JP6969069B2 - 脱細胞化された組織スキャフォールドの製造方法及び製造装置 - Google Patents

Description

本発明は、例えば治療法、疾患モデリング、薬物スクリーニング、診断、及びバイオマーカーの発見に使用する細胞外マトリクス（ＥＣＭ）スキャフォールドの製造に関する。

組織工学は、臓器の機能を回復することによって世界中の数百万の人々の生活の質を改善し、かつヒト疾患をｅｘ ｖｉｖｏで研究するための３Ｄプラットフォームを提供することを目的とする新たに発展しつつある分野である。組織工学における一つの重要な課題は、組織及び臓器の生理学的構造及び組成を再現する３Ｄ構造（「スキャフォールド」）の開発である。

２Ｄ細胞培養物及び動物モデルは、ヒト疾患の研究のための前臨床モデルとして通常使用されている。これらのモデルからは有用な情報が得られているものの、両者の系は、培養に際しての早期の細胞脱分化及び早期の老化、双方向性の腫瘍−間質クロストークの欠如、遺伝子発現及びタンパク質発現の欠陥、ヒト生物学との相関の欠如、並びに種特異的毒性を含む幾つかの制限によって特徴付けられる。

細胞外マトリクス（ＥＣＭ）から構成される生物学的スキャフォールドは、組織試料の脱細胞化によって製造される。ＥＣＭの完全性、生体活性、及び３Ｄ構造は、脱細胞化されたスキャフォールドにおいて維持され得る。しかしながら、生物学的スキャフォールドの製造は、カニューレ挿入により灌流−脱細胞化を可能にすることができる血管柄／血管を欠いているため難しい。報告されているプロトコルは、低速で撹拌することを特徴とし、組織の脱細胞化試薬への長時間の（例えば数週間の）曝露を必要とする。さらに、これらのプロトコルは、小規模の組織の完全な脱細胞化に十分ではなく、そして組織の外表面は界面活性剤及び酵素への連続的な曝露によってしばしば損傷を受ける。

本発明者らは、高周波振動下で種々の細胞傷害剤のセットを用いる１サイクル以上の処理を特徴とする処理方式が、細胞外マトリクスを傷害することなく、多種多様な組織を脱細胞化するために使用され得ることを認識した。これらの方式は、生得の組織の３Ｄ構造、並びに細胞外マトリクスの組成及び形態を維持する無細胞スキャフォールドの再現可能な製造に有用な可能性がある。

本発明の一態様は、脱細胞化された組織スキャフォールドの製造方法であって、
（ｉ）組織試料を準備する工程と、
（ｉｉ）上記試料を浸透圧試薬で処理する工程と、
（ｉｉｉ）上記試料を界面活性剤で処理する工程と、
を含み、上記組織試料を、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の間に、１ｍｍ以上の変位及び３Ｈｚ以上の周波数を有する振動に供することで、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する、方法を提供する。

特許請求の範囲に記載される方法によって製造された脱細胞化された組織スキャフォールドは、起源組織に由来する無細胞の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）からなり、かつ該起源組織の３次元構造、ＥＣＭの組成及びＥＣＭの生物活性を保持する。

脱細胞化された組織スキャフォールドは、本明細書に記載される方法を使用して、６時間未満で、３時間未満で、又は２時間未満で製造され得る。

浸透圧試薬、界面活性剤、及び他の脱細胞化試薬での処理の間に、組織試料は、高周波振動、すなわち３Ｈｚ以上の振動に供される。この振動は、組織内での試薬の分配を向上させ、細胞溶解の効率を高め、及び／又は組織からの細胞成分若しくは免疫原性成分の流出を改善する。この振動は完全な脱細胞化に必要とされる時間を短縮するが、ＥＣＭタンパク質、３Ｄ組織構造、並びにＥＣＭが細胞のホーミング、分化及び増殖を誘導する能力は維持される。

