JPH01117795A - 有機酸化物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はメタン資化性菌を用いる有機酸化物の製造法に
関し、詳しくはメタンという安価に入手できる化合物を
エネルギー源として用い、目的とする有機酸化物′を効
率よく製造する方法に関する。

［従来の技術１発明が解決しようとする問題点コナーゼ
）を有し、メタンまたはメタノールを単一炭素源として
生育する。該メタン酸化酵素はメタ、ンのみならず炭素
数２以上のアルカン、アルケン、４賦化合物をも酸化す
ることができる。この共酸化能を利用することによって
種々の酸化物を製造する方法も提案されている。

ところで、メタン資化性菌を用いて酸化物を製造する場
合、エネルギーを供給する必要があり、エネルギー源と
してメタノール５ホルムアルデヒド、ギ酸、エタノール
、　ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨが使用できることが知られて
いる（特公昭５８−３１１９８号）。

しかし、これらエネルギー源のうちメタノール、ホルム
アルデヒドは多量に供給すると反応阻害を起こすため、
使用上に問題があり、またエタノール、ＮＡＤＨなどは
高価であるため、実用性に欠ける等の問題があった。

［問題点を解決するための手段］ そこで本発明者らは、安価に入手できる物質の中からメ
タン資化性菌のエネルギー源として利用しうるものを検
索すべく検討を重ねた。その過程で、従来はメタンモノ
オキシゲナーゼがメタンを酸化しやすいことから、メタ
ンを用いると共酸化基質は酸化されず、目的とする酸化
物が製造されないと考えられていたが、意外にもメタン
をエネルギー源として利用することによって他のエネル
ギー源を用いた場合と同様に酸化物を製造できることを
見出した。本発明はかかる知見に基いて完成されたもの
である。

すなわち本発明は、メチロコッカス属、メチロモナス属
、メチロシスチス属、メチロバクター属およびメチロバ
クテリウム属の中のいずれかに属するメタン資化性菌を
、アルカン、アルケンもしくは環状化合物と酸素の存在
下に接触させて有機酸化物を製造するにあたり、エネル
ギー源としてメタンを用いることを特徴とする有機酸化
物の製造法を提供するものである。

本発明において原料として用いるアルカンとしてはメタ
ン、エタン、プロパｙｒ〜サン、オクタンなどがあり、
アルケンとしてはエチレン、プロピレン、ブテン類など
がある。また、環状化合物としてはシクロヘキサンなど
の脂環式化合物；ベンゼン、トルエンなどの芳香族化合
物が挙げられる。

これら原料から誘導される酸化物は、アルカンからアル
コール；アルケンからエポキサイド；環状化合物から環
状アルコールである。

本発明に使用できるメタン資化性菌としては、例えばメ
チロコッカス・カプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏ−ｃｏｃ
ｃｕｓ　ｃａ　５ｕｌａｔｕｓ）　ＭＣｌ８１１１３２
　などのメチロコッカス属細菌、メチロモナス・アジレ
（■■ム旦匹旦！ｉＬＬり　ＮＧＩＢ　１１１２４など
のメチロそナス属細菌、メチロバクター・カプスラツス
（■旦ｆＪ１■と：）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１１２０１など
のメチロバクター属細菌、メチロシスチス・バルパム（
Ｍｅｔｈ　ｌｏｃ　５ｔｉｓ　■二Ｊ凹）　ＮＣＩＢ　
１１１２９などのＡＴＣｏ　２７８８８などのメチロバ
クテリウム属細菌などを挙げることができる。

上記メタン資化性菌を培養するために用いる培地として
は該細菌が十分に増殖しつるものであればよく、通常は
炭素源としてメタン、メタノールなどを用いる。また、
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸カリウム、硝酸
アンモニウムなど常用のものを使用すればよい。その他
にリン酸、カルシウム塩、マグネシウム塩および微量の
無機塩（第２銅塩、第１鉄塩、コバルト塩など）等を適
宜加える。好適な培地としてホイッテンベリー等の培地
（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　６１．２
０５〜２０８頁。

１９７０年）がある。培地を入れた培養容器の空間はメ
タンと酸素含有ガス（空気など）との混合ガスにて置換
し、該ガスと接触している培地にメタン資化性菌を接種
する。

