JPS5847496A - ヒドロキノンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、メチロ栄養性微生物を使って、ベンゼンから
ヒドロキノンを製造する為の微生物学的変換方法に関す
る。

メチロ栄養性（Ｍｅｔｈｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）微生物は
メタン資化性微生物であり、これは炭素とエネルギーと
の源として、単炭素化合物を使うことができる。

これらの微生物は、６種類にわけられる。第１番目のタ
イプは、エネルギーと炭素との源としての単炭素化合物
でのみ増殖する偏性メチロ栄養性微生物からなる。第２
のタイプは単炭素化合物で増殖する、しかし、例えばグ
ルコースの様な他の有機化合物でも増殖可能な条件メチ
ロ栄養筒である。

一方、第６のタイプは特定のメタン資化性酵母である。

偏性メチロ栄養筒はその形態学と、利用同化経路のタイ
プに基いて、２つのタイプに分類することができる。タ
イプＩ微生物（メチロモナスとメチロコッカス種を含む
）は細胞中に膜が分散してオリ、ヘキスロースモノホス
フェイト同化経路を使う。この群に含まれるのはメチロ
コッカス、キャプスレータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　、　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ　）、メチロモナスア
ルバス（Ｍｅｔｈｌｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｉｃａ
）及びメチロモナスアルバス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａ
ｓ　ａｌｂｕｓ）である。

タイプ■微生物、例えばメチロシナス種は、膜が細胞内
の周辺に配列されており、セリン経路からの炭素を同化
する。このタイプの一例として、メチロシナストリコス
ポリウムがある。

これら全ての種の菌に存在する、メタンモノオキシゲナ
ーゼ酵素はメタンが初期酸化してメタノールになる為の
原因となる。この酵素は、アルカン、アルケン及び種々
の芳香族の混合物を含め様々の炭化水素基体中へ酸素原
子を挿入できることが示されてもいる。従来これらの微
生物は、この目的の為に唯一のエネルギー源としてのメ
タンで培養されてきた。そしてこの生物学的変換反応を
観察すると、一般的に基体分子中に単一の酸素原子が挿
入されている。例えば、英国特許第２０２４２０５Ａ号
出願には、メタン含有雰囲気中で増殖するメチロシナス
トリコスポリウム細胞を使う多数の生物学的変換反応が
記載されている。

特に、フェノール生成のためのベンゼン酸化が記載され
ており、カテコールと１．４−ジヒドロキシはンゼン（
ヒドロキノン）との混合物を生成するためのフェノール
酸化も記載されている。

今や驚くべきことには、該微生物を唯一のエネルギー・
炭素源としてのメタノールで増殖し、使用するとベンゼ
ンを単一工程で直接かつあざやかに酸化してヒト８０キ
ノンを唯一の生成物として得られることが発見された。

ヒドロキノン（１，４−ジヒドロキシベンゼン）は写真
業界で還元剤、展開剤としての特殊用途を特つ価値ある
生成物である。

従って、本発明によりベンゼンからヒドロキノンを製造
するための単一工程微生物学的変換法が提供される。特
に、本発明により、々ンゼンを、唯一のエネルギー・炭
素源としてのメタノールで増殖したメチロ栄養性微生物
の細胞又は酸化酵素系を含むその製剤又はエキスと接触
させ、生成ヒドロキノンを回収することからなるヒドロ
キノン製造法が提供される。

本方法での使用に特に適当な微生物はスコツトランド゛
のアバーディーン（Ａｂθｒｄｅｅｎ　）のトリー・リ
サーチ・ステーショｙ　（Ｔｏｒｒｙ’　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ　）の国立産業用微生物寄託機関
（ＮＣＩＢ）にＮＣｌＢ１１１３１として寄託されてい
る既知菌株メチロシナス　トリコスポリウム０Ｂ３ｂで
ある。

従って、本発明により、液体メタノールが唯一の炭素・
エネルギー源として加えられている培地での培養により
唯一のエネルギー・炭素源としてのメタノールでの増殖
に適合した菌株メチロシナス　トリコスポリウム０Ｂ３
ｂからの菌も提供される。

