JP2000166551A - アルカン酸化酵素の固定化方法 - Google Patents
アルカン酸化酵素の固定化方法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】アルカノール特にメタノールを穏和な条件で効
率的に生産する。 【解決手段】アルカン酸化酵素を高比表面積基体に固定
化する工程を含む酵素の固定化方法。
率的に生産する。 【解決手段】アルカン酸化酵素を高比表面積基体に固定
化する工程を含む酵素の固定化方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アルカン資化菌の
アルカン酸化酵素の固定化方法およびメタノールの製造
方法に関するものであり、ジメチルエーテル（ＤＭＥ）
などの化学品の合成中間体として有用なアルカノールを
酵素を利用したアルカンの酸化反応により選択的に製造
する技術に関する。
アルカン酸化酵素の固定化方法およびメタノールの製造
方法に関するものであり、ジメチルエーテル（ＤＭＥ）
などの化学品の合成中間体として有用なアルカノールを
酵素を利用したアルカンの酸化反応により選択的に製造
する技術に関する。
【０００２】
【従来技術及びその課題】アルカノール、特にメタノー
ルは一般的にメタンを原料とした合成ガス（一酸化炭素
および水素）から製造されるが、これらの製法は一般に
高温、高圧下で行われるため、より緩和な条件下でのメ
タノール合成が検討されている。ScienceVol.280, 24 A
pril (1998) 560-563では比較的熱安定性の良い金属錯
体系触媒によるメタンからメタノールの直接合成が報告
されている。
ルは一般的にメタンを原料とした合成ガス（一酸化炭素
および水素）から製造されるが、これらの製法は一般に
高温、高圧下で行われるため、より緩和な条件下でのメ
タノール合成が検討されている。ScienceVol.280, 24 A
pril (1998) 560-563では比較的熱安定性の良い金属錯
体系触媒によるメタンからメタノールの直接合成が報告
されている。
【０００３】このような最新の研究成果においてもメタ
ンの酸化によるメタノール転化反応は百数十度の温度を
必要とするが、ある種の金属酵素はこれを常温、常圧で
進めることができる。 J.Biol.Chem.,264(17) 10023-10
033, 1989には、メタン資化菌内に保有されるメタンモ
ノオキシゲナーゼ（MMO）を用いたメタンからメタノー
ルの直接合成法について、詳しい記載がある。菌体内に
存在するMMOには可溶型と膜結合型のコンポーネント型
酵素が存在することが知られている。前者は二核の鉄原
子を活性サイトとして持つ金属酵素で、後者は銅原子が
酵素活性に大きく関与している。これを触媒としたメタ
ン／メタノール転化反応は、バイオミメティックスの面
からも注目されている。J. Am. Chem. Soc., 119, 1231
1-12321,1997には形式価数4価の鉄原子によるMMOの高活
性転化反応メカニズムが示されている。
ンの酸化によるメタノール転化反応は百数十度の温度を
必要とするが、ある種の金属酵素はこれを常温、常圧で
進めることができる。 J.Biol.Chem.,264(17) 10023-10
033, 1989には、メタン資化菌内に保有されるメタンモ
ノオキシゲナーゼ（MMO）を用いたメタンからメタノー
ルの直接合成法について、詳しい記載がある。菌体内に
存在するMMOには可溶型と膜結合型のコンポーネント型
酵素が存在することが知られている。前者は二核の鉄原
子を活性サイトとして持つ金属酵素で、後者は銅原子が
酵素活性に大きく関与している。これを触媒としたメタ
ン／メタノール転化反応は、バイオミメティックスの面
からも注目されている。J. Am. Chem. Soc., 119, 1231
1-12321,1997には形式価数4価の鉄原子によるMMOの高活
性転化反応メカニズムが示されている。
【０００４】USP5,190,870には、こうした生体機能を利
用したアルカノールの製造方法が開示されている。生体
機能を利用したアルカノールの製法として微生物学的方
法（発酵法）、酵素学的方法が提案されている。微生物
学的方法は、メタン資化菌を直接用いる方法であり、菌
体内部の酵素を利用する方法であるが、固定化できる菌
体密度およびメタン資化菌の菌体内部での酵素密度およ
びメタン資化菌の酵素誘導条件等の制約により固定化で
きる酵素密度には限度がある。
用したアルカノールの製造方法が開示されている。生体
