KR102548568B1 - 코코넛 껍질에 고정화한 메탄산화세균 및 이를 이용한 메탄올 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균 및 이의 고정화 방법과 이를 이용하여 메탄 가스로부터 메탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균은 고정화 효율이 우수할 뿐 아니라 기질로서 CH₄를 이용하여 메탄올을 생산할 수 있으며, 메탄올을 생성하는 동안 안정성이 높아지고, 반복된 배양을 수행하여도 메탄올 생산 효율이 유지되어 여러 번 재사용할 수 있다. 또한, 효율적으로 메탄올을 생산할 수 있어 온실가스를 효과적으로 감축할 수 있으며, 기존 공정에 비해 기술적 및 경제적으로 우수한 메탄올 생산 공정을 확립할 수 있다.

Description

코코넛 껍질에 고정화한 메탄산화세균 및 이를 이용한 메탄올 생산방법{Methanotrophs immobilized on coconut coir and method for production of methanol using the same}

본 발명은 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균 및 이의 고정화 방법과 이를 이용한 메탄 가스로부터 메탄올 생산방법에 관한 것이다.

주요 온실 가스(GHG)인 메탄(CH₄)의 배출 증가(331 Tg/년)는 세계적인 환경 문제이다. CH₄는 가장 풍부한 천연가스 중 하나로서, 풍부한 에너지원이지만, 상기 CH₄는 1차 온실가스로서 심각하게 유해한 환경적 영향 때문에 최근 CO₂보다 더 관심을 받고 있다. 따라서, CH₄의 유해한 온실가스 효과를 줄이기 위해, 메탄올과 같은 부가가치가 높은 바이오 제품을 생산하기 위한 원료로 CH₄을 효과적으로 활용하기 위한 전략 개발이 필요하다.

메탄올은 교통수단의 연료를 포함하여 다양하고 복잡한 화학적 합성 반응을 위한 핵심적인 기본 물질로서 사용된다. 메탄올은 CH₄보다 약 400배 높은 에너지 밀도를 가지며, 보관 및 운송 비용이 현저히 절감될 수 있다.

CH₄에서 메탄올로의 화학적 전환의 공정은 고온 및 고압에서 이루어지며 값비싼 화학적 촉매와 가혹한 반응 조건을 필요로 하는 열 화학 공정을 통해 주로 수행되므로, 공정의 높은 비용 및 낮은 에너지 효율성 등의 문제가 있다. 이러한 화학적 방법과 비교할 때, 생물학적 공정은 더욱 자연친화적이고, 높은 전환율, 선택성, 및 낮은 자본/에너지 비용의 이점을 가진다. 따라서, CH₄에서 메탄올로의 생물학적 전환을 위한 방법을 개발하기 위한 노력이 최근 증가되고 있다.

메탄산화세균(Methanotrophs)은 메탄 일원자산소화효소(methane monooxygenase; MMO)를 이용하여 CH₄를 효율적으로 사용하여 메탄올을 생산하는 세균집단을 통칭하는 것이다. 메탄산화세균은 멤브레인 관련 미립자 MMO(pMMO)와 세포질 용해 MMO(sMMO)의 두가지 유형의 MMO를 생산한다. pMMO는 막-결합 미립자 효소 시스템과 관련되는 반면, sMMO는 세포질 복합체 내에 위치하며, 이들 효소의 발현은 구리(Cu) 금속 이온 농도에 크게 의존한다. pMMO 발현은 Cu 수준이 높을수록 우세하고, sMMO은 Cu 농도가 낮을수록 우세하다. pMMO는 sMMO보다 CH₄ 산화에 대한 더 높은 친화력을 가진다.

메탄산화세균은 CH₄를 탄소원으로 이용하여 MMO, 메탄올 탈수소효소(methanol dehydrogenase; MDH), 포름알데히드 탈수소효소(formaldehyde dehydrogenase; FalDH) 및 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase; FDH)를 이용한 하기 반응식 1의 복잡한 경로를 통해 바이오매스 전환시 CO₂를 생성시킨다. 구체적으로, 메탄산화세균은 메탄을 메탄올로 산화시키고, 메탄올을 다시 포름알데히드로 산화시킨다. 그리고 포름알데히드를 포름산으로 산화시켜 최종적으로 유해성이 적은 이산화탄소로 전환한다.

[반응식 1]

메탄올은 상기 대사경로에서 MDH 효소가 후속 단계를 위하여 이를 대사하기 때문에 최종적으로 생산되는 양은 적다. 이에 염화암모늄, 시클로프로판올, 염화마그네슘, 인산염 완충액 및 염화나트륨과 같은 억제제를 이용한 MDH의 부분적 억제를 통해 sMMO 활성에 필요한 보조 인자(nicotinamide adenine dinucleotide)의 재생으로 메탄올 생산을 향상시키기 위한 방법이 연구되어왔다. 이와는 반대로, pMMO가 CH₄를 메탄올로 전환시키는 촉매 활성에는 어떠한 보조인자도 필요하지 않다.

한편, 고정화된 전세포(whole cells)는 메탄산화세균의 CH₄의 산화 능력을 향상시키는 것으로 알려지면서 이와 관련된 연구가 이루어지고 있다. 그러나 효율적인 전세포 고정화는 반복되는 회분 조건하에서 메탄올 생산을 제한하는 주요 요인이 된다. 따라서, 메탄산화세균에 의한 메탄올의 생산 방법에 있어서, 반복적인 회분 조건하에서 셀 로딩 및 메탄올 생산 효율을 향상시킬 수 있는 개선된 방법이 필요하였다.

