JP2000166553A - アルカン資化菌の固定化方法 - Google Patents

アルカン資化菌の固定化方法

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JP2000166553A
JP2000166553A JP34917598A JP34917598A JP2000166553A JP 2000166553 A JP2000166553 A JP 2000166553A JP 34917598 A JP34917598 A JP 34917598A JP 34917598 A JP34917598 A JP 34917598A JP 2000166553 A JP2000166553 A JP 2000166553A
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alkane
methane
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Toyohiro Maeda
豊広 前田
Hiroaki Morita
宏明 森田
Ichiro Okura
一郎 大倉
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Osaka Gas Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】アルカノール特にメタノールを穏和な条件で効
率的に生産する。 【解決手段】アルカン資化菌を高比表面積基体に吸着さ
せるアルカン資化菌の固定化方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、アルカン資化菌特
にメタン資化菌の固定化方法に関するものであり、種々
の化学品の合成中間体として有用なアルカノール特にメ
タノールを生体機能を利用したアルカンの酸化反応によ
り選択的に製造方法に関する。
【0002】
【従来技術及びその課題】メタノールは一般的にメタン
を原料とした合成ガス(一酸化炭素)から製造される
が、これらの製法は一般に高温、高圧下で行われるた
め、より緩和な条件下でのメタノール合成が検討されて
いる。Science Vol.280, 24 April (1998) 560-563で
は比較的熱安定性の良い金属錯体系触媒によるメタンか
らメタノールの直接合成が報告されている。このような
最新の研究成果においてもメタンの酸化によるメタノー
ル転化反応は百数十度の温度を必要としするが、ある種
の金属酵素はこれを常温、常圧で進めることができる。
J.Biol.Chem.,264(17) 10023-10033, 1989 には、メタ
ン資化菌内に保有されるメタンモノオキシゲナーゼ(MM
O)を用いたメタンからメタノールの直接合成法につい
て、詳しい記載がある。菌体内に存在するMMOには可溶
型と膜結合型のコンポーネント型酵素が存在することが
知られている。前者は二核の鉄原子を活性サイトとして
持つ金属酵素で、後者は銅原子が酵素活性に大きく関与
している。これを触媒としたメタン/メタノール転化反
応は、バイオミメティックスの面からも注目されてい
る。J. Am. Chem. Soc., 119, 12311-12321, 1997には
形式価数4価の鉄原子によるMMOの高活性転化反応メカニ
ズムが示されている。
【0003】USP5,190,870には、こうした生体機能を利
用したアルカノールの製造方法が開示されている。生体
機能を利用したアルカノールの製法として微生物学的方
法(発酵法)、酵素学的方法が提案されている。 酵素
法は、例えばMethylococus capusulatus BathやMethylo
sinus tricosporium OB3b等のメタン資化細菌よりメタ
ンモノオキシゲナーゼ(MMO)を分離し、それを触媒と
してメタノールを合成する方法であり、MMOを酵素触媒
とした触媒サイクルによるメタノールの製法が提案され
ている。MMOは完全に単離する方法が複雑であり、ま
た、単離後の活性低下が大きく、不安定である。USP5,1
92,672にはMMOを安定化させるための単離方法、取り扱
い方法が記載されているが、未だ十分とは言えない。こ
れに対しメタン資化菌内に保有されるMMOは、単離され
たMMOに比べ遥かに安定であるため、菌体をそのまま用
いれば、MMOの長時間に渡る活性を利用することが可能
である。しかし、菌体内に存在するメタンデヒドロゲナ