機能を利用したアルカノールの製法として微生物学的方
法（発酵法）、酵素学的方法が提案されている。微生物
学的方法は、メタン資化菌を直接用いる方法であり、菌
体内部の酵素を利用する方法であるが、固定化できる菌
体密度およびメタン資化菌の菌体内部での酵素密度およ
びメタン資化菌の酵素誘導条件等の制約により固定化で
きる酵素密度には限度がある。
【０００５】酵素法は、例えばMethylococus capusulat
us Bathや Methylosinus tricosporium OB3b等のメタン
資化細菌よりメタンモノオキシゲナーゼ（MMO）を分離
し、それを触媒としてメタノールを合成する方法であ
り、MMOを酵素触媒とした触媒サイクルによるメタノー
ルの製法が提案されている。MMOは完全に単離する方法
が複雑であり、また、単離後の活性低下が大きく、不安
定である。
us Bathや Methylosinus tricosporium OB3b等のメタン
資化細菌よりメタンモノオキシゲナーゼ（MMO）を分離
し、それを触媒としてメタノールを合成する方法であ
り、MMOを酵素触媒とした触媒サイクルによるメタノー
ルの製法が提案されている。MMOは完全に単離する方法
が複雑であり、また、単離後の活性低下が大きく、不安
定である。
【０００６】USP5,192,672にはMMOを安定化させるため
の単離方法、取り扱い方法が記載されているが、未だ十
分とは言えない。
の単離方法、取り扱い方法が記載されているが、未だ十
分とは言えない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の項１〜
項１０に関する。 項１． アルカン酸化酵素を高比表面積基体に固定化す
る工程を含む酵素の固定化方法。 項２． 固定化を非結合性固定化方法により行う項１に
記載の固定化方法。 項３． 非結合性固定化方法が、ゲル固定化法、ミセル
固定化法、電解重合法、高比表面積への吸着固定法から
なる群から選ばれる項１記載の固定化方法。 項４． 高比表面積基体が導電性を有する項１記載の固
定化方法。 項５． 高比表面積基体が酸素透過性膜である項１記載
の固定化方法。 項６． 高比表面積基体が炭素体である項１記載の固定
化方法。 項７． アルカン酸化酵素が、アルカン資化菌の産生す
る酵素である項１記載の固定化方法。 項８． アルカン資化菌が好熱菌である項７記載の固定
化方法。 項９． メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）およびメ
タノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を含むアルカン資
化菌が生産し得る酵素を基体に固定化する工程およびＭ
ＤＨを休眠化する工程を含む項１記載の固定化方法。 項１０． 項１〜９に記載の固定化方法により得られた
固定化酵素を含バイオリアクターにメタンを供給する工
程および該装置からメタノールを回収する工程を含むメ
タノールの製造方法。
項１０に関する。 項１． アルカン酸化酵素を高比表面積基体に固定化す
る工程を含む酵素の固定化方法。 項２． 固定化を非結合性固定化方法により行う項１に
記載の固定化方法。 項３． 非結合性固定化方法が、ゲル固定化法、ミセル
固定化法、電解重合法、高比表面積への吸着固定法から
なる群から選ばれる項１記載の固定化方法。 項４． 高比表面積基体が導電性を有する項１記載の固
定化方法。 項５． 高比表面積基体が酸素透過性膜である項１記載
の固定化方法。 項６． 高比表面積基体が炭素体である項１記載の固定
化方法。 項７． アルカン酸化酵素が、アルカン資化菌の産生す
る酵素である項１記載の固定化方法。 項８． アルカン資化菌が好熱菌である項７記載の固定
化方法。 項９． メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）およびメ
タノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を含むアルカン資
化菌が生産し得る酵素を基体に固定化する工程およびＭ
ＤＨを休眠化する工程を含む項１記載の固定化方法。 項１０． 項１〜９に記載の固定化方法により得られた
固定化酵素を含バイオリアクターにメタンを供給する工
程および該装置からメタノールを回収する工程を含むメ
タノールの製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において、アルカン資化菌