本発明に用いるメタン資化性菌は好気性細菌であり、そ
の培養は２０〜５０℃にて好気的条件下に回分培養もし
くは連続培養を行なえばよい。

培養物はそのまま前記原料の酸化反応に使用することが
できるが、遠心分離等の操作により固液分離して得た微
生物菌体を用いることが好ましい。さらに、リン酸Ｍｉ
樹液等の適当な溶液で洗浄し、該溶液に懸濁した微生物
菌体は一層好適である。そのほか、微生物菌体破砕物、
同抽出物等のメタン酸化酵素を含むものを使用したり、
微生物菌体を常法により固定化したもの等を使用するこ
ともできる。ここで、破砕処理は常法により行なえばよ
く、たとえば微生物菌体を超音波、フレンチプレスなど
により破砕する方法がある。また、抽出処理は前記破砕
処理をしたのち遠心分離を行ない可溶性抽出物を得る方
法などを採用することができる。

メタン資化性菌を酸素の存在下に上記原料と接触させる
にあたり、エネルギー源としてメタンを反応系に加える
。メタンの使用量は特に制限はないが、通常は上記原料
とメタンの合計量の１０〜９０容量％、好ましくは３０
〜ｂ る。なお、このエネルギー源と共に他のエネルギー源、
たとえばメタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、
ギ酸、水素、　ＮＡＤＨなどを組合せて用いることもで
きる。

上記原料から酸化物を製造するための反応条件は使用す
る微生物の種類、形態等を考慮して決定すればよいが、
一般的には温度１５〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃
、ｐ）ｌ　５．５〜９．０、好ましくは６〜８．５であ
り、目的とする酸化物が十分に生成、蓄積されるまで行
なう０本発明によれば、使用した原料に相応してアルコ
ール、エポキサイド、環状アルコールが得られる。

［実施例コ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

なお、実施例等に用いるメタン資化性菌は以下の方法に
より培養した。

第１表に示す培地８１を１０１容のシアーファーメンタ
−に仕込み、１２０℃で２０分間殺菌した後、冷却した
。！ここに、第２表に示す培地８５ｍ１を１２０℃で２
０分間殺菌したものを加えた。

箋−」−一去 硫酸マグネシウム・７水塩　　１．０ｇ硫酸カリウム　
　　　　　　　　１．０ｇ塩化カルシウム　　　　　　
　５０　　ｍｇＮａＭｏＯ４，１ｍｇ ＦｅＳＯ４”７ＪＯ５００ｕｇ ＺｎＳ０４”７Ｈｉ０　　　　　　　　　４００　　ｕ
ｇＨ，ＢＯ４１５μｇ ｃｏｃＩ１２・６ＨｚＯ５０ｕｇ ＭｎＣ１！ｚ’４Ｈｚ０　　　　　　　　　２０　　μ
ｇＮｉＣｊ！ｚ・６Ｈ２０１０μｇ ＣｕＳＯ４”５１（２０２００ｇｇ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　２５Ｇ　　μｇ蒸
留水　　　　　　　　　　　ＩＬ に）１２ＰＯ４，１５，６ｇ Ｆｅ−ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　２４ＯＢ蒸留水
　　　　　　　　　　　１１ （ｐＨａ、ａ） 次に、第１表に示す培地５０ｍ１＋を５００ｍＲ容のマ
イ　　ｒヤーフラスコに入れたものを８木用意し、１２
０℃　　（で２０分間殺菌した後、第２表に示す培地を
１２０℃　　：で２０分間殺菌したものを０．５ｍＪ！
加え、ここにメタ　　６ン責化性菌を１白金耳接種した
。ここにメタン　　１５０ｍ１！を加えた後、ゴム栓で
密栓し、４５℃で３日間　　１振どう培養した。培養終
了後のフラスコ培養液　　］８８本を種菌とし、これを
前記ジャーファーメンタ−に無菌的に仕込み、メタン−
空気混合ガス　　□（メタン：空気−１＝４）を毎分４
ＪＺの割合で　　□供給し、３日間培養した。菌濃度が
１．５ｍｇ／ｍＮに　　ノ達した後、第１表および第２
表に示した培地を　　”１００　：　１．５の割合で混
合した培地にざらにＣｕＳＯ４・　　（５Ｈ２０を１　
ｍｇ／ｉｔの割合で加えた培地を無菌フィル　　ｊター
で除菌しながら１．６１１時間の割合で供給して　　゛
連続的に培養した。　　　　　　　　　　　　　　　ｌ
実施例１ 前記メタン資化性菌の培養方法によ）て連続環　　１養
したメチロコッカス・カプスラツスＮＣＩＢ　１１１３
２　　　；の培養液を第３表に示した組成の培地を用い
て有濃度が０．１７ｍｇ／ｍｊとなるように希釈した。

二〇希釈液３００ｍＩｌを１１容のジャーファーメンタ
−ご仕込み、４５℃に昇温した。次いで、空気をｉｏ　
ｍｊ／分、メタンを１２０ｍＪ！／分の割合で供給し、
さらにプロピレンを１２０ｍ１／分の割合で供給してプ
ロピレンオキサイドを９０分間にわたり生産せしめさ。