ーゼ(MDH)の作用により、メタンより生成されたメタ
ノールは、さらに酸化を受け蟻酸になり、二酸化炭素に
まで酸化される。特開平3−43090にはメタン資化
菌体を用いたn−アルカンからn−アルカノールの合成
法において、MDHの作用のみを選択的に阻害する方法が
開示されている。しかし、このようなMDHの休眠化処理
を受けたメタン資化菌のメタン・メタノール転化触媒機
能は充分解明されておらず、製造法として未だ確立され
ていない。さらにこれらを利用した、経済性を配慮した
バイオリアクターに関する具体的知見はほとんどない。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討を
進めた結果、メタン資化細菌が高比表面積基体表面に自
発的に吸着する性質を見出し本発明に至った。即ち本発
明によればメタン資化細菌を高比表面積基体例えば炭素
体に高密度に固定化することが可能で、これを用いてア
ルカン・アルカノール転化リアクターへの菌体あるいは
酵素の充填が容易に且つ安定に行われる。
【0005】本発明は、以下の項1〜項11に関する。 項1. アルカン資化菌を高比表面積基体に固定化させ
るアルカン資化菌の固定化方法。 項2. アルカン資化菌がメタン資化菌である項1に記
載の固定化方法。 項3. 高比表面積基体が導電性を有する項1に記載の
固定化方法。 項4. 高比表面積基体が炭素体である項1に記載の固
定化方法。 項5. アルカン資化菌が好熱菌である項1に記載の固
定化方法。 項6. 固定化を非結合性固定化方法により行う項1に
記載の固定化方法。 項7. 非結合性固定化方法が、ゲル固定化法、ミセル
固定化法、電解重合法、高比表面積基体への吸着固定法
からなる群から選ばれる項1記載の固定化方法。 項8. 高比表面積基体が酸素透過性膜であることを特
徴とする項1記載の固定化方法。 項9. 高比表面積基体にアルカン資化菌の生菌体を吸
着させた後、菌体を破砕することを特徴とする固定化菌
体の処理方法。 項10. 項1〜8のいずれかに記載の方法により得る
ことができるアルカン資化菌固定化体または項9に記載
の方法により得ることができるアルカン資化菌破砕物の
固定化体にメタンを供給する工程およびメタノールを回
収する工程を含むメタノールの製造方法。 項11. メタンモノオキシゲナーゼ(MMO)および
メタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)を含むメタン資
化菌を基体に固定化する工程およびMDHを休眠化する
工程を含むメタン資化菌の固定化方法。
【0006】
【発明の実施の形態】本発明において、アルカン資化菌
としては、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタ
ン、ヘキサンなどの炭素数1〜6のアルカン、特にメタ
ンを炭素源として利用することができる菌を広く利用で
きる。好ましいアルカン資化菌としては、メタン資化
菌、ブタン資化菌などが挙げられ、特にメタン資化菌が
挙げられる。本発明のアルカン資化菌は、アルカンをア
ルカノールに酸化できる酵素、特にメタンモノオキシゲ
ナーゼ(MMO)を有する菌が好ましい。MMOは、メタ
ンをエネルギー源として利用できるメタン資化菌、一般
にメチロトロフス(Methylotorophs)と呼ばれる菌体に
広く存在することが知られているが、具体的なメタン資
化菌としてはメチロモナス・メタニカ(Methylomonas
methanica)、メチロコッカス・カプスラタス(Methylo
coccus Capsulatus(Buth) 通称バス菌)、メチロシヌ
ス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium
OB3b)、メチロシヌス・エス・ピー・CRL31(Methylo
sinus sp. CRL31)などが挙げられる。好熱性菌であ
るメチロコッカス・カプスラタスがアルカン資化菌とし
て特に好ましい。
【0007】メタン資化菌などのアルカン資化菌を培養
するための培地としては炭素源、窒素源、無機物及び必
要に応じてその他の栄養源を含むものであれば合成培
地、天然培地のいずれも使用可能である。しかし培地内
の金属イオンの組成によって可溶型、膜型の生成は大き
く異なり、銅イオンの多く存在する培地内では膜型の生
成が促進される。膜型の活性は可溶型に比べ高いが、可
溶型の倍化時間は膜型より短い。
【0008】メタン資化菌などのアルカン資化菌の培養