本発明の方法での使用前に該メチロ栄養性微生物は炭素
源としてのメタノールを使って増殖しなければならない
。

メタノールでの微生物増殖には大規模即ち産業的利用に
とって多数の利点がある。例えば、メタノールガスの使
用に関連した危険と困難が避けられる。即ち、メタノー
ルは含め易く、かつ火災の危険が少ない。更に、培養液
中のメタノールの濃度のモニターが、例えば気・液クロ
マトグラフイーという標準の分析技術を使うことにより
簡単であり、又、メタノールは液体栄養培地に完全に溶
けるので増殖細胞との接触がはるかに良い。該微生物は
バッチ条件でも連続条件でも増殖でき、これら条件及び
それにとって適当な可能な変更条件は当業者に良く知ら
れている。

微生物生長のための商業的方法では段階を追って進める
ｊことが一般に必要である。これら段階はプロセスの性
質、規模微生物の特性に依存して多くても少なくてもよ
い。普通、生長は、フラスコに普通食まれている滅菌栄
養培地中に細胞を接種することにより開始する。フラス
コ中では微生物の増殖は様々な手段、例えば、適温維持
、完全通気のための振とうにより促進される。この工程
は、より多量の栄養培地を含むフラスコや容器中で１回
以上くり返すことができる。最後の発育工程からの微生
物（培地は付随していてもいなくてもよい）を大規模発
酵機に導入して所望量の微生物を生成する。微生物を最
大収率で得るためには培養、発酵中の条件を注意深くコ
ントロールする必要がある。２５〜３５℃の温度を一般
に用い、２８〜３０℃の温度が好ましい。ｐＨも６．０
〜７５、好ましくは６．６〜Ｚ２に注意深くコントロー
ルする。、ｐｔ（６，８が最適である。ｐＨは硝酸添加
でコントロールすると便利であり、ｐＨ調節器を使って
行うのが最も便利である。微生物発育に使う培地は硝酸
塩、リン酸塩、硫酸塩及びＣａ、　Ｆｅ　（そのエチレ
ンジアミン四酢酸錯体としての）等の微量元素を含み、
使用前り滅菌する。培地の酸素源は一般に空気である。

増殖に必要なメタノールは発酵中にわけてか連続して直
接加える。培地のメタノールの容量濃度が２％を越えな
い様にするのが最良である。培養後の細胞を後の対数相
中に収集する。これは標準技術、例えば凝集、沈殿又は
遠心分離により達成でき、ついで細胞を水で洗う。別法
として液を生物学的変換に直接使用できるが、この場合
には発酵を続けてメタノールの全てを使用前に消費して
しまう。連続培養では微生物を適当な発酵容器、例えば
、内部か外部の再循環式冷却用ルーズの備わった攪拌型
仕切板付き発酵機中で増殖できる。新鮮な培地とメタノ
ールを培地に連続ポンプ注入し、培地と細胞密度が一定
のままである様な速度で培地を除く。

更に驚くべきことには、メタノールで増殖する細胞は酵
素であるメタンモノオキシゲナーゼ（初期酸化攻撃でメ
タンをメタノールに転化する原因である）を必要としな
いとしても、この酵素は生成され、高活性体として存在
する。これが以後のはンゼン生物学的転換の達成を可能
にする原因と考えられる。但し、関与する酵素系の性質
は十分には理解されていない。

本発明の方法では全細胞の浮遊液を使うと最も便利だが
、該酸化酵素系を含む破砕細胞や部分的に精製された粗
エキスや無細胞粒子を使うことも可能である。更に、不
動化細胞製剤や不動化酵素エキスをつくるための様々な
方法が記載されている。例えば、細胞又は酵素を不溶性
多糖類マトリックス中に固定している。これらの可能性
、その達成方法、条件は当業者に良く知られている。

本発明の方法を実施するためにはベンゼンを前述の如く
即ち、酸化酵素系を含むエキスやその製剤を使ってメタ
ノールで増殖した微生物の全細胞の培養物と接触させ、
生物学的転換が完了する迄混合物を培養する。ついでハ
イド“ロキノンを常法で回収する。

典型的な生物学的転換法では、前詠の如くメタノールで
増殖することにより調１製したメチロシナストリコスポ
リウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ）ＯＢ３ｂの細胞を含む粗発酵液にばンゼン
を加える。