振動は、単一平面内、好ましくは線形一次元又は線状であってよい。任意の方向又は平面の振動を使用することができる。例えば、該振動は、水平方向（すなわち、重力に対して垂直）又は鉛直方向（すなわち、重力に対して平行）であってよい。

試料は、３Ｈｚ以上、５Ｈｚ以上、又は１０Ｈｚ以上であり、かつ１００Ｈｚ以下、７５Ｈｚ以下、５０Ｈｚ以下、又は３０Ｈｚ以下の周波数で振動され得る。振動周波数の好適な範囲は、列挙した下限値のいずれか１つと、列挙した上限値のいずれかとの組み合わせを含む。例えば、試料は、３Ｈｚ〜７５Ｈｚで、例えば１０Ｈｚ〜５０Ｈｚで振動され得る。

振動は、試料に４ｍｓ^−２〜５００ｍｓ^−２の、好ましくは４０ｍｓ^−２〜５０ｍｓ^−２の、例えば４２ｍｓ^−２〜４７ｍｓ^−２のｇ力を与え得る。例えば、任意の方向での振動が、１．８ｍｓ^−２〜１８１．１ｍｓ^−２で、好ましくは約４５．３ｍｓ^−２で行われ得る。

振動の変位は、１ｍｍ以上、５ｍｍ以上、７．５ｍｍ以上、又は１０ｍｍ以上であり、かつ５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、又は２５ｍｍ以下であってよい。変位の好適な範囲は、列挙した下限値のいずれか１つと、列挙した上限値のいずれかとの組み合わせを含み得る。例えば、試料は、５ｍｍ〜５０ｍｍの、好ましくは７．５ｍｍ〜２５ｍｍの変位で振動され得る。

組織試料を振動させるための好適な振動モーター及び他の装置は、当該技術分野でよく知られている。好適な手段には、振動式組織破砕機が含まれる。例えば、組織試料は、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴ（商標）装置（Qiagen NV社（オランダ））を使用して鉛直方向で振動されるか、又はＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（商標）装置（Qiagen NV社（オランダ））を使用して水平方向に振動され得る。

本明細書に記載される脱細胞化のために適した組織試料には、０．１ｃｍ〜４ｃｍの、例えば０．２ｃｍ〜１．０ｃｍの長さ、幅又は直径の切片又はブロック（例えば、０．００５ｃｍ^３〜１０ｃｍ^３の、例えば０．００８ｃｍ^３〜１ｃｍ^３の、例えば約０．１２５ｃｍ^３の体積を有する切片）が含まれる。該切片又はブロックは、いかなる形状であってもよい。好ましくは、該切片は、標準的な研究室用容器、例えばマルチウェルプレートにおいて操作するために好適なサイズであり、例えば約０．５ｃｍの辺を有する略立方体であってよい。

疾患モデリング及び薬物スクリーニングのための小規模の３Ｄ組織微小環境の複雑性の再現において、小さな血管柄のない切片又はウェッジが有用な場合がある。好適な試料は、パンチ生検、針生検、外科切開によって、又は自動式若しくは非自動式のダイサー装置を使用して得ることができる。

好適な組織試料には、腎臓、筋肉、骨、脂肪、軟骨、肺、膀胱、角膜、皮膚、肝臓、腸管、膵臓、前立腺、乳房、脾臓、胎盤、及び心臓試料が含まれる。幾つかの実施の形態では、上記組織試料には、動物の尾部のような種々の組織の組み合わせが含まれ得る。

組織試料は、哺乳動物組織、例えばブタ、ヒツジ、齧歯類動物、非ヒト霊長類又はヒト組織であってよい。好ましくは、組織試料は、ヒト組織である。

脱細胞化に対するヒト組織は、移植における臨床使用に適していないヒト臓器から得られてもよい。好適な臓器は、関連する国内法及び倫理指針に従って得られてもよい。これに加えて、ヒト組織は、術後の組織切除から得ることができる。

