JPH01300888A - 失活菌体の再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は失活菌体の再生方法に関し、詳しくはメタン酸
化能を失なったメタン資化性菌を酸素およびメチオニン
誘導体を供給しながら培養することにより、メタン酸化
能を回復させる方法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする練題ボ］メ
タン資化性菌の有するメタン酸化酵素（メタンモノオキ
シゲナーゼ）は、メタンの他、アルカン、アルケン、環
状化合物、有機硫黄化合物、有機窒素化合物をも酸化し
、酸化物を与えること（共酸化）から産業上の利用価値
が高いが、酵素の安定性が悪（、失活しやすいという欠
点がある。

もし、失活した菌体のメタン酸化能を回復させることが
できれば１．菌体を繰返し使用でき、生産コストの低減
を図れる。失活した菌体のメタン酸化能の回復は炭素源
と酸素の供給により認められているものの、十分ではな
い（米国特許筒４，３４８，４７６号明細書）。

〔銖月慮を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、失活した菌体のメタン酸化能を簡
便な方法で十分に回復させ、繰返し菌体を使用すること
を目的として鋭意検討した結果、失活した菌体を酸素と
メチオニン誘導体を供給しながら再生操作を行なうこと
により、メタン酸化能を回復させる方法を見出し、本発
明を完成するに至った。

すなわち本発明は、メタン酸化能を部分的または完全に
失なったメタン資化性菌のメタン酸化能を回復させるに
あたり、酸素およびメチオニン誘導体を供給しながら該
メタン資化性菌の再生操作を行なうことを特徴とする失
活菌体の再生方法を提供するものである。

メタン資化性菌を利用した酸化反応は、一般に原料を電
子供与体の存在下に、メタン資化性菌と接触させること
により行なわれる。

本発明に使用できるメタン資化性菌としては、たとえば
メチロコッカス・カプスラツス（Ｍｅｔｈ　１ｏｃｏｃ
ｃｕｓ匹匹風旦旦）ＮＣＴＢ　１１１３２などのメチロ
コッカス属細菌、メチロモナス・アジレ（Ｍｅｔｈ　ｌ
ｏｍｏｎａｓ　」ｌＪリーＮＣＩＢ　１１１２４などの
メチロモナス属細菌、メチロモナス・トリコスボリウム
（Ｍｅｔｈ　１ｏｓｉｎｕｓ　ｔｒｔｃｈｏｓ　ｏｒｔ
ｕｌｌ）ＮＣＴＢ　１１１３１などのメチロシヌス属細
菌、メチロシスチス・パルバス（Ｍｅｔｈ　ｌｏｃ　５
ｔｉｓ　７ＮＣＩＢ１１１２９などのメチロシスチス属
細菌、メチロバクテリウム・オルガノフィラムＭｅｔｈ
　ｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｒ　ａｎｏ　ｈｉｌｕｍ）
ＡＴＣＣ２７８８６などのメチロバクテリウム属細菌な
どを挙げることができる。

上記メタン資化性菌を培養するために用いる培地として
は該細菌が十分に増殖しうるちのであればよく、通常は
炭素源としてメタン、メタノールなどを用いる。また、
窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸
アンモニウムなど常用のものを使用すればよい。その他
にリン酸、カルシウム塩、マグネシウム塩および微量の
無機塩（第２銅塩、第１鉄塩、コバルト塩など）等を適
宜加える。好適な培地としてホイツテンベリー等の培地
（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　６１．２
０５〜２０８頁。

１９７０年）がある。培地を入れた培養容器の空間はメ
タンと酸素含有ガス（空気など）との混合ガスにて置換
し、該ガスと接触している培地にメタン資化性菌を接種
する。

本発明に用いるメタン資化性菌は好気性細菌であり、そ
の培養は２０〜６０°Ｃにて好気的条件下に回分培養も
しくは連続培養を行なえばよい。

培養物はそのまま後記する原料の酸化反応に使用するこ
とができるが、遠心分離等の操作により固液分離して得
た微生物菌体を用いることもできる。さらに、リン酸緩
衝液等の適当な溶液で洗浄し、該溶液に懸濁した微生物
菌体を用いてもよい。

そのほか、微生物菌体を常法により固定化したもの等を
使用することもできる。反応槽において上記メタン資化
性菌を原料と接触させるにあたり、電子供与体を存在さ
せることが必要である。ここで電子供与体としてはメタ
ン；メチルアルコール。

