JP7616987B2 - Ｒｔｅｌ１発現の調節用のオリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、ＲＴＥＬ１の発現の調節又はＲＴＥＬ１活性の調節をもたらす、ＲＴＥＬ１に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴマー）などのＲＴＥＬ１阻害剤に関する。本発明は、特に、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染の治療及び／又は予防用の、核酸分子を標的とするＲＴＥＬ１の使用に関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡなどのｃｃｃＤＮＡを不安定化するためのＲＴＥＬ１阻害剤の使用に関する。本発明はまた、医薬組成物、並びにＨＢＶ感染の治療及び／又は予防におけるその使用も含む。

Ｂ型肝炎は、逆転写を介して複製する小型肝臓指向性ウイルスであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する感染性疾患である。慢性ＨＢＶ感染は、肝硬変及び肝細胞がんのような重篤な肝疾患に対する重要な因子である。慢性ＨＢＶ感染に対する現在の治療は、多機能逆転写酵素であるウイルスポリメラーゼを標的とする、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビルジイソプロキシル、及びテノホビル・アラフェナミドなどのペグ化１型インターフェロン又はヌクレオシ（チ）ド類似体の投与に基づいている。治療の成功は、通常、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の消失として測定される。しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡは感染後も体内に残存するため、完全なＨＢｓＡｇクリアランスが達成されることは稀である。ＨＢＶの持続は、核内で安定に維持されているＨＢＶゲノムのエピソーム型によって媒介される。このエピソーム型は「共有結合閉環状ＤＮＡ」（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ：ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる。ｃｃｃＤＮＡは、ウイルス複製中間体であるプレゲノムＲＮＡ（ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ：ｐｇＲＮＡ）を含む、全てのＨＢＶ転写物の鋳型として役立つ。ｃｃｃＤＮＡのいくつかのコピーの存在は、末期のＨＢＶ感染を再開するのに充分であろう。ＨＢＶに対する現在の治療はｃｃｃＤＮＡを標的としない。慢性ＨＢＶ感染の治癒にはｃｃｃＤＮＡの除去が必要である（Ｎａｓｓａｌ、「Ｇｕｔ．」（２０１５年１２月）第６４巻、第１２号、第１９７２～８４頁、ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ－２０１５－３０９８０９に概説される）。

テロメア伸長ヘリカーゼ１調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｈｅｌｉｃａｓｅ １：ＲＴＥＬ１）は、テロメアの安定性、保護、及び伸長において機能し、ＤＮＡ複製時にテロメアを保護することが知られているシェルタリン複合体中のタンパク質と相互作用するＤＮＡヘリカーゼをコードする。この遺伝子の突然変異は、先天性角化異常症及びＨｏｙｅｒａｌｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群と関連している（例えば、Ｖａｎｎｉｅｒら（２０１４年）「Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」第２４巻、第４１６頁による概説を参照されたい）。

核内に位置するＲＴＥＬ１は、テロメア長調節、ＤＮＡ修復、及びゲノム安定性の維持に関与するＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼとして機能する。ＲＴＥＬ１は抗リコンビナーゼとして作用して、毒性組換えに対抗し、減数分裂の間の交差を制限し、鎖侵入事象を物理的に解離することにより減数分裂組換え及び交差ホメオスタシスを制御し、これによって、減数分裂の合成依存性鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ：ＳＤＳＡ）及びＤループ組換え中間体の分解による非交差修復を促進する。その上、ＲＴＥＬ１はＴループを分解し、テロメアのＧ４－ＤＮＡ構造に拮抗することによってテロメアの脆弱性を防ぎ、テロメアの動態及び安定性を共に確保する。

ＲＴＥＬ１は、ｓｉＲＮＡスクリーニングにおいてＨＰＶエピソームの安定化剤として同定されている：（Ｅｄｗａｒｄｓら（２０１３年）「ＰＬｏＳ Ｏｎｅ」第８巻、第ｅ７５４０６頁）。ＲＴＥＬ１を標的とするｓｉＲＮＡも、同様に、Ｈｏｙｅｒａａｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群におけるＲＴＥＬ１との相互作用物質を同定するために使用されている（Ｓｃｈｅｒｔｚｅｒら（２０１５年）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ」第４３巻、第１８３４頁）。加えて、ＲＴＥＬ１は、ＨＩＶ感染を阻害する標的を提供する必須宿主タンパク質に対するｓｉＲＮＡスクリーニングから、ＨＩＶ宿主依存性因子として同定された（国際公開第２００７／０９４８１８号）。

著者らの知る限りでは、ＲＴＥＬ１は、ｃｃｃＤＮＡの安定性及び維持に関してｃｃｃＤＮＡ依存性因子として同定されたことはなく、ＲＴＥＬ１を阻害する分子がＨＢＶ感染治療のｃｃｃＤＮＡ不安定化剤として示唆されたこともない。

発明の目的
本発明は、ＨＢＶ感染細胞におけるＲＴＥＬ１の阻害とｃｃｃＤＮＡの低減との間に相関があり、これがＨＢＶ感染個体の治療に関連することを示す。本発明の目的は、ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡを低減するＲＴＥＬ１阻害剤を同定することである。このようなＲＴＥＬ１阻害剤はＨＢＶ感染の治療に用いることができる。

本発明は、インビトロ及びインビボでＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる、新規の核酸分子を更に同定する。

本発明は、ＲＴＥＬ１の発現を調節することができ、ＲＴＥＬ１の機能に関連した疾患を治療又は予防するための、核酸を標的とするオリゴヌクレオチドに関する。

したがって、第１の態様では、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療及び／又は予防用のＲＴＥＬ１阻害剤を提供する。特に、ｃｃｃＤＮＡ及び／又はプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を低減することができるＲＴＥＬ１阻害剤が有用である。このような阻害剤は、有利には、１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子から選択され、これは哺乳動物ＲＴＥＬ１に相補的な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどのＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを低減することができる。

更なる態様では、本発明は、例えば１２～３０ヌクレオチドなどの１２～６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、哺乳動物ＲＴＥＬ１に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド、特に１６～２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドは、ＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｈＲＮＡ核酸分子であり得る。

アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマ結合設計を有し得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の切断によってＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる。切断は、好ましくは、ヌクレアーゼ動員を介して達成される。

更なる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬学的賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

更なる態様では、本発明は、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物を該細胞に投与することによって、ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞におけるＲＴＥＬ１発現を調節するための、インビボ又はインビトロ方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、ＲＴＥＬ１のインビボ活性に関連する疾患、障害、又は機能障害を治療又は予防するための方法であって、該疾患、障害、又は機能障害に罹患する又は罹り易い対象に、治療的又は予防的に有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法を提供する。

本発明の更なる態様は、本発明の核酸分子のコンジュゲート及び本発明の分子を含む医薬組成物である。特に、ＧａｌＮＡｃクラスタのように、肝臓を標的とするコンジュゲートである。

例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。ここで、該オリゴヌクレオチドは波線（Ａ～Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ～Ｈ）又はＴ_２（Ｉ）のいずれかとして表され、アシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分は三価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である。化合物Ａ～Ｄは、ジリジンブランチャ（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサ、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物Ａ及びＢにおいて、オリゴヌクレオチドは、リンカなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合される。化合物Ｃ及びＤにおいて、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合される。化合物Ｅ～Ｉは、種々の長さ及び構造の市販のトレブラ（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャ分子及びスペーサ、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。

定義
ＨＢＶ感染
用語「Ｂ型肝炎ウイルス感染」又は「ＨＢＶ感染」とは、当該技術分野では一般的に知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、かつ肝臓に影響を及ぼす感染性疾患を指す。ＨＢＶ感染は急性感染又は慢性感染であり得る。慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＣＨＢ）感染は、世界中で２億４８００万人に影響する世界的な疾病負荷である。年間およそ６８６，０００人の死亡は、ＨＢＶ関連末期肝疾患及び肝細胞がん（ＨＣＣ）に起因する（ＧＢＤ、２０１３年；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、２０１５年）。ＷＨＯは、更なる介入がなければ、ＣＨＢ感染者の数は今後４０～５０年間にわたり現在の高い水準を維持し、累積２０００万人が２０１５～２０３０年の間に死亡すると予測した（ＷＨＯ、２０１６年）。ＣＨＢ感染症は特異な臨床症状を呈する同種疾患ではない。感染した個体は、生涯でＣＨＢ関連肝疾患のいくつかの段階を経て進行している。これらの病期もまた標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ：ＳＯＣ）による治療の基礎となる。現在のガイドラインでは、血清ＡＬＴレベル、ＨＢＶ ＤＮＡレベル、及び肝疾患の重症度の３つの基準に基づいて、ＣＨＢに感染した特定の個人のみを治療することを推奨している（ＥＡＳＬ、２０１７年）。この推奨は、ＳＯＣ、すなわちヌクレオシ（チ）ド類似体（ｎｕｃｌｅｏｓ（ｔ）ｉｄｅ ａｎａｌｏｇ：ＮＡ）及びペグ化インターフェロン－α（ＰＥＧ－ＩＦＮ）が治癒的ではなく、かつ長期間投与しなければならず、それによって安全性リスクが増加するという事実による。ＮＡはＨＢＶ ＤＮＡ複製を効果的に抑制する。しかしながら、他のウイルスマーカには非常に限られた影響しか及ぼさない／一切影響を及ぼさない。ＨＢＶ感染の２つの特徴である、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）は、ＨＢＶ治癒を目的とする新薬の主な標的である。ＣＨＢ患者の血漿中において、ＨＢｓＡｇサブウイルス（中空）粒子は、ＨＢＶビリオンを数で１０３～１０５倍上回る（Ｇａｎｅｍ＆Ｐｒｉｎｃｅ、２０１４年）。その過剰は、急性ＨＢＶ感染の消散後に観察された血清学的マーカである中和抗ＨＢｓ抗体を発現できない個体を含む、該疾患の免疫病理発生に寄与すると考えられている。