幾つかの実施の形態では、試料採取される組織は、傷害又は疾患と関連する病状を呈しない正常組織であってもよい。

他の実施の形態では、試料採取される組織は傷害又は疾患と関連する病状を呈する病的組織であってもよい。例えば、試料採取される組織は、脂肪質、線維性、癌性、炎症性であってもよく、又は疾患若しくは傷害と関連する１以上の他の特徴を呈してもよい。幾つかの実施の形態では、病的組織は、ウイルス性感染症、アルコール又は毒物による傷害、線維症、アミロイドーシス、及び癌を含む急性疾患又は慢性疾患と関連する病状を呈し得る。病的組織の例には、線維性肝臓組織、硬変肝臓組織又は癌性肝臓組織（種々の病因による）、アミロイド性腎組織、アミロイド性心臓組織、線維性腸管組織、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を患う患者由来の腸管組織、癌性膵臓組織、線維性肺組織、及び癌性乳房組織が含まれる。

病的な組織試料から製造される脱細胞化されたスキャフォールドは、健康な組織試料から製造されるスキャフォールドとは異なる構造及び組成を有する場合がある。例えば、病的なスキャフォールドの形態、又はコラーゲン、テネイシン、及びラミニン等のＥＣＭ成分の量若しくは相対量は、健康な組織試料と比較して病的な組織試料に由来するスキャフォールドにおいて変更される場合がある。疾患の特徴（例えば、アミロイド形成性タンパク質）は、ＥＣＭと関連している場合があり、その特徴は脱細胞化の間に保持され得るため、診断の感度が増大する。これは、疾患モデリング、薬物スクリーニング及び診断に対して特異的な疾患修飾スキャフォールドを得るのに有用な可能性がある。

病的な組織は、疾患を有する個体から得られてもよい。

本明細書に記載される脱細胞化のために組織及び組織試料を取得及び保存する方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、組織を、凝集を予防するためヘパリン処理してもよく、及び／又は凍結保護剤で灌流してもよい。好適な凍結保護剤として、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、及びショ糖が挙げられる。

組織試料は、振動されながら浸透圧試薬、界面活性剤、並びに任意にプロテアーゼ及び他の酵素を含む脱細胞化試薬への一連の連続する曝露によって脱細胞化される。振動と脱細胞化試薬への連続する曝露との組み合わせは、細胞及び細胞片を組織試料の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）から剥離し、それらをＥＣＭの損傷なく除去する。

組織試料は、脱細胞化試薬へと、該組織を該試薬に浸漬することによって曝露され得る。浸漬された試料はその後、振動される。

組織試料は、脱細胞化全体を通じて連続して振動されてもよく、又はその振動は、先行する脱細胞化試薬を除去して、新たな脱細胞化試薬を添加することを可能にするために停止されてもよい。

組織試料を脱細胞化試薬に曝露する各々の工程は、脱細胞化試薬による１回以上の個別の処理を含み得る。例えば、工程（ｉｉ）は、浸透圧試薬による１回、２回、３回又はそれより多くの回数の個別の処理を含んでよい。工程（ｉｉｉ）は、界面活性剤による１回、２回、３回、又はそれより多くの回数の個別の処理を含んでよい。

種々の脱細胞化試薬への曝露の順序は、それらの種々の作用機序に基づく。任意に、試料中の細胞を、まずは機械的に傷害することで、激しい細胞破砕を促進することもできる。低張液への曝露（工程ｉｉ）は、細胞溶解を増幅する一方で、細胞物質が洗い出される。組織への曝露は、界面活性剤への曝露（工程ｉｉｉ）であり、こうして細胞物質は効果的に洗い出される。

方法は、工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｉｉｉ）を１回以上繰り返すことを含んでもよい。例えば、組織試料は、脱細胞化試薬による複数サイクルの処理に曝露され得る。例えば、組織試料を、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む複数回の処理サイクルに供してよく、例えば組織試料を、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む少なくとも２回、少なくとも３回、又は少なくとも４回の処理サイクルに供してよい。