エチルアルコールなどの低級アルコール；エチレングリ
コール、ｌ、４−ブタンジオールなとのα。

ω−ジオール；ホルムアルデヒドなどの低級アルデヒド
；ギ酸もしくはギ酸ナトリウムなどのギ酸塩類；水素；
　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈｚ　；　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ｈＩ　ｚな
どがある。

これらは単独であるいは組合せて用いる。

次に、原料としてはアルカン、アルケン、環状化合物お
よびその誘導体（例えばハロゲン、ニトロ、アミノ置換
体、アルコール、エーテル、エステル）などがあげられ
る。

上記原料と前記メタン資化性菌を接触させる酸化反応は
、電子供与体の存在下で行なえばよく、反応温度や反応
時間は原料やメタン資化性菌等の種類を考慮して、目的
とする酸化反応が十分に行なわれるように設定すればよ
い。

この酸化反応によって、エポキサイド、アルコール、ア
ルデヒド、Ｓ−オキサイド、Ｎ−オキサイドなどが生成
する。

以上のような酸化反応に用いられたメタン資化性菌は繰
返し使用すると、メタン酸化能を部分的または完全に失
なって失活菌体となる。そのため、このままでは該菌体
を再度酸化反応に用いることはできない。メタン酸化能
失活菌体を再生するには、メタン酸化能を失活した菌体
を酸素およびメチオニン誘導体を供給しながら再生操作
を行なえばよい。ここでメチオニン誘導体としては、次
の一般式 ％式％（１） （式中、２は０またはｌ、ｍは１〜４．およびｎは０ま
たは１を示す。）で表わされる化合物が好適である。一
般式（Ｉ）で表わされるメチオニン誘導体としては具体
的にメチオニン、β−メ千オニン、エチオニン、ホモメ
チオニン、ヘキソメチオニ７などをあげることができる
。

メチオニン誘導体は、メタン資化性菌のメタン酸化能を
失なう前あるいは失活した後に、０．０２ｎ　ｍｏｌ／
分・■菌体以上、好ましくは０．０５〜５０ｎ　ｍｏｌ
／分・ｍｇ菌体の割合で添加し、１５〜６０°Ｃにて好
気的条件下で３０〜６００分間再生操作を行なえばよい
。供給方法は、前述の如く一定の時間内に一定の割合で
連続的に供給する方法以外に一定時間分をまとめて添加
する方法がある。

このようにして再生したメタン資化性菌は、十分なメタ
ン酸化能を有しているので、前記した酸化反応に再び用
いることができる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により説明する。

なお、メタン資化性菌の培養は、以下に示す方法で行な
った。

第１表に示した培地と第２表に示した培地を１００：ｌ
の割合で混合した培地８１を１０ｆｆｉ容のジャーファ
ーメンタ−に無菌フィルターを通して仕込んだ。

卯」−表 硫酸マグネシウム・７水塩１．０ｇ 硝酸カリウム　　　　　　　　　　　　１．０ｇ塩化カ
ルシウム　　　　　　　　　　　５０＋＋＋ｇＮ　ａ　
ＭｏＯ４１ｍｇ ＦｅＳＯ４・７ＨｚＯｓｏｏμｇ ＺｎＳＯａ−７Ｈｚ０　　　　　　　４００ｕｇＨｆｆ
ＢＯ４１５ｎｇ Ｃｏ　Ｃ１ｚ−６ＨｚＯ５０ｕ　ｇ ＭｎＣｆｆｉｚ・４Ｈｚ０　　　　　　　　２０ｎｇＮ
　１Ｃ１２−６Ｈ，０１０μｇ ｃｕｓＯ４・５ＨｚＯ２００μｇ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　２５０μｇ蒸留水
　　　　　　　ＩＰ 】ユＪ。

ＮａｚＨＰ０４１２Ｈｚ０　　　４３　ｇＫＨ２Ｐ０．
　　　　　１５．６ｇ Ｆ　ｅ−ＥＤＴＡ　　　　　２４０ｍｇ蒸留水　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＰ（ｐＨ６，８） 次に、第１表に示す培地５０ｍ１を５００ｄ容の　　１
マイヤーフラスコに入れたものを８本用意し、　　　　
）１２０°Ｃで２０分間殺菌した後、第２表に示す培　
　地を１２０°Ｃで２０分間殺菌したものを０．５ｍｌ
＋加え、ここにメタン資化性菌を１白金耳接種した。　
　。