ガス中のプロピレンオキサイドは、該ガスを２モルの硝
酸溶液に導き、プロピレングリコールヒしてガスクロマ
トグラフィーにて定量した。まさ、反応液中に蓄積した
プロピレンオキサイドはがスクロマトグラフィーにて直
接定量し、９０分間り反応で生成したプロピレンオキサ
イド量を求めす、その結果、９０分間に２７５μｍＯＲ
のプロピレンオキサイドが生成した。

：ヒ較例１ 実施例１において、メタンを供給しなかったこヒ以外は
実施例１と同様の操作を行なったとこう、２１ｔＬＩＤ
Ｏｊ！のプロピレンオキサイドが生成した。

呈−じＬ−去 硫酸マグネシウム・７水塩　　１．０ｇ硝酸カリウム　
　　　　　　　　１．０ｇ塩イｂカルシウム　　　　　
　　ｔｏｏ　　ｍｇＮａＭｏＯ４１Ｂ ＦｅＳＯａ４Ｈ２０５００Ｂｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈｚ０　　　　　　　　　４００　８ｇ
Ｈ３ＢＯ４１５ユ。

ＣｏＣ１１ｚ・６Ｈｚ０　　　　　　　　　５０　　ｔ
ＬｇＭｎＣ１’２・４Ｈ２０２０ｔＬｇ ＮｉＣｌｌ、・６８２０　　　　　　　　　１０　　μ
ｇＣｕＳＯａ”５Ｈ２０１５ＱＱ　　ｇｇＥＤＴＡ　　
　　　　　　　　　　　２５０　　μｇＮａ舎ｏａ・ｘ
２Ｈｚｏ　　　　　　　６４５　ｍｇＫＨｚＰＯ４２３
４ｍｇ Ｆｅ−ｔＤＴＡ　　　　　　　　　　　　３．８１１ｇ
蒸留水　　　　　　　　　　　１ｆｔ （ｐＨａ、ａ） 実施例２ 実施例１において、空気を６０　ｍ１７分、メタンを１
２０Ｉｆｌｊ／分およびプロピレンを４０　ｍｐ１分の
割合で供給したこと以外は、同様の操作を行なった。そ
の結果、２１６μｍｏｊのプロピレンオキサイドが生成
した。

比較例２ 実施例２においてメタンを供給しなかったこと以外は、
同様の操作を行なったところ、２ｏμｍｏｔ！のプロピ
レンオキサイドが生成した。

実施例３ 前記メタン資化性菌の培養方法によって連続培養したメ
チロコッカス・カプスラツスＭＣＩＢ　１１１３２の培
養液を遠心分離して菌体を集め、＋１）１　Ｂ、ａのパ
イプスパッツ１−に菌濃度が０．５ｍｇ／ｌｊｌとなる
ように懸濁した。

このＦＪ濁ｔ？Ｅ１ｍＩＩ！をＴｍｊ容のマイヤーフラ
スコに入れ、ゴム栓をした後、第４表に示す割合で混合
したプロピレン−メタン混合ガスを２ｍｊ加え、４５℃
で３分間、３００回転回転受振どう攪拌した。

その後、ただちにガスクロマトグラフィーにて生成した
プロピレンオキサイド量を定量した。この結果を第４表
に示す。

比較例３ 実施例３において、プロピレン−メタン混合ガスの代り
にプロピレンのみ２１１ｊを加えて同様の操作を行なっ
たところ、プロピレンオキサイド３２ｎｍｏｊ　　が生
成した。

実施例４ ホイッテンベリー等の方法（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、。

６１、２０５〜２０８．１９７０年）により調製した培
地５０ｍ！を５００ｍｊ容マイヤーフラスコに入れたも
のを３本用意し、１２０℃で１５分間加圧滅菌した。冷
却後、気相部をメタン：空気！１：４の混合ガスで置換
し、これにメチロモナス・アジレＮＣｌＢ１１１２４、
　　メチロシスチス・バルバムＮＧＩＢ　１１１２９お
よびメチロバクテリウム・オルガノフイラムＡＴＩＩ：
Ｃ２７８８Ｂの細菌を各々１白金耳接種し、３０℃で３
２時時間上う培養した。

上記方法で得られた３種類の菌を種菌とし、同様の培地
にそれぞれ５ＩＩｌｊ接種し、３０℃で１６時時間上う
培養した。培養終了後、菌体を遠心分離して集め、菌濃
度が０．５Ｂ／＋ｊとなるように５ｍＭパイプスバッフ
ァー（ｐＨ６，１１）に懸濁した。この懸濁液１　ｍｌ
を７ｍｊのマイヤーフラスコに入れ、ゴム栓をした後、
第５表に示す割合で混合したプロピレン−メタン混合ガ
ス２１１１１を加え、３０℃で３分間、３００回転回転
受振どう培養した。その後、ただちにガスクロマトグラ
フィーにて生成したプロピレンオキサイド量を定量した
。この結果を第６表に示す。