浸透圧ストレスは、組織試料における細胞の溶解を引き起こし、機械的傷害の効果を増幅する。浸透圧ストレスは、組織中の細胞に対して異なる浸透圧を有する１以上の浸透性試薬（すなわち、非等張性試薬）に上記組織試料を曝露することによって誘導され得る。組織を、細胞よりも低い浸透圧を有する１以上の低張試薬に曝露して細胞を低張性環境に供してもよく、及び／又は細胞よりも高い浸透圧を有する１以上の高張性試薬に曝露して細胞を高張性環境に供してもよい。幾つかの実施の形態では、低張試薬が好ましい場合がある。

高張性試薬は、例えば、タンパク質からＤＮＡを分離するのに有用な場合がある。好適な高張性試薬は当該技術分野でよく知られており、水、任意に、例えばリン酸塩、ホウ酸塩又はＴｒｉｓによって緩衝されてもよい食塩水（例えば、０．９％（重量／容量）超のＮａＣｌ、例えば３％〜１０％（重量／容量）のＮａＣｌ）、ポリエチレングリコール溶液、及びデキストロース溶液が挙げられる。

幾つかの好ましい実施の形態では、浸透圧剤は、食塩水、例えば８．７％（重量／容量）ＮａＣｌである。

低張試薬は、例えば、ＥＣＭの分子及び構造における最小の変化を伴って単純な浸透圧効果により細胞の溶解を誘導するのに有用な場合がある。好適な低張試薬は当該技術分野でよく知られており、脱イオン水、及び０．９％（重量／容量）未満のＮａＣｌの食塩水が挙げられる。

幾つかの好ましい実施の形態では、浸透圧剤は、脱イオン水である。

界面活性剤は上記組織中の脂質及び脂肪を可溶化し、ＥＣＭからの細胞片の除去を促進する。

好ましい界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、例えばＢｉｇＣＨＡＰ、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（商標）、Ｂｒｉｊ（商標）３５、Ｂｒｉｊ（商標）５６、Ｂｒｉｊ（商標）７２、Ｂｒｉｊ（商標）７６、Ｂｒｉｊ（商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（商標）９７、Ｂｒｉｊ（商標）５８Ｐ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ（Sigma-Aldrich社）、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシルα−Ｄ−グルコピラノシド、デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシルα−Ｄ−マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ｎ−ヘキサデシルβ−Ｄ−マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールエーテル、ポリオキシエチレン、サポニン、Ｓｐａｎ（商標）２０、Ｓｐａｎ（商標）４０、Ｓｐａｎ（商標）６０、Ｓｐａｎ（商標）６５、Ｓｐａｎ（商標）８０、Ｓｐａｎ（商標）８５（Sigma Aldrich社）、タージトール、テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＣＦ−２１、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＣＦ−３２、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＤＦ−１２、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＤＦ−１６、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＧＲ−５Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）−１５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）−１５１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）、ＴＷＥＥＮ（商標）（Sigma Aldrich社）、チロキサポール、ｎ−ウンデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。本発明の目的のためには、あらゆる両性界面活性剤が作用すると考えられる。好ましい両性界面活性剤には、限定されるものではないが、以下の、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、スルホベタイン３−１０（ＳＢ ３−１０）、スルホベタイン３−１２（ＳＢ ３−１２）、スルホベタイン３−１４（ＳＢ ３−１４）、ＡＳＢ−１４、ＡＳＢ−１６、ＡＳＢ−Ｃ８０、非界面活性スルホベタイン（ＮＤ ＳＢ）２０１、ＤＤＭＡＢ、ＤＤＭＡＵ、ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ（商標）界面活性剤の３０％溶液、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）の３０％溶液、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商標）３−０８界面活性剤、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商標）３−１０界面活性剤、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商標）３−１２界面活性剤、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商標）３−１４界面活性剤、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商標）３−１６界面活性剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。

