JPH01222791A - アカネ色素の収得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は植物組織培養による赤色天然色素の製造方法に
関するものである。

（ロ）従来の技術 植物由来のアントラキノン系の色素の原料としてムラサ
キ、アカネ等があり、これらの植物を栽培あるいは、カ
ルス培養によって得られた原料から色素を抽出すること
が知られている。

（ハ）発明が解決しようとする課題 栽培植物から得たアカネ色素は水に難溶であるため使用
分野が限定されている。栽培する場合は、その期間が長
く高価であるので一般にはほとんど使用されていない。

また組織培養によって得ろ方法は栽培よりも生育期間が
早く、天候に左右されず大量の生産が可能であるがまだ
高価であり、染料、使用色素等へ利用する為には培養期
間を短くし、生産効率を上げる必要がある。

本発明は、これら天然物、カルス培養法の欠点を解決（
すなわち、配管体が多い水易溶性色素の生産、培養速度
向上によるコストダウン）したものである。

（ニ）課題を解決するための手段 本発明では植物にアグロバクテリウム・リゾジェネス（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）
を接種し、誘起してきた毛状根を培養する方法を採取し
た。

この方法は次の原理に基づくものである。すなわち、ア
グロバクテリウム・リゾジェネスを植物の菫・葉・根な
どに接電すると、感染部域から毛状根と呼ばれる不定根
が発生する。この根はアグロバクテリウム・リゾジェネ
スのＲｉプラスミドの遺伝子の一部が植物の遺伝子に組
み込まれることにより発生し、通常のｌｆｌ物の根に比
べて生育が非常に速く、または二次代謝産物の生産量が
同等以上であることが知られている。

本発明では原料とするアカネは、西洋アカネ（Ｒｕｂｉ
ａ　ｔｉｎｃｔｏｒｕｍ　Ｌ、）、日本アカネ（Ｒｕｂ
ｉａａｋａｎｅ　Ｎａｋａｉ）、アカミノアカネ（Ｒｕ
ｂｉａｃｏｒｄｉｒｏｒｉａ　Ｌ、）、オオアカネ（Ｒ
ｕｂｉａ　ｈｅｘａｐｈｙｌｌａＭａｋｉｎｏ）などの
アカネ科又はその他近縁植物が挙げられる。これらの中
で西洋アカネが好ましい１列である。

本植物に毛状根を作らせるために利用できるアグロバク
テリウム・リゾジェネス菌としてはアグロバクテリウム
　リゾジェネスＡＴＣＣ１５８３４アグロバクテリウム
　リゾジェネスＡＴＣＣ４３０５７（Ａ４）アグロバク
テリウム　リゾジェネスＡＴＣＣ１３３３２アグロバク
テリウム　リゾジェネスＡＴＣＣ１３３３３アグロバク
テリウム　リゾジェネスＡＴＣＣ２５８１８などが挙げ
られる。これらの菌は、アカネを形質転換さ仕、毛状根
を発育されろＲｉプラスミドを保持しているものである
。

上記したアカネに、アグロバクテリウム、リゾジェネス
菌が接種される。この接種に当り、アカネは、その菫、
葉、根ならびにそれらのプロトプラストの何れを用いて
もよい。本発明で接種とは、換言すればアグロバクテリ
ウム、リゾジェネス菌の保持するＲ１プラスミドを上記
のアカネに導入することである。具体的には次の方法で
行うことができる。

１、植物固体への直接接種法 ２、葉切片や菫切片を用いた共存培養法（リーフ・ディ
スク法） （Ｒ，Ｂ、Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃ
ｅ、２２７．１２２９（１９８５））３、植物体のプロ
トプラストを利用した共存培養法（Ｚ、Ｍ、Ｗｅｉ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、、５．９
３−９６（１９８６））４、植物体のプロトプラストと
アグロバクテリウムリゾジェネスのスフェロプラスト法 （Ｒ，）ｌａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｐ、、３．６０（１９８４））５、アグロバク
テリウム・リゾジェネス菌のＲｉプラスミドをマイクロ
インジェクションなどの方法で直接細胞内に抽出する方
法。

Ｒｉプラスミドを上記１〜４の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス菌の除菌が必
要で、その方法としては下記の方法がある。

１、高温処理（４０℃、数時間〜ｔａ間）２、抗生物質
処理（例えば、カルベニシリン、グラフオラン） ３、毛状根先端の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方法
を単独あるいは組み合わせて処理して得られた毛状根の
培養方法としては以下の方法がある。