としては、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタ
ン、ヘキサンなどの炭素数１〜６のアルカン、特にメタ
ンを炭素源として利用することができる菌を広く利用で
きる。好ましいアルカン資化菌としては、メタン資化
菌、ブタン資化菌などが挙げられ、特にメタン資化菌が
挙げられる。
としては、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタ
ン、ヘキサンなどの炭素数１〜６のアルカン、特にメタ
ンを炭素源として利用することができる菌を広く利用で
きる。好ましいアルカン資化菌としては、メタン資化
菌、ブタン資化菌などが挙げられ、特にメタン資化菌が
挙げられる。
【０００９】アルカン酸化酵素としては、メタンおよび
必要に応じて他のアルカンをメタノールおよびアルカノ
ールに酸化できる酵素であればその種類および由来につ
いては限定されない。好ましいアルカン酸化酵素として
は、アルカン資化菌、特にメタン資化菌の産生するモノ
オキシゲナーゼ、特にメタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭ
Ｏ）が例示される。ＭＭＯは、メタン、エタン、プロパ
ン等のアルカンをアルカノールに酸化することができ
る。固定化されるアルカン酸化酵素としては、ＭＭＯな
どのアルカン酸化酵素単独でもよく、アルカン酸化酵素
とともにアルカンの酸化に関連する他の一連の酸化還元
酵素とともに高比表面積基体に固定化してもよい。さら
に、アルカン酸化酵素の他にこれら関連酸化還元酵素と
ともに、或いは関連酸化還元酵素に代えてアルカン資化
菌特にメタン資化菌を同時に固定化してもよい。特に本
発明の方法で得られる固定化酵素を、アルカン特にメタ
ンを酸化してアルカノール特にメタノールを製造するた
めに繰り返し使用するに際し、他の酸化還元酵素ないし
アルカン資化菌の併用が有利であり得る。
必要に応じて他のアルカンをメタノールおよびアルカノ
ールに酸化できる酵素であればその種類および由来につ
いては限定されない。好ましいアルカン酸化酵素として
は、アルカン資化菌、特にメタン資化菌の産生するモノ
オキシゲナーゼ、特にメタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭ
Ｏ）が例示される。ＭＭＯは、メタン、エタン、プロパ
ン等のアルカンをアルカノールに酸化することができ
る。固定化されるアルカン酸化酵素としては、ＭＭＯな
どのアルカン酸化酵素単独でもよく、アルカン酸化酵素
とともにアルカンの酸化に関連する他の一連の酸化還元
酵素とともに高比表面積基体に固定化してもよい。さら
に、アルカン酸化酵素の他にこれら関連酸化還元酵素と
ともに、或いは関連酸化還元酵素に代えてアルカン資化
菌特にメタン資化菌を同時に固定化してもよい。特に本
発明の方法で得られる固定化酵素を、アルカン特にメタ
ンを酸化してアルカノール特にメタノールを製造するた
めに繰り返し使用するに際し、他の酸化還元酵素ないし
アルカン資化菌の併用が有利であり得る。
【００１０】好適なアルカン酸化酵素であるMMO酵素
は、メタンをエネルギー源として利用できるメタン資化
菌、一般にメチロトロフス（Methylotorophs）と呼ばれ
る菌体に広く存在することが知られているが、具体的な
メタン資化菌としてはメチロモナス・メタニカ（Methyl
omonas methanica）、メチロコッカス・カプスラタス
（Methylococcus Capsulatus(Buth) 通称バス菌）、メ
チロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus ｔrich
osporium OB3ｂ）、メチロシヌス・エス・ピー・CRL31
（Methylosinus ｓｐ. CRL31）などが挙げられる。好
熱性菌であるメチロコッカス・カプスラタスがＭＭＯの
供給源として好ましい。
は、メタンをエネルギー源として利用できるメタン資化
菌、一般にメチロトロフス（Methylotorophs）と呼ばれ
る菌体に広く存在することが知られているが、具体的な
メタン資化菌としてはメチロモナス・メタニカ（Methyl
omonas methanica）、メチロコッカス・カプスラタス
（Methylococcus Capsulatus(Buth) 通称バス菌）、メ
チロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus ｔrich