好ましいアニオン性界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウムＳＤＳ）及びデオキシコール酸ナトリウム（ＳｄＣ）が含まれる。例えば、組織試料を、０．０１％〜５％のＳＤＳ、例えば０．０１％〜１％のＳＤＳ及び／又は０．１％〜１０％のデオキシコール酸ナトリウム（ＳｄＣ）、例えば約４％のデオキシコール酸ナトリウムに曝露してもよい。幾つかの好ましい実施の形態では、界面活性剤は、４％のＳＤＳを含み得る。

界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、例えばケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシ胆汁又はヒツジ胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、ドクサートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、グリココール酸ナトリウム塩水和物、グリココール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸３−スルフェート二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン塩溶液、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール液、ｎｉａｐｒｏｏｆ ４、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＱＳ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＱＳ−４４溶液、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−ブタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、１−ノナンスルホン酸ナトリウム、１−プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム無水物、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム無水物、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸３−スルフェート二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）−２００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商標）ＧＳ−２０溶液、トリズマドデシル硫酸塩、ウルソデオキシコール酸及びそれらの組み合わせが含まれ得る。

好ましい非イオン性界面活性剤には、ポリエチレングリコール及びＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、例えばポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル又はＴＸ−１００とも呼ばれる；ＣＡＳ ９００２−９３−１；Ｃ_１４Ｈ_２２Ｏ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ（ｎ＝９〜１０））が含まれる。例えば、組織試料を、０．０１％〜１０％のＴＸ−１００、又は１％〜３％のＴＸ−１００、例えば３％のＴＸ−１００に曝露してもよい。

界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、スルホベタイン−１０（３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート）、スルホベタイン−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート等の両性界面活性剤を含んでもよい。例えば、上記組織試料を０．０１％〜５％の両性界面活性剤、例えば０．０１％〜１％の両性界面活性剤に曝露してもよい。

多数の他の好適な界面活性剤が当該技術分野でよく知られており、商業的供給元（例えば、米国ミズーリ州のSigma Aldrich Co LLC）から入手可能である。

組織を、２種以上の異なる界面活性剤に曝露してもよい。例えば、工程（ｉｉｉ）は、組織試料をアニオン性界面活性剤、例えばＳＤＳ及び／又はＳｄＣ、並びに非イオン性界面活性剤、例えばＴＸ−１００に曝露することを含み得る。

幾つかの実施の形態では、試料を、ＳＤＳ、ＳｄＣ及びＴＸ−１００、例えば３％のＳｄＣ、０．５％のＳＤＳ及び３％のＴＸ−１００に曝露してもよい。

幾つかの実施の形態では、組織試料を、二価の金属イオン、例えばＣａ^２＋をキレート化し、ＥＣＭへの細胞接着を崩壊するキレート化剤、例えばＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを含む溶液中の界面活性剤に曝露してもよい。

幾つかの実施の形態では、組織試料を、アルコールに曝露してもよい。使用されるアルコールは、どのようなアルコールであってよく、かつ好ましいアルコールは、限定されるものではないが、以下の群：エチルアルコール、メチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、イソアミルアルコール、ｎ−デシルアルコール、及びそれらの組み合わせから選択される。

幾つかの実施の形態では、脱細胞化の方法は、組織試料をプロテアーゼ及び／又はヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼで処理することを更に含んでよい。好ましくは、組織試料は、プロテアーゼで処理される。

試料は、プロテアーゼによって単独工程で、又は脱細胞化剤による繰り返しの処理サイクルの一部として処理され得る。

プロテアーゼは、組織試料中のタンパク質を分解し、細胞構造及び細胞内の構造を崩壊させ、ＥＣＭとの細胞結合を破壊する。好適なプロテアーゼは当該技術分野でよく知られており、ディスパーゼ及びトリプシンが挙げられる。組織試料を、０．００２５％（重量／容量）〜０．２５％（重量／容量）のトリプシン、例えば０．０２５％のトリプシンに曝露してもよい。