本発明では、従来、植物の組織培養に用いられている培
地を用いることかできる。例えば、ムラシゲ・スクーグ
培地（Ｍ　Ｓ培地）、ガンボルダＢ５培地、ホワイト培
地、その他が挙げられる。培地には、無機成分及び炭素
源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類
及びアミノ酸類から選ばれる少なくとも１種類以上の成
分を添加し、必要に応じてその池の成分も添加した培地
を用いることができる。

上記培地中の無機成分としては窒素、亜鉛、鉄、銅、モ
リブデン、ホウ素、リン、コバルト、カリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、塩素、ナトリ
ウム、ヨウ素、その他がある。

具体的には硝酸アンモニウム、リン酸２水素アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カルシウム、硝酸カルラム、硫酸亜鉛、硫酸
第１鉄、硫酸第２鉄、エチレンジアミン四酢酸鉄、硫酸
銅、モリブデン酸、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、
リン酸、リン酸１ナトリウム、リン酸ｌカリウム、リン
酸２ナトリウム、リン酸３ナトリウム、塩化コバルト、
塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫
酸ナトリウム、硫酸マンガン、ヨウ化カリウムなどが例
示される。

また、炭素源にはショ糖及び他の炭水化物、その誘導体
、脂肪酸などの有機酸、エタノール等のＩＩアルコール
等が例示される。第１表に培地を例示する。

第１表 Ｎ　Ｈ、Ｎ　Ｏ，１６５０ａ９／１２ Ｋ　Ｎ　Ｏｆｆ　　　　　　　　　１９００Ｋ）（、Ｐ
ｏ、　　　　　　　　　１７ＧＣａＣＩｔｓ　２ＨｔＯ
４４０ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，０３７０ ＭｎＳＯ４・４ＨｔＯ２２，３ Ｈ３Ｂ０２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６．２Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ−・４
　ＨｔＯ８，６ Ｋ　Ｉ　　　　　　　　　　　　Ｑ、８３Ｎ　ａ　ｔＭ
ｏＯａ　’　２　Ｆ−１ｔＯＯ，２５Ｃｕ　Ｓ　Ｏ−・
５８　ｔｏ　　　　　　０．０２５Ｃ，ＣＩ　、　−６
８，ＯＯ，０２５ Ｎ　ａ　ｔ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　　３７　、
３Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４・７　ＨｔＯ２７，８チアミン　　
　　　　　　　　　　１．０ミヨイノシトール　　　　
　　　１００蔗糖　　　　　３００００ 植物ホルモン類には、インドール酢酸（［ＡＡ）、ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシ酸、２．
４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのオー
キシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン、
ベンジルアデニンなどのサイトカイニン類が例示される
。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢｌ）
、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。

液体培地中の成分の濃度は、広い範囲で変えることがで
きる。通常は無機成分を約０．１ＨＭ　−ＬＯＯｉＭ。

炭素源を約１％〜１０％、植物ホルモン類を約０、Ｏ１
μＭ−１０ＨＭ１　ビタミン類およびアミノ酸類をそれ
ぞれ約０．１ｊ１９〜５００ｉ９／　Ｌ　ａ度とするこ
とができる。

毛状根の初期植え付は量は、広い範囲で変えることがで
きる。通常、固型培地では機端から約１〜３ｃｍ、また
液体培地では５０１１２の培地に対して毛状根を約１１
９〜約１９（新！＃重量）を植え付Ｃすることが望まし
い。

毛状根の培養において、光は必須ではなく、通常、暗所
で培養できる。培養温度は約ｌＯ℃〜３５℃、特に約２
３℃〜２８℃が適している。

このようにして得られた毛状根からアカネ色素の抽出精
製を行う。すなわち毛状根を培養液から分離採取後、エ
タノール、メタノール、アセトン、クロロホルムなどの
有機溶媒あるいはこれらの混合液、または水酸化ナトリ
ウムあるいは硫酸を含有するアルカリ性あるいは酸性の
水溶液で抽出をくり返した後、この抽出液を減圧下加熱
濃縮する。

撹拌時間、抽出温度などの抽出条件は適宜選択すること
ができるが、通常１回の抽出に要する撹拌時間は、２０
分ないし２時間程度である。この抽出液をろ紙あるいは
セライトなどのろ過助剤を用いて濾別後、メンブランフ
ィルタ−（０，２〜０．８ミクロン）を用いる精密ろ過
あるいは、吸着樹脂、イオン交換樹脂、ケイ酸などの無
機物質などの吸着剤を用いる公知の方法により精製する
ことにより、目的とするアカネ色素を得ることができる
。