はアルカン、特にメタンの存在下振盪培養、あるいは通
気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は菌の種
類によって好適条件は異なるが、一般に20℃から40℃
の範囲が適している。しかし、Bath等の好熱菌では好適
温度が40℃を超えることもある。また、pH域は中性付
近が好ましいが、MDHを休眠化させた場合にはエネルギ
ー源として蟻酸を補給することが有効であった。したが
って溶液のpHは酸性側になることもある。蟻酸の添加
で酵素の再活性化のターンオーバーは10万回以上と推
定される。
【0009】MDHの休眠化は、シクロプロパノールを
系内に存在させることにより、行うことができる。ここ
で「休眠化」とは、例えばメタンからメタノールへの酸
化の場合、メタノールからホルムアルデヒドを経てギ酸
に酸化する経路を抑制するが、メタンからメタノールへ
の酸化は抑制されないことを意味する。
【0010】本発明者らは種々のフィラー材料、例え
ば、シリカ粉末、タルク、酸化チタン、酸化鉄等の金属
酸化物、活性炭、炭素繊維等について菌体との相互作用
を調べた結果、アルカン資化菌特にメタン資化菌は、炭
素体に対して特異的な吸着が行なわれることがわかっ
た。即ち生菌体は溶液中に分散された炭素体に選択的に
吸着され、短時間の内に炭素体を凝集させ、沈降せしめ
る。900m2・g(BET)程度の比表面積の活性炭では炭素
体と同重量以上の菌体を固定することができる。この場
合凝集し沈降するのに要する時間は1分以内である。
【0011】菌体の活性はこれにより低下することはな
く、むしろ活性が向上することもある。
【0012】本発明における菌体固定のための炭素体と
しては、活性炭、活性炭素繊維、天然グラファイト、人
造グラファイト等、いずれも使用することが可能で、中
でも高比表面積を有する活性炭が好ましく、木炭、石炭
チャー、椰子殻、コーヒー豆、キチン等の天然物の炭化
物、あるいは合成樹脂の還元雰囲気中での焼成物で、高
温、あるいは低温で処理された炭化物である。活性炭の
比表面積を拡大させるために、必要に応じ水蒸気による
高温処理あるいは塩化亜鉛水溶液を含浸することによる
高温処理で賦活が施される。
【0013】高比表面積基体の形状としては、粉体状、
繊維状、これらを使用したプレス成形物、塗工成形物、
織布、不織布などいずれも使用することが可能で、特に
これらに限定されるものではない。
【0014】炭素体は電子伝導性を有するため、この導
電性を利用して、菌体又は破砕菌体中に含まれる酵素、
補酵素、その他生体関連物質、あるいは溶液中に溶解し
た酸素、水素、メタン、エネルギー源としての蟻酸、ア
ルデヒド、金属化合物を酸化還元するための電極として
使用することが可能である。この場合電界を印加するこ
とで酵素による反応サイクルを効率的に進めることが可
能である。アルカン資化菌の炭素体への固定化体をバイ
ンダーを用いて固めることにより炭素電極を得ることが
できる。
【0015】本発明の酸素透過性膜としては、ポリ−
[Ru(vbpy)3](ClO4)2フィルムが挙げられる。該フィル
ムは0.5mM[Ru(vbpy)3](ClO4)2 とBuNClO4/CH3CNの溶
液中で電解重合法により金属電極、カーボン電極上に作
成することができる。電解条件としては、例えば-1.25V
vs Ag/Ag+と-1.95V vs Ag/Ag+の間で電位走査をおこな
えばよい。
【0016】菌体を破砕して使用する場合にも炭素体な
どの高比表面積基体に吸着させた状態で行うことが可能
である。炭素体などの高比表面積基体に吸着された菌に
高濃度培地液を少量添加しスラリー化し破砕機で破砕す
る。
【0017】菌体は高濃度の金属イオン存在下で比較的
安定にハンドリングすることが可能である。
【0018】
【実施例】[メタン資化菌の培養]菌株譲渡機関(ATC
C)よりメタン資化菌ATCC Number: 35070: Methylosin
us trichosporium OB3bを入手し培養を行った。
【0019】培地として下記組成の培養液を用いジャー
ファーメンター(容量3L)にて50%メタン・50%
空気(30℃)を供給し菌体の増殖を行った。菌体内に
はMMOが誘導された。倍化時間は8時間であった。またsM
MOの精製量:菌体100g当たりのMMO採取量約25mgであっ
た。 水1リットルに上記の各成分を溶解しpHを7.0に調整
した。 [純度及び活性の測定]精製度の評価は、SDS電気泳動法