osporium OB3ｂ）、メチロシヌス・エス・ピー・CRL31
（Methylosinus ｓｐ. CRL31）などが挙げられる。好
熱性菌であるメチロコッカス・カプスラタスがＭＭＯの
供給源として好ましい。
【００１１】アルカン酸化酵素を産生する生物、例えば
メタン資化菌などのアルカン資化菌を培養するための培
地としては炭素源、窒素源、無機物及び必要に応じてそ
の他の栄養源を含むものであれば合成培地、天然培地の
いずれも使用可能である。しかし培地内の金属イオンの
組成によって可溶型、膜型の生成は大きく異なり、銅イ
オンの多く存在する培地内では膜型の生成が促進され
る。膜型の活性は可溶型に比べ高いが、可溶型の倍化時
間は膜型より短い。
メタン資化菌などのアルカン資化菌を培養するための培
地としては炭素源、窒素源、無機物及び必要に応じてそ
の他の栄養源を含むものであれば合成培地、天然培地の
いずれも使用可能である。しかし培地内の金属イオンの
組成によって可溶型、膜型の生成は大きく異なり、銅イ
オンの多く存在する培地内では膜型の生成が促進され
る。膜型の活性は可溶型に比べ高いが、可溶型の倍化時
間は膜型より短い。
【００１２】アルカン酸化酵素を産生する生物、例えば
メタン資化菌などのアルカン資化菌の培養はアルカン、
特にメタンの存在下振盪培養、あるいは通気攪拌培養等
の好気的条件下で行う。培養温度は菌の種類によって好
適条件は異なるが、一般に２０℃から40℃の範囲が適し
ている。しかし、Bath等の好熱菌では好適温度が４０℃
を超えることもある。また、pH域は中性付近が好ましい
が、MDHを休眠化させた場合にはエネルギー源として蟻
酸を補給することが有効であった。したがって溶液のｐ
Hは酸性側になることもある。蟻酸の添加で酵素の再活
性化のターンオーバーは１０万回以上と推定される。
メタン資化菌などのアルカン資化菌の培養はアルカン、
特にメタンの存在下振盪培養、あるいは通気攪拌培養等
の好気的条件下で行う。培養温度は菌の種類によって好
適条件は異なるが、一般に２０℃から40℃の範囲が適し
ている。しかし、Bath等の好熱菌では好適温度が４０℃
を超えることもある。また、pH域は中性付近が好ましい
が、MDHを休眠化させた場合にはエネルギー源として蟻
酸を補給することが有効であった。したがって溶液のｐ
Hは酸性側になることもある。蟻酸の添加で酵素の再活
性化のターンオーバーは１０万回以上と推定される。
【００１３】ＭＤＨの休眠化は、シクロプロパノールを
系内に存在させることにより、行うことができる。ここ
で「休眠化」とは、例えばメタンからメタノールへの酸
化の場合、メタノールからホルムアルデヒドを経てギ酸
に酸化する経路を抑制するが、メタンからメタノールへ
の酸化は抑制されないことを意味する。
系内に存在させることにより、行うことができる。ここ
で「休眠化」とは、例えばメタンからメタノールへの酸
化の場合、メタノールからホルムアルデヒドを経てギ酸
に酸化する経路を抑制するが、メタンからメタノールへ
の酸化は抑制されないことを意味する。
【００１４】培養菌体からのアルカン酸化酵素例えばMM
Oの抽出方法は公知の方法即ちI.J.Higgins等、J.Genera
l Microbiology 125, 63-72(1981)に記載されている方
法によって行うことができる。しかし、本発明ではアル
カン酸化酵素特にMMOは菌体から抽出された純粋な酵素
である必要はない。
Oの抽出方法は公知の方法即ちI.J.Higgins等、J.Genera
l Microbiology 125, 63-72(1981)に記載されている方
法によって行うことができる。しかし、本発明ではアル
カン酸化酵素特にMMOは菌体から抽出された純粋な酵素
である必要はない。
【００１５】即ち、アルカン資化菌特にメタン資化菌の
生菌を培養液から遠心分離等の方法によって濃縮、分離
し、その菌体、あるいは凍結した菌体、あるいは乾燥菌
体をプレス破砕、磨砕、自己消化、超音波処理などによ
り菌体細胞を破壊した処理物、または、この試料をＤＴ
Ｔ（ジチオスレイトール）等の還元剤を含む緩衝液に溶
解し、不溶成分を除去した試料も利用できる。
生菌を培養液から遠心分離等の方法によって濃縮、分離
し、その菌体、あるいは凍結した菌体、あるいは乾燥菌
体をプレス破砕、磨砕、自己消化、超音波処理などによ
り菌体細胞を破壊した処理物、または、この試料をＤＴ
Ｔ（ジチオスレイトール）等の還元剤を含む緩衝液に溶
解し、不溶成分を除去した試料も利用できる。
【００１６】さらに、この試料からゲルクロマトグラフ