본 발명자들은 이를 연구하던 중 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화시켰으며, 상기 고정화를 위한 최적 조건을 도출하고, 이를 이용한 메탄올 생산 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 코코넛 껍질에 메탄산화세균(Methanotrophs)을 고정화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 메탄올 생산용 조성물 및 메탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 코코넛 껍질을 메탄산화세균과 함께 배양하는 단계;를 포함하는, 코코넛 껍질에 메탄산화세균(Methanotrophs)을 고정화하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 포함하는 메탄올 생산용 조성물을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 이용하여 메탄 가스로부터 메탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균은 고정화 효율이 우수할 뿐 아니라 기질로서 CH₄를 이용하여 메탄올을 생산할 수 있으며, 메탄올을 생성하는 동안 안정성이 높아지고, 반복된 배양을 수행하여도 메탄올 생산 효율이 유지되어 여러 번 재사용할 수 있다. 또한, 효율적으로 메탄올을 생산할 수 있어 온실가스를 효과적으로 감축할 수 있으며, 기존 공정에 비해 기술적 및 경제적으로 우수한 메탄올 생산 공정을 확립할 수 있다.

도 1은 코코넛 껍질에 메틸로시스티스 브리오필리아(M. bryophila)를 흡착을 통해 고정화시키는 경우 (a) pH (b) 온도, (c) 배양 시간 및 (d) 세포 로딩이 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 코코넛 껍질에 M. bryophila를 공유 고정화시키는 경우 (a) pH (b) 온도, (c) 배양 시간 및 (d) 세포 로딩이 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 코코넛 껍질에 고정화된 M. bryophila를 이용하여 메탄올 생성시, (a) 배양 시간 및 (b) CH₄ 농도에 따른 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 (a) 파라핀 오일이 M. bryophila에 의한 메탄올 생산에 미치는 영향 및 (b) 파라핀 오일의 존재 하에서 CH₄ (30 %)를 사용한 24 시간 배양 기간 동안 고정화된 M. bryophila의 산화 환원 상태 및 (c) 파라핀 오일 존재 유무에 따른 MDH 및 MMO를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 (a) 파라핀 오일 존재 하에서 고정화된 M. bryophila 세포의 메탄올 생산 프로파일 및 (b) 파라핀 오일 농도가 메탄올 생산에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 메탄올 생산 주기 반복에 따른 (a) 메탄올 생산량, (b) 파라핀 오일 존재 하에서의 메탄올 생산량, 생산 주기 반복에 따른 (c) 세포 침출 및 (d) MMO 활성을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 코코넛 껍질을 메탄산화세균과 함께 배양하는 단계;를 포함하는, 코코넛 껍질에 메탄산화세균(Methanotrophs)을 고정화하는 방법을 제공한다.

본 발명의 코코넛 껍질(coconut coir)은 건조 및 분쇄하여 사용하며, 1-5mm의 입자 크기로 분쇄, 바람직하게는 1-2mm로 분쇄될 수 있다.

상기 코코넛 껍질은 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 의해 기능적으로 활성화(functionally activated, 기능화) 될 수 있다. 상기 기능화는 코코넛 껍질을 글루타르알데히드를 포함하는 완충액에 현탁 및 반응시킴으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 글루타르알데히드는 상기 완충액 부피를 기준으로 0.1-5% v/v, 바람직하게는 1% v/v 포함되는 것일 수 있다. 상기 완충액은 인산염 완충액인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 방법은 상기 코코넛 껍질을 메탄산화세균과 함께 배양하는 단계에 앞서, 상기 코코넛 껍질을 글루타알데히드를 통하여 기능적으로 활성화시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 코코넛 껍질의 기능적 활성화가 완료되면 원심분리에 의해 코코넛 껍질을 회수하고 인산 완충액으로 세척하여 과량의 글루타알데히드를 제거하는 과정을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 메탄산화세균은 코코넛 껍질을 지지체(support)로 하여, 공유(covalent) 결합을 통해 코코넛 껍질에 고정화되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 메탄산화세균(Methanotrophs)은 메탄을 탄소원 및 에너지원으로 사용하여 성장하는 세균집단을 통칭하는 것으로, 메틸로셀라(Methylocella), 메틸로모나스(Methylomonas), 메타노모나스(Methanomonas), 메틸로코쿠스(Methylococcus), 메틸로시누스(Methylosinus), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로미크로비움(Methylomicrobium) 및 메틸로시스티스(Methylocystis)에 속하는 메탄산화세균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 메탄산화세균일 수 있다. 바람직하게는 상기 메탄산화세균은 메틸로시스티스 브리오필리아(Methylocystis bryophila), 메틸로페룰라 스텔라타(Methyloferula stellata) 및 메틸로셀라 툰드라(Methylocella tundrae)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 메틸로시스티스 브리오필리아(M. bryophila)(DSM 21852), 메틸로페룰라 스텔라타(M. stellata)(DSM 22108) 및 메틸로셀라 툰드라(M. tundrae)(DSMZ 15673)를 코코넛 껍질에 고정화하여 메탄올 생산에 이용하였다. 더욱 바람직하게는 메틸로시스티스 브리오필리아(Methylocystis bryophila)일 수 있고, 상기 균주를 코코넛 껍질에 고정화시켜 이용할 경우 다른 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화 시키는 경우 보다 우수한 메탄올 생산능 및 고정화 수율을 나타낼 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법에 있어서, 상기 배양은 pH 4 내지 8에서(실시예 전체)에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 pH 5.5 내지 8에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 범위보다 낮거나 높은 pH 조건에서 배양하는 경우, 메탄산화세균의 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율이 감소될 수 있다. 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5에서 수행될 수 있고, 상기 범위의 pH 조건에서 배양하는 경우 메탄산화세균의 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율이 다른 pH 조건을 이용한 경우 보다 현저하게 증가될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 pH 6.8 내지 7.2에서 수행될 수 있으며, 상기 범위의 pH 조건에서 가장 우수한 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율을 나타낼 수 있다.