ここにメタン５０ｄを加えた後、ゴム栓で密栓し、　　
（４５°Ｃで３日間振とう培養した。培養終了後の）　
　′ラスコ培養液８本分を種菌とし、これを前記ジャー
ファーメンタ−に無菌的に仕込み、メタン−空　　ノ気
混合ガス（メタン：空気＝１　：　４）を毎分４２　　
土の割合で供給し、３日間培養した。菌濃度が０．５ζ
■／　ｍｌに達した後、第１表および第２表に示した　
　羊培地をｔｏｏ：１．５の割合で混合した培地にさら
　　ンにＣｕ　Ｓ　０４−５　Ｈ２Ｏを１■／２の割合
で加えた培　　１地を無菌フィルターで除菌しながら１
．６１！、７時　　　ノ間の割合で供給して連続的に培
養した。　　　　　　　（また、菌体の活性の測定は以
下に示す方法で行　　）なった。菌体を０．５■／　ｍ
ｌの濃度になるように　　　ズ５ｍＭパイプスバッファ
ーに懸濁したちのｌｄを　　ノアｄ容のマイヤーフラス
コに入れ、ここにプロピ　　Ｈ／ン２　ｍｌを加えてゴ
ム栓で密栓後、４５°Ｃで３０少間培養した。次いで、
メタノールを１ｍＭとなるように加え、さらに３分間培
養した後、ガスクコマドグラフィーにて生成したプロピ
レンオキサイドの量を定量し、菌体１　ｍｇあたり１分
間に生成、たプロピレンオキサイドの量で示した。

辷施例１〜４および比較例１ メタン資化性菌の培養方法に従って連続培養しヒメチロ
コッカス・カプスラツスＮＣＩ［ｌ　１１１３２の音養
液２１を遠心分離して菌体を集めた後、４ｍＭＤリン酸
緩衝波緩衝液　６．８）　２００戚に懸濁し、回度遠心
分離して菌体を洗浄した。さらに、この先注操作を２回
繰り返した。その後、菌体を４ｍＭノン酸緩衝液（ｐＨ
６，８）に、菌濃度２　ｍｇ　／　ｍｌとよるように懸
濁し、この懸濁液４０−Ｏｍｆｔを１ｆｆｉ容Ｄジャー
ファーメンタ−に入れ、４５°Ｃに昇温し１次いで、空
気を毎分４０ｍ１の割合で供給しな〉（ら、ギ酸カリウ
ムを１０ｍＭとなるように添加し社。さらに、メタン酸
化酵素の自殺基質であるア巨チレンをｌｄ／分の速度で
１分間供給し、メタン酸化能を失活せしめた。１０分後
にＬ−メチオニン酸を第３表に示す速度で加えて２４０
分後にジャーファーメンタ−内の菌体の活性を測定した
。

なお、菌体の再生期間中はギ酸でｐｉを７．０に維持し
た。この結果を第３表に示す。

第３表 実施例５および比較例２ メタン資化性菌の培養方法に従って培養したメチロコッ
カス・カプスラツスＮＣｌ３１１１３２を、実施例１と
同様の方法で集菌、懸濁、培養した後、アセチレンの代
りにプロピレンオキサイドを４ｍＭとなるように一時添
加し、メタン酸化能を失活させだ、３０分後に空気を３
．Ｓ！！／分の割合で１０分間供給してプロピレンオキ
サイドを除去した後、Ｌ−メチオニン５０ｍｇ／ｇを加
え、空気を４０ｍ／分の割合で流しながら２４０分後に
菌体の活性を測定した。なお、比較例２ではＬ−メチオ
ニン無添加の条件で、実施例５と同様の方法で行なった
。この結果を第４表に示す。

第４表 〔発明の効果〕 本発明によれば、酸素と共に少量のメチオニン誘導体の
添加により、メタン酸化酵素を失活した菌体を節便に再
生でき、この菌体を繰り返し生産工程に用いることがで
きるので安価に目的とする酸化物を生産することができ
る。

従って、本発明は化学工業、医薬、農薬、廃水処理など
の分野において有用である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）メタン酸化能を部分的または完全に失なったメタ
   ン資化性菌のメタン酸化能を回復させるにあたり、酸素
   およびメチオニン誘導体を供給しながら該メタン資化性
   菌の再生操作を行なうことを特徴とする失活菌体の再生
   方法。