ィーやイオン交換クロマトグラフィーにより精製した酵
素も利用できる。
ィーやイオン交換クロマトグラフィーにより精製した酵
素も利用できる。
【００１７】本発明に用いるアルカン酸化酵素、例え
ば、メタンモノオキシゲナーゼとして、該酵素又はそれ
を構成するコンポーネントまたは、サブユニットに対す
る抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによ
り、メタン資化菌等のアルカン資化菌の破砕試料から分
離した酵素を用いるのが、精製純度が高く、かつ、失活
度合いが少ないため、望ましい。
ば、メタンモノオキシゲナーゼとして、該酵素又はそれ
を構成するコンポーネントまたは、サブユニットに対す
る抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによ
り、メタン資化菌等のアルカン資化菌の破砕試料から分
離した酵素を用いるのが、精製純度が高く、かつ、失活
度合いが少ないため、望ましい。
【００１８】もちろん、大腸菌などの適当な宿主および
ベクター等を用いて遺伝子組み換え操作により作製した
ＭＭＯなどのアルカン酸化酵素も利用できる。この場
合、アルカン特にメタンの酸化に複数の酵素が関与する
場合には、必要に応じて遺伝子組み換え操作により作製
したアルカン酸化酵素と同時に又は逐次的に、遺伝子組
み換え操作により作製した関連する酸化還元酵素を固定
化することもできる。アルカン資化菌（特にメタン資化
菌）などの菌体由来の酵素を用いると、アルカンの酸化
還元に必要な一連の酵素が存在するため有利であり得
る。また、アルカン資化菌にアルカン酸化酵素特にＭＭ
Ｏを導入することにより形質転換して、アルカン酸化酵
素として用いてもよい。一方、アルカン酸化酵素を担
体、好ましくは炭素体等の導電性の高比表面積基体に固
定化する場合、固定化担体をバインダーで固めて電極と
して用いることができる。
ベクター等を用いて遺伝子組み換え操作により作製した
ＭＭＯなどのアルカン酸化酵素も利用できる。この場
合、アルカン特にメタンの酸化に複数の酵素が関与する
場合には、必要に応じて遺伝子組み換え操作により作製
したアルカン酸化酵素と同時に又は逐次的に、遺伝子組
み換え操作により作製した関連する酸化還元酵素を固定
化することもできる。アルカン資化菌（特にメタン資化
菌）などの菌体由来の酵素を用いると、アルカンの酸化
還元に必要な一連の酵素が存在するため有利であり得
る。また、アルカン資化菌にアルカン酸化酵素特にＭＭ
Ｏを導入することにより形質転換して、アルカン酸化酵
素として用いてもよい。一方、アルカン酸化酵素を担
体、好ましくは炭素体等の導電性の高比表面積基体に固
定化する場合、固定化担体をバインダーで固めて電極と
して用いることができる。
【００１９】本発明におけるアルカン酸化酵素固定のた
めの高比表面積基体としては、導電性を有する基体が好
ましい。好ましい導電性高比表面積基体としては、炭素
体を挙げることができる。
めの高比表面積基体としては、導電性を有する基体が好
ましい。好ましい導電性高比表面積基体としては、炭素
体を挙げることができる。
【００２０】炭素体としては、活性炭、活性炭素繊維、
天然グラファイト、人造グラファイト等いずれも使用す
ることが可能で、中でも活性炭が好ましく、木炭、石炭
チャー、椰子殻、コーヒー豆、キチン等の天然物の炭化
物、あるいは合成樹脂の還元雰囲気中での焼成物で、高
温、あるいは低温で処理された炭化物が使用できる。
天然グラファイト、人造グラファイト等いずれも使用す
ることが可能で、中でも活性炭が好ましく、木炭、石炭
チャー、椰子殻、コーヒー豆、キチン等の天然物の炭化
物、あるいは合成樹脂の還元雰囲気中での焼成物で、高
温、あるいは低温で処理された炭化物が使用できる。
【００２１】活性炭の比表面積を拡大させるために、必
要に応じ水蒸気による高温処理あるいは塩化亜鉛水溶液
を含浸することによる高温処理で賦活することができ
る。。
要に応じ水蒸気による高温処理あるいは塩化亜鉛水溶液
を含浸することによる高温処理で賦活することができ
る。。
【００２２】高比表面積基体の形状としては、粉体状、
繊維状、これらを使用したプレス成形物、塗工成形物、
織布、不織布などいずれも使用することが可能で、特に
これらに限定されるものではない。
繊維状、これらを使用したプレス成形物、塗工成形物、
織布、不織布などいずれも使用することが可能で、特に
これらに限定されるものではない。
【００２３】炭素体は電子伝導性を有するため、この導
電性を利用して、菌体又は破砕菌体中に含まれる酵素、