본 발명의 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법에 있어서, 상기 배양은 3 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 3 내지 10℃의 온도에서 수행될 수 있고, 상기 범위보다 고정화 온도가 높은 경우 메탄올 생산 효율이 감소될 수 있고, 고정화 온도가 낮은 경우 고정화 수율이 감소될 수 있다. 더욱 바람직하게는 3.5 내지 4.5℃에서 수행될 수 있고, 상기 범위의 온도에서 배양하는 경우 다른 온도 조건에서 배양하는 경우 보다 메탄올 생산 효율이 높으면서도 적절한 고정화 수율을 나타낼 수 있다. 3.8 내지 4.2℃에서 수행될 수 있고, 상기 범위의 온도 조건에서 적절한 고정화 수율을 나타내면서도 가장 우수한 메탄올 생산 효율을 나타낼 수 있다.

본 발명의 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법에 있어서, 상기 배양은 8 내지 32시간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는 20 내지 32시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 상기 범위보다 낮거나 높은 배양 시간 조건에서 배양하는 경우, 메탄산화세균의 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율이 감소될 수 있다. 더욱 바람직하게는 21 내지 27시간동안 수행되는 것일 수 있고, 상기 범위의 배양 시간 조건에서 고정화하는 경우 메탄산화세균의 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율이 다른 배양 시간 조건을 이용한 경우 보다 현저하게 증가될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 23 내지 25시간 동안 수행될 수 있고, 상기 범위의 배양 시간 조건에서 가장 우수한 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율을 나타낼 수 있다.

본 발명의 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법에 있어서, 상기 배양은 상기 코코넛 껍질 1000 중량부를 기준으로 상기 메탄산화세균을 10 내지 300 중량부의 건조 세포 질량(dry cell mass) 농도로 세포 로딩(cell loading)하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양은 상기 코코넛 껍질 1000 중량부를 기준으로 상기 메탄산화세균을 50 내지 150 중량부의 건조 세포 질량(dry cell mass) 농도로 세포 로딩(cell loading)하는 것일 수 있고, 상기 범위보다 세포 로딩이 많은 경우 메탄올 생산 효율이 감소될 수 있고, 세포 로딩이 적은 경우 고정화 수율이 감소될 수 있다. 더욱 바람직하게는 코코넛 껍질 1000 중량부를 기준으로 상기 메탄산화세균을 80 내지 120 중량부의 건조 세포 질량 농도로 세포 로딩 하는 것일 수 있고, 상기 범위의 농도로 세포 로딩하여 배양하는 경우 다른 세포 로딩 농도로 배양하는 경우보다 메탄올 생산 효율이 높으면서도 적절한 고정화 수율을 나타낼 수 있다. 보다 더 바람직하게는 코코넛 껍질 1000 중량부를 기준으로 상기 메탄산화세균을 90 내지 110 중량부의 건조 세포 질량 농도로 세포 로딩 하는 것일 수 있고, 상기 범위의 세포 로딩 농도로 배양시켜 메탄산화세균을 고정화한 경우 가장 우수한 메탄올 생산 효율을 나타낼 수 있다.

상기 메틸로시스티스 브리오필리아는 지지체 1g 당 DCM 0.01 내지 300 mg의 세포 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 50 내지 150 mg의 세포 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80 내지 120 mg일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 90 내지 110 mg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 코코넛 껍질(coconut coir)을 글루타르알데히드로 기능화시킨 다음, 50mM의 인산염 완충액(pH 7.0) 내에 상기 코코넛 껍질(CC) 1 g 당 메틸산화세균 세포를 100 mg 건조 세포 질량(dry cell mass, DCM), 즉 100 mg DCM/g of CC로 세포 로딩(cell loading)하여, 4℃에서 100rpm으로 교반 및 24시간 동안 배양시킴으로써 메탄산화세균 전체 세포(whole cell)들을 코코넛 껍질 지지체 상에 고정화하였으며, 상기 pH, 온도, 세포 로딩 및 배양 시간 조건을 다양하게 조절하여 비교한 결과, 상기 배양 조건이 가장 우수한 메탄올 생산 효율을 나타낼 수 있는 최적 고정화 조건임을 확인하였다(실시예 1 내지 2 참조).

본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 공유 고정화된 메탄산화세균이 흡착 방법으로 고정화된 메탄산화세균 또는 고정화되지 않은 메탄산화세균(자유 세포)보다 메탄올 생산 효율, 고정화 수율, 안정성 및/또는 재사용성이 우수함을 확인하였다(실시예 1 내지 4 참조).

본 발명에서 상기 "배양"은 미생물 또는 첨가물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 제공한다.

본 발명에 따른 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균은 코코넛 껍질 표면에 메탄산화세균 세포가 공유(covalent) 결합되어 고정화된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균은 반복된 배양을 수행하여도 메탄올 생산 효율이 유지되어 여러 번 재사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균이 8 사이클 재사용 후에도 메탄올 생산 효율이 우수하게 유지될 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

나아가, 본 발명은 상기 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 포함하는 메탄올 생산용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 메탄 가스로부터 메탄올을 생산하는 것일 수 있다.

더 나아가, 본 발명은 상기 코코넛 껍질에 메탄산화세균을 고정화하는 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 이용하여 메탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 메탄올을 생산하는 방법은 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 이용하여 메탄 가스로부터 메탄올을 생산하는 방법을 의미하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 메탄올을 생산하는 방법은 메탄 가스를 기질로서 공급하여 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 인산 나트륨 완충액(pH, 7.0)에 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 접종하고, 메탄 가스를 공급 및 포화시킨 상태에서 배양하여 메탄올을 생산하였다.