幾つかの実施の形態では、組織試料を、二価の金属イオン、例えばＣａ^２＋をキレート化し、ＥＣＭへの細胞接着を崩壊するキレート化剤、例えばＥＤＴＡを含む溶液中のプロテアーゼに曝露してもよい。

好ましい実施の形態では、組織試料を、プロテアーゼ及び界面活性剤で同時に処理してもよい。

例えば、試料を、ＳＤＳ、ＳｄＣ、ＴＸ−１００及び／又はトリプシンを含む溶液で処理してもよい。これらの成分は、任意の組み合わせで又は任意の濃度で、例えば０．１％〜１０％のＳｄＣ；０．１％〜１０％のＳＤＳ；０．１％〜２０％のＴＸ−１００；０．０５％〜０．５％のトリプシン−ＥＤＴＡ、０．１％〜１０％のＮａＣｌ、例えば３％のＳｄＣ；０．５％のＳＤＳ；３％のＴＸ−１００；０．０２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ、４．３％のＮａＣｌで使用することができる。

幾つかの実施の形態では、脱細胞化の方法は、組織試料を、ＤＮＡを変性させる過酢酸（ＰＡＡ）及び／又はホスホジエステル結合を分解する水酸化アンモニウムで処理することを更に含んでよい。

組織試料を、脱細胞化試薬での処理後に、例えば上記工程の１つ以上の間に、及び／又はサイクルの間に洗浄してもよい。

組織試料を、好適な洗浄溶液、例えば緩衝生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１％〜１０％の食塩水溶液又は脱イオン水で洗浄してもよい。例えば、該試料を、界面活性剤及び任意にプロテアーゼへの曝露後に、及び／又は浸透圧剤への曝露後に１％のＰＢＳで洗浄してもよい。

一般的に、組織試料は、１％のＰＢＳで１分間にわたり周囲温度で洗浄される。

幾つかの実施の形態では、洗浄工程は２回以上のＰＢＳへの連続した曝露を含んでよい。

工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の前に、組織試料中の細胞を、その除去を容易にするために機械的傷害に供することができる。凍結／解凍、超音波処理、又は高密度焦点式超音波処理（ＨＩＦＵ）を含む、細胞外マトリクスに影響することなく組織の細胞を傷害する任意の好適な技法によって細胞を機械的に傷害してもよい。

好ましくは、組織試料は、脱細胞化前に少なくとも１サイクルの凍結／解凍に供される。

幾つかの実施の形態では、機械的傷害技法は、最初の処理の後に繰り返されなくてもよい。例えば、他の脱細胞化試薬への曝露の後の凍結／解凍処理等は、ＥＣＭ傷害を引き起こす可能性がある。

他の実施の形態では、組織試料中の細胞を最初の処理の後、例えば工程（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）の１回以上の繰り返しの後に機械的傷害に１回以上供してもよい。例えば、組織試料を、ＨＩＦＵ又は超音波処理に１回以上供してもよい。

好ましくは、組織試料を１回以上の凍結／解凍サイクルに供することによって、該細胞を機械的に傷害する。例えば、上記組織は、−２０℃以下、好ましくは−５０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下で凍結された後、１回以上解凍されてもよい。凍結された組織は、簡便には４℃〜３７℃で解凍されてもよい。幾つかの実施の形態では、ＥＣＭを傷害し得る組織内での温度勾配を最小化するため、上記組織を約４℃で解凍してもよい。例えば、該組織は約−８０℃で２４時間以上凍結された後、約４℃で解凍されてもよい。幾つかの好ましい実施の形態では、組織試料を、３７℃で、例えば４５分間〜１時間解凍した後、ＰＢＳ中に３７℃で、例えば１５分間浸漬してもよい。