補酵素、その他生体関連物質、あるいは溶液中に溶解し
た酸素、水素、メタン、エネルギー源としての蟻酸、ア
ルデヒド、金属化合物を酸化還元するための電極として
使用することが可能である。
電性を利用して、菌体又は破砕菌体中に含まれる酵素、
補酵素、その他生体関連物質、あるいは溶液中に溶解し
た酸素、水素、メタン、エネルギー源としての蟻酸、ア
ルデヒド、金属化合物を酸化還元するための電極として
使用することが可能である。
【００２４】この場合電界を印加することで酵素による
反応サイクル例えばメタンからメタノールへの酸化を効
率的に進めることが可能である。
反応サイクル例えばメタンからメタノールへの酸化を効
率的に進めることが可能である。
【００２５】酵素のゲル固定化には、アルギン酸、アク
リルアミドなどを用いることができるが、その場合に、
上述の炭素体を適当量比にてゲルモノマーに混合し、酵
素を加えて重合しゲル化処理することにより、ゲル内で
の導電性を持たせることが可能である。
リルアミドなどを用いることができるが、その場合に、
上述の炭素体を適当量比にてゲルモノマーに混合し、酵
素を加えて重合しゲル化処理することにより、ゲル内で
の導電性を持たせることが可能である。
【００２６】ミセル固定化法、電解重合法、高比表面積
への吸着固定法などは、公知の方法に従い行うことがで
きる。
への吸着固定法などは、公知の方法に従い行うことがで
きる。
【００２７】本発明の酸素透過性膜としては、ポリ−
［Ru(vbpy)3］(ClO4)2フィルムが挙げられる。該フィル
ムは0.5mM［Ru(vbpy)3］(ClO4)2 とBuNClO4/CH3CNの溶
液中で電解重合法により金属電極、カーボン電極上に作
成することができる。電解条件としては、例えば-1.25V
vs Ag/Ag+と-1.95V vs Ag/Ag+の間で電位走査をおこな
えばよい。
［Ru(vbpy)3］(ClO4)2フィルムが挙げられる。該フィル
ムは0.5mM［Ru(vbpy)3］(ClO4)2 とBuNClO4/CH3CNの溶
液中で電解重合法により金属電極、カーボン電極上に作
成することができる。電解条件としては、例えば-1.25V
vs Ag/Ag+と-1.95V vs Ag/Ag+の間で電位走査をおこな
えばよい。
【００２８】MMO酵素によるメタン酸化の反応サイクル
は補酵素としてNADHを介してMMOを還元し酸素で酸化す
ることにより4価の鉄オキソ化部位を得る方法がとられ
ていると考えられている。
は補酵素としてNADHを介してMMOを還元し酸素で酸化す
ることにより4価の鉄オキソ化部位を得る方法がとられ
ていると考えられている。
【００２９】このＮＡＤＨ供給は、固定化処理するMMO
酵素試料にＮＡＤを還元する酵素を適当量比にて添加し
て処理することでも可能である。
酵素試料にＮＡＤを還元する酵素を適当量比にて添加し
て処理することでも可能である。
【００３０】ＮＡＤＨを供給するかわりに、還元力を供
給する目的として、メチルビオロゲンなどを酵素に添加
して処理することも可能である。
給する目的として、メチルビオロゲンなどを酵素に添加
して処理することも可能である。
【００３１】
【実施例】以下、実施例をあげて本発明を説明するが、
本発明は実施例に限定されない。 [メタン資化菌の培養]菌株譲渡機関（ＡＴＣＣ）よりメ
タン資化菌ATCC Number: 35070: Methylosinus trichos
porium OB3bを入手し培養を行った。
本発明は実施例に限定されない。 [メタン資化菌の培養]菌株譲渡機関（ＡＴＣＣ）よりメ
タン資化菌ATCC Number: 35070: Methylosinus trichos
porium OB3bを入手し培養を行った。
【００３２】培地として下記組成の培養液を用いジャー
ファーメンター（容量３Ｌ）にて５０％メタン・５０％
空気（３０℃）を供給し菌体の増殖を行った。菌体内に
はMMOが誘導された。倍化時間は8時間であった。 [培地組成] Culture Medium K2HPO4 ０．７ 重量部 KH2PO4 ０．５４ 重量部 MgSO4・７H2O １．０ 重量部 NH4Cl ０．５ 重量部 FeSO4・７H2O ０．００４ 重量部 CaCl2・２H2O ０．２ 重量部 CuCl2・２H2O ０．００００１ 重量部 NiCl2・６H2O ０．００００２ 重量部 Trace Element ZnSO4・７H2O ０．０００１ 重量部 MnCl2・４H2O ０．００００３ 重量部 H3BO4 ０．０００３ 重量部 CoCl2・６H2O ０．０００２ 重量部 Na2MnO4・２H2O ０．００００３ 重量部 上記各成分を水１リットルに溶解しpHを７．０に調整し