본 발명에 따른 메탄올을 생산하는 방법에 있어서, 상기 배양은 12시간 이상 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 20시간 이상 96시간 미만 수행되는 것일 수 있다. 후속 활용 및 환원력 고갈 방지 차원에서, 더욱 바람직하게는 36 내지 60시간 수행되는 것일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 45 내지 50시간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 메탄올을 생산하는 방법에 있어서, 상기 메탄 가스의 공급 농도(feed concentration)는 10 내지 50% v/v일 수 있다. 바람직하게는 25 내지 50% v/v인 것일 수 있고, 메탄 가스가 상기 범위보다 낮은 농도로 메탄 가스가 공급되는 경우 메탄올 생산 효율이 감소할 수 있고, 더 증가하는 경우 경제적인 면에서 비효율적일 수 있다. 더욱 바람직하게는 메탄 가스의 공급 농도는 25 내지 30% v/v인 것일 수 있고, 상기 범위의 농도로 공급할 경우 가장 비용면에서 경제적이면서도 높은 메탄올 생산 효율을 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 메탄올을 생산하는 방법에 있어서, 상기 배양은 파라핀 오일(paraffin oil)의 존재 하에 수행될 수 있다. 이때, 상기 파라핀 오일의 농도는 메탄올 생산 반응을 위한 혼합물 전체 부피를 기준으로 1.25 내지 10 % (v/v)로 첨가되는 것일 수 있다. 바람직하게는 4 내지 9 % (v/v)인 것일 수 있고, 상기 농도 범위보다 더 높거나 낮은 농도로 첨가되는 경우 메탄올 생산 효율이 감소 될 수 있다. 더욱 바람직하게는 4 내지 6 % (v/v)인 것일 수 있고, 상기 농도 범위에서 다른 농도 조건 대비 메탄올 생산 효율이 우수하게 나타날 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 4.5 내지 5.5 % (v/v)인 것일 수 있다.

파라핀 오일의 존재는 더 높은 MMO 활성과 MDH 활성에 영향을 미칠 수 있다(실시예 3 참조).

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

준비예 1. 실험 준비

1-1. 물질 준비

메틸로시스티스 브리오필리아(Methylocystis bryophila)(DSM 21852), 메틸로페룰라 스텔라타(Methyloferula stellata)(DSM 22108) 및 메틸로셀라 툰드라(Methylocella tundrae)(DSMZ 15673) 메탄산화세균 균주는 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)에서 수득하였다.

(주)엔케이(부산)로부터 고순도 메탄(CH₄) 가스를 구입하였고, 2,6-디클로로페놀인도페놀(DCPIP), 암모늄 클로라이드(NH₄Cl), 칼슘 클로라이드(CaCl₂), 글루타르알데히드, MgCl₂, 나프탈렌, 페나진 메토 설페이트 및 테트라아조화-o-디아니시딘 클로라이드는 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하였다. 사용된 다른 모든 화학 물질과 시약은 분석 등급이었다.

코코넛 껍질(coconut coir, CC)은 현지 시장(대한민국 서울)에서 조달하여 0.1 N HCl로 전처리한 후 25 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, CC를 건조, 분쇄하고 1-2mm의 일반적인 크기 범위로 체질하여 고정화에 사용하였다.

1-2. 균주 및 배양

메탄산화세균 균주, 메틸로시스티스 브리오필리아(M. bryophila), 메틸로페룰라 스텔라타(M. stellata) 및 메틸로셀라 툰드라(M. tundrae)는 각각 20% CH₄를 피드로 포함하는 1L 플라스크 (Duran-Schott, Germany) 내 질산염 미네랄염 배지(200 mL)에서 성장시켰다. 플라스크를 회전 진탕기(Lab Champion IS-971R, Champion Laboratories, USA)에서 5일 동안 200 rpm의 교반 속도로 30℃에서 배양하였다. 그 후, 완전히 자란 세포를 4℃에서 30분 동안 4,000 rpm으로 원심 분리(한국 자이 로젠 1580R, 대한민국)하여 수집하고 사용 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 1. 코코넛 껍질에 고정화된 메틸산화세균 및 이를 이용한 메탄올의 생산

1-1. 코코넛 껍질 상에 메틸산화세균의 고정화

전체 세포의 안정성을 높이기 위해 메틸로시스티스 브리오필리아(M. bryophila), 메틸로페룰라 스텔라타(M. stellata) 및 메틸로셀라 툰드라(M. tundrae)를 포함하는 메틸산화세균을 흡착(adsorption) 고정화 방법 및 공유(covalent) 고정화 방법을 통해 코코넛 껍질(CC)에 고정화하였다.

구체적으로, 공유 고정화를 위하여, 코코넛 껍질(CC)을 글루타르 알데히드로 기능화시켜, 고정화를 위한 지지체로 사용하였다. 상기 기능화는 코코넛 껍질(CC)을 글루타르 알데히드를 1 % (v/v) 함유한 인산염 완충액에 현탁시키고 반응시킨 뒤 원심 분리 및 인산 완충액으로 2회 세척하여 과량의 글루타르 알데히드를 제거하는 기존의 방법을 이용하여 수행하였다.

50mM의 인산염 완충액(pH 7.0) 내에 상기 실시예 1-2에서 배양된 메틸산화세균 세포를 100 mg DCM/지지체 g(지지체 g당 100 mg의 건조 세포 질량(dry cell mass, DCM))으로 세포 로딩(cell loading)하여, 4℃에서 100rpm으로 교반 및 24시간 동안 배양시킴으로써 전체 세포들을 코코넛 껍질(CC) 지지체 상에 고정화하였다. 이후, 증류 폐액(distilled waste)으로 2회 세척하고 완충액으로 한번 더 세척하여 지지체에 미결합 또는 느슨하게 부착된 세포들을 제거하고, 지지체에 고정화된 세포를 회수 하였으며, 고정화된 세포들은 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.