最良の結果を得るには５〜６０９／ｌの細胞を含む液が
好ましく、特には１０〜２０１乾燥細胞１ｔの細胞密度
の液が好ましい。ベンゼンは一般に０．１〜１０ｍ／／
ｌ（液）の割合で加える。混合物を２５〜６５℃、好ま
しくは２８〜３０℃で培養する。培養物のｐＨは６．８
〜７２に維持する。ｐＨ７，’ｏが理想である。これら
条件下で生物学的転換は急速に進み、細胞存在量、はン
ゼン添加量に依存して２〜５時間以内に実質上完了する
。反応の進行はガスクロマトグラフィーでモニターでき
、ベンゼン全量がハイドロキノンに転化した時に工程を
停止する。生成ハイピロキノンを常法、例えば水非混和
性溶媒を使っての溶媒抽出で回収する。酢酸エチルが適
当な溶媒である。抽出液の乾燥、蒸発によりハイドロキ
ノンを高純度状態で生成する。

一定量の細胞で酸化されうるインゼン量には限りがある
が、例えばギ酸ナトリウム、ホルムアルデヒド又はメタ
ノールを使って電子源を加えることにより細胞の酸化力
を増したり再生することが可能である。生物学的転換中
に電子源を加えるか、使用済細胞を別工程で、例えば被
分離細胞をギ酸ナトリウム溶液中に一夜浮遊することに
より再生できる。かくて細胞を生物学的転換で数度再使
用できる。

別法として、ベンゼンを細胞培地へ連続添加し、生成キ
ノンをコンスタントに除く連続法も使用でキル。ｐＨ％
の他の工程パラメータの適当なモニターが必要であり、
細胞を必要に応じて補充して生培地を維持するが、これ
ら要件は当業者の常識である。

以下の実施例はメタノールでのメチロ栄養性微生物の増
殖、ベンゼンからヒドロキノンを製造する方法でのそれ
らの使用の例示である。

実施例　１゜ （１）　　培地 Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙ等著”Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂＬｏｌ、”６１．２０５〜２１８頁（１９７０年
）記載の方法により培養培地を作った。溶液を次の如く
して作った。

（ａ）微量元素溶液 Ｎ　ａ　２　Ｅ　ＤＴ　Ａ　　　　　５００　ｍ９Ｆｅ
Ｓ○４−７Ｈ２０２００ｑ ｚｎｓｏ４−７Ｈ２０１（Ｃｖ ＭｎＣ１□・４Ｈ２０３ｍｙ Ｈ３ＢＯ３６０■ ＣｏＣ１□・６Ｈ２０２０１１ｖ ｃｕｃ１□、　２Ｈ２０１ｗｑ ＮｔＣ１□・６Ｈ２０２■ ＮａＭｏ　Ｏ，ａ　・２Ｈ２０３”？ 蒸留水　　　残 　ｔ （ｂ）　　ＦｅＥＤＴＡ溶液 ＦｅＥＤＴＡ　　　　８　？ 蒸留水　　　　残 　ｔ （Ｃ）　　リン酸塩緩衝液 Ｎａ２ＨＰＯ４４９，７ｙ ＫＨ２ＰＯ４３９，Ｏｆ 蒸留水　　　　残 １　を 上記成分を蒸留水に溶かして最終容量５０ｔとし、１２
１℃１５分でオートクレーブ滅菌した。

ＣａＣ１゜・２Ｈ２０２０り ＫＮＯ１００Ｆ 晩ＳＯ４・７Ｈ２０１００７ Ｈ２Ｏ１００溶液　　　　　　５〇− 微量元素溶液　　　　　　５〇− 消泡剤ウコン（Ｕｃｏｎ）　　　５ｍ／上記滅菌培地を
冷却後に５００−のＡＲメタノール（孔径、が０，４５
ミクロンのフィルターでの濾過により滅菌）と１ｔの滅
菌リン酸塩緩衝液を無菌添加した。