ｃｃｃＤＮＡ（共有結合閉環状ＤＮＡ）
ｃｃｃＤＮＡは感染した肝細胞の核に存在するウイルスの遺伝的鋳型であり、増殖性感染に必要な全てのＨＢＶ ＲＮＡ転写物を生じ、慢性ＨＢＶ感染の自然経過中のウイルス持続に関与する（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ＆Ｚｏｕｌｉｍ（２０１０年）「Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．」第１５巻補遺、第３号、第３～１４頁、ｄｏｉ：１０．３８５１／ＩＭＰ１６１９）。ｃｃｃＤＮＡはウイルスのリザーバとして作用し、治療中止後のウイルスリバウンド源であって、長期の、時として生涯の治療を必要とする。ＰＥＧ－ＩＦＮは、その種々の副作用に起因して、ＣＨＢの小サブセットにしか投与できない。

したがって、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの分解又は除去により定義される完全治癒をＣＨＢ患者の大部分にもたらすことができる新規の治療法が、強く必要とされている。

化合物
本明細書では、用語「化合物」とは、ＲＴＥＬ１の発現又は活性を阻害することができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明に係るＲＮＡｉ分子若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、又はそのような核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、ＲＴＥＬ１を標的とする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡであり得る。

オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子としてそれが当業者により一般的に理解されているように、定義される。そのような共有結合ヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称することができ、これは互換的に使用することができる。

明細書及び特許請求の範囲に記載されているオリゴヌクレオチドは、概して、７０ヌクレオチド長未満の治療用オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、若しくはそれを含み得、又は例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマ若しくはリボザイムなどの他のオリゴマー核酸分子であり得る。治療的オリゴヌクレオチド分子は、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって、研究室内で作製される。しかしながら、ｓｈＲＮＡは、多くの場合、レンチウイルスベクタを用いて細胞に送達され、次いで転写されて一本鎖ＲＮＡを生成し、これにより、ＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）を含む）と相互作用することができるＲＮＡステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成するであろう。本発明の一実施形態では、ｓｈＲＮＡは、化学的に生成されたｓｈＲＮＡ分子である（プラスミド又はウイルスからの細胞ベースの発現に依存しない）。

オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。概して、本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは標的細胞への侵入時にベクタから転写されるｓｈＲＮＡである。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～７０ヌクレオチド長、例えば１２～６０、例えば１３～５０、例えば１４～４０、例えば１５～３０、例えば１２～２５、例えば１６～２２、例えば１６～２０連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、１２～２５ヌクレオチドの長さを有し得る。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、１５～２２ヌクレオチドの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２４以下のヌクレオチド、例えば２２、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６、又は１７ヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、核酸分子が１２～２５ヌクレオチドを含むと記される場合、１２ヌクレオチド及び２５ヌクレオチドの両方が含まれる。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（複数可）は、哺乳動物における標的核酸の発現の調節用である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子は、典型的には、標的核酸（複数可）の発現を阻害するためのものである。

本発明の一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨと相互作用する高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）に結合され得る。

オリゴヌクレオチドのライブラリは、バリアントオリゴヌクレオチドのコレクションとして理解されるべきである。オリゴヌクレオチドのライブラリの目的は様々であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリは、オリゴヌクレオチドのライブラリ内で最も強力な配列を同定する目的で、１つ以上の哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸を標的とする重複する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリは、親又は先祖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド設計バリアント（子核酸分子）のライブラリであって、ここで、該オリゴヌクレオチド設計バリアントは親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。本明細書のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。

有利には、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低下させるため、ＲＮＡヌクレオシドを含まない。

有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。更に、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。

ＲＮＡｉ分子
本明細書では、用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」とは、細胞の細胞質中のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングを誘導することができる短い二本鎖ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドであって、触媒ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用するものを指す。ＲＮＡｉ分子は、細胞、例えば哺乳動物対象などの対象内の細胞における標的核酸の発現を調節、例えば阻害する。ＲＮＡｉ分子の１つのタイプは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）であり、これは、２つの相補的オリゴヌクレオチドから構成される二本鎖ＲＮＡ分子であり、転写後に一方の鎖が相補的ｍＲＮＡに結合すると、その分解及び翻訳の喪失が生じる。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）はステムループ（ヘアピン）構造を形成する一本鎖ＲＮＡベースオリゴヌクレオチドであり、これはＤＩＣＥＲ及びＲＮＡ低減サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してｍＲＮＡを低減することができる。ＲＮＡｉ分子は、目的の遺伝子（標的核酸）の配列に基づいて設計することができる。次いで、対応するＲＮＡｉは、化学的に若しくはインビトロ転写によって合成され得るか、又はベクタ若しくはＰＣＲ産物から発現され得る。

ｓｉＲＮＡ
用語「ｓｉＲＮＡ」とは、低分子干渉リボ核酸ＲＮＡｉ分子を指す。これは二本鎖ＲＮＡ分子のクラスであり、当該技術分野では低分子干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られている。ｓｉＲＮＡは、典型的にはセンス鎖（パッセンジャ鎖とも呼ばれる）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を含む。ここで、各鎖は、１７～３０ヌクレオチド長、典型的には１９～２５ヌクレオシド長であり、該アンチセンス鎖は、標的核酸（好適には成熟ｍＲＮＡ配列）に対して相補的、例えば少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的であり、該センス鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖が二重鎖又は二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖に対して相補的である。ｓｉＲＮＡ鎖は、平滑末端二重鎖を形成し得るか、又は有利には、センス鎖及びアンチセンス鎖３’末端は、例えば、１、２、又は３ヌクレオシドの３’オーバーハングを形成することがあり、これは、インビボでＲＩＳＣ基質を形成するＤｉｃｅｒによって生成される生成物に類似する。Ｄｉｃｅｒ基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２ｎｔ３’オーバーハングを有する。したがって、二重鎖領域は、例えば１７～２５ヌクレオチド長、例えば２１～２３ヌクレオチド長であり得る。

一旦細胞内に入ると、アンチセンス鎖は、標的核酸の標的分解又は標的阻害を媒介するＲＩＳＣ複合体に組み込まれる。ｓｉＲＮＡは、典型的にはＲＮＡヌクレオシドに加えて修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子はまた、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。特に、２’フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又は２’－Ｏ－メトキシエチルをｓｉＲＮＡに組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡセンス（パッセンジャ）鎖のヌクレオチドの全ては、ＬＮＡなどの２’糖修飾ヌクレオシドで修飾され得る（例えば、国際公開第２００４／０８３４３０号、同第２００７／０８５４８５号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのパッセンジャ鎖は不連続であり得る（例えば、国際公開第２００７／１０７１６２号を参照されたい）。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のシード領域で生じる熱不安定化ヌクレオチドの取込みは、ｓｉＲＮＡのオフターゲット活性の低減に有用であることが報告されている（例えば、国際公開第２０１８／０９８３２８号を参照されたい）。好適には、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に５’リン酸基又は５’リン酸模倣物を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端は、ＲＮＡヌクレオシドである。

一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートのヌクレオシド間結合を更に含む。ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｉｅ）若しくはメチルホスホネートのヌクレオシド間結合は一方若しくは両方の鎖の３’末端にあり得る（例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖）か、又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホネートのヌクレオシド間結合は一方若しくは両方の鎖の５’末端にあり得る（例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖）か、又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホネートのヌクレオシド間結合は一方又は両方の鎖の５’末端及び３’末端の両方にあり得る（例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖）。いくつかの実施形態では、残りのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ｓｉＲＮＡ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を低減し得るため、したがって、アンチセンス鎖における全てのヌクレオシド間結合が修飾されはしないことが有利である。

ｓｉＲＮＡ分子は、リガンドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合する。

生物学的分布については、ｓｉＲＮＡを標的リガンドに結合させるか、及び／又は例えば、脂質ナノ粒子に製剤化することができる。

本発明の他の態様は、治療的使用に適したｓｉＲＮＡ分子といったこれらのｄｓＲＮＡを含む医薬組成物と、例えば本明細書に開示されている種々の疾患状態の治療のために、本発明のｓｉＲＮＡといったｄｓＲＮＡ分子を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法と、に関する。

ｓｈＲＮＡ
短ヘアピンＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子は、一般に４０～７０ヌクレオチド長、例えば４５～６５ヌクレオチド長、例えば５０～６０ヌクレオチド長であり、ステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成し、これは、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡをプロセシングすると考えられるＤｉｃｅｒとして既知のエンドヌクレアーゼと相互作用し、次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）に組み込まれる。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ核酸分子は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ＲＮＡｉ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を低減し得るため、したがってｓｈＲＮＡ分子のステムループにおける全てのヌクレオシド間結合が修飾されはしないことが有利である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ｓｈＲＮＡ分子のステムループの３’及び／又は５’末端、特に標的核酸に相補的ではない分子の部分（例えば、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はパッセンジャ鎖）に配置されることが有利であり得る。標的核酸に相補的なｓｈＲＮＡ分子の領域は、しかしながら、Ｄｉｃｅｒによる切断後に３’末端及び／又は５’末端になると予測される部分における最初の２～３個のヌクレオシド間結合でもまた修飾され得る。

連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」とは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖に含まれる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に対して１００％相補的であるｓｈＲＮＡ分子の一部である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマ領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意には、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、標的化のためのコンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカ領域を含み得る。ヌクレオチドリンカ領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に対して１００％相補的である。

ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。

修飾ヌクレオシド
用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」とは、本明細書で使用される場合、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」若しくは修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。未修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。

修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１以上のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ用途のオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマオリゴヌクレオチドのギャップ領域Ｇ内、並びに領域Ｆ及びＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ：ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当該技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾されており、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部が、修飾されている。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。