凍結／解凍に供される組織試料は、ＥＣＭ傷害を防止するために乾燥していることが好ましい。幾つかの実施の形態では、組織試料は、例えば５分間〜３０分間の室温での曝露によって凍結／解凍工程の前に乾燥されてもよい。

組織試料を、等張緩衝液、例えば食塩水、例えば０．９０％（重量／容量）ＮａＣｌ、又はＰＢＳ中で凍結／解凍に供してもよい。

機械的傷害は、その組織内での激しい細胞破砕を促進させる。機械的傷害によって引き起こされる細胞溶解は、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）における浸透圧試薬及び界面活性剤での処理によって増幅され得る。

第一の実施の形態の集合のうちの幾つかの実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を０回〜５０回繰り返す工程（例えば、上清が澄明になるまで）と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を０回〜１０回、組織から一切の試薬及びプロテアーゼが除去されるまで繰り返す工程と、
（ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を０回〜１０回繰り返す工程（例えば、組織が完全に白色になるまで）と、
（ｉ）試料を食塩水に、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）を０回〜１０回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

第一の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を４回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を４回繰り返す工程と、
（ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と、
（ｉ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な組織試料として、肝臓、例えばヒト肝臓又は腸管、例えばヒト腸管が挙げられる。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ３及びＨＩ５）。

第一の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を１０回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を４回繰り返す工程と、
（ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と、
（ｉ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な組織試料として、肝臓、例えばヒト肝臓が挙げられる。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ４３）。

第一の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ｄ）を１１回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｈ）工程（ｇ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な組織試料として、肝臓、例えばヒト肝臓が挙げられる。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ３６）。

第一の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を５回〜１０回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）工程（ａ）を５回〜１０回繰り返す工程と、
（ｅ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに曝露する工程と、
（ｆ）任意に、工程（ａ）〜（ｅ）を１回以上繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な組織試料として、腎臓、例えばヒト腎臓、又は心臓、例えばヒト心臓が挙げられる。

上記試料を、上記工程の間にＰＢＳを用いて洗浄してもよい。

好適な方式を、表２に示す。

第一の実施の形態の集合では、組織試料を、鉛直方向に５０Ｈｚで、例えばＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴ（商標）を使用して振動させてもよい。

第二の実施の形態の集合のうちの幾つかの実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を１９回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を４回繰り返す工程と、
（ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を２回繰り返す工程と、
（ｉ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ４）。

第二の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を９回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す工程と、
（ｇ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｈ）工程（ｇ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ４３）。

第二の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を９回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ３６）。

第二の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を１９回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を食塩水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を５回繰り返す工程と、
（ｈ）工程（ａ）〜（ｄ）を５回繰り返す工程と、
（ｉ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な方式を、表２に示す（ＨＬ−Ｃ１）。

第二の実施の形態の集合のうちの他の実施の形態では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、
（ａ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｂ）工程（ａ）を４回繰り返す工程と、
（ｃ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｄ）上記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに、例えば４分間にわたり曝露する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）上記試料を過酢酸（ＰＡＡ）に２分間にわたり曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）を１回繰り返す工程と、
（ｈ）上記試料を水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ）に２分間にわたり曝露する工程と、
（ｉ）工程（ｈ）を２回繰り返す工程と、
（ｊ）上記試料を脱イオン水に、例えば２分間にわたり曝露する工程と、
（ｋ）工程（ｊ）を１０回繰り返す工程と、
（ｌ）工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｍ）上記試料を食塩水に、例えばＰＢＳに、例えば５分間にわたり曝露する工程と、
（ｎ）工程（ｍ）を２回繰り返す工程と、
を含んでもよい。

好適な方式を、表２に示す（ＨＰ１）。

第二の実施の形態の集合では、組織試料を、水平方向に３０Ｈｚで、例えばＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（商標）を使用して振動させてもよい。