1-2. 메탄산화세균을 이용한 메탄으로부터 메탄올의 생산

자유(free) 또는 고정화(immobilization)된 메탄산화세균 세포(3 mg DCM mL^-1)에 의한 메탄올 생산은 종래 방법을 이용하여 20 mL 반응 부피를 갖는 혈청 보틀(120 mL, Sigma-Aldrich, USA)에서 회분 조건하에 수행하였다.

100 mmol/L의 인산 나트륨 완충액(pH, 7.0) 내에 MgCl₂ (20mmol/L), 포름산염 (100mmol/L), Fe²⁺ (10μmol/L), Cu²⁺ (5μmol/L) 및 접종원(inoculums)으로서 3mg DCM/mL의 메탄산화세균을 포함하는 20mL의 반응 혼합물을 준비하였다. 추가로, 상부 공간(headspace)은 메탄가스(CH₄, 30 %)를 반응 기질로서 공급하여 포화시키고, 24시간 동안 배양하여 메탄올을 생산하였다. 이때, 상기 CH₄로 포화된 상부 공간은 메탄 가스 30% (v/v)에 나머지 70% (v/v)는 일반 공기로 구성되어 있다.

1-3. 세균 종류 및 고정화 방법에 따른 고정화 수율 및 메탄올 생산 효율

고정화 세포에 의한 메탄올 생산(methanol production)은 자유 세포(free cell)에 의한 메탄올 생산량을 100%로 고려하여 상대적 효율(relative efficiency, RE, %)로 계산하였고, 고정화 수율(immobilization yield, IY, %)은 하기의 식을 이용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[수학식 1]

고정화 수율(IY, %) = (지지체 상에 결합된 세포의 양/로딩된 세포의 총량) × 100

메탄산화세균	흡착		공유 고정화
	IY (%)	RE (%)	IY (%)	RE (%)
M. bryophila	17.9 ± 2.0	78.3 ± 6.1	48.6 ± 4.1	96.8 ± 5.8
M. stellata	14.2 ± 1.5	69.2 ± 6.8	36.7 ± 3.5	87.9 ± 7.0
M. tundrae	16.7 ± 1.8	76.0 ± 7.1	46.4 ± 4.4	89.3 ± 7.5

표 1에 나타낸 바와 같이, 공유 고정화를 통해 코코넛 껍질(CC)에 고정된 메탄산화세균의 메탄올 생산에 대한 IY 및 RE는 각각 36.7-48.6 % 및 87.9-96.8 % 범위였다. 반면에 흡착을 통해 CC에 고정된 메탄산화세균의 경우 현저히 낮은 IY (14.2-17.9 %)와 RE (69.2-78.3 %)를 나타내었다. 여기서, 메탄산화세균의 공유 고정화는 흡착을 통한 고정화에 비해 IY 및 RE가 3.4배 및 1.4배 높은 것으로 나타나, 메탄올 생산능이 더 우수한 것으로 확인되었다.

특히, M. bryophila, M. stellata 및 M. tundrae 중 M. bryophila는 흡착 및 공유 고정화된 세포를 통해 각각 78.3 % 및 96.8 %의 가장 높은 RE를 나타냈다. 따라서 M. bryophila를 사용하여 후속 연구를 수행하였다.

실시예 2. 고정화 조건 및 메탄올 생산 조건의 최적화

2-1. M. bryophila의 고정화 조건 최적화

메탄산화세균 전체 세포의 특성은 고정화 조건의 변화에 따라 크게 영향을 받으므로, 효율적인 생촉매를 얻기 위해서는 고정화 조건의 최적화가 필요하다

메탄산화세균의 효율적인 고정을 달성하기 위하여 상기 실시예 1과 동일한 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 코코넛 껍질(CC)에 메탄산화세균 M. bryophila을 고정화하는 과정에 있어서, 다양한 pH(4-8), 고정화(배양) 시간(8-32 시간), 온도(4, 16 및 25℃) 및 세포 로딩(50-300 mg DCM/지지체 g) 조건에 따른 메탄올 생산 및 고정화 수율을 평가하여 고정화 조건을 최적화하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

먼저, 온도, 배양 시간 및 세포 로딩량은 실시예 1과 동일한 조건으로 하고, 서로 다른 pH를 갖는 나트륨 아세테이트(sodium-acetate, pH 4-5) 및 인산염(phosphate, pH 6-8) 완충액(100mmol/L)들을 각각 사용하여, M. bryophila을 고정화시켜, pH 조건(4-8)에 따른 IY 및 RE를 평가하였다. 도 1a 및 도 2a에 나타낸 바와 같이, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통한 고정화에 대하여 최적 pH는 각각 6 및 7이었으며, 이때 IY는 각각 18.3 및 48.6 %, RE는 78.9 및 96.8 %이었다. 특히 pH 7이 가장 최적의 조건임을 확인하였다.

다음으로, pH, 배양 시간 및 세포 로딩량은 실시예 1과 동일한 조건으로 하고, 고정화 온도(배양 온도)를 4, 16, 25 및 30℃로 다르게 하여 IY 및 RE를 평가하였다. 도 1b 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통한 고정화에 대하여 4℃에서 30 ℃로 배양 온도(temperature)가 증가함에 따라 IY는 각각 18.3 %에서 19.1 %, 48.6 %에서 52.9 %로 약간 증가하였고, 대조적으로 메탄올 생산에 대한 RE는 각각 78.9 %에서 53.8 % 및 96.8 %에서 79.5 %로 크게 감소하였다. 이러한 결과는 낮은 온도(4 ℃)가 고정화를 위해 높은 온도보다 더 유리하다는 것을 의미한다.

