JPS61274689A - 有機化合物の酸化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物が産生ずる酵素系を用いる有機化合物の
酸化方法に関する。

〔従来の技術〕

１９０６年にゼンゲｙ　（Ｓ２５ｈｎｇｅｎ　）がメタ
ンを唯一の炭素源及びエネルギー源とするメタン酸化菌
バシラスψメタニカ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｔｈａｎ
ｉｃａ　ｌを単離して以来、数多くのメタン酸化菌が自
然界から単離されている。

また、フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ　）により、メタン酸
化菌がメタン共存下で本来生育基質とならない低級アル
カンを酸化する現象〔コオキシデーション（Ｃｏ−ｏｘ
ｉｄａｔｉｏｎ　ｌが見出され、メタン酸化酵素系の基
質特異性が幅広いものであることが明らかになシ、近年
この方面の応用研究が活発となってきた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、従来既知のメタン酸化菌の産生ずる酵素
系は高温において活性が低下し、長鎖の炭化水素を有す
る物質の酸化能が劣るという欠点があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者は、斯かる欠点のない酵素系を見出す
べく鋭意研究を行また結果、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙ
ｌｏｍｏｎａａ　）属に属する微生物によって生産され
る新規な酵素系が高温においても良好な活性を有するこ
とを見出し、本発明を完成した。

従って、本発明は、メチロモナス属に属する好熱性メタ
ン酸化微生物によって産生される酵素系（以下「好熱性
メタン酸化酵素系」と称する）を用いて有機化合物を酸
化することを特徴とする特機化合物の酸化方法である。

本発明で使用する酵素系を産生ずるメチロモナス属に属
する好熱性メタン酸化微生物としては、先に本発明者ら
によって、千葉県内のガス田土壌より分離され、メチロ
モナス・サーモフイラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ　）　ＡＪ１１３３１と命名し、
工業技術院微生物工業技術研究所Ｋａ工研菌寄第４８５
９号として寄託したものが挙げられる。当該菌株は特公
昭５７−１９１３０　号に記載の如き次の菌学的性質を
有する。

（ａ）形　態 １）細胞の形および大きさ＝０．３〜０．９　Ｘ　０．
３〜１．３μｍ１球菌状〜桿菌状 ２）　細胞の多形性の有無：なし ３１　運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極鞭毛 ４）胞子の有無、形状、大きさ、部位：なし５）　ダラ
ム染色性：陰性 ６）抗酸性：陰性 （ｂ）　　各培地における生育状態 １）　肉汁寒天平板培養：生育せず ２）肉汁寒天斜面培養：生育せず ３）肉汁液体培養：生育せず ４）肉汁ゼラチン穿刺培養：変化せず ５）リドマス・ミルク；変化せず ６）その他：第１表に示す無機塩培地に５０’Ｃで４日
間培養したときのコロニーの性質、中程度の生育、円形
、薄膜〜凸円状、金縁、半透明、混光、均質、黄色〜黄
緑色を呈す。

第１表　培地組成（ｐ）１７．２　） 成分　Ｐ／ｌ　　成分　？−／１ ＮａＮＯ，λＯＣａＣ１，−２Ｈ，ＯＯ，０１５ＮＨ４
ＣＬ　　Ｏ，５ＦｅＣＬ、　　　０．０１ＫＨ，ＰＯ４
１，５Ｃｕ５Ｏ，・５鴇００．００１に、ＨＪつ、１．
２　　　　コリン・ｃｔ　　　　　ｏ、ｏｏｓＭｇＳＯ
，−７Ｈ，００，２ビｌミ７Ｂ、、　　　　　　５Ｘ１
０’？（気相のガス組成　ＣＨ４：空気：　Ｏ，：　Ｃ
ｏ、　＝３５：５０：１０：５） （Ｃ）　　生理学的性質 １）硝酸塩の還元；陰性（肉汁硝酸塩、培地で）２）脱
窒反応：陰性（肉汁硝酸塩培地で）３１ＭＲテスト：陰
性 ４）ＶＰテスト：陰性 ５）インドールの生成：陰性 ６）硫化水素の生成：陰性 ７）デンス“ンの加水分解：陰性 ８）クエン酸の利用；コープー（Ｋｏｓｅｒ　）培地で
利用しない。クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔａｎｓｅｎ
）培地で利用しない。