た。 [純度及び活性の測定]精製度の評価は、SDS電気泳動法
により行った。酵素活性は、反応時間に対してメタノー
ル生成量を顕色剤又はガスクロマトグラフィーにより検
出し関係式を求めた。実施例１ メタン資化菌菌体液１ｍｌをシクロプロパノール処理
し、メタノール脱水素酵素の活性を休眠化した後に活性
炭粒子と懸濁してカラムに充填し、カラム体積として１
ｍｌのリアクターを作製した。このリアクターを菌体リ
アクターと称する。
ファーメンター（容量３Ｌ）にて５０％メタン・５０％
空気（３０℃）を供給し菌体の増殖を行った。菌体内に
はMMOが誘導された。倍化時間は8時間であった。 [培地組成] Culture Medium K2HPO4 ０．７ 重量部 KH2PO4 ０．５４ 重量部 MgSO4・７H2O １．０ 重量部 NH4Cl ０．５ 重量部 FeSO4・７H2O ０．００４ 重量部 CaCl2・２H2O ０．２ 重量部 CuCl2・２H2O ０．００００１ 重量部 NiCl2・６H2O ０．００００２ 重量部 Trace Element ZnSO4・７H2O ０．０００１ 重量部 MnCl2・４H2O ０．００００３ 重量部 H3BO4 ０．０００３ 重量部 CoCl2・６H2O ０．０００２ 重量部 Na2MnO4・２H2O ０．００００３ 重量部 上記各成分を水１リットルに溶解しpHを７．０に調整し
た。 [純度及び活性の測定]精製度の評価は、SDS電気泳動法
により行った。酵素活性は、反応時間に対してメタノー
ル生成量を顕色剤又はガスクロマトグラフィーにより検
出し関係式を求めた。実施例１ メタン資化菌菌体液１ｍｌをシクロプロパノール処理
し、メタノール脱水素酵素の活性を休眠化した後に活性
炭粒子と懸濁してカラムに充填し、カラム体積として１
ｍｌのリアクターを作製した。このリアクターを菌体リ
アクターと称する。
【００３３】培養液１Ｌの培養液試料を遠心処理して回
収したメタン資化菌菌体を液体窒素により凍結し、プレ
ス破砕装置により菌体を破砕した。 破砕した試料を分
子ふるいクロマトグラフィーであるゲルろ過クロマトグ
ラフィーのカラムにより精製操作を行い、クロマトグラ
フィーカラムから溶出した画分のうち、メタン酸化酵素
の分子量の溶出位置の画分を回収した。回収した画分試
料を限外ろ過濃縮法により濃縮した後に、アルギン酸溶
液に懸濁し、活性炭素繊維を添加し、カルシウム溶液に
て 小粒子ゲル化処理を行った。ゲルをカラムに充填し
容積１ｍｌの反応リアクターを作製した。このリアクタ
ーを酵素リアクターと称する。
収したメタン資化菌菌体を液体窒素により凍結し、プレ
ス破砕装置により菌体を破砕した。 破砕した試料を分
子ふるいクロマトグラフィーであるゲルろ過クロマトグ
ラフィーのカラムにより精製操作を行い、クロマトグラ
フィーカラムから溶出した画分のうち、メタン酸化酵素
の分子量の溶出位置の画分を回収した。回収した画分試
料を限外ろ過濃縮法により濃縮した後に、アルギン酸溶
液に懸濁し、活性炭素繊維を添加し、カルシウム溶液に
て 小粒子ゲル化処理を行った。ゲルをカラムに充填し
容積１ｍｌの反応リアクターを作製した。このリアクタ
ーを酵素リアクターと称する。
【００３４】作製した２種類のリアクターに対して、混
合比１対１に調製した空気とメタン混合気体１２０ｍｌ
を供給して、３０分間のメタンの消費量（メタノールの
生産量）を測定した。
合比１対１に調製した空気とメタン混合気体１２０ｍｌ
を供給して、３０分間のメタンの消費量（メタノールの
生産量）を測定した。
【００３５】結果 メタンの消費速度を比べた結果、酵素リアクターは、菌
体リアクターに比べて２倍以上のメタン消費速度が得ら
れた。
体リアクターに比べて２倍以上のメタン消費速度が得ら
れた。
【００３６】
【発明の効果】本発明はアルカン資化菌の固定化方法及
びメタノールの製造装置および製造方法に関するもので
あり、燃料あるいは樹脂原料として、メタノールの製造
方法特に有用である。メタノールから誘導されるDME燃
料合成プロセスの中のメタノール合成パートとして、大
きな意義を持つ。
びメタノールの製造装置および製造方法に関するもので
あり、燃料あるいは樹脂原料として、メタノールの製造
方法特に有用である。メタノールから誘導されるDME燃
料合成プロセスの中のメタノール合成パートとして、大
きな意義を持つ。
【００３７】ジメチルエーテル（DME）はメタノールの
脱水触媒反応により得られるため、メタノールのメタン