또한, pH, 온도 및 세포 로딩량은 실시예 1과 동일한 조건으로 하고, 고정화를 위한 배양 시간(incubation period) 프로파일을 8 시간에서 최대 32시간으로 증가시키면서 IY 및 RE를 평가하였다. 그 결과, 도 1c 및 2c에 나타낸 바와 같이, 24시간의 배양 시간은 흡착 및 공유 고정화 방법을 통한 고정화에 대하여 각각 18.3 및 48.6의 % IY 및 78.9 및 96.8의 % RE를 나타내 최적의 고정화를 위한 배양 시간임을 알 수 있었다.

지지체의 경제적 중요성은 세포 부하와 직접 관련이 있다. 마지막으로, pH, 온도 및 배양 시간은 실시예 1과 동일한 조건으로 하고, CC에 대한 메탄산화균 세포의 효과적인 로딩은 지지체의 g당 50-300 mg의 DCM(50-300 mg DCM/지지체 g)의 초기 세포 농도에서 측정되었다. 그 결과 도 1d 및 도 2d에 나타낸 바와 같이, 세포 로딩의 증가와 함께 세포 고정화의 양이 증가하였고, 300 mg DCM/지지체 g의 초기 로딩에서 흡착 및 공유 고정화 방법을 통한 CC에 대한 최대 세포 로딩량(amount of cells immobilized)은 각각 28.1 및 117 mg DCM/지지체 g으로 나타났다. 상기와 같이 300 mg DCM/지지체 g의 초기 로딩에서 최대 로딩 값에 도달하는 동안 100mg DCM/지지체 g의 초기 로딩시 대비 RE는 흡착 및 공유 고정화 방법에 대해 각각 78.9 %에서 48.5 %로, 96.8 %에서 81.7 %로 감소하였으며, 이는 물질 전달 또는 확산 제한과 관련될 수 있다. 따라서, 메탄올 생산을 위한 세포 로딩의 최적 조건은 100 mg DCM/지지체 g인 것을 확인하였다.

2-2. 메탄올 생산 조건 최적화

메탄올 생산 조건을 최적화 하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 자유 또는 고정화된 메탄산화세균(M. bryophila) 세포(3 mg DCM mL^-1)를 이용하여, 배양시간(CH₄와 반응시키는 시간) 및 메탄(CH₄) 가스 공급 농도(feed concentration)에 따른 메탄올 생산의 상대 효율(RE)을 측정하였다.

자유 또는 고정화 세포의 메탄올 생산 프로파일은 30℃에서 최대 96 시간 배양 동안 평가되었다. 자유 또는 고정화된 M. bryophila 세포의 메탄올 생산 프로파일을 평가하여 안정성을 모니터링하였으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 자유 세포와 관련하여 메탄올 생산은 배양 기간이 최대 24시간까지 증가함에 따라 증가했으며 최대 생산량은 4.15 mmol/L이었다. 그 후, 메탄올 생산은 96시간의 긴 배양 기간에서 3.50mmol/L로 약간 감소하였다. 여기서 메탄올 생산의 감소는 MDH(methanol dehydrogenase) 활성의 불완전한 억제와 연관되어 메탄올의 후속 활용 또는 환원력 고갈을 초래할 수 있다. 유사하게, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 최대 메탄올 생산량은 3.76 mmol/L 및 5.11 mmol/L이 각각 최적의 배양 기간인 48 시간에서 관찰되었다.

메탄올 생산에 대한 CH₄ 농도 (10-50 %)의 영향은 자유 또는 고정화 세포 모두에 대해 앞서 살펴본 최적의 배양 조건(48 시간)에서 평가되었다. 자유 또는 고정화된 세포를 이용한 메탄올 생산에 대한 메탄 공급 농도의 영향을 측정하기 위해, 메탄올 생산에 대한 상이한 공급 농도(10-50 %, v/v)의 영향을 조사하였으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, 메탄올 생산은 공급 농도가 10 %에서 30 %로 증가함에 따라 증가하였고, 최대 50 % 농도까지의 더 높은 공급 농도에서 메탄올 생산이 안정화되었다. 여기서 메탄올 생산의 안정화는 기질 억제 또는 O₂의 낮은 가용성(공급 농도 50 %에서 CH₄와 공기의 1:1 비율)과 관련이 있을 수 있다. 생체 변환 과정에서 1 몰의 CH₄를 메탄올로 전환하려면 0.5 몰의 O₂가 필요하다. 자유 세포 또는 흡착 또는 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 최대 메탄올 생산량은 각각 4.24, 4.16 및 5.52 mmol/L였다. 이때, 공유 고정화 세포에 의한 메탄올 생산은 자유 세포 및 흡착 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산보다 각각 30.2 % 및 36.3 % 높았다. 다만, CH₄ 공급 농도 30 % 및 50 % 에서의 메탄올 생산량은 큰 차이가 나지 않으므로, 하기 실시예에서는 경제적인 면까지 고려하였을 때의 가장 적절한 CH₄ 공급농도인 30%에서 메탄올을 생산하였다.