９）無機窒素源の利用：硝酸塩を利用する、アンモニウ
ム塩を利用する １０）　　色素の生成；水溶性色素生成する。

１１）　　ウレアーゼ：陰性 １２）オキシダーセ：陰性 １３）カタラーゼ：陽性 １４）　　生育の範囲：温度　３０℃〜５５℃ｐ）１　
　５〜８ １５）酸素に対する態度：好気性 １６）Ｏ−Ｆ’テスト〔ヒユー・アンド・ライフッｙ　
（Ｈｕｇｈ　＆　Ｌｅｉｆｓｏｎ　ｌ法による’）：０
．Ｆ変化しない １７）糖類から酸およびガスの生成の有無：酸の生成　
　ガスの生成 Ｌ−アラビノース　　　　　　　−　　　　　　　−Ｄ
−キシロース　　　　　　　−　　　　　　−Ｄ−グル
コース　　　　　　　　−　　　　　　　−Ｄ−マンノ
ース　　　　　　　　−　　　　　　−Ｄ−７ラクトー
ス　　　　　　　−　　　　　　　−Ｄ−ガラクトース
　　　　　　−− 麦　　芽　　糖　　　　　　　　−− シ　　　ヨ　　　塘　　　　　　　　　　　　−−乳　
　　　　糖　　　　　　　　−− トレハロース　　　　　　　　　　−　　　　　　　−
Ｄ−ソルビット　　　　　　　　−　　　　　　　−Ｄ
−マンニット　　　　　　　　−　　　　　　−イノシ
ット　　　　　　　　　　−　　　　　　−グリセリン
　　　　　　　　　−− デンプン　　　　　　　−− １８）メタンの利用性：利用する １９）　　窒素の固定：固定しない （ｄ）ＤＮＡのＧＣ含量：５７．５％ ■好熱性メタン酸化酵素系の製造法 本発明の微生物はメタンを唯一の炭素源として生育する
ものであるから、炭素源として杜メタンが用いられるが
、炭酸ガスによって生育が促進されるのでメタン、炭酸
ガス、及び酸素又は空気からなる気相が通常用いられる
。

気相の組成は特に制限はないが、メタンは５〜９０チ、
炭酸ガスは５〜３０チの範囲が好ましい。又酸素につい
ては水性培養液中の酸素濃度が２　ｐｐｍ以上になると
生育が阻害されるので２　ｐｐｍ以下（気相中の酸素の
分圧１〜２０チ）が望ましい。本菌はグルコース等の一
般の有機炭素源が共存すると生育が著しく阻害されるた
め、その使用は避けねばならない。

窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、及び硝酸アンモニウム、硝酸カリウ
ム、硝酸ナトリウム等の硝酸塩が用いられる。

無機イオンとしては、Ｋ　、　Ｎａ　、　Ｍｇ　”　、
　Ｃａ　”。

Ｆｅ”　、　Ｃｕ”　、　Ｃｚ−、ＰＯ４−”、　８０
４−”　、　％カ用イラれ、その他必要に応じてビタミ
ンＢｉｔ等有機微量栄養素も適宜用いられる。

培地のｐＨは４．５〜８．０が望ましく、培養温度は３
０〜５５℃、特に５０℃が望ましい。培養法は静置培養
、振盪培養及び通気攪拌培養法のいずれでもよい。

■酸化反応 本発明の好熱性メタン酸化酵素系によって酸化すること
のできる有機化合物としては例えば次のものが挙げられ
る。

１、　炭化水素 １−１．　　ガス状アルカン Ｒ−ＣＨＩＣＨ３→Ｒ−Ｃ山ＣＨ４０Ｈ＋　ＲＣＨＣＨ
ｓＯＨ １−２液状アルカン １−３．　１−アルケン １−４．２−アルケン １−５．脂環式化合物 １−６．芳香族化合物 ＯＨ λ　アルコール ２−１．−級アルコール Ｒ−ＣＨ，ＯＨ−Ｒ−ＣＨＯ、Ｒ−Ｃｏｏ）１２−４　
　二級アルコール １　ハロアルカン ３−１．　　　ｇ−ｃｚｘ　−Ｒ−ＣＭ、ＯＨ→Ｒ−Ｃ
ＨＯ→Ｒ−ＣＯＯＨ ３−２，Ｘ−ＣＨ，−Ｘ−Ｘ−ＣＨ，ＯＨ４Ｘ−ＣＯＯ
Ｈ３−３，Ｘ−ＣＨ，−Ｒ’−ＣＨ，−Ｘ→Ｘ−ＣＨ，
−Ｒ／−Ｃ属ＯＨ−Ｘ−ＣＨ，−Ｒ／−ＣＯＯｆ（ 〔式中、ＲはＨ又は炭素数１〜２０の飽和若しくは不飽
和の直鎖若しくは分岐炭化水素基（特に炭素数１〜８の
飽）口直鎖炭化水素基が好ましい）を、Ｒ′は炭素数１
〜１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基（特に炭素数１
〜４の直鎖アルキレン基が好ましい）ｔ−１Ｘはハロゲ
ン原子を示す〕 本発明の酸化方法を実施するには、上記の如くして培養
した好熱性メタン酸化微生物の細胞をそのまま酵素系と
して使用しても（休止菌体性酸化）、またセルフリー化
した酵素系画分を使用してもよい（無細胞抽出減法酸化
）。無細胞抽出減法酸化の場合には、補酵素としてＮＡ
ＤＨを添加するのが好ましいが、この補酵素を再生させ
るための適当な方法、例えばホルムアルデヒド、蟻酸等
の電子供与体と触媒量のＮＡＤ　　ｔ”添加してＮＡＤ
Ｈを再生させる方法も採用できる。

休止菌体法及び無細胞抽出液法の何れの方法も、酸化反
応はｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６，５〜７．５の緩衝
液中で行うのが好ましい。基質が液体及び固体状の場合
には、これらを本酵素系を含む反応液に直接添加し、ま
た気体状の場合には容器内の気相を部分置換して密封し
、何れの場合も５０℃で振盪して反応を行うのが好まし
い。

〔作用〕

本発明の好熱性メタン酸化酵素系を使用する有機化合物
の酸化反応は次に示す如く、種々の点において従来公知
のメタン酸化酵素による酸化反応とは相違する。

（１）公知のメタン酸化酵素によるアルカン酸化は、何
れもアルカンの末端及びその隣接炭素原子が優先的に同
時に酸化されるのであるが、本発明においてはガス状ア
ルカンと液状アルカンに対して酸化パターンが異なシ、
更にアルカンの鎖長が長くなるに従って内部のＣ−Ｈ結
合を優先的に酸化する傾向があるという特殊性を有する
。

（ｉ）　　タイプ■の内膜構造を有するメタン酸化菌は
、オキシゲナーゼを無細胞抽出液として分画すれば幅広
い基質特性を発揮するものの、菌体を細胞のまま用いる
と酸化される基質がかなり限定されることが知られてい
る。しかし、本発明の酵素系を有する菌株はタイプＩの
菌株であシながら、細胞のままでも長鎖アルカンを酸化
する。

（ＩＩＩ）　　従来公知のメタン酸化酵素は炭素原子４
個までのガス状アルケンを酸化して相当するエポキサイ
ドを生成するが、炭素数５個以上の液状アルケンは酸化
しないとされていたが、本発明の好熱性メタン酸化酵素
系はペンテン、ヘキセン等も酸化する。

（ｌｖ）　　従来、タイプ■のメタン酸化菌は菌体のま
までシクロヘキサン、トルエン等の環状化合物を酸化す
るという報告はなされていないが、本菌株は菌体の１ま
で当該環状化合物を酸化する。

（Ｖ）　　本酵素系は強力なデヒドロゲナーゼ活性を有
しておシ、反応温度が５０℃であることと相まって、他
に報告例がないようなアルコール類を酸化する。すなわ
ち、炭素原子１４．１６等の長鎖脂肪族アルコール、ベ
ンジルアルコール等の芳香族アルコールに対し酸化能を
有する。

（ｖｌｌ　　反応温度が５０℃であるので、例えば常温
で固体のヘキサデカノール（融点４９℃）等のアルコー
ルをも酸化することができる。

−本ｍｇ系ｉ、ω−ハロアルカン、α、ω−ハロアルカ
ン等のハロゲン化アルカンに対して脱ハロゲン反応、更
に酸化反応を示すが、斯かる反応は従来例をみない。

〔発明の効果〕

紙上の如く、本発明で使用するメタン酸化酵素系は従来
公知のメタン酸化酵素系と異って、高温において強い酸
化活性を有し、広範の有機化合物を酸化することができ
るので、その利用範囲が広いという利点を有する。

〔実施例〕

次に参考例及び実施例を挙げて説明する。

参考例１ （：）メチロモナス・サーモフイラの培養培地（ＶＣａ
培地） ＮａＮＯ，ＺＯ！？ ＮＨ４ｃｔ　　　　　　ｏ、ｓ ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　１．５ へ）ｉＰｏ、　　　　　　Ｌ２ ＭｇＳＯ，・７Ｈ，００，２ ＣａＣｔｔ　・２Ｈｔ　０Ｏ−０１５ ＦｅＣ１３０，０１ ＣｕＳＯ４−５Ｈ，ＯＯ，００１ ビタミンＢ＋＊　　　　　　５Ｘ１０−’イオン交換水
　　　　ＩＬ （ｐＨ７，２） ５００ｒＲ１容坂ロフラスコに上記培地５０ｄ１ｒ：入
れ、通常のオートクレーブで滅菌（１２１℃、１０分）
したのち、メチロモナス・サーモフイラＡＪ１１３３１
の種培養液５１１Ｌｌを植菌した。次いで唯一の炭素源
であるメタンを、空気／メタン／酸素／二酸化炭素＝５
０／３５／１０１５　（容量比）の混合ガスとして容器
中に密封し、５０℃で２０時間振盪培養した。この培養
により、乾燥菌体としてＩ　Ｐ／Ｌ　（ＯＤ、ｏ　　３
　）が得られる。

（１）休止菌体法酸化に使用する酵素系（１）で得た培
養液を冷却下で遠心分離して菌体を集め、これを５　ｒ
ｎＭ　Ｍｇｃｚ、　ｔ−含有する２　０　ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７）に懸濁し、冷却下で遠心分離する操作を
２回繰り返して菌体を洗浄した。これを再び上記リン酸
緩衝液に０Ｄ−１０〜２０（菌体量３．５〜７．０？／
Ａ）になるように懸濁した。

（Ｉｌｌ）無細胞抽出滅法酸化に使用する酵素系（１）
と同様にして洗浄した菌体を上記リン酸緩衝液に０ＤＳ
４０２０〜４０となるように懸濁し、これを冷却下１８
，０００ｐａｉの圧力でフレンチ・プレス・−ｋ　＃　
（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　Ｃｅ１ｔ　ｌに通して菌
体を破壊した。次いで１０，０００Ｘ％、１５分で遠心
分離して未破壊菌体を除去し、その上清を採取して酵素
液を得た。

尚酵素系中の蛋白質の定量はローリ−法の改良法である
バートリー（Ｍａｒｔｒｅｅ　）法を使用した。

実施例１　アルカン類の酸化 休止菌体法： ＯＤ、。１０（菌体量３．５　？／ｌ　）になるように
菌体懸濁液を調製する。反応基質が気体のときは、空気
と基質の混合ガスをフラスコに密封し、液体のときは０
．２　ｖ／ｖ　％の濃度で添加し、５０℃で振盪した。

反応後、ｎ−オクタンよシ長鎖のアルカンを基質とした
ときは常法に従って反応液をエーテル抽出し、得られた
エーテル濃縮液を、また他の基質の場合はその反応液２
μｔｔ−ガスクロマトグラフィーに付して酸化生成物を
分析した。その結果を第２表に示す。

以下余白 この反応の反応温度は５０℃であるので、沸点３６℃の
ｎ−ペンタンは反応系では気体として機能していること
を考えると、本酵素系によるアルカン酸化においては、
ガス状アルカンと液状アルカンに対する酸化パターンを
異にする。すなわち、ガス状アルカンに対しては１位と
２位の酸化が同時に起シ、かつ炭素鎖長が長くなるに伴
い２位の酸化が強くなるのに対し、液状アルカンでは１
位の酸化は起らず、ｎ−オクタンに至っては３位、４位
の酸化も起る。このように、本酵素系は菌体のままでも
長鎖アルカンに対して酸化活性を示す。

実施例２　アルケン類の酸化 無細胞抽出液法： ＯＤ、。２０の菌体懸濁液を参考例１　（Ｊｌｌ）の如
く処理し酵素液を得た。この酵素液１０１Ｒ１ｔ−５０
ｒＩ１１容の三角フラスコに入れ、これに１−ヘキセン
２０μｔとＮＡＤＨ５ｍＭ　ｆ：添加し、シリコンゴム
栓で密栓後、５０℃で１時間振とうした。反応液は中性
条件下でエーテル抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃
縮液を分析サンプルとした。酸化生成物はガスクロマト
グラフィー及びＧＣ−マススペクトル分析によって確認
した。その結果を第３表に示す。

第３表 実施例３　環状有機化合物の酸化 実施例１と同様にして環状有機化合物の酸化を行った。

その結果を第４表に示す。

第４表 第４表から明らかなように、本酵素系は環状有機化合物
を酸化する。

実施例４　アルコール類の酸化 実施例１に従って菌体懸濁液（０Ｄｓ４゜１０）を調製
し、これに基質アルコールｔ−２Ｖ／Ｖ　％添加し、５
０℃で６０分間反応させた。酸化生成物はガスクロマト
グラフィーで定量した。尚炭素数８個以上のアルコール
については、反応後宮法に従ってエーテル抽出し、ガス
クロマトグラフィーに付した。その結果を第５表及び第
１図に示す。尚第１図中、コントロールは熱失活菌体を
使用したときの結果を示す。

第５表 （注）＊１）　　酸化物は、対応するアルデヒド及びカ
ンボン酸＊２）　　酸化物は、対応するメチルケトンこ
れらから明らかな如く、１−オールの酸化活性は極めて
強く、炭素数１４個までの１−オールはほぼ１００チ脂
肪酸に酸化される。

実施例５　ハロアルカンの酸化 菌体濃度をＯＤｓ＜ｏ　　１５に調製した菌体懸濁液１
０Ｋｌ（１００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、これに１
−クロロ−ヘキサンあるいは、１，６−ジクロロヘキサ
ン２０μｔを添加し、密栓した後、５０°Ｃ湯浴中で１
分間に９０往復で振とうする。１２時間振盪後、５　Ｎ
　ＨＣｔ　ｔ−用いて反応液のｐＨを３に調整し、エー
テル抽出する。エーテル溶液は、無水硫酸ナトリウムで
乾燥後、濃縮し、ガスクロマトグラフィー及びガスマス
によシ酸化生成物を分析した。その結果を第６表及び第
２図に示す。尚第２図中コントロールは熱失活菌体を使
用したときの結果を示す。

第６表

【図面の簡単な説明】

第１図はｎ−ドデカノールを本発明方法で酸化して得ら
れる酸化生成物のガスクロマトグラム、第２図は１−ク
ロロヘキサンを本発明方法で酸化して得られる酸化生成
物のガスクロマトグラムである。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、メチロモナス属に属する好熱性メタン酸化微生物に
   よつて産生される酵素系を用いて有機化合物を酸化する
   ことを特徴とする有機化合物の酸化方法。