（２）接種物 ５　ｍｌの凍結メチロシナーストリコスポリウム（Ｍｏ
−ｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ
）　０Ｂ３ｂ培養菌を、１００−の上記培地を含む滅菌
３００ｍｇ三角フラスコに接種した。回転振とう機（２
２０ｒｐｍ　）で７２時間２８℃で培養した。この培養
物の１０ｍアリコートを使って、１００−の上記培地を
含む６０〇−三角フラスコに接種した。回転振と５機（
２２０ｒｐｍ）で２８℃で４８時間培養した。つ℃・で
各フラスコの内容物を使って、１ｔの上記媒地を含ｔｒ
２．８Ｌ　Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコに接種した。これ
らフラスコを回転振とう機（２２０ｒｐｍ）で４８時間
２８℃で培養した。

（３）発酵 前原の如くして調製した５０ｔの培地を含む７５を発酵
機に、前述の如くして調製した５つのフエルンバツノ・
フラスコの内容物を無菌接種した。培地に２５ｔ／分の
空気を通気し、４５０　ｒｐｍで攪拌した。次組成の供
給物の自動添加により培地ｐ）ｌを６．８に維持した。

濃硝酸　　　６６０，１１／ ＦｅＥＤＴＡ溶液　　　　３８０ｍ１ 微量要素溶液　　　　６０〇− 蒸留水　　２８２０＋＋ｔ Ａ、　Ｒ，メタノール　　５８４０．＋ｔｇ上記供給物
は、メタノール（滅菌濾過し、無菌添加した）以外の全
成分を１２１℃で６０分間オートクレーブすることによ
り滅菌体で調製した。他成分を室温に冷却後に滅菌メタ
ノールを加°えた。

５６．５時間後に、次の如くして調製した硝酸溶液を該
供給物の代りに使った。

濃硝酸　　７５ｍ１ 蒸留水　　残 ００ｄ １’２１′℃で１５分間オートクレーブした。

この溶液を自動給送して培地ｐＨを６．８に維持し、こ
の間に１．７２２ｔの濾過滅菌メタノールを同時に培地
に無菌添加した。接種後８１時間培地の培養を続けたら
全メタノールが消費されていた。

１６．１９／ｌの乾燥細胞を含む５５１の培養液を得こ
れを更に処理することなくそのまま生物学的転換に使っ
た。

実施例　２゜ 実施例１（２）で述べた如くして調製した２００−の振
とうフラネコ増殖メチロシナストリコスポリウム培養菌
を３ｔの発酵容器中の２ｔの媒体〔実施例１（１）の如
くして製造。但し、ＦθＥＤＴＡと微量元素は半量とし
た〕に接種した。発酵機を７５０＋＋＋／／分で通気し
、１０００　ｒｐｍで攪拌した。温度を２８℃に維持し
、ｐＨを、次′組成の供給物の自動添加により６．８に
コントロールした。

濃硝酸　　３０．９ｄ ＦｅＥＤＴＡ溶液　　　１８．８ｄ 微量元素溶液　　　３０．０− 蒸留水　　１９５．３＋＋ｔ メタノールＡ、Ｒ，２２５ｍＡ ３２時間発酵後に２００ｍ１の滅菌メタノールを加え、
５８時間後に１００−の滅菌メタノールを追加した。通
気量を１０００　ｍｅＺ分に上げ、攪拌を１３００　ｐ
ｐｍに高めた。６９５時間後に発酵を停止した。液は１
４．Ｏｆ／ｚの乾燥細胞と０．０１％未満のメタノール
を含んでいた。

実施例　６゜ ハイドロキノンの製造 ベンゼン（２−；試薬級）を、恒温槽（Ｌ、Ｈ。

Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｒｒｇ社製）中の、’　１６．１　
ｙ／ｌのメチロシナストリコスポリウム０Ｂ３ｂの全細
胞を含む実施例１で得られた２ｔの液に１度に加えた。

“温度６０℃、　　ｐＨ６，９，攪拌速度１０１０００
ｒｐ通気量２００ＣＣ／％で２．５時間培養した。水相
の一部を取出し、酢酸エチルで抽出した。抽出物をクロ
マト分析したらヒドロキノンの存在は示されたが、ベン
ゼンやフェノールは痕跡量も存在しなかった。２−のは
ンゼンを培地に追加し、培養を更に２．５時間続けた。