本発明のオリゴヌクレオチドでは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を用いることが有利である。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、そのヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエートである。

ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域、例えばギャップマの領域Ｆ及びＦ’においても有用であり得る。ギャップマオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域Ｆ及びＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、ここで、領域Ｇのヌクレオシド間結合の全てはホスホロチオエートであり得る。

有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である。

欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンと、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。そのようなバリアントは、例えばＨｉｒａｏら（２０１２年）「Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４５巻、第２０５５頁、及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．」第３７巻、第１．４．１に記載されている。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵにより示され、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖－修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。

相補性
用語「相補性」とは、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合の能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５－メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏら（２０１２年）「Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４５巻、第２０５５頁、及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．」第３７巻、第１．４．１を参照されたい）。

用語「％相補性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性の百分率は、２つの配列間（標的配列５’－３’とオリゴヌクレオチド配列３’－５’を整列させたとき）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対より）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％相補性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

以下は、標的核酸（配列番号１１）に完全に相補的なオリゴヌクレオチドモチーフ（配列番号３３）の例である。

５’－ＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＴＣ－３’（配列番号１１）
３’－ＡＡＡＣＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡＴＴＴＴ－５’（配列番号３３）

同一性
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

ハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」とは、本明細書で使用される場合、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔ_ｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ（２００３年）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」第１３巻、第５１５～５３７頁）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ゜は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ゜_{＝－ＲＴｌｎ（Ｋ}ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ゜は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ゜は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的反応について、ΔＧ゜はゼロ未満である。ΔＧ゜は、Ｈａｎｓｅｎら（１９６５年）「Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．」第３６～３８頁及びＨｏｌｄｇａｔｅら（２００５年）「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ」に記載されているように、例えば、等温滴定熱量測定（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＩＴＣ）を用いて実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ゜測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ゜はまた、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ（１９９８年）「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．」第９５巻、第１４６０～１４６５頁：に記載されているように、杉本ら（１９９５年）「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第３４巻、第１１２１１～１１２１６頁及びＭｃＴｉｇｕｅら（２００４年）「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第４３巻、第５３８８～５４０５頁に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを用いて、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ゜値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ゜により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ゜値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ゜値で標的核酸にハイブリダイズする。

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＲＴＥＬ１をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＲＴＥＬ１標的核酸と称され得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物ＲＴＥＬ１のエクソン領域（特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの標的エクソン領域だけでなく、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を標的とすることができるか、又は例えば、ＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡのイントロン領域を標的とすることができる（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドはイントロン領域を標的とする）。ヒトＲＴＥＬ１遺伝子は、タンパク質をコードするこれらの７つの転写物のうち１５の転写物をコードし、したがって、潜在的な核酸標的である。表１は、配列番号１のヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ上に位置する７つの転写物の予測されるエクソン及びイントロン領域を列挙する。本発明のオリゴヌクレオチドは、表１に列挙された転写物の１つ以上の成熟ｍＲＮＡ配列を標的とすることができることが理解されよう。

好適には、標的核酸は、ＲＴＥＬ１タンパク質、特に哺乳動物ＲＴＥＬ１、例えばヒトＲＴＥＬ１をコードする（例えば、表２及び表３を参照されたい）。これは、ヒト及びサルＲＴＥＬ１についてのプレｍＲＮＡ配列を提供する。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び／若しくは２、又はその天然に存在するバリアント（例えば、表１の哺乳動物ＲＴＥＬ１タンパク質をコードする配列）から選択される。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。

インビボ又はインビトロでの適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＲＴＥＬ１標的核酸を発現している細胞内のＲＴＥＬ１標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合により１つ又は２つのミスマッチを除いて、また場合により、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカ領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ’’）を除いて、ＲＴＥＬ１標的核酸に相補的である。標的核酸は、いくつかの実施形態では、成熟ｍＲＮＡ（例えば、表１に列挙した転写物のエクソン領域）又はプレｍＲＮＡなどのメッセンジャＲＮＡといったＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、ヒトＲＴＥＬ１などの哺乳動物ＲＴＥＬ１タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば、配列番号１として開示されているようなヒトＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ配列である。例示的な標的核酸に関する更なる情報は、表２及び表３で提供される。

注記 配列番号２は、配列決定が配列を正確に精製することができず、したがって縮重配列が含まれる、複数のＮＮＮＮの領域を含む。疑いを避けるため、本発明の化合物は実際の標的配列に相補的であり、したがって、縮重化合物ではない。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号２である。

標的配列
用語「標的配列」は、本明細書で使用される場合、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

いくつかの実施形態では、標的配列は、上記の表１のリストから選択されるＲＴＥＬ１ヒトｍＲＮＡエクソンなどのヒトＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡエクソンからなる群から選択される配列である。

いくつかの実施形態では、標的配列は、上記の表１のリストから選択されるＲＴＥＬ１ヒトｍＲＮＡイントロンなどのヒトＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡイントロンからなる群から選択される配列である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。

オリゴヌクレオチドが相補的又はハイブリダイズする標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～３５ヌクレオチド、例えば１２～３０、例えば１４～２０、例えば１６～２０連続ヌクレオチドである。本発明の一実施形態では、標的配列は、表４に示される配列番号３～２１からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、標的配列は、表５Ａ又は表５Ｂに示される領域から選択される。

標的細胞
用語「標的細胞」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸を発現している細胞を指す。本発明の治療的使用のためには、標的細胞がＨＢＶに感染している場合が有利である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、若しくはウッドチャック細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞（例えば、カニクイザル細胞）若しくはヒト細胞である。

好ましい実施形態では、標的細胞は、ＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ又はＲＴＥＬ１成熟ｍＲＮＡなどのＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを発現する。ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。

更に、標的細胞は肝細胞であってもよい。一実施形態では、標的細胞は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞であり、ＨＢＶ感染個体に由来するか、又はヒト化肝臓を有するＨＢＶに感染したマウス（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、ＰＸＢマウス）に由来するかのいずれかである。

本発明によれば、標的細胞は、ＨＢＶに感染していてもよい。更に、標的細胞は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含み得る。したがって、標的細胞は、ＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ又はＲＴＥＬ１成熟ｍＲＮＡなどのＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含むことが好ましい。

天然に存在するバリアント
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＲＴＥＬ１遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する充分に相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。

いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸、例えば配列番号１及び／又は２に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＲＴＥＬ１標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、既知の多型である。

発現の調節
用語「発現の調節」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドの投与前のＲＴＥＬ１の量と比較したときに、ＲＴＥＬ１の量を変更するオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体若しくは標的細胞、又は非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された個体若しくは標的細胞であると一般的に理解されている。

調節の１つのタイプは、例えばｍＲＮＡの分解又は転写の遮断による、ＲＴＥＬ１の発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低下、回避、又は終了するオリゴヌクレオチドの能力である。別のタイプの調節は、例えばスプライス部位の修復又はスプライシングの防止、又はマイクロＲＮＡ抑制などの阻害メカニズムの除去若しくは遮断による、ＲＴＥＬ１の発現を回復、増加又は増強するオリゴヌクレオチドの能力である。

糖修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。

リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。

そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）又は二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、又は典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、又はモルホリノ核酸も含まれる。

糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔ^ｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．」（１９９７年）第２５巻、第４４２９～４４４３頁、及びＵｈｌｍａｎｎ；「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第３巻、第２号、第２９３～２１３頁を参照されたい）。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）である。

実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、向上された結合親和性、及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．」（１９９７年）第２５巻、第４４２９～４４４３頁、並びにＵｈｌｍａｎｎ；「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第３巻、第２号、第２９３～２１３頁、並びにＤｅｌｅａｖｅｙ及びＤａｍｈａ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（２０１２年）第１９巻、第９３７頁を参照。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。

本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’糖修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。

非限定的に、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら、「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」第１２巻、第７３～７６頁；Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」（２０１０年）第７５巻、第５号、第１５６９～８１頁；光岡ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（２００９年）第３７巻、第４号、第１２２５～１２３８頁；並びに、Ｗａｎ及びＳｅｔｈ、「Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（２０１６年）第５９巻、第９６４５～９６６７頁に開示されている。

本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に示す（ここで、Ｂは上記の定義の通りである）。

スキーム１

特定のＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。

薬学的に許容される塩
用語「薬学的に許容される塩」とは、生物学的に又は別様に望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第１級、第２級、及び第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、双性イオンの形態で存在することもできる。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸及びメタンスルホン酸の塩である。

ＲＮａｓｅ Ｈ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮＡＳＥＨ１）から入手できる。

ギャップマ
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマであってもよく、また、ギャップマオリゴヌクレオチド又はギャップマ設計とも称される。アンチセンスギャップマは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする、連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）が隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。

ギャップマ設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマ領域を含んでもよい。

ギャップマ設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであってもよい。

例として、本発明のギャップマオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１８－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１６－Ｆ’_２－８
ただし、ギャップマ領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’は独立して１～８個のヌクレオシドを含み、そのうち１～４個は２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧはＲＮａｓｅＨを動員することが可能な６～１８個のヌクレオシドの領域、例えば６～１６個のヌクレオシドの領域である。いくつかの実施形態では、Ｇ領域はＤＮＡヌクレオシドからなる。

領域Ｆ、Ｇ、及びＦ’は、更に以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込まれることができる。

ギャップマ－領域Ｇ
ギャップマの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。好適には、ギャップマは、少なくとも５又は６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１８連続ＤＮＡヌクレオシド、５～１７連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有してもよい。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８連続ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、いくつかの場合においてメチル化されていてもよく、そのような残基には５’－メチル－シトシン（^ｍｅＣ、又はｃの代わりにｅ）と注釈が付けられる。ギャップ中のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドが潜在的な毒性を低減するようにギャップ中に存在する場合に有利であり、修飾はオリゴヌクレオチドの効力に有意な影響を及ぼさない。５’メチルＤＮＡヌクレオシドのような５’置換ＤＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡギャップ領域での使用が報告されている（欧州特許出願公開第ＥＰ２７４２１３６号）。

いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

従来のギャップマはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’－アルキル化ＤＮＡ（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９号及びＶｅｓｔｅｒら、「Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」第１８号（２００８年）第２２９６～２３００頁に記載されている通り、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＮＡ及び２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓら（２００３年）「Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．」第１２５巻、第６５４～６６１頁）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（参照により本明細書に組み込まれるＦｌｕｉｔｅｒら、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．」（２００９年）第１０巻、第１０３９頁に記載されている通り）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成しているアンロックド核酸である。そのようなギャップマに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する（すなわち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合により、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する１～３糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。

ギャップマ隣接領域、Ｆ及びＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆは、１～８連続ヌクレオチド長、例えば２～６、例えば３～４連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、２～８連続ヌクレオチド長、例えば３～６、例えば４～５連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆ’の最も３’の実施形態は、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

領域Ｆ又は領域Ｆ’の長さが１である場合、それはＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｆ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択されてもよい。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｆ’は、独立して、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイング設計）。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及び領域Ｆ’は、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、又はβ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみからなる。このような設計はまた、均一フランク又は均一ギャップマ設計とも称される。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の全ヌクレオシド、又はＦ及びＦ’は、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１～５、例えば２～４、例えば３～４、例えば１、２、３、４又は５連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ヌクレシドは、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の全ヌクレシド、又はＦ及びＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７又は８連続ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、隣接領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）隣接領域であり、一方、３’（Ｆ’）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥからなるのは３’（Ｆ’）隣接領域であり、一方、５’（Ｆ）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の最も５’及び最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ及びＦ’の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

ＬＮＡギャップマ
ＬＮＡギャップマは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、又はそれからなる、ギャップマである。β－Ｄ－オキシギャップマは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、又はそれからなる、ギャップマである。

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］_１－５のものであり、領域Ｇはギャップマ領域Ｇの定義に定義した通りである。

ＭＯＥギャップマ
ＭＯＥギャップマは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマは、設計［ＭＯＥ］_１－８－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］_１－８、例えば［ＭＯＥ］_２－７－［領域Ｇ］_５－１６－［ＭＯＥ］_２－７、例えば［ＭＯＥ］_３－６－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］_３－６のものであり領域Ｇはギャップマの定義に定義した通りである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマは、当該技術分野で広く使用されている。

オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマＦ－Ｇ－Ｆ’、並びに更に５’及び／又は３’ヌクレオシドを含み、又はそれからなり得る。更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、又は完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。

領域Ｄ’又はＤ’’の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマをコンジュゲート部分又は他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、又は合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。

領域Ｄ’及びＤ’’は、各々、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、又は

Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマ部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含み、又はそれからなり、標的核酸に相補的であっても、又は相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’及びＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカとしての役割を果たし得る（リンカの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’及びＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマ領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３

いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

コンジュゲート
コンジュゲートという用語は、本明細書で使用される場合、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）。

１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、又は安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、及び／又は細胞取込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節又は向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、又は細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織、又は細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織又は器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織又は器官内のオフ標的活性又は活性）。

国際公開第９３／０７８８３号及び同第２０１３／０３３２３０号は、好適なコンジュゲート部分を提供し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。更に好適なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し得る部分である。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、同第２０１４／２０７２３２号、及び同第２０１４／１７９６２０号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取込みを強化する一方で、腎臓におけるその存在を低減し、それにより、結合オリゴヌクレオチドの肝臓／腎臓比を、同じオリゴヌクレオチドの未結合バージョンと比較して増加させる。

オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成はまた、Ｍａｎｏｈａｒａｎ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（２００１年）及びＭａｎｏｈａｒａｎ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２００２年）第１２巻、第１０３頁による包括的な概説で報告されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）又はそれらの組合せからなる群から選択される。

リンカ
リンケージ又はリンカは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基又はセグメントを別の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカ又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば標的核酸（領域Ａ）に相補的な例えばオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列に共有結合する役割を果たす。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）の間に位置するリンカ領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）とを含み得る。

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含み、又はそれからなる生体切断可能なリンカを指す。生理学的に不安定なリンカが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化若しくは、還元条件又は薬剤などの化学条件、及び哺乳動物細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素若しくは加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカは、１～１０のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオシドを含み、より好ましくは２～６のヌクレオシドを含み、最も好ましくは２～４の連結されたヌクレオシドを含み、これは少なくとも３又は４又は５の連続したホスホジエステル結合など、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカを指す。領域Ｙリンカは、エチレングリコール、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ、又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカ（領域Ｙ）は、例えばＣ２－Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルであり、例えば、Ｃ６－Ｃ１２アミノアルキル基を含む。好ましい実施形態では、リンカ（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

治療
用語「治療」とは、本明細書で使用される場合、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。予防とは、ＨＢＶ感染が慢性ＨＢＶ感染に転化するのを防ぐこと、又は慢性ＨＢＶ感染による肝硬変及び肝細胞がんなどの重篤な肝疾患を予防することと理解することができる。

予防
本明細書において、用語「予防すること」、「予防」、又は「予防する」とは、予防的治療、すなわち、その目的が疾患を治癒することよりむしろ予防することである、測定又は手段に関する。予防とは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果が、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという観点から、予防的に得られることを意味する。したがって、本明細書における「ＨＢＶ感染予防」とは、対象におけるＨＢＶ感染の発生を予防すること、及びＨＢＶ感染の症状の発生を予防することを含む。本発明では、特に、ＨＢＶに感染した母親からの小児におけるＨＢＶ感染の予防が企図される。また、急性ＨＢＶ感染が慢性ＨＢＶ感染に変化することを防ぐことも企図される。

患者
本発明の目的について、「対象」（又は「患者」）は、脊椎動物であり得る。本発明に関連して、用語「対象」は、ヒト及び他の動物、特に哺乳動物と、他の生物との両方を含む。したがって、本明細書に提供される手段及び方法は、ヒト治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。したがって、本明細書では、対象は、マウス、ラット、ハムスタ、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、又は霊長類などの動物であり得る。好ましくは、対象は、哺乳動物である。より好ましくは、対象は、ヒトである。

感染肝細胞におけるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは持続的な慢性感染及び再活性化に関与し、全てのウイルスサブゲノム転写物及びプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の鋳型であって、新たに合成されたウイルス子孫と細胞内ヌクレオカプシド再循環を介したｃｃｃＤＮＡプール補充との両方を確実にする。本発明の文脈において、ＲＴＥＬ１がｃｃｃＤＮＡ安定性と関連することが初めて示された。この知識により、ＨＢＶ感染対象におけるｃｃｃＤＮＡを不安定化する機会が生まれ、慢性感染ＨＢＶ患者の完全治癒の機会が開ける。

本発明の一態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染の治療及び／又は予防用のＲＴＥＬ１阻害剤である。

ＲＴＥＬ１阻害剤は、例えばＲＴＥＬ１タンパク質に特異的に結合する小分子であり得る。ここで、該阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡへのＲＴＥＬ１タンパク質の結合を防止又は低減する。

本発明の実施形態は、ＨＢＶ感染細胞などの感染細胞中のｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを低減することができる、ＲＴＥＬ１阻害剤である。

更なる実施形態では、ＲＴＥＬ１阻害剤は、ＨＢＶ感染個体においてインビボでＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを低減することができる。

本発明のオリゴヌクレオチド
治療用オリゴヌクレオチドは、ＲＴＥＬ１転写物を標的とし、ＲＮＡ干渉経路又はＲＮａｓｅＨ切断のいずれかを介してその分解を促進することができるので、潜在的に優れたＲＴＥＬ１阻害剤である。あるいは、アプタマのようなオリゴヌクレオチドもまた、ＲＴＥＬ１タンパク質相互作用の阻害剤として作用し得る。

本発明の一態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療及び／又は予防用のＲＴＥＬ１標的化オリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、又はｓｈＲＮＡ分子からなる群から選択され得る。

本発明のセクションは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療及び／又は予防に好適な新規のオリゴヌクレオチドを解説する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、インビトロ及びインビボでＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる。阻害は、ＲＴＥＬ１をコードする又はＲＴＥＬ１の調節に関与する標的核酸に、オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより達成される。標的核酸は、配列番号１及び／又は２の配列といった哺乳動物ＲＴＥＬ１配列であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより、それを調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞中１０μＭを用いて、インビトロでＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０％又は７０％阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０μＭ ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞を用いてインビトロでＲＴＥＬ１タンパク質の発現レベルを少なくとも５０％阻害することができ、この標的低減の範囲は、ｃｃｃＤＮＡ低減と良好な相関を有する核酸分子を選択するという点で有利である。好適には、実施例は、ＲＴＥＬ１ ＲＮＡ又はタンパク質阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば、実施例１）。標的阻害は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＲＴＥＬ１発現の所望の阻害を示すのに尚充分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシド、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。

本発明の一態様は、１２～６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば少なくとも１２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸、特にヒトＲＴＥＬ１核酸に対して少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である、オリゴヌクレオチドに関する。これらのオリゴヌクレオチドはＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる。

本発明の一態様は、１２～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、哺乳動物ＲＴＥＬ１に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、本発明に係るオリゴヌクレオチドに関する。

本発明の更なる態様は、配列番号１の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する、例えば完全に相補的である、１２～２０、例えば１５～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、本発明に係るオリゴヌクレオチドに関する。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは標的核酸又は標的配列の領域と少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。

本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列が、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、又はいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合、これは有利であり得る。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１の対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも９５％相補性、例えば完全に（又は１００％）相補的である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的配列に対して少なくとも９０％相補的であり、例えば１００％の相補性を有する１５～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該標的配列は、配列番号３～２１（表４）又は表５Ａの領域１Ａ～９５９Ａからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的配列に対して少なくとも９０％相補的であり、例えば１００％の相補性を有する１６～２０、例えば１５～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、該標的配列は、配列番号３～２１（表４）又は表５Ｂの領域Ｂ１～Ｂ２８からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１２～６０ヌクレオチド長、例えば１３～５０、例えば１４～３５、例えば１５～３０、例えば１６～２０連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２～３０、例えば１３～２５、例えば１５～２３、例えば１６～２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの連続ヌクレオチド配列は、１８～２８、例えば１９～２６、例えば２０～２４、例えば２１～２３連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２～２２、例えば１４～２０、例えば１６～２０、例えば１５～２１、例えば１５～１８、例えば１６～１８、例えば１６～１７の連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、表６（材料及び方法セクション）に列挙された配列からなる群より選択される配列を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号２２～２３７（表６に列挙したモチーフ配列を参照）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、好ましくは１００％の同一性を有する、１０～３０ヌクレオチド長を含むか又はそれらからなる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４２、４２、４３、４３、４６、４９、８３、１０９、１３０、２０３、及び２３２から選択される。

連続オリゴヌクレオチド配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。

修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。

本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＲＮＡヌクレオシド（特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子）又はＤＮＡヌクレオシド（特に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いて設計することができる。高親和性修飾ヌクレオシドを用いることが有利である。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、又は少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２～９個の修飾ヌクレオシド、例えば３～８個の修飾ヌクレオシド、例えば４～７個の修飾ヌクレオシド、例えば６又は７個の修飾ヌクレオシドを含む。好適な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」、及びロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。

更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好適なヌクレオシド間結合は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端における少なくとも２～３個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である場合、有利である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％、例えば全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であれば有利である。いくつかの実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続配列中の全ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７又は８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２～６個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３～７個のＬＮＡヌクレオシド、４～８個のＬＮＡヌクレオシド、又は３、４、５、６、７若しくは８個のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％、例えば修飾ヌクレオシドの８０％、例えば８５％、例えば９０％がＬＮＡヌクレオシドである。より更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドの全修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、及び以下のＬＮＡヌクレオシドの１つ以上：β－Ｄ又はα－Ｌ立体構造のいずれかのチオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、ＳｃＥＴ及び／若しくはＥＮＡ、又はそれらの組合せの両方を含んでもよい。更なる実施形態では、全ＬＮＡシトシン単位は、５－メチル－シトシンである。オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性にとって、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドがあることが有利である。

本発明の一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能である。

本発明において、有利な構造設計は、例えば、「ギャップマ」、「ＬＮＡギャップマ」、及び「ＭＯＥギャップマ」の「定義」セクションに記載されているギャップマ設計である。本発明では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＦ－Ｇ－Ｆ’設計のギャップマである場合が有利である。いくつかの実施形態では、ギャップマは、均一フランクを有するＬＮＡギャップマである。

本発明のいくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマは、以下の均一フランク設計から選択される：２－１２－３、４－１４－２、３－１０－３、３－９－３、２－１５－２、２－１２－４、１－１３－２、３－１３－２、４－１３－２、２－１２－２、３－１２－２、３－１５－２、３－１４－２、３－１３－３、２－１４－４、３－１２－３、１－１４－３、３－１４－３、２－１４－３、２－１５－３、３－１１－３、１－１２－３、１－１１－４、１－１３－２、２－１３－２、２－１６－２、１－１４－２、１－１７－３、及び１－１８－２。

表６（材料と方法セクション）は、各モチーフ配列の好ましい設計を列挙する。

全ての場合において、Ｆ－Ｇ－Ｆ’設計は、「オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又は領域Ｄ’’」のもと「定義」セクションに記載されるように、領域Ｄ’及び／又は領域Ｄ’’を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマ領域の５’末端又は３’末端に、１、２、又は３個のホスホジエステル結合ヌクレオシド単位、例えばＤＮＡ単位を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２つの５’ホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドと、続いて「定義」セクションで定義したＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマ領域と、からなる。５’末端又は３’末端にホスホジエステル結合されたＤＮＡ単位を含むオリゴヌクレオチドは、コンジュゲーションに好適であり、本明細書に記載されるようなコンジュゲート部分を更に含み得る。肝臓への送達では、ＡＳＧＰＲ標的化部分は、コンジュゲート部分として特に有利である。

本発明のいくつかの実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４２＿２、４２＿３、４３＿１、４３＿２、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、１３０＿１、１０９＿１、８３＿１、２０３＿１、及び２３２＿１（表６参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される。

コンジュゲート
ＨＢＶ感染は主に肝臓の肝細胞に影響を及ぼすので、ＲＴＥＬ１阻害剤をコンジュゲート部分に結合させ、未結合阻害剤と比較して阻害剤の肝臓への送達を増加させることが、有利である。一実施形態では、肝臓標的化部分は、コレステロール若しくは他の脂質を含む部分、又はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し得るコンジュゲート部分から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲート部分に共有結合した本発明の核酸分子を含むコンジュゲートを提供する。

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースと同等以上の親和性でアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ標的化部分）に結合することができる、１つ以上の炭水化物部分を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性は、研究されている（例えば、Ｊｏｂｓｔ、「Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ」、Ｋ．ＪＢ．Ｃ．（１９９６年）第２７１巻、第６６８６頁を参照）か、又は当該分野に典型的な方法を用いて容易に決定される。

一実施形態では、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群から選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するために、ＡＳＧＰＲ標的化部分（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に付着させることができる。一般に、ＡＳＧＰＲ標的化部分は、足場の同じ末端にあり得る。一実施形態では、コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得るブランチャ分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサに結合された、２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分からなる。

更なる実施形態では、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。

ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分としては、例えば、国際公開第２０１４／１７９６２０号及び同第２０１６／０５５６０１号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、並びにＴｙｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３などのＧａｌＮＡｃ部分が結合した小ペプチド；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するグリコトリペプチド（例えば、Ｄｕｆｆら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ」（２０００年）第３１３巻、第２９７頁参照）；リジン系ガラクトースクラスタ（例えば、Ｌ３Ｇ４；Ｂｉｅｓｓｅｎら、「Ｃａｒｄｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．」（１９９９年）第２１４巻）；及びコールラン系ガラクトースクラスタ（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に対する炭水化物認識モチーフ）を挙げることができる。

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に三価ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分は、当該技術分野で公知の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端に結合することができる。一実施形態では、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。

一実施形態では、コンジュゲート部分は、図１、特に図１Ｄに示されるような、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。

製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻、第２８７～３１３頁を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。

薬学的塩
本発明に係る化合物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、適切な非毒性の有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸などの無機酸に由来するもの、並びにｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性、及び溶解性を向上させるために、薬剤師によく知られている技術である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第４巻、第４２７～４３５頁、又はＡｎｓｅｌ、「Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」第６版（１９９５年）第１９６頁及び第１４５６～１４５７頁に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩であり得る。

更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム又はカリウム塩である。

医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。

本発明での使用に適した製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）第１７版（１９８５年）に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２４９巻、第１５２７～１５３３頁（１９９０年））を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体及びアジュバントの更に適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又はその薬学的に許容される塩は、粉末、例えば凍結乾燥粉末などの固体形態である。

本発明の化合物、オリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性又は不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の処方のための組成物及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、又は滅菌してフィルタにかけられ得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９又は６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。

投与
本発明の化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、局所的（皮膚、吸入、眼、又は耳など）、又は経腸的（経口的に又は消化管を通して）、又は非経口的（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、又は髄腔内など）に投与され得る。

好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入、髄腔内又は頭蓋内、例えば脳内又は脳室内、硝子体内投与を含む、非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、又は月に１回であり得る。

本発明はまた、医薬の製造のために記載された本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用も提供する。ここで、該医薬は皮下投与のための剤形である。

併用療法
いくつかの実施形態では、化合物などの本発明の阻害剤である本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用治療で使用するものである。治療薬は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療であり得る。

例として、本発明のオリゴマー又はオリゴマーコンジュゲートは、アンチセンス（他のＬＮＡオリゴマーを含む）、ｓｉＲＮＡ（ＡＲＣ５２０など）、アプタマ、モルホリノ、又は任意の他の抗ウイルス、ヌクレオチド配列依存性作用様式のいずれかを介して作用する、オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤、例えば配列特異的オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤などの他の活性剤と組み合わせて使用することができる。

更なる例として、本発明のオリゴマー又はオリゴマーコンジュゲートは、インターフェロン（例えば、ペグ化インターフェロンα）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＧＳ－９６２０）、又は治療ワクチンなどの免疫刺激抗ウイルス化合物といった他の活性物質と組み合わせて使用することができる。

更なる例として、本発明のオリゴマー又はオリゴマーコンジュゲートは、抗ウイルス活性を有する他の活性物質、例えば小分子と組み合わせて使用することができる。これらの他の活性物質は、例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（例えば、エンテカビル又はテノホビル・ジソプロキシルフマル酸塩）、封入阻害剤、侵入阻害剤（例えば、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ）であり得る。

ある特定の実施形態では、更なる治療薬は、ＨＢＶ剤、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗悪心剤、止瀉薬、止瀉薬、又は免疫抑制剤であり得る。

特に、関連する実施形態では、追加のＨＢＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン；ＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害薬；第２のアンチセンスオリゴマー；ＨＢＶ治療ワクチン；ＨＢＶ予防ワクチン；ラミブジン（３ＴＣ）；エンテカビル（ＥＴＶ）；フマル酸テノホビルジイソプロキシル（ＴＤＦ）；テルビブジン（ＬｄＴ）；アデホビル；又はＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）であり得る。

他の特定の関連する実施形態では、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａｃｏｎ－１）（ペグ化及び非ペグ化）；リバビリン；ペガシス；ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ社製ＶＰ５０４０６シリーズ）；ＨＣＶアンチセンス剤；ＨＣＶ治療ワクチン；ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤；ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤；又はＨＣＶモノクローナル抗体療法若しくはＨＣＶポリクローナル抗体療法であり得る。

用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用され得る。

研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＲＴＥＬ１タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。

本発明はまた、ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞においてＲＴＥＬ１発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法であって、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を該細胞に投与することを含む方法も、包含する。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、肝臓中に存在する。標的細胞は肝細胞であってもよい。

本発明の一態様は、医薬として使用する本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物に関する。

本発明の一態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを低下させることができ、したがってＨＢＶ感染を阻害することができる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、感染細胞中における以下のパラメータ（ｉ）ｃｃｃＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡの減少、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｖ）ＨＢＶウイルス抗原の減少のうちの１つ以上に影響を及ぼすことができる。

例えば、ＨＢＶ感染を阻害する核酸分子は、（ｉ）感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを、対照と比較して、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減、又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡレベルを、少なくとも４０％、対照と比較して、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減することができる。対照は、未処理の細胞若しくは動物、又は適切な対照で処理された細胞若しくは動物であり得る。

ＨＢＶ感染の阻害は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞を用いてインビトロで、又はヒト化肝細胞ＰＸＢマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏから入手可能、また、Ｋａｋｕｎｉら（２０１４年）「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．」第１５巻、第５８～７４も参照されたい）を用いてインビボで測定することができる。ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌阻害は、製造業者の指示に従って、例えばＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。細胞内ｃｃｃＤＮＡ又はＨＢＶ ｍＲＮＡ及びｐｇＲＮＡの減少は、例えば、材料及び方法セクションに記載されるように、ｑＰＣＲによって測定することができる。試験化合物がＨＢＶ感染を阻害するかどうかを評価するための更なる方法は、例えば国際公開第２０１５／１７３２０８号に記載されている通りｑＰＣＲにより、又はノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、又は免疫蛍光を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡの分泌を測定することである。

ＲＴＥＬ１レベルの低下により、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を使用して、ＨＢＶ感染の発症又は治療を阻害することができる。特に、本発明のｃｃｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の不安定化及び低減は、ＨＢｓＡｇの分泌のみを減少させる化合物と比較して、慢性ＨＢＶ感染の発症をより効率的に阻害又は治療する。

したがって、本発明の一態様は、ＨＢＶ感染個体におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを減少させるための本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用に関する。

本発明の更なる態様は、慢性ＨＢＶ感染の発症を阻害又は治療するための本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用に関する。

本発明の更なる態様は、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させるための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用に関する。本発明の特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、慢性ＨＢＶ感染の発症を阻害する。

本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物（又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、若しくは医薬組成物を予防的に受容するもの）で処理される対象は、好ましくはヒトであり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及び／又はＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者であり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及びＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者である。

したがって、本発明は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を投与することを含む、ＨＢＶ感染を治療する方法に関する。本発明は更に、慢性ＨＢＶ感染に起因する肝硬変及び肝細胞がんを予防する方法に関する。

本発明はまた、医薬、特にＨＢＶ感染若しくは慢性ＨＢＶ感染の治療、又はＨＢＶ感染者の感染性の低減に使用する医薬の製造のための、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用を提供する。好ましい実施形態では、医薬は、皮下投与のための剤形で製造される。

本発明はまた、医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、医薬組成物の使用を提供する。ここで、該薬物は静脈内投与のための剤形である。

本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬組成物は、併用療法において使用され得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬組成物は、ＨＢＶの治療及び／又は予防のために、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビルなどの他の抗ＨＢＶ剤、又はＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶカプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えば、国際公開第２０１２／１４５６９７号、同第２０１４／１７９６２９号、及び同第２０１７／２１６３９０号に記載）、ｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開第２００５／０１４８０６号、同第２０１２／０２４１７０号、同第２０１２／２０５５３６２号、同第２０１３／００３５２０号、同第２０１３／１５９１０９号、同第２０１７／０２７３５０号、及び同第２０１７／０１５１７５号に記載）、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）、又はＴＬＲ２、３、７、８、若しくは９アゴニストなどの他の抗ＨＢＶ剤と組み合わせてもよい。

本発明の実施形態
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。

１．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療及び／又は予防用のＲＴＥＬ１阻害剤。

２．該ＲＴＥＬ１阻害剤が、有効量で投与される、実施形態１に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

３．該ＨＢＶ感染が、慢性感染である、実施形態１又は２に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

４．該ＲＴＥＬ１阻害剤が、感染細胞中のｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを低減することができる、実施形態１～３に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

５．該ＲＴＥＬ１阻害剤が、ｃｃｃＤＮＡといったＤＮＡへのＲＴＥＬ１の該結合を防止又は低減する、実施形態１～４のいずれか一つに用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

６．該阻害剤が、ＲＴＥＬ１タンパク質に特異的に結合する小分子であって、ここで、該阻害剤が、ｃｃｃＤＮＡへのＲＴＥＬ１タンパク質の結合を防止又は低減する、実施形態５に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

７．前記阻害剤が、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸に対して少なくとも９０％相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、１２～６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、実施形態１～５のいずれか一つに用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

８．該ＲＴＥＬ１標的核酸のレベルを低減することができる、実施形態７に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

９．該標的核酸が、ＲＮＡである、実施形態７又は８に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１０．該ＲＮＡが、プレｍＲＮＡである、実施形態９に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１１．該オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡから選択される、実施形態７～１０のいずれか一つに用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１２．該オリゴヌクレオチドが、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は二本鎖ｓｉＲＮＡである、実施形態１１に用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１３．該哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸が、配列番号１又は２から選択される、実施形態７～１２のいずれか一つに用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１４．該オリゴヌクレオチドの該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の該標的核酸に対して少なくとも９８％の相補性である、実施形態７～１２のいずれか一つに用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１５．ＨＢＶ感染細胞中の該ｃｃｃＤＮＡが、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば１００％減少している、実施形態１～１４のいずれか一つに用途が記載のＲＴＥＬ１阻害剤。

１６．該ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡが、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば１００％減少している、実施形態７～１５のいずれか一つに用途が記載のオリゴヌクレオチド。

１７．１２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる１２～６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸に対して少なくとも９０％相補的、例えば９５％、例えば９８％の完全な相補性である、オリゴヌクレオチド。

１８．該オリゴヌクレオチドが、化学的に生成される、実施形態１７に記載のオリゴヌクレオチド。

１９．該哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸が、配列番号１又は２から選択される、実施形態１７～１８に記載のオリゴヌクレオチド。

２０．該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の該標的核酸に対して少なくとも９８％の相補性である、実施形態１７～１８に記載のオリゴヌクレオチド。

２１．該オリゴヌクレオチドが、１２～３０ヌクレオチド長である、実施形態１７～２０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

２２．該オリゴヌクレオチドが、二本鎖ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子である、実施形態１７～２１のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

２３．該オリゴヌクレオチドが、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１７～２１のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

２４．連続ヌクレオチド配列が、配列番号３～２１から選択される標的配列（表４）に相補的である、実施形態１７～２３のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

２５．配列番号１及び配列番号２の標的核酸と、－１５ｋｃａｌ未満のΔＧ゜でハイブリダイズすることができる、実施形態１７～２４に記載のオリゴヌクレオチド。

２６．該連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１４連続ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施形態１７～２５のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

２７．該連続ヌクレオチド配列が、１４～２２個のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施形態１７～２５のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

２８．該連続ヌクレオチド配列が、１６～２０個のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施形態２７に記載のオリゴヌクレオチド。

２９．該オリゴヌクレオチドが、１４～２５ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる、実施形態１７～２８のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

３０．該オリゴヌクレオチドが、１６～２２ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる、実施形態２９に記載のオリゴヌクレオチド。

３１．該オリゴヌクレオチドが、配列番号２２～２３７から選択される配列を含む、実施形態１７～３０のいずれか一つに記載のヌクレオチド。

３２．該連続ヌクレオチド配列が、それが相補的である該標的核酸と比較して、０～３個のミスマッチを有する、実施形態１７～３１のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

３３．該連続ヌクレオチド配列が、該標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施形態３２に記載のオリゴヌクレオチド。

３４．該連続ヌクレオチド配列が、該標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施形態３２に記載のオリゴヌクレオチド。

３５．該連続ヌクレオチド配列が、標的核酸配列の両方に対して完全に相補的である、実施形態３２に記載のオリゴヌクレオチド。

３６．１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１７～３５に記載のオリゴヌクレオチド。

３７．該１つ以上の修飾ヌクレオシドが、高親和性修飾ヌクレオシドである、実施形態３６に記載のオリゴヌクレオチド。

３８．該１つ以上の修飾ヌクレオシドが、２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態３６又は３７に記載のオリゴヌクレオチド。

３９．該１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態３８に記載のオリゴヌクレオチド。

４０．該１つ以上の修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態３６～３９に記載のオリゴヌクレオチド。

４１．該修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及びＥＮＡから選択される、実施形態４０に記載のオリゴヌクレオチド。

４２．該修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－を有するオキシ－ＬＮＡである、実施形態４０又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。

４３．該オキシ－ＬＮＡが、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態４２に記載のオリゴヌクレオチド。

４４．該修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－を有するｃＥＴである、実施形態４０又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。

４５．該ｃＥＴが、（Ｓ）ｃＥＴ、すなわち６’（Ｓ）メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態４４に記載のオリゴヌクレオチド。

４６．該ＬＮＡが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－を有するＥＮＡである、実施形態４０又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。

４７．該ヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１７～４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

４８．該修飾ヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性である、実施形態４７に記載のオリゴヌクレオチド。

４９．該修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４７又は４８に記載のオリゴヌクレオチド。

５０．該オリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能できるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１７～４９のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

５１．該アンチセンスオリゴヌクレオチド又は該連続ヌクレオチド配列が、ギャップマである、実施形態５０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５２．該アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマからなるか、又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１～４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、ＧがＲＮａｓｅＨを動員することが可能な６～１８個のヌクレオシドの領域である、実施形態５１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５３．該２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態５２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５４．領域Ｆ及び領域Ｆ’内の１つ以上の該２’糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５２又は５３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５５．領域Ｆ及び領域Ｆ’内の該２’糖修飾ヌクレオシドの全てが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５６．該ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、α－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、β－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、α－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、β－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、α－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴ、β－Ｄ－ＥＮＡ、及びα－Ｌ－ＥＮＡから選択される、実施形態５３又は５５に記載のオリゴヌクレオチド。

５７．領域Ｆ及び領域Ｆ’が、同一ＬＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５３～５６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５８．領域Ｆ及び領域Ｆ’内の該２’糖修飾ヌクレオシドの全てが、オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５３～５７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５９．領域Ｇ内の該ヌクレオシドが、ＤＮＡ及び／又はα－Ｌ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５２～５８のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

６０．領域Ｇが、少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

６１．領域Ｇ内の該ヌクレオシドの全てが、ＤＮＡヌクレオシドである、実施形態６０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

６２．該オリゴヌクレオチドが、ＣＭＰ番号２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４２＿２、４２＿３、４３＿１、４３＿２、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４９＿１、１３０＿１、１０９＿１、８３＿１、２０３＿１、及び２３２＿１、又はその薬学的に許容される塩から選択される、実施形態１７～６２のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。

６３．実施形態１７～５０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又は実施形態５１～６２のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、該アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分と、を含むコンジュゲート化合物。

６４．該オリゴヌクレオチドが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、該コンジュゲート部分が該ｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合している、実施形態６３に記載のコンジュゲート化合物。

６５．該コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質、又はそれらの組合せから選択される、実施形態６３又は６４に記載のコンジュゲート化合物。

６６．該コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、実施形態６３～６５のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

６７．該コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群から選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、実施形態６６に記載のコンジュゲート化合物。

６８．該アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、実施形態６７に記載のコンジュゲート化合物。

６９．該コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である、実施形態６７又は６８のコンジュゲート化合物。

７０．該コンジュゲート部分が、２～４つの末端ＧａｌＮＡｃ部分と、該アンチセンス化合物にコンジュゲートされ得るブランチャ分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサと、からなる、実施形態６９に記載のコンジュゲート化合物。

７１．該スペーサが、ＰＥＧスペーサである、実施形態７０に記載のコンジュゲート化合物。

７２．該コンジュゲート部分が、三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、実施形態６６～７１に記載のコンジュゲート化合物。

７３．該コンジュゲート部分が、図１の三価ＧａｌＮＡｃ部分のうち１つから選択される、実施形態６６～７２に記載のコンジュゲート化合物。

７４．該コンジュゲート部分が、図１Ｄの三価ＧａｌＮＡｃ部分である、実施形態７３に記載のコンジュゲート化合物。

７５．該オリゴヌクレオチド又は該アンチセンスオリゴヌクレオチドと該コンジュゲート部分との間に位置するリンカを含む、実施形態６３～７４のコンジュゲート化合物。

７６．該リンカが、生理学的に不安定なリンカである、実施形態７５に記載のコンジュゲート化合物。

７７．該生理学的に不安定なリンカが、ヌクレアーゼ感受性リンカである、実施形態７６に記載のコンジュゲート化合物。

７８．該生理学的に不安定なリンカが、２～５個の連続ホスホジエステル結合からなる、実施形態７６又は７７のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。

７９．未結合（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）オリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、肝臓対腎臓の間の改善した細胞分布、又は該コンジュゲート化合物の該肝臓への改善した細胞取込みを示す、実施形態６６～７８に記載のコンジュゲート化合物。

８０．実施形態１７～５０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又は実施形態５１～６１のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態６３～７９に記載のコンジュゲート化合物又はその許容される塩、並びに薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。
８１．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を予防、改善、及び／又は阻害する化合物を同定するための方法であって、以下：
ａ．試験化合物を
ｉ．ＲＴＥＬ１ポリペプチド；又は
ｉｉ．ＲＴＥＬ１を発現する細胞と接触させること；と、
ｂ．該試験化合物の存在下及び非存在下において、ＲＴＥＬ１の該発現及び／又は活性を測定すること；と、
ｃ．該ＲＴＥＬ１の発現及び／又は活性を低減し、ｃｃｃＤＮＡを低減する化合物を同定することと、を含む、方法。

８２．ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞におけるＲＴＥＬ１発現を調節するためのインビトロ又はインビボ方法であって、実施形態１７～５０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５１～６１のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態６３～７９に記載のコンジュゲート化合物、又は実施形態８０に記載の医薬組成物を、有効量で該細胞に投与することを含む、方法。

８３．該ＲＴＥＬ１発現が、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して、該標的細胞において、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下している、実施形態８２に記載の方法。

８４．該標的細胞がＨＢＶに感染しており、該ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡが、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して、該ＨＢＶ感染標的細胞において、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下している、実施形態８２に記載の方法。

８５．疾患の治療又は予防方法であって、治療的又は予防的に有効な量の、実施形態１７～５０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド、又は実施例５１～６１のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態６３～７９に記載のコンジュゲート化合物、又は実施形態８０に記載の医薬組成物を、該疾患に罹患する又は罹り易い対象に投与することを含む、方法。

８６．対象における疾患を治療又は予防用の医薬としての用途の、実施形態１７～５０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５１～６１のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３～７９のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物、又は実施形態８０に記載の医薬組成物。

８７．対象における疾患を治療又は予防するための医薬を調製するための、実施形態１７～５０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態５１～６１のいずれか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３～７９のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物の、使用。

８８．該対象が、哺乳動物である、実施形態８５～８７に記載の方法、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は使用。

８９．該哺乳動物が、ヒトである、実施形態８８に記載の方法、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は使用。

次に、本発明を、限定的な特徴を有しない以下の実施例によって説明する。

材料及び方法
オリゴヌクレオチドモチーフ配列及びオリゴヌクレオチド化合物

モチーフ配列は、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列を表す。

設計とはギャップマ設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’を指す。ここで、各数は、連続修飾ヌクレオシドの数、例えば２’修飾ヌクレオシド（１番目の数＝５’フランク）、続いてＤＮＡヌクレオシドの数（２番目の数＝ギャップ領域）、続いて修飾ヌクレオシドの数、例えば２’修飾ヌクレオシド（３番目の数＝３’フランク）、必要に応じて、標的核酸に相補的である連続配列の一部である必要はないＤＮＡ及びＬＮＡの更なる反復領域が前又は後にある修飾ヌクレオシドの数を表す。

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、５－メチルＤＮＡシトシンは「ｅ」で表し、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当該技術分野で一般に知られている。以下は適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用する装置、支持体及び濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されている場合がある。

オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８のホスホラミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで使用して、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、オリゴヌクレオチドを、水性アンモニアを用いて５～１６時間６０℃で固相支持体をから切断する。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製し、ＵＰＬＣによって特徴付け、分子量をＥＳＩ－ＭＳによって更に確認する。

オリゴヌクレオチドの伸長：
β－シアノエチル－ホスホラミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ－Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイト及びアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）の溶液を活性剤として用いて行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカ、又はそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホロチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を用いることにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を用いて導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。

固相合成後のコンジュゲーションでは、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカホルフォラミダイトを使用でき、脱保護及び固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが単離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。

ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラムでの分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集された画分を凍結乾燥して、精製された化合物を典型的には白色固体として得る。

省略語：
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ

Ｔ_ｍアッセイ：
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖を、５００ｍＬのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈し、５００ｍＬの２倍Ｔ_ｍ緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）と混合する。この溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで、室温で３０分間アニールする。二重鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）は、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ペルチェ温度プログラマＰＴＰ６を備えたＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定する。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで２５℃に低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解及びアニーリングの両方の極大値とを使用して、二重鎖Ｔ_ｍを評価する。

クローン増殖培地（ｄＨＣＧＭ）．ｄＨＣＧＭは、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｍＭヘペス、４４ｍＭ ＮａＣＯ３、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２％ＤＭＳＯ、及び１０％ＦＢＳ（石田ら、２０１５年）を含有するＤＭＥＭ培地である。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下において３７℃のインキュベータで培養した。培養培地を、播種後２４時間、採取まで２日毎に交換した。

初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）
ヒト化マウス（ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス）から採取した新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）（本明細書ではＰＨＨと称する）を、株式会社フェニックスバイオ（日本）から入手した。細胞を、以下の細胞密度でコラーゲンＩコーティングプレート上に播種した：改変肝細胞クローン増殖培地（ｄＨＣＧＭ）中、３５，０００細胞／ウェル（３８４ウェル）、７０，０００細胞／ウェル（９６ウェル）、又は４００，０００細胞／ウェル（２４ウェル）。ｄＨＣＧＭは、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｍＭヘペス、４４ｍＭ ＮａＣＯ３、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２％ＤＭＳＯ、及び１０％ＦＢＳ（石田ら、２０１５年）を含有するＤＭＥＭ培地である。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下において３７℃のインキュベータで培養した。培養培地を、播種後２４時間、採取まで２日毎に交換した。

ＨＢＶ感染及びオリゴヌクレオチド治療
ＰＨＨを、ＨＢＶ（ＣＨＢ個体から精製）により感染多重度（ＭＯＩ）４０で、４％ＰＥＧと共に２４時間インキュベートした。翌日、ウイルス 接種材料を除去した。ＰＨＨにおけるｃｃｃＤＮＡ確立化合物処理を、ＨＢＶ感染後３日目に開始した。培地に溶解した新鮮なオリゴヌクレオチドを２日毎（例１）に、又は新鮮なオリゴヌクレオチドを３日目、５日目、７日目、及び９日目に補充し、その後、培地を２日毎（例２）に補充して、１９日目に細胞を採取した。

ＨＢＶ抗原測定
ＨＢＶ抗原の発現及び分泌に対する影響を評価するため、１９日目に上清を回収した。ＨＢＶ増殖パラメータであるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルは、製造業者のプロトコルに従って、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ＣＬ０３１０－２号、ＣＬ０３１２－２号）を用いて測定した。簡単に述べると、２５μＬ／ウェルの上清をそれぞれの抗体被覆マイクロタイタプレートに移し、２５μＬの酵素コンジュゲート試薬を加えた。プレートを振盪機上で室温にて６０分間インキュベートした後、自動洗浄機を用いて洗浄緩衝液によりウェルを５回洗浄した。２５μＬの基質Ａ及びＢを各ウェルに加えた。プレートを振盪機上で室温にて１０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ発光リーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光を測定した。

ＣＣＫ８細胞毒性測定
オリゴヌクレオチドの処理に対する細胞毒性の影響を評価するため、細胞をＨＢＶ感染及びオリゴヌクレオチド処理に記載されているように処理し、１８日目に、ＰＨＨを２４時間３７℃のインキュベータで５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中においてプレインキュベートした。１０μＬのＣＣＫ－８溶液を９６ウェルプレートの各ウェル１００μＬに加え、１～４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎＭでの吸光度を各プレートについて測定し、値を対照の％として計算した（未処理細胞）。

細胞内ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ及びＲＴＥＬ１ ＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
ｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｙｓｔｅｍ及びＲＮｅａｓｙ９６ウェル抽出プレート（ＲＮｅａｓｙ ９６ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ８０００ Ｋｉｔ（１２）／カタログ番号／ＩＤ：９６７１５２）を用いて、製造業者のプロトコルに従って細胞から抽出した。相対的ＨＢＶ及び細胞ｍＲＮＡ発現レベルを、ＡＢＩ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ ＦｌｅｘでリアルタイムＰＣＲを用いて分析した。

β－アクチン（ＡＣＴ Ｂ）及びＨＢＶ ｐｇＲＮＡを、技術的反復実験（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）でＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４４４５５８）を用いてｑＰＣＲにより定量した。結果はヒトＡＣＴ Ｂ内因性対照で正規化した。ｍＲＮＡ発現は、参照遺伝子ＡＣＴ Ｂ及び非トランスフェクト細胞に対して正規化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて分析した。ＡＣＴＢ ＲＮＡ及びＨＢＶ ｐｇＲＮＡの定量に用いられるプライマを表７に列挙する。

ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ定量
ＤＮＡを、ＳＤＳ溶解緩衝液を用いてＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞から抽出し、ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４０６７）プロトコルを用いて精製した。ｃｃｃＤＮＡレベルを、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、米国）により消化した後、５００ｎｇのＤＮＡに対して１０ＵのＴ５を用いて１時間３７℃にて総体積２０ｕＬで決定した。消化後、試料を５０μＬに希釈し、そのうち４μＬをｑＰＣＲ反応に使用した。ｍＲＮＡ発現は、参照遺伝子ミトコンドリアＤＮＡ及び非トランスフェクト細胞に対して正規化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて分析した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応測定を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。ｑＰＣＲはＦａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３８５６１２）を用いて行った。プライマを表８に示す。

実施例１：ＨＢＶ感染ＰＨＨにおけるＨＢＶパラメータに対するＲＴＥＬ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
以下の実験では、ＨＢＶパラメータ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ、及びｃｃｃＤＮＡに対するＲＴＥＬ１ノックダウンの影響を、表６のオリゴヌクレオチド化合物を用いて試験した。

ＰＨＨは、材料及び方法のセクションに記載されている通りに培養した。細胞は、ＨＢＶ感染後３日目にｄＨＣＧＭ培地中へ溶解した最終オリゴヌクレオチド濃度１０μＭで、最終培養体積１００μＬ／ウェルで投与した。実験は生物学的三つ組で行い、２日毎にオリゴヌクレオチドを補充してＨＢＶ感染後１９日目に細胞を採取した。材料及び方法に従って、細胞毒性をＣＣＫ８を用いて決定し、上清を回収してＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを測定し、細胞を２つの画分に採取した。一方は１つの溶解緩衝液を用いるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ及びｐｇＲＮＡ測定用であり、もう一方は材料及び方法に記載されている別の溶解緩衝液を用いるｃｃｃＤＮＡ測定用である。全ての値は対照（未処理細胞）の％として表９に示されている。すなわち、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、及びｐｇＲＮＡについては、阻害が大きいほど値は低くなる。

ＣＣＫ８細胞毒性を材料及び方法のセクションに記載されている通りに測定して、ウイルスパラメータのいずれかの減少が細胞死の原因ではないことを確認したが、値が１００％に近いほど毒性は低い。結果を表９に示す。

ＲＴＥＬ１を標的とする全ての試験されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＣＫ８によって測定された細胞毒性が観察されないパラメータｃｃｃＤＮＡ、ｐｇＲＮＡ、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｅＡｇの少なくとも１つに対する単一の測定時点における、標的ノックダウン及びＨＢＶ抗ウイルス効果を示す。

実施例２：感染ＰＨＨ中のｃｃｃＤＮＡに対する影響を試験したＲＴＥＬ１を標的とする更なるオリゴヌクレオチドライブラリ
以下の実験において、ＲＴＥＬ１転写物を横切って標的化する２３６オリゴヌクレオチドの更なるライブラリを作製し、表６にＣＭＰ番号５０＿１～２３７＿１として示した。ｃｃｃＤＮＡと同様にＲＴＥＬ１を低減する能力を試験した。

ＰＨＨは、材料及び方法のセクションに記載されている通りに培養した。細胞は、ＨＢＶ感染後３、５、７、及び９日目にｄＨＣＧＭ培地中へ溶解した最終オリゴヌクレオチド濃度１０μＭで、最終培養体積１００μＬ／ウェルで投与した。実験は生物学的三つ組で行い、１９日目まで２日毎に補充培地を用いてＨＢＶ感染後１９日目に細胞を採取した。

材料及び方法に従って、細胞を２つの画分に採取した。一方は１つの溶解緩衝液を用いるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ用であり、もう一方は材料及び方法に記載されている別の溶解緩衝液を用いるｃｃｃＤＮＡ測定用である。全ての値は対照（未処理細胞）の％として表１０に示されている。すなわち、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ、及びｃｃｃＤＮＡについては、阻害／低減が大きいほど値は低くなる。

ＣＣＫ８細胞毒性を材料及び方法のセクションに記載されている通りに測定して、ウイルスパラメータの低減が細胞死によって引き起こされ得るかどうかを評価した。値が１００％に近いほど毒性は低い。結果を表１１に示す。対照の８０％を超えるＣＣＫ８値については、細胞死が表１０に示すＲＴＥＬ１及びｃｃｃＤＮＡの低減に影響を及ぼす可能性は低いと考えられる。

結果は、ライブラリ中２３６個のオリゴヌクレオチドのうち５％のみが、ＲＴＥＬ１又はｃｃｃＤＮＡの少なくともいずれかを対照の少なくとも８０％まで低減することができなかったことを示す。このことから、ＲＴＥＬ１及び／又はｃｃｃＤＮＡを低減することができるＲＴＥＬ１転写物全体を標的化するオリゴヌクレオチドを生成することが可能であり、概して、ＲＴＥＬ１及びｃｃｃＤＮＡの減少は細胞死によるものではないが、いくつかの化合物についてはそうであるかもしれないことがわかる。

Claims (14)

1. Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）感染の治療及び／又は予防に使用するための、ＲＴＥＬ１阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＲＴＥＬ１阻害剤が、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸、特にヒトＲＴＥＬ１標的核酸に対して少なくとも９５％相補的であり、かつＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを低減することができる、少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む１２～６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、例えば、前記哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸が、配列番号１又は２から選択される、医薬組成物。
2. 前記ＨＢＶ感染が、慢性感染である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＲＴＥＬ１阻害剤が、感染細胞中のｃｃｃＤＮＡを低減することができる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記ＲＴＥＬ１阻害剤が、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも９８％の相補性である、請求項４に記載の医薬組成物。
6. ＨＢＶ感染細胞中の前記ｃｃｃＤＮＡが、対照と比較して少なくとも６０％減少している、及び／又は、前記ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡが、対照と比較して少なくとも６０％減少している、請求項３に記載の医薬組成物。
7. 前記ＲＴＥＬ１阻害剤が、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸、特にヒトＲＴＥＬ１標的核酸に相補的な少なくとも１０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む１２～３０ヌクレオチド長の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に対して完全に相補的である、及び／又は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１２～２５、特に１５～２１ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号３～２１から選択される標的配列に１００％相補的である、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
10. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２２～２３７からなる群より選択される配列を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 請求項７～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
    ａ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、例えば、前記１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択され、例えば、前記１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドであり、
    ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、例えば、前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
    ｃ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能であり、及び／又は
    ｄ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマからなるか、又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１～４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、ＧがＲＮａｓｅＨを動員することが可能な６～１６個のヌクレオシドの領域、例えば６～１８個のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である、医薬組成物。
12. 前記ＲＴＥＬ１阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、そして、少なくとも１つのコンジュゲート部分が、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合している、請求項７～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができ、例えば、前記コンジュゲート部分が、以下の図１Ａ－図１Ｉ：
    の三価ＧａｌＮＡｃ部分のうち１つから選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含む２～５個の結合したヌクレオシドから構成される生理学的に不安定なリンカを含み、ここで、前記生理学的に不安定なリンカが前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に共有結合している、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。

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