酸化による本プロセスはDMEの製造プロセスとしても有
意義なものとなる。DMEはLPGの主成分であるプロパン、
ブタンに類似した性質を有し、貯蔵安定性に優れ、高い
燃焼効率、低毒性、低公害性といった優れた性能を持っ
た新ディーゼル燃料として注目されており、DME燃料の
より効率的な合成法としても究めて重要である。
脱水触媒反応により得られるため、メタノールのメタン
酸化による本プロセスはDMEの製造プロセスとしても有
意義なものとなる。DMEはLPGの主成分であるプロパン、
ブタンに類似した性質を有し、貯蔵安定性に優れ、高い
燃焼効率、低毒性、低公害性といった優れた性能を持っ
た新ディーゼル燃料として注目されており、DME燃料の
より効率的な合成法としても究めて重要である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B033 NA02 NA12 NA23 NB12 NB23 NB48 NC04 NC06 ND02 NE07 4B050 CC08 DD02 GG10 LL05 4B064 AC02 CA02 CB12 CD04 DA16
Claims (10)
- 【請求項１】アルカン酸化酵素を高比表面積基体に固定
化する工程を含む酵素の固定化方法。 - 【請求項２】固定化を非結合性固定化方法により行う請
求項１に記載の固定化方法。 - 【請求項３】非結合性固定化方法が、ゲル固定化法、ミ
セル固定化法、電解重合法、高比表面積への吸着固定法
からなる群から選ばれる請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項４】高比表面積基体が導電性を有する請求項１
記載の固定化方法。 - 【請求項５】高比表面積基体が酸素透過性膜である請求
項１記載の固定化方法。 - 【請求項６】高比表面積基体が炭素体である請求項１記
載の固定化方法。 - 【請求項７】アルカン酸化酵素が、アルカン資化菌の産
生する酵素である請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項８】アルカン資化菌が好熱菌である請求項７記
載の固定化方法。 - 【請求項９】メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）およ
びメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を含むアルカ
ン資化菌が生産し得る酵素を基体に固定化する工程およ
びＭＤＨを休眠化する工程を含む請求項１記載の固定化
方法。 - 【請求項１０】請求項１〜９に記載の固定化方法により
得られた固定化酵素を含バイオリアクターにメタンを供
給する工程および該装置からメタノールを回収する工程
を含むメタノールの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10349170A JP2000166551A (ja) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | アルカン酸化酵素の固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10349170A JP2000166551A (ja) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | アルカン酸化酵素の固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000166551A true JP2000166551A (ja) | 2000-06-20 |
Family
ID=18401949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10349170A Pending JP2000166551A (ja) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | アルカン酸化酵素の固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000166551A (ja) |
-
1998
- 1998-12-08 JP JP10349170A patent/JP2000166551A/ja active Pending
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