ついで液を酢酸エチル（６００ｍｌ’）で抽出し、抽水
液を乾燥しくＭｇ５Ｏ４）、蒸発してピンク色固体（２
，８９）を得た。そのＮＭＲ，ＩＲのスペクトルはヒド
ロキノンの真正サンプルのものと同一だった。

ガスクロマド分析により生成物の純度は９９％より良い
ことが示された。

実施例　４゜ ヒドロキノンの製造 はンゼン（２００μｔ）を、実施例２記載通りにナタノ
ールで増殖させたＭ、　）リコスポリウム０Ｂ３ｂの全
細胞を８．８？／を含む５ｏｏｃｃの液と共に５時間、
回転振とう機で３００ｒｐｍ、３０℃で培養した。

余液を酢酸エチル（５Ｘ１００＋＋＋／りで抽出し、抽
出液を合せ、乾燥し、蒸発して１５０■のヒドロキノン
を生成した。

実施例　５゜ ヒドロキノンの製造 メタノール（１３，３ｙ／ｌ　）で増殖させたメチロシ
ナストリコスポリウム０Ｂ３ｂの全細胞培養液２〇−を
含む６０〇−振とうフラスコに２０μｚ（０，０１６ｆ
）のベンゼンを入れ、回転振とう機で４時間、３０℃で
培養した。ガスクロマド分析により、ベンゼンは残留し
ておらず、ヒドロキノンのみが存在することが示された
。余液を酢酸エチル（６ｒｎ１．）で抽出し、蒸発して
１６■のヒドロキノンを生成した。

実施例　６゜ 再生細胞を使ってのヒドロキノンの製造メタノールで増
殖させたメチロシナストリコスボＩ）　、）　Ａ　０Ｂ
３ｂ　ノ細胞ヲ１８．Ｏｙ／を含ｔｒｙ（５００−）を
回転ｉとう機で５時間、６０℃で０．５−のベンゼンと
共に培養した。細胞を遠心分取した。上澄み液の分析に
よりヒドロキノンの存在が示された。遠心分取細胞の半
分を、ギ酸す）　ＩＪウムを含む水（２５０ｙ）に再浮
遊させ、生成サスはンションを４℃で一夜攪拌した。更
に０．２５＋＋＋ｌのベンゼンと共に６０℃、５時間、
再培養して更にヒドロキノンを生成した。

上記方法は少くとも８回の再生に対して反復できた。一
方、ギ酸ナトリウムで処理しなかった細胞は２サイクル
後に活性を失った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 第１項 ヒドロキノンの製造方法において、 ベンゼンを唯一のエネルギーと炭素との源としてのメタ
   ノールで増殖したメチロ栄養性微生物の細胞あるいは、
   酸化酵素系を含むその製剤又はエキスと接触させ、生成
   ヒドロキノンを回収することからなる方法。 第２項 メチロ栄養性微生物がメチロシナス　トーリコスポリウ
   ム０Ｂ３ｂである、特許請求の範囲第１項記載の方法、
   。 第３項 ベンゼンをメチロ栄養性微生物の全細胞の浮遊液と接触
   させる、特許請求の範囲第１、又は第２項記載の方法。 第４項 浮遊液が粗発酵液である、特許請求の範囲第３項記載の
   方法。 第５項 培地を”２８〜６０℃の温度及び６．８〜７２のｐＨに
   維持する、特許請求の範囲第６又は第４項記載の方法。 竿６項 細胞密度が５〜６０２（乾燥細胞）／ｌである、特許請
   求の範囲第６〜５項の何れかの項に記載の方法。 第７項 ギ酸ナトリウム、ホルムアルデヒドあるいはメタノール
   を電子源として加える、特許請求の範囲第６〜６項の何
   れかの項に記載の方法。 第８項 生成ヒドロキノンを水非混和性有機溶媒で抽出すること
   により回収する、特許請求の範囲第１〜７項の何れかの
   項に記載の方法。 第９項 液体メタノールが唯一の炭素とエネルギーとの源として
   添加されている培地中での培養により、唯一のエネルギ
   ーと炭素との源としてのメタノールで増殖する様に適合
   された、メチロシナストリコスポリウム○Ｂ３ｂ由来細
   菌。