それぞれの液体ク
ロマトグラムを示す。 ji1図 !12 図
素および天然アカネ抽出液について、それぞれの液体ク
ロマトグラムを示す。 ji1図 !12 図
Claims (1)
- 1、アカネにアグロバクテリウム・リゾジェネスを接種
し、次いで培養して毛状根を形成させ、この毛状根から
アカネ色素を抽出することからなるアカネ色素の収得方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63049013A JP2609271B2 (ja) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | アカネ色素の収得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63049013A JP2609271B2 (ja) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | アカネ色素の収得方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01222791A true JPH01222791A (ja) | 1989-09-06 |
JP2609271B2 JP2609271B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=12819257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63049013A Expired - Fee Related JP2609271B2 (ja) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | アカネ色素の収得方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2609271B2 (ja) |
-
1988
- 1988-03-02 JP JP63049013A patent/JP2609271B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2609271B2 (ja) | 1997-05-14 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |