JPH01160479A - 失活菌体の再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は失活菌体の再生方法に関し、詳しくはメタン酸
化能を部分的もしくは完全に失なったメタン資化性菌を
特定の物質を添加した再生液で再生操作を行なうことに
よりメタン酸化能を回復させる方法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕メ
タン資化性菌の有するメタン酸化酵素（メタンモノオキ
シゲナーゼ）は、メタンのほかアルカン、アルケン、環
状化合物、有機硫黄化合物、有機窒素化合物をも酸化し
、酸化物を与えること（共酸化）から産業上の利用価値
が高いが、酵素の安定性が悪く、失活しやすいという欠
点がある。

もし、失活した菌体のメタン酸化能を回復させることが
できれば、菌体を繰返し使用でき、生産コストの低減を
図ることができる。現在までに失活した菌体のメタン酸
化能の回復は炭素源と酸素の供給により認められている
ものの、十分ではない（米国特許筒４，３４８，４７６
号明細書）。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、失活した菌体のメタン酸化能を十
分に回復させ、繰返し菌体を使用することを目的として
鋭意検討した結果、失活した菌体を特定の物質を添加し
た再生液で再生操作を行なうことにより、メタン酸化能
を回復させる方法を見出し、本発明を完成するに至った
。

すなわち本発明は、メタン酸化能を部分的または完全に
失なったメタン資化性菌のメタン酸化能を回復させるに
あた・す、メタン、メタノールおよびホルムアルデヒド
の中の少なくとも１種の物質を含む再生液に窒素源、硫
黄源および酸素を供給しながら該メタン資化性菌を培養
することを特徴とする失活菌体の再生方法を提供するも
のである。

メタン資化性菌を利用した酸化反応は、一般に原料を電
子供与体の存在下に、メタン資化性菌と接触させること
により行なわれる。

本発明に使用できるメタン資化性菌としては、たとえば
メチロコッカス・カプスラツスＭｅｔｈ　１ｏｃｏｃｃ
ｕｓΩ匹虹Ｉ閃）　Ｎ　ＣＩ　Ｂ　１１１３２などのメ
チロコッカス属細菌、メチロモナス・アジレＭｅｔｈ　
ｌｏｍｏｎａｓ■１ｌｅ）ＮＣＩＢ　１１１２（などの
メチロモナス属細菌、メチロモナス・トリコスポリウム
（Ｍｅｔｈ　１ｏｓｉｎｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｓ　ｏｒｉ
ｕｍ）ＮＣＩＢ　１１１３１などのメチロシヌス属細菌
、メチロシスチス・パルバム（Ｍｅｔｈ　Ｉｏｃ　５ｔ
ｉｓ　７ＮＣＩＢ１１１２９などのメチロシスチス属細
菌、メチロバクター・カプスラタ（Ｍｅｔｈ　１ｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｊμ凹１ｕ）ＮＣＩＢ１１１２８などのメチ
ロバクター属細菌などを挙げることができる。

上記メタン資化性菌を培養するために用いる培地として
は該細菌が十分に増殖しうるちのであればよく、通常は
炭素源としてメタン、メタノールなどを用いる。また、
窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸
アンモニウムなど常用のものを使用すればよい。その他
にリン酸、カルシウム塩、マグネシウム塩および微量の
無機塩（第２銅塩、第１鉄塩、コバルト塩など）等を適
宜加える。好適な培地としてホイツテンベリー等の培地
Ｕ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋　６Ｌ　２０
５〜２０８頁、１９７０年）がある。培地を入れた培養
容器の空間はメタンと酸素含有ガス（空気など）との混
合ガスにて置換し、該ガスと接触している培地にメタン
資化性菌を接種する。

本発明に用いるメタン資化性菌は好気性細菌であり、そ
の培養は２０〜５０°Ｃにて好気的条件下に回分培養も
しくは連続培養を行なえばよい。

培養物はそのまま後記する原料の酸化反応に使用するこ
とができるが、遠心分離等の操作により固液分離して得
た微生物菌体を用いることもできる。そのほか、微生物
菌体を常法により固定化したもの等を使用することもで
きる。

上記メタン資化性菌を原料と接触させるにあたり、電子
供与体を存在させることが必要である。

ここで電子供与体としてはメチルアルコール、エチルア
ルコールなどの低級アルコール；ホルムアルデヒド、ア
セトアルデヒド、プロピオンアルデヒドなどの低級アル
デヒド；ギ酸もしくはギ酸ナトリウムなどのギ酸塩類；
水素、ＮＡＤＨ２；Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈｚ、メタンなど
がある。これらは単独であるいは組合せて用いる。

次に、原料としてはアルカン、アルケン、環状化合物お
よびその誘導体（例えばハロゲン、ニトロ、アミノ置換
体、アルコール、エーテル、エステル）などがあげられ
る。

上記原料と前記メタン資化性菌を接触させる酸化反応は
、電子供与体の存在下で行なえばよく、反応温度や反応
時間は原料やメタン資化性菌等の種類を考慮して、目的
とする酸化反応が十分に行なわれるように設定すればよ
い。

この酸化反応によって、エポキサイド、アルコール、ア
ルデヒド、Ｓ−オキサイド、Ｎ−オキサネトなどが生成
する。

以上のような酸化反応に用いられたメタン資化性菌は繰
返し使用すると、メタン酸化能を部分的または完全に失
なって失活菌体となる。そのため、このままでは該菌体
を再度酸化反応に用いることはできない。メタン酸化能
失活菌体を再生するには、メタン酸化能を失活した菌体
を炭素源、窒素源、硫黄源および酸素を供給しながら再
生操作を行なえばよい。ここで用いる炭素源としてはメ
タン、メタノールおよびホルムアルデヒドがあり、これ
らの１種または２種以上を用いる。メタノールまたはホ
ルムアルデヒドの添加量は１０〜６００ｎ　ｍｏ１／分
・ｌｎｇ菌体、好ましくは３０〜４００ｎ　ｍｏｌ／分
・■菌体である。メタノールまたはホルムアルデヒドは
一時的に加える方法と連続して供給する方法があるが、
−時的に多量加えると１．メタノール、ホルムアルデヒ
ドの毒性が現われて再生しない場合があり、適当量を連
続的に供給する方法が好ましい。メタノールまたはホル
ムアルデヒドを連続的に供給する場合、１０ｎ　ｍｏｌ
／分・■菌体以下でも再生されるが、再生に時間がかか
る。一方、６００ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体以上供給する
と、メタノールまたはホルムアルデヒドが完全に消費さ
れず蓄積して再生が停止する場合がある。また、メタン
資化性菌は好気性細菌であるので、メタン−空気混合ガ
スを用いる。この場合のメタン供給量はｌ　Ｏｎ　ｍｏ
ｌ／分−ｆｆ１ｇ菌体以上、好ましくは３０ｎ　ｍｏｌ
／分・■菌体以上である。メタンと空気の容量比につい
て特に制限はないが、酸素が極端に不足すると再生が遅
れ、酸素が全くない状態では再生しない。メタンを大過
剰に供給しても、再生を阻害することはないが、菌体−
は必要以上のメタンを消費せず無駄となる。３０ｎ　ｍ
ｏｌ／分・■菌体のメタンが消費できるに充分なメタン
供給速度、メタン−空気混合比を用いればよい。次に、
窒素源としてはガス状窒素、硝酸、硝酸カリウム、硝酸
ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペ
プトン、カザミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギ
ンなど無機、有機窒素源をあげることができ、その添加
量は１　ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体以上、好ましくは２〜
５００ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体である。添加量が少ない
場合には再生が遅れる。過剰に加えてもそれ以上の効果
はなく、逆に再生を阻害する場合もある。

硫黄源としては硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸
ナトリウム、硫化ナトリウム、ハイドロサルファイド、
水硫化ソーダなどをあげることができ、その添加量は０
．０２　ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体、好ましくは０．１〜
１５０ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体である。添加量が少ない
場合には再生が遅れ、過剰に加えてもそれ以上の効果は
ない。これら成分の供給方法は上記のように一定時間あ
たりに一定の割合で連続供給することもできるが、数時
間骨を再生操作開始時あるいは途中にまとめて一時的に
添加してもよい。−時的に添加する場合には、上記連続
供給する場合の添加量に見合った量を加えればよい。再
生操作はメタン資化性菌が好気性細菌であるので２０〜
５０°Ｃにて好気的条件で振とう培養すればよい。再生
温度は菌株により異なるが、少なくとも菌体が生育する
温度範囲であれば充分に再生することができる。再生に
必要な時間は菌体の失活程度、炭素源、窒素源、硫黄源
、酸素の供給量、温度、菌株により異なるが、通常２０
分以上、好ましくは３０〜７２０分間振とうすればよい
。再生操作を長時間行なってもそれ以上の効果がない。

炭素源、窒素源、硫黄源を充分量以上に供給すると再生
と同時に菌体が増殖する。そのため、再生と菌体増殖の
二つの目的で本発明を用いることもできる。このように
して再生したメタン資化性菌は十分なメタン酸化能を有
しているので、前記した酸化反応に再び用いることがで
きる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により説明する。

なお、メタン資化性菌の培養は、以下に示す方法で行な
った。

第１表に示す培地８１を１０ｊ２容のジャーファーメン
タ−に仕込み、１２０°Ｃで２０分間殺菌した後、冷却
した。ここに、第２表に示す培地８５戚を１２０°Ｃで
２０分間殺菌したものを加えた。

玉上表 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　１．０ｇ硝酸カリ
ウム　　　　　　　　　　　１．０ｇ塩化カルシウム　
　　　　　　　　　５０■ＮａＭｏ０ａ　　　　　　　
　　　　　　　１ｍｇＦｅ５Ｏａ・ＩＨｚＯ５００ｕｇ ＺｎＳＯ４’７Ｈｚ０　　　　　　　４００μｇＨ，Ｂ
Ｏ，’　　　１５μｇ Ｉ」二しコ」Ｌぎ） ＣＯＣｆｚ・　６Ｈｚ０　　　　　　　　　　　　５０
ｕｇＭｎＣ１ｚ・　４ＨｚＯ２０ａｇ ＮｉＣ／！ｚ・　６　Ｈ２Ｏ１０ｉｇ ＣｕＳＯｓ・　５Ｈｚ０　　　　　　　　　　　２００
　μｇＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５０ｉｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　１ｆ
ｆｉ華主表 Ｎａ、ＨＰＯａ−１２Ｈ，０４３ｇ ＫＨ２Ｐ０．　　　　　　　　　　　１５．６ｇＦ　ｅ
−ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　２４　Ｑｍｇ蒸留水　
　　　　　　　　　　　　　　１ｉ（ｐＨ６，８） 次に、第１表に示す培地５０１ｄを５００戚容のマイヤ
ーフラスコに入れたものを８本用意し、１２０°Ｃで２
０分間殺菌した後、第２表に示す培地を１２０°Ｃで２
０分間殺菌したものを０．５ｄ加え、ここにメタン資化
性菌を１白金耳接種した。ここにメタン５０ｒＩ１１を
加えた後、ゴム栓で密栓し、３０〜４５°Ｃで３日間振
とう培養した。培養終了後のフラスコ培養液８本分を種
菌とし、これを前記ジャーファーメンタ−に無菌的に仕
込み、メタン−空気混合ガス（メタン：空気＝１：４）
を毎分４１の割合で供給し、３日間培養した。菌濃度が
１．５■／ｄに達した後、第１表および第２表に示した
培地を１００：１．５の割合で混合した培地にさらにＣ
ｕＳＯ４・５ＨｚＯを１ｍｇ／ｆの割合で加えた培地を
無菌フィルターで除菌しながら１．６１！、／時間の割
合で供給して連続的に培養した。

実施例１〜５および比較例１ メタン資化性菌の培養方法に従って連続培養したメチロ
コッカス・カプスラツスＭＣＩＢ　１１１３２の培養液
２１を遠心分離して菌体を集めた。

集めた菌体を第３表に示す反応再生液に菌濃度３■／−
となるように懸濁し、この懸濁液４００ｄをｌｉ、容の
ジャーファーメンタ−に仕込んだ後、４５℃に昇温した
。次いで、空気を毎分２００ｄの割合で通気しながら、
メタノールを１０ｍＭの濃度になるように一時添加した
。さらに、メタン資化性菌のメタン酸化酵素の自殺基質
であるアセチレンを２ｍｌ／毎分の速度で１分間供給し
、メタン酸化活性を失活せしめた。１０分後に反応液中
の菌体の活性を測定した後、空気を毎分２００ｄ割合で
供給しながらメタノールを第４表に示す速度で供給し、
毎分９００回転で攪拌した。２４０分後にジャーファー
メンタ−内の菌体の活性を測定した。なお、再生操作中
はＩＭの硝酸およびＩＭの苛性カリで培養液のｐＨを７
に維持した。この結果を第４表に示す。

３　　　　　　　、・　　　　ン　） 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　１．０ｇ硝酸カリ
ウム　　　　　　　　　　　１．０ｇ塩化カルシウム　
　　　　　　　　１００■ＮａＭ００４　　　　　　　
　　　　　　ｌＩＩ１ｇＦｅｓＯ４・７ＨｚＯ５００ｉ
ｇ ＺｎＳＯａ”７Ｈｚ０　　　　　　　４００ｉｇＨ，Ｂ
０．　　　　　　　　　　　　　１５ｉｇＣｏＣ１！、
ｚ・６ＨｚＯ５０ｕｇ ＭｎＣｆｆｉｚ・４ＨｚＯ２０１ｉｇ Ｎ　ｉ　Ｃｊ２　ｚ・６Ｈ，０１０ｉｇ３ＪＬ０Ｌ［と Ｃｕ　Ｓ　Ｏａ　・５　Ｈｚ　０　　　　　　　　１５
００　ｕ　ｇＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　
　２５０ｉｇＮａｚＨＰ０４・１２Ｈｚ　　Ｏ６４５ｍ
ｇＫＨｚＰＯａ　　　　　　　　　　　　　　２３４ｍ
ｇＦｅ−ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　３，５ｍ
ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　１１（ｐＨ６
，８） 表より明らかなように、メタノールは１０ｎ　ｍｏｌ／
分・■菌体以上の割合で供給すればよい、また、メタノ
ールを４００ｎ　ｍｏｌ／分・■凹体を超えて供給して
も相応する効果が得られず、コスト高となる。

なお、菌体の活性の測定は以下に示す方法で行なった。

菌体を０．５ｍｇ／ＩＩｄｌの濃度になるように５ｍＭ
パイプスバッファーに懸濁したちのｌＩｄを７戚容のマ
イヤーフラスコに入れ、ここにプロピレン２ｄを加えて
ゴム栓で密栓後、４５°Ｃで３０秒間培養した。次いで
、メタノールを１ｍＭとなるように加え、さらに３分間
培養した後、ガスクロマトグラフィーにて生成したプロ
ピレンオキサイドの量を定量し、菌体１ｍｇあたり１分
間に生成したプロピレンオキサイドの量で示した。

実施例６〜９および比較例２ メタン資化性菌の培養方法に従って連続培養したメチロ
コッカス・カプスラツスＮＣＩＢ　１１１３２を、菌濃
度を０．５■／戚としたこと以外は実施例１と同様の方
法で培養した後、アセチレンでメタン酸化活性を失活さ
せた。１０分後にジャーファーメンタ−中の培養液１Ｏ
Ｉ１１を１００ｄ容のマイヤーフラスコに移し、ここに
メタノールを第５表に示す濃度となるように添加して綿
栓をし、４５°Ｃで毎分２００回転の割合で振とうした
。２４０分後にこの菌体の活性を測定した。この結果を
第５表に示す。なお、アセチレン添加前の活性は３４６
ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体、アセチレン添加１０分後の活
性はＯｎｍｏｌ／分・■菌体であった。

実施例１０〜１５および比較例３ 実施例１において、アセチレンを０．５７１分の速度で
１分間供給したことおよび１０分後にメタノールの代り
にメタン−空気混合ガスを２００ｍ１１分の割合で供給
したこと以外は、同様の操作を行なった。この結果を第
６表に示す。

なお、メタン−空気比について特に制限はないが、表よ
り明らかなように、酸素が極端に不足すると、メタン資
化性菌の再生が遅れ、酸素が全くない状態では再生しな
い。

実施例１６〜２０ 実施例１において、メタノールの代りにホルムアルデヒ
ドを第７裏に示す割合で供給したこと以外は、実施例１
と同様の操作を行ない１４０分後に菌体の活性を測定し
た。この結果を第７表に示す。

表から明らかなように、ホルムアルデヒドを４００ｎｍ
ｏｌ／分・■菌体以上供給すると、ホルムアルデヒドの
毒性のためにメタン資化性菌は再生しにくくなる。

比較例４ 実施例１８において、ホルムアルデヒドの代すにギ酸カ
リウム１００１００ｎ／分・■菌体を供給したこと以外
は、実施例１８と同様の操作を行なった。その結果、ア
セチレン添加前の活性は３８７ｎ　ｍｏ＋／分・ｍｇ菌
体、アセチレン添加後１０分の活性は８ｎｍｏｌ／分・
■菌体、ギ酸カリウム供給後１４０分の活性は２４ｎｍ
ｏｌ／分・ｌｌ１ｇ菌体であった。

実施例２１〜２４ 実施例３において、第３表に示した反応再生液の硝酸カ
リウムの代りに第８表に示す窒素源を用いたことおよび
再生操作中のｐ　ＩＩ　ｌｌ整をＩＭの塩酸およびＬＭ
の苛性カリで行なったこと以外は、実施例３と同様の操
作を行なった。この結果を第８表に示す。

１目り表。

比較例５ 実施例３において、第３表に示した反応再生液の硝酸カ
リウムの代りに塩化カリウムを用いたことおよび再生操
作中のｐＨｔｌ！整に水酸化カリウムを用いたこと以外
は、実施例３と同様の操作を行なった。その結果、アセ
チレン添加前の活性は３７２ｎｍｏｌ／分・■菌体、ア
セチレン添加後１０分の活性は９ｎｍｏ＋／分・■菌体
、メタノール供給後２４０分の活性は２４ｎ＋ｓｏｌ／
分・■菌体であった。

実施例２５〜２８および比較例６ メタン資化性菌の培養方法に従って培養したメチロコッ
カス・カプスラツスＮＣＩＩＩＩ　１１１３２の培養液
を遠心分離し、第１０表に示す塩類を含む第９表の反応
再生液で３回洗浄した後、同じ反応再生液に面濃度が３
■／ｄとなるよう懸濁した。

９　　　　　、・　　　′　） 硝酸カリウム　　　　　　　　１．０ｇ塩化カルシウム
　　　　　　１００ｍｇ塩化マグネシウム　　　　　２
００■ ＮａｚＨＰＯ４・１２Ｈｚ　０　６４５■ＫＨ，ＰＯ４
２３４■ 蒸留水　　　　　　　　　　　　Ｉｆ （ｐＨ６，８） この懸濁液４００１ｄを４００１ｄ容のジャーファーメ
ンタ−に仕込み、４５°Ｃに昇温した後、プロピレンオ
キサイド２ｎ　ｍｏｌ／４００ｒｒｄｌの割合で加え、
空気を８０ｍ１／ｗｉｎ、メタノールを３００ｎ　ｍｏ
ｌ／分・■菌体の割合で３０分間供給した。３０分後に
菌体を遠心分離し、残存するプロピレンオキサイドを除
き、再度同じ反応再生液に懸濁し、５０分後にメタノー
ル８　’Ｏｎ　ｍｏｌ／分・■菌体、空気４０Ｉｄ／分
の割合で供給すると同時に第１０表に示す硫黄化合物を
加え、さらに２４０分間撹拌した。

この結果を第１０表に示す。

実施例２９ メタン資化性菌の培養方法に従って連続培養したメチロ
コッカス・カプスラツスＮＣＩＢ　１１１３２の培養液
を第３表に示した反応再生液で菌濃度３■／ｄとなるよ
うに希釈した。この希釈液４００ｍｌ１を１ｆｆｉ容の
ジャーファーメンタ−に仕込み、４５°Ｃに昇温した後
、毎分プロピレン１５０ｍ、空気５０戚の割合で通気し
ながら、毎分９００回転の速度で攪拌した。また、プロ
ピレンの供給と同時に、メタノールを毎分３００ｎ　ｍ
ｏ！／■菌体の割合で供給した。９０分後にプロピレン
およびメタノールの供給を停止し、空気を毎分３．２１
の割合で供給して反応液中に蓄積したプロピレンオキサ
イドを追い出した。２０分後に空気の供給を停止し、メ
タン：空気＝４：ｌのメタン−空気混合ガスを毎分２０
０　ｒａｉｌの割合で供給した。２４０分後にジャーフ
ァーメンタ−内の菌体の活性を測定した。なお、再生期
間中、菌体は増殖しなかった。

この結果を第１１表に示す。

第１１表 実施例３０ メタン資化性苗の培養方法に従って連続培養したメチロ
コッカス・カプスラツスＮＣＩＢ　１１１３２の培養液
を第３表に示した反応再生液で菌濃度３■／ｍｉとなる
ように希釈した。この希釈液４００ａｔｉ！をｌＩ！、
容のジャーファーメンタ−に仕込み、３７．５°Ｃに昇
温した後、毎分１−ブテン３２０Ｊｄｌ、空気８０−の
割合で通気しながら、毎分９００回転の速度で攪拌した
。また、ｌ−ブテンの供給と同時にメタノールを毎分３
００ｎ　ｎ＋ｏｌ／■菌体の割合で供給した。１５０分
後に１−ブテンおよびメタノールの供給を停止し、反応
液を遠心分離して１．２−ブチレンオキサイドを除いた
後、これを新しく用意した第３表に示した反応再生液４
００ｄに再懸濁した。この間、遠心分離および再懸濁に
２０分を要した０次いで、毎分空気を４０ｄ、メタンを
１６０ｄの割合で供給しながら３７．５℃に保った。４
００分後にジャーファーメンタ−内の菌体の活性を調べ
た。なお、再生期間中、菌体は増殖しなかった。この結
果を第１２表に示す。

第１２表 実施例３１〜３４ ホイッテンベリー等の方法Ｕ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、。

■、２０５〜２０８．１９７０）により調製した培地５
０戚を、５００ｄ容のマイヤーフラスコに入れたものを
４本用意し、１２０°Ｃで１５分間加圧滅菌した。

冷却後、気相部をメタン：空気＝１：４のメタン−空気
混合ガスで置換し、次いでこれにメチロモナス・アジレ
ＮＣＩＢ　１１１２４．メチロシスチス・パルバムＮＣ
ＩＢ　１１１２９．メチロモナス・トリコスポリウムＮ
ＣＩＢ　１１１３１．メチロバクター・カプスラタＭＣ
ｌＢ１１１２８の細菌をそれぞれ接種し、３０°Ｃで３
２時間振とう培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離して集菌し、第１３表に
示す反応再生液に菌濃度１■／１１１となるように懸濁
した。この懸濁液１０ｄを２５０　ｍｌ容のマイヤーフ
ラスコに入れ、メタノールを２ｍＭ加え、さらにアセチ
レン１００μｌを加えてゴム栓で密栓し、３０゛Ｃで１
０分間振とう攪拌した後、ゴム栓を取り、空気を１１／
分の割合で１０分間フラスコ内に通気し、残存するアセ
チレンを除去した。ここにメタン１（ｉｏｄを加えてゴ
ム栓をし、３０°Ｃで２２０分間振とうした後、菌体の
活性を測定した。この結果を第１４表に示す。

１３　　　　　心　　　・′） 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　　１．０ｇ硝酸カ
リウム　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ塩化カルシ
ウム　　　　　　　　　　１００■Ｎ　ａ、ＨＰ　Ｏａ
　・１２　Ｈｚｏ　　　　　　　６４５ｍｇＫＨ，Ｐｏ
、　　　　　　　　　　　　　２３４■蒸留水　　　　
　　　、１　ｆｆｉ 実施例３５〜４１ メタン資化性菌の培養方法に従って３１″Ｃで連続培養
したメチロモナス・メタニカＮＣＩＢ　１１１３０゜メ
チロモナス・アジレＮＣＩＢ　１１１２４．メチロモナ
ス・アルバスＮＣＴＢ　１１１２．メチロシヌス・トリ
コスボリウムＮＣｒＢ　１１１３１．メチロシヌス・ス
ポリウムＮＣＩＢ　１１１２６．メチロシスチス・パル
バムＮＣｌＢ１１１２９、メチロバクター・カプスラタ
ＮＣＩＢ　１１１２８の培養液４００　ｍｌを遠心分離
して菌体を集めた。

集めた菌体を第１５表に示す反応再生液に菌濃度０．５
■／緘となるように懸濁し、この懸濁液４００ｍ１をＩ
１１容のジャーファーメンタ−に仕込んだ後、３１°Ｃ
に昇温した。次いで、毎分プロピレン１５０ｍ１．空気
１５０　ｍｌの割合で通気しながら毎分９００回転の速
度で攪拌した。また、プロピレンの供給と同時にメタノ
ールを毎分３００ｎ　ｍｏｌ／■・菌体の割合で供給し
た。３０分後にプロピレンおよびメタノールの供給を停
止し、空気を毎分５ｊ２の割合で供給して反応液中に蓄
積したプロピレンオキサイドを追い出した。２０分後に
空気の供給量を２５ｍ１まで下げ、さらにメタンを１１
０ｍ／分の割合で供給した。メタン−空気混合ガス供給
後１８０分、３００分後にジャーファーメンタ−内の菌
体の活性を測定した。この結果を第１６表に示す。

１５　　　　・　　Ｓ） 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　１．０ｇ硝酸カリ
ウム　　　　　　　　　　　１．０ｇ塩化カルシウム　
　　　　　　　　　５０■Ｎ　ａ　Ｍｏ（Ｌ　　　　　
　　　　　　　　　１　ｕＦｅＳＯａ’７ＨｚＯ５００
μｇ ＺｎＳＯａ・７ＨｚＯ４００ｕｇ Ｈ，Ｂｏ、　　　　　　　　　　　　　　１５μｇＣａ
　Ｃｌ　ｚ・６　Ｈ，０５０μｇ ＭｎＣ１ｔ’４ＨｚＯ２０μｇ ＮｉＣｊ！、・６　Ｈ２Ｏ１０μｇ ＣｕＳＯｎ・５ＨｚＯ５００μｇ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　２５０μｇＮａｚ
ＨＰＯａ　　・１２Ｈｚ０　　　　６４５ｍｇＫＨ，Ｐ
ｏ、　　　　　　　　　　　　２３４■Ｆｅ−ＥＤＴＡ
　　　　　　　　　　　３．６ｍｇ蒸留水　　　　　　
１１ （ｐＨ６，８） 実施例４２〜４７．比較例７ メタン資化性菌の培養方法に従って４５°Ｃで連続培養
したメチロコッカス・カプスラツスＮＣｌＢ１１１３２
の培養液に第１５表に示す反応再生液を加え、菌濃度を
０．３■／ｄとしたのち、１１容のジャーファーメンタ
−に５００ｄ仕込んだ。４５°Ｃに昇温した後、メタン
１１０ｄ／分、空気５０ｄを流しながら１成のアセチレ
ンを一時添加し、メタン酸化能を失活せしめた。

１０分後に菌体を遠心分離し、第１７表に示す反応再生
液で菌体を３回洗浄した。その後、同じ反応再生液に菌
体を懸濁し、菌濃度を１．４５■／　ｍｌとした後、各
１０ｍを２５０１ｄ容のマイヤーフラスコに入れた。

次いで、種々の濃度となるように硝酸カリウムを加え密
栓後、メタン５０戚を加え４５°Ｃ１８０回転／分の割
合で振とう攪拌した。

３時間後に菌体の活性を調べた。結果を第１８表に示す
ヶ ぶ」二し聚 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　　１ｇ塩化マグネ
シウム・６水塩　　　２０３■塩化カルシウム　　　　
　　　　　５ｏ■ＮａＭｏＯ４１ｍｇ Ｆｅｃｌｚ・６ＨｔＯ５００ｔｔｇ ＺｎＣｊ！ｚ　　　　　　　　　　　　２００μｇＨｓ
Ｂ　Ｏａ　　　　　　　　　　　　　１５　ｕ　ｇＣｏ
Ｃｌｚ・６Ｈ，０５０ｕｇ ＭｎＣ１，ｚ・４ＨｚＯ２０ｕｇ Ｎｉ（１，・６Ｈ２０１０１１ｇ Ｃ１０１ｌ・２ＨｚＯ３４０＃ｇ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　２５０ｕｇＮａｚＨ
ＰＯ，・１２Ｈｚ０　　　６４５■ＫＨ，Ｐｏ、　　　
　　　　　　　　２３４■Ｆｅ−ＥＤＴＡ　　　　　　
　　　　＞、６ｍｇ蒸留水　　　　　　ＩＩ！。

第１８表 なお、アセチレン添加前の菌体の活性は５７８ｎ　ｍｏ
ｌ／分・■菌体であった。

実施例４８〜５３．比較例８ 実施例４２〜４７において、第１７表中の硫酸マグネシ
ウム・７水塩の代りに硝酸カリウム１ｇ／２を加えたこ
と、第１８表において硝酸カリウムの代りに種々の濃度
の硫酸マグネシウム・７水塩を加えたこと以外は同様の
方法で実験を行なった。結果を第１９表に示す。

第１９表 実施例５４〜５９．比較例９ メタン資化性菌の培養方法において、培地中の硫酸マグ
ネシウム・７水塩の濃度を７　ｇ／ｌとし、３１”Ｃで
メチロシスチス・パルバム　ＮＣＩＢ　１１１２９を培
養した。

菌体培養液５００ｍ（菌濃度０．４９■／ｍ）を１！容
のジャーファーメンタ−に入れ、３３°Ｃに昇温した後
、毎分プロピレン１５０ｄ、空気１５〇−の割合で毎分
９００回転の速度で攪拌した。また、プロピレンの供給
と同時にメタノールを毎分３００ｎ　ｍｏｌ／■菌体の
割合で供給した。３０分後にプロピレンおよびメタノー
ルの供給を停止し、空気を毎分５２の割合で供給して反
応液中に蓄積したプロピレンオキサイドを追い出した。

次いで、菌体を遠心分離し、第１７表に示した反応再生
液から硫酸マグネシウム・７水塩を除いた液で４回フラ
スコに入れた。このフラスコに種々の濃度となるように
硫酸マグネシウム・７水塩を加え、ゴム栓で密栓後、メ
タン５０ｄを添加し、３０°Ｃ１８０回転／分の割合で
振とうした。

振とう開始３００分後に菌体の活性を調べた。

結果を第２０表に示す。

第２０表 実施例５４　　　　１．０　　　　　　　４３２実施例
５５　　　　３．５　　　　　　　４２８実施例５６　
　　　７．０　　　　　　　４０３実施例５７　　　１
６．０　　　　　　　４６１実施例５８　　　３０．０
　　　　　　　３２６実施例５９　　　４０．０　　　
　　　　２８２比較例９　　　０　　　　　　　　６８
なお、プロピレン供給後３０分の水中のプロピレンオキ
サイドは２．２ｍＭ、プロピレン供給前の菌体の活性は
４４９ｎ　ｍｏｌ／分・ｌｌ１ｇ菌体、遠心分離、洗浄
後の菌体の活性は１４２ｎ　ｍｏｌ／分・■菌体であっ
た。

〔発明の効果］ 本発明によれば、メタン酸化酵素を失活した菌体を再生
させることができ、この菌体を繰り返し生産工程に用い
ることができるため、安価に目的とする酸化物を生産す
ることができる。

従って、本発明は化学工業、医薬、農薬、廃水処理など
の分野に有用なものである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）メタン酸化能を部分的または完全に失なったメタ
   ン資化性菌のメタン酸化能を回復させるにあたり、メタ
   ン、メタノールおよびホルムアルデヒドの中の少なくと
   も１種の物質を含む再生液に窒素源、硫黄源および酸素
   を供給しながら該メタン資化性菌を再生することを特徴
   とする失活菌体の再生方法。
2. （２）メタン資化性菌がメチロコッカス属、メチロモナ
   ス属、メチロシヌス属、メチロシスチス属およびメチロ
   バクター属の中のいずれかに属するものである特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）窒素源が窒素ガス、硝酸、硝酸塩、アンモニア、
   アンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、Ｌ−グルタミ
   ンおよびＬ−アスパラギンの中のいずれかである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）硫黄源が硫酸、硫酸塩、硫化ナトリウム、ハイド
   ロサルファイドおよび水硫化ソーダの中のいずれかであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。