による精製標品の純度分析および酵素反応時間に対して
メタノール生成量を顕色剤又はガスクロマトグラフィー
により検出し関係式を求める。実施例1〜3及び比較例1〜3 上記培養液に、表1に記載の担持体(活性炭(AC)、活
性炭素繊維(AC)、シリカまたはタルク)と懸濁してカ
ラムに充填した。尚、比較例1は、担持体を用いていな
い。
【0020】作製したリアクターに対して、混合比1対
1に調製した空気とメタン混合気体120mlを供給し
て、30分間のメタンの消費量(メタノールの生産量)
を測定した。結果を表1に示す。
【0021】
【表1】 担持体 吸着有無 菌体量 比活性 (dry-cell/g-AC) (mμmol/dry-cell/min) 実施例1 活性炭 有 1.1 31 実施例2 活性炭 有 1.0 25 実施例3 活性炭素繊維 有 0.6 22 比較例1 なし 無 − 21 比較例2 シリカ 無 − 12比較例3 タルク 無 − 21
【0022】
【発明の効果】本発明はアルカン資化菌の固定化方法、
固定化菌体の処理方法に関するものであり、メタノール
の製造に特に有用である。本発明は、メタノールから誘
導されるDME燃料合成プロセスの中のメタノール合成パ
ートとして、大きな意義を持つ。ジメチルエーテル(DM
E)はメタノールの脱水触媒反応により得られるため、
メタノールのメタン酸化による本プロセスはDMEの製造
プロセスとしても有意義なものとなる。DMEはLPGの主成
分であるプロパン、ブタンに類似した性質を有し、貯蔵
安定性に優れ、高い燃焼効率、低毒性、低公害性といっ
た優れた性能を持った新ディーゼル燃料として注目され
ており、DME燃料のより効率的な合成法としても究めて
重要である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 4B033 NA01 NA12 NA23 NB02 NB12 NB23 NB63 NB65 NB66 NC04 NC06 NC15 ND02 ND20 NE07 4B064 AC02 CA02 CA33 CB12 CC03 CD04 DA16

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】アルカン資化菌を高比表面積基体に固定化
    させるアルカン資化菌の固定化方法。
  2. 【請求項2】アルカン資化菌がメタン資化菌である請求
    項1に記載の固定化方法。
  3. 【請求項3】高比表面積基体が導電性を有する請求項1
    に記載の固定化方法。
  4. 【請求項4】高比表面積基体が炭素体である請求項1に
    記載の固定化方法。
  5. 【請求項5】アルカン資化菌が好熱菌である請求項1に
    記載の固定化方法。
  6. 【請求項6】固定化を非結合性固定化方法により行う請
    求項1に記載の固定化方法。
  7. 【請求項7】非結合性固定化方法が、ゲル固定化法、ミ
    セル固定化法、電解重合法、高比表面積基体への吸着固
    定法からなる群から選ばれる請求項1記載の固定化方
    法。
  8. 【請求項8】高比表面積基体が酸素透過性膜であること
    を特徴とする請求項1記載の固定化方法。
  9. 【請求項9】高比表面積基体にアルカン資化菌の生菌体
    を吸着させた後、菌体を破砕することを特徴とする固定
    化菌体の処理方法。
  10. 【請求項10】請求項1〜8のいずれかに記載の方法に
    より得ることができるアルカン資化菌固定化体または請
    求項9に記載の方法により得ることができるアルカン資
    化菌破砕物の固定化体にメタンを供給する工程およびメ
    タノールを回収する工程を含むメタノールの製造方法。
  11. 【請求項11】メタンモノオキシゲナーゼ(MMO)お
    よびメタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)を含むメタ
    ン資化菌を基体に固定化する工程およびMDHを休眠化
    する工程を含むメタン資化菌の固定化方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002335984A (ja) * 2001-05-16 2002-11-26 Osaka Gas Co Ltd 微生物による物質生産方法

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