실시예 3. 메탄올 생산에 대한 파라핀 오일의 영향

3-1. 메탄올 생산량 측정

M. bryophila의 메탄올 생산에 대한 파라핀 오일 (paraffin oil)이 미치는 효과를 알아보기 위해, 상기 실시예 1 및 2를 통해 확인된 최적 조건을 이용하여, 30% 메탄올 생산을 위한 반응 혼합물 전체 부피 기준으로 파라핀 오일을 5 % (v/v) 첨가하고, CH₄를 기질로 공급하여 30℃에서 96 시간의 배양 기간 동안의 메탄올 생산 조건에서 메탄올 생산량을 평가하였다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 처음에는 자유 세포에 의한 메탄올 생산이 6.82 mmol/L으로 최대 48 시간 동안 증가하였다. 그 후, 메탄올 생산은 96시간 배양에서 6.54 mmol/L로 약간 감소하였다. 파라핀 오일을 첨가한 군은 대조군(4.15 mmol/L)에 비해 메탄올 생산을 1.6배 (6.82mmol/L) 향상 시켰다.

CH₄에서 메탄올로의 전환 수율은 대조군(48.2 %)이 아닌 파라핀 오일(5 %, v/v) 처리군에서 71.5 %로 더 높게 관찰되었으며, 이는 파라핀 오일의 존재 하에서 기체상에서 세포로의 CH₄의 질량 전달이 더 개선됨과 관련될 수 있다. 또한, 파라핀 오일의 존재 하에서 메탄올 생산 프로파일의 상당한 변화가 관찰되었으며, 특히, 24시간 배양시 자유 세포(0.17 mmol/L/h)에 비해 고정화된 세포에서 0.27 mmol/L/h의 더 높은 생산성 속도를 나타내었다.

3-2. 전기 화학 및 생촉매 분석

파라핀 오일의 존재하에 24시간 배양시 메탄올 생산에 사용된 M. bryophila 세포의 산화 환원 상태를 20mV/s의 스캐닝 속도로 평가하였으며, 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오타이드에 비하여 NAD⁺/NADH (E₀ = -0.32 V)는 세포의 세포 내 산화 환원 상태를 나타낸다 (Mohan et al., 2010).

도 4b에 나타낸 바와 같이, 파라핀 오일을 사용하는 세포의 전체 산화 환원 상태는 전위에서 파라핀 오일(6.60 μA/cm²)이 없는 대조군과 비교하여 최대 전류 밀도가 9.64 μA/cm² 인 -3.0 V에서 시작하여 더 높은 환원 상태로 이탈하였다. 이것은 메탄산화세균의 대사 활동의 향상과 관련이 있다. 또한, 파라핀 오일이 있는 상태에서 세포에 의한 높은 메탄올 생산은 파라핀 오일이 없는 대조군과 비교하여 더 높은 MMO(CH₄ monooxygenases) 활성 (108 %)과 약간 감소된 MDH(methanol dehydrogenase) 활성 (91.4 %)을 나타내었다(도 4c).

3-3. 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산

먼저 파라핀 오일 (5.0 %, v/v)의 존재 하에서 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산을 평가하였으며, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산의 경우 자유 세포에 비해 유사한 경향이 관찰되었다. 자유 세포 및 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 48시간 배양시 최대 메탄올 생산량은 각각 6.82, 6.91 및 9.67 mmol/L이었다. 여기서, 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산은 자유 세포와 비교하여 최대 41.8 %까지 향상되었다.

파라핀 오일의 유효 농도를 평가하기 위해 여러 농도(1.25 내지 10.0%, v/v)의 파라핀 오일을 첨가한 반응 혼합물을 48시간 동안 배양하여 메탄올 생산을 모니터링하였으며, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.

도 5b에 나타낸 바와 같이, 자유 세포에 의한 메탄올 생산은 파라핀 오일 농도가 1.25 %에서 5.0 % (v/v)로 증가함에 따라 4.81mmol/L에서 6.82mmol/L로 증가하였다. 반면, 5.0 %에서 10.0 % (v/v)까지 파라핀 오일 농도가 더 증가되는 경우 메탄올 생산이 오히려 5.92mmol/L로 감소하였다. 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산도 상기 자유 세포와 유사한 경향을 나타내었고, 최적 파라핀 오일 농도는 5 % (v/v)였으며, 이때 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 최대 메탄올 생산량은 각각 6.91mmol/L 및 9.67mmol/L이다. 여기서 메탄올 생산의 안정화는 배지에서 CH₄의 포화와 관련이 있을 수 있다. 또한 높은 농도 (10.0 %, v/v)에서 파라핀 오일의 존재 하에서 sMMO 활성이 18.1 % 감소됨에 따라, 이러한 감소가 상기 메탄올 생산 억제 현상에 일부 영향을 미치는 것임을 확인하였다.

실시예 4. 반복된 배치 메탄올 생산 및 고정화된 세포의 침출

파라핀 오일 (5 %, v/v)의 유무에 관계없이 CH₄ (30 %)를 공급 원료(feed)로 사용하여 24 시간 배양의 최대 8 사이클(cycle) 동안 CC에 고정화된 메탄산화세균(M. bryophila) 세포에 의한 메탄올 생산을 평가하여 재사용성을 평가하였다. 각 사이클 후, 고정화된 세포를 4 ℃에서 30 분 동안 4,000 rpm에서 원심 분리하여 분리하고 다음 주기에서 후속 사용을 위해 인산염 완충액으로 세척하였다. 메탄올의 초기(제로 사이클) 생산 효율을 100 %로 간주하여 메탄올 생산 상대적 효율(RE)을 평가하였다.

자유 및 고정화 세포에 의한 메탄올 생산은 배양 24 시간의 최대 8 사이클 동안 반복 배치 조건에서 비교되었으며, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, 8 사이클의 재사용 후, 자유 세포와 흡착에 의해 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산에 대한 RE는 각각 2.9 % 및 14.5 %로 감소하였다. 반면에, 공유 고정화된 세포의 경우 동일한 조건에서 RE가 53.6 %로 증가하였다. 이 때, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포는 자유 세포에 비해 메탄올 생산 안정성이 5.0 배 및 18.5 배 개선된 것으로 확인되었다.