本発明によると、西洋アカネの毛状根から得られたアカ
ネ色素はアントラキノン系色素の配糖体の生産が親植物
から得られたアカネ色素に比較して非常に多いので、天
然のアカネから得られるものよりも水に可溶である色素
を大量に短時間に収得できる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ 西洋アカネ（Ｒｕｂｉａ　ｔｉｎｃｔｏｒｕｍ）の種子
を次亜鉛素酸ナトリウム溶液で殺菌した後、ムラシゲ・
スクーグ（以下ＭＳ）固型培地上に播種し、無菌植物体
を得た。この無菌植物体を上記と同じ組織の固型培地で
継代培養したのち、リンスマイヤー・スクー、グ培地（
ＬＳ培地）にシュクロース３％、ＮＡＡ５ｘｌＯ″７モ
ル、カイネチン１Ｏ−７モルを加え、ｐＨ４，２とした
１０１２の液体培地で２週間（１４日間）振盪培養した
。振盪培養の条件は２５℃、旋回回転数１００回／分、
振幅数３０ｘｚ、暗所で培養を行った。その結果、新鮮
重量で増殖率６　、２２　＠の毛状根が得られた。この
毛状根にｌ：ｌ（ｖ　／　ｖ　）の割合でメタノールを
加え、細胞を破砕後濾過し、残渣についてはさらに同量
のメタノ−ルで抽出した。抽出液をエバポレーターで濃
縮し、１５９のアカネ色素を得た。

実施例２ 実施例１で得られた西洋アカネの無菌植物の菫に、Ｒｉ
プラスミドを保持するアグロバクテリウムリゾジェネス
（ＡＴＣＣ１３３３２）菌を接種した。２〜５週間後に
接種部域に形成した毛状根を切取り、グラフオラン０．
５９／Ｌを添加したＭＳ固型培地上に移植し、１〜２週
間で同一組成の新しい培地に移植した。２〜３回この操
作を繰り返して、除菌された毛状根を得た。

１００ｉＱの三角フラスコにＭＳ液体培Ｗ！！５０ｘＱ
を入れ、１２０℃・１５分間滅菌した。この培地に上記
の毛状根を移植し、２５℃、２週間（１４日間）、振盪
培養（旋回回転数１００回／分、振幅数３０ｘｘ）ｔ、
た。増殖した毛状根から実施例１と同様にして０．２ｇ
のアカネ色素を得た。

実施例３ 実施例！で得た西洋アカネの無菌植物の葉（５１１翼角
）と！！！（長さ３〜５ｘｉ）を調整し、ＭＳ液体培地
（２０＋＋＋２培地／１００ｍ（７三角フラスコ）Ｌ：
））値する。Ｒｉプラスミドを保持するアグロバクテリ
ウム・リゾジェネス（ＡＴＣＣ１５８３４）菌をＹＥＢ
液体培地で約２０時間培養し、菌数を約１０６＠／村に
なるようにして、先の組織片の入った三角フラスコに一
定量を加え、′２５℃、暗所で２′Ｅ３間、旋回回転数
１００回／分・振幅数３０ｚｍで振盪培養した。

アグロバクテリウム・リゾジェネス菌と共存培養した組
織片はグラフオラン０．５９／ｌ、を含むＭ　Ｓ固型培
地上に移植し、約２〜６週間培養した。形成した毛状根
は実施例２と同様に除菌操作を繰り返し、無菌の毛状根
を得た。

以下、実施列２と同様にして振盪培養を行って得られた
毛状根をＬＳ液体培地！Ｏ１２を入れた１５１２容ジャ
ーファーメンタ−に移し、２５℃、撹拌数５０回転／分
、通気量ＩＯ量／分の条件で２週間通気撹拌培養を行っ
た後、増殖した毛状根を実施例！と同様に処理して２．
２ｇのアカネ色素を抽出した。

実施例で得られたアカ・ネ色素についてＨＰＬＣ分析（
条件、カラム：　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　５ＣＫ４．６Ｘ
２００ｘｉ。

西独のナーゲル社製）、溶媒Ａ：メタノール７０％、Ｈ
，０２０％、０．２Ｍリン酸酸液ｌ形、溶媒Ｂ：メタノ
ール４０％、Ｈ，０５０％、０．２Ｍリン酸酸液ｌ形、
流速：　Ｌ、０ｘＱ１分濃度勾配条件Ｂ→Ａ：３０分）
を行ったところ、図１に示されるような結果となり、天
然アカネ抽出液のそれ（図２）と比較して配糖体が多い
ことが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図と第２図は、この発明によって得られたアカネ色
素および天然アカネ抽出液について、それぞれの液体ク
ロマトグラムを示す。 ｊｉ１図 ！１２　図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、アカネにアグロバクテリウム・リゾジェネスを接種
   し、次いで培養して毛状根を形成させ、この毛状根から
   アカネ色素を抽出することからなるアカネ色素の収得方
   法。