第　　６　　表 比較例４ 実施例３において、プロピレン−メタン混合ガスの代り
トプロピレンのみ２ｍＡ加えたこと以外は、同様の操作
を行なったところ、プロピレンオキサイドの生成量はメ
チロモナス・アジロＮＣＩＢ　１１１２４を用いたもの
では１００ｍＯＪ、メチロシスチス・バルバムＮＣＩＢ
　１１１２９を用いたものでは８　ｎｍｏｊ！、メチロ
バクテリウム・オルガノフイラムＡＴＣＣ２７８８６を
用いたものではｔｏｎｍｏｉ＋であった。

実施例５ 実施例３において、プロピレン−メタン混合ガスの代り
に第７表に示す割合で混合した１−ブテン−メタン混合
ガスを用いたこと以外は、同様の操作を行なったところ
、１．２−ブチレンオキサイドが生成した。この結果を
第７表に示す。

比較例５ 実施例５において、１−ブテン−メタン混合ガスの代り
に１−ブテンのみ２ｍ１を加えて同様の操作を行なった
ところ、１９ｎｍｏｊの１．２−ブチレンオキサイドが
生成した。

実施例６ 第９表に示す培地と第２表に示した培地を１００み、メ
チロバクター・カプスラツスＮＲＲＬ　Ｂ−１１２０１
を１白金耳接種し、メタン１００ｍＲを加えた後、ブチ
ルゴム栓で密栓した。次いで、３０℃で３日間振どう培
養したものを種菌とし、上記２．５１容のマイヤーフラ
スコに仕込んだ。さらに、メタン５００ｍｊを加え、シ
リコンゴム栓で密栓した後、３０℃で２４時時間上う培
養した。

その後、菌体を遠心分離により集め、ＣｕＳＯ４・５Ｍ
、ＯＯ，５Ｂ／ｊ！を含む４ｍＭリン酸バッファー（ｐ
Ｈｅ、ａ）に菌濃度が０．５ｍｇ／ｍｉ＋となるように
懸濁した。

この懸濁液１ｍＢを７ｍｊ！のマイヤーフラスコに入れ
、ゴム栓をした後、第８表に示す割合で混合したプロピ
レン−メタン混合ガスを２ｍＲ加え、４５℃で３分間、
３００回転／分で振どう攪拌した。その後、ただちにガ
スクロマトグラフィーにて生成したプロピレンオキサイ
ド量を定量した。この結果を第８表に示す。

五−」Ｌ−嚢 第　　９　　表 硫酸マグネシウム・７水塩　　１．０ｇ硫酸カリウム　
　　　　　　　　１．０ｇ塩酸カルシウム　　　　　　
　５０　　ｍｇＮａＭｏ０４１　　ｍｇ ＦｅＳＯ４４Ｈｚ０　　　　　　　　５００　　ａｇＺ
ｎＳＯ４’７Ｈａ０　　　　　　　　４００　　ＢｇＨ
ｓＢ０４１５　　μｇ ＣＯＣ１’ｚ・８ｔｈ０　　　　　　　　　５０　　μ
ｇＭｎＣｊ、・４Ｈ２０２０Ｂ ＮｉＣｊ、・６）１２０　　　　　　　　　１０　　μ
ｇＣｕＳＯ４”５８２０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５００　　　ＢｇＥＤＴＡ　　　　　　　　
　　　　２５０　　μｇ蒸留水　　　　　　　　　　　
ＩＪＺ 比較例６ 実施例６において、プロピレン−メタン混合ガスの代り
にプロピレンのみ２ｍｆｌを加えて実施例６と同様の操
作を行なったところ、プロピレンオキサイド１８ｎｌｌ
ｌＯＲが生成した。

［発明の効果］ 本発明によれば、安価に入手できるエネルギー源を用い
て効率よく有機酸化物を製造することができる。

従って、本発明は化学工業や発酵工業の分野に有用なも
のである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）メチロコッカス属，メチロモナス属、メチロシス
   チス属，メチロバクター属およびメチロバクテリウム属
   の中のいずれかに属するメタン資化性菌を、アルカン、
   アルケンもしくは環状化合物と酸素の存在下に接触させ
   て有機酸化物を製造するにあたり、エネルギー源として
   メタンを用いることを特徴とする有機酸化物の製造法。