더 많은 사이클의 반복 사용에 대한 메탄올 생산은 누적 생산과 관련하여 더 유리할 수 있다. 전체적으로, 8 사이클 동안의 자유 세포와 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 누적 메탄올 생산량은 각각 14.1, 13.2 및 24.3 mmol/L이었다.

상기 실시예 3에서 살펴본 바와 같이, 파라핀 오일은 MMO의 CH₄ 용해도와 생촉매 활성에 유익한 영향을 미쳤으며 MDH 활성을 감소시켰다. 따라서 메탄올 생산을 개선하기 위해 파라핀 오일(5 %, v/v)의 존재 하에서 생산을 평가하였으며, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

도 6b에 나타낸 바와 같이, 8 사이클 재사용 후, 자유 세포는 6.9 %의 메탄올 생산 효율을 나타내었으며, 이는 파라핀 오일이 없을 때의 자유 세포에 의한 메탄올 생산 효율(2.9 %, 도 6a)보다 2.4배 더 높았다. 또한, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포는 각각 21.6 % 및 72.2 %의 더 높은 RE를 유지하였다. 종래의 폴리머 매트릭스를 통해 캡슐화된 M. sporium 및 M. trichosporium의 다른 균주가 반복 배치 조건에서 재사용 3 사이클 내에서 메탄올 생산이 최대 90 %까지 현저하게 감소된 바 있으나, 본 발명에 따른 공유 고정화된 M. bryophila 세포는 메탄올 생산 효율이 안정적으로 유지되었다. 전반적으로, 자유 세포 및 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포에 의한 누적 메탄올 생산량은 각각 30.9, 31.8 및 52.9 mmol/L로 관찰되었고, 파라핀 오일이 없는 각 세포의 경우(도 6a)와 비교하여 파라핀 오일 존재 하에서 2.3배, 2.4배 및 2.2배 향상되었다.

또한, 고정화된 세포의 침출을 평가하여 반복된 배치 조건에서 안정성을 측정하였으며, 그 결과를 도 6c에 나타내었다.

도 6c에 나타낸 바와 같이, 공유 결합으로 고정화된 세포는 흡착에 의해 고정화된 세포(32.9 %)보다 5.4배 더 낮은 누적 침출 (9.3 %)을 나타냈으며, 이로 인해, 공유 결합으로 고정화된 세포에 의한 메탄올 생산이 높은 안정성을 나타내는 것임을 확인하였다.

또한, 자유 및 고정화된 세포의 MMO 활성을 평가하여 생물 촉매 잠재력을 측정하였으며, 그 결과를 도 6d에 나타내었다.

도 6d에 나타낸 바와 같이, 8 사이클 재사용 후 잔류 활성이 9.8%인 세포의 후속 재사용에서 자유 세포의 MMO 활성이 크게 감소하여 메탄올 생산이 감소하였다. 대조적으로, 흡착 및 공유 고정화 방법을 통해 고정화된 세포는 각각 8 사이클 재사용 후 26.8 % 및 74.5 %의 더 높은 잔류 MMO 활성을 유지하여, 이러한 영향에 의해 메탄올 생산의 높은 안정성이 유지될 수 있음을 확인하였다.

상기와 같이, 실험을 통하여 코코넛 껍질을 포함하는 메탄산화세균 고정화용 지지체는 고정화 효율이 우수할 뿐 아니라 기질로서 CH₄를 이용하여 메탄올을 생산할 수 있으며, 메탄올을 생성하는 동안 안정성이 높고, 반복된 배양을 수행하여도 메탄올 생산 효율이 유지되어 여러 번 재사용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (15)

1. 코코넛 껍질(coconut coir)을 메탄산화세균과 함께 배양하는 단계;를 포함하는, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균(Methanotrophs)을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법으로서,
   상기 메탄산화세균은 메틸로시스티스 브리오필리아(Methylocystis bryophila)이고,
   상기 배양은 상기 코코넛 껍질 1000 중량부를 기준으로 상기 메탄산화세균을 80 내지 120 중량부의 건조 세포 질량(dry cell mass) 농도로 세포 로딩(cell loading)하여, pH 6.5 내지 7.5 및 3.5 내지 4.5℃의 온도에서 21 내지 27시간 동안 배양하는 것이고,
   상기 메탄산화세균은 공유(covalent) 결합을 통해 코코넛 껍질에 고정화되는 것인, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 코코넛 껍질은 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 의해 기능적으로 활성화된 것을 특징으로 하는, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 배양은 pH 6.8 내지 7.2에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 배양은 3.8 내지 4.2℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 배양은 23 내지 25 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 배양은 상기 코코넛 껍질 1000 중량부를 기준으로 상기 메탄산화세균을 90 내지 110 중량부의 건조 세포 질량 농도로 세포 로딩하는 것을 특징으로 하는, 메탄올 생산을 위한 메탄산화세균을 코코넛 껍질에 고정화하는 방법.
10. 제1항의 방법으로 제조된 메탄올 생산을 위한 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균.
11. 제1항의 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 포함하는 메탄올 생산용 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 메탄 가스로부터 메탄올을 생산하는 것을 특징으로 하는, 메탄올 생산용 조성물.
13. 제1항의 방법으로 제조된 코코넛 껍질에 고정화된 메탄산화세균을 이용하여 메탄올을 생산하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 메탄올을 생산하는 방법은 메탄 가스를 기질로서 25 내지 50% v/v의 공급농도로 공급하여, 45 내지 50시간 배양하는 단계를 포함하는, 메탄올을 생산하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 배양은 파라핀 오일의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는, 메탄올을 생산하는 방법.

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