好適な食塩水溶液、界面活性剤及びプロテアーゼ溶液、並びに他の脱細胞化試薬は、より詳細に上述されている。

脱細胞化後に、組織試料は、例えば滅菌手段への曝露によって滅菌されてよい。好適な滅菌手段として、ガンマ線照射、電解水及び化学的作用物質、例えば過酢酸（ＰＡＡ）が挙げられる。組織試料を、０．０１％の過酢酸及び４％のエタノールに、例えば３０分間〜２時間にわたって曝露してもよい。例えば、脱細胞化された組織試料を、滅菌手段中に浸漬してもよく、任意に本明細書に記載されるように振動に供してもよい。

脱細胞化及び滅菌に続き、例えば、細胞の不在について、及び／又はコラーゲン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、成長因子、及び細胞外プロテアーゼ等のＥＣＭ成分の存在について、脱細胞化された組織試料を試験してもよい。

アミロイド性組織試料の場合に、脱細胞化された組織試料を、アミロイド性フィブリルに関して試験してもよい。

巨視的な可視化、顕微鏡検査、及び免疫組織化学の技法を含む好適な技法が、当該技術分野でよく知られている。

脱細胞化された組織試料、例えばヒト組織試料は、標準的な組織学的染色の手法を使用して組織学的切片中に検出可能な筋フィラメント、内皮細胞、平滑筋細胞、並びに細胞片及び核を欠く場合がある。

本明細書に記載されるように製造された脱細胞化された組織試料は、３Ｄの臓器形態及び構造、並びに起源組織試料のＥＣＭ生物活性を保持する。

幾つかの実施の形態では、上に記載される方法によって製造された脱細胞化された組織試料の構造及び形態は電子顕微鏡検査によって確認することができる。

起源組織に応じて、脱細胞化された組織試料は正常ＥＣＭを含んでもよく、又は疾患により修飾されたＥＣＭであってもよい。例えば、脱細胞化された組織試料は、組織疾患又は病態の特徴である１以上の構造変化を含んでもよい。

脱細胞化された組織試料は、スキャフォールド中で培養される細胞の効果的な付着、遊走、増殖及び三次元組織化を可能とする。また、脱細胞化された組織試料は、細胞表現型及び機能特性を維持する生物活性分子及び生体誘導（bioinductive）特性を提供し、組織特異的マトリクスの産生を促進し得る。

本明細書に記載される脱細胞化された組織試料の製造の後に、方法は、該試料をエラスターゼ、又はマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のようなプロテアーゼと一緒にインキュベートすることを含んでよい。これは、ＥＣＭ関連バイオマーカーの同定において有用な可能性がある。

本明細書に記載される脱細胞化された組織試料の製造の後に、方法は、脱細胞化された試料を、例えば電気泳動及び／又は質量分析技術を使用してプロテオミクス分析に供することを含んでよい。これもまた、ＥＣＭ関連バイオマーカーの同定において有用な可能性がある。

本明細書に記載される脱細胞化された組織スキャフォールドの製造の後、方法は、人工組織試料を製造するため細胞によって脱細胞化されたスキャフォールドを再増殖することを含んでもよい。

好適な細胞として、健康な細胞又は罹患した細胞、例えばヒト初代及び細胞株の組織細胞（例えば、組織シヌソイド細胞）、内皮細胞、ｉＰＳＣ又は患者特異的ｉＰＳＣ由来細胞、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、胎性幹細胞（例えば、羊水幹細胞）、癌細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、及び両能性肝幹細胞が挙げられる。

脱細胞化された肝臓試料を、初代肝細胞、肝臓星細胞、又はクッパー細胞によって再増殖させてもよい。脱細胞化された腸管試料を、上皮細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、腸癌細胞、ｉＰＳＣ若しくは患者特異的ｉＰＳＣ由来細胞、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、胎性幹細胞（例えば、羊水幹細胞）、又は両能性肝幹細胞によって再増殖させてもよい。脱細胞化された膵臓試料を、膵島β細胞、内皮細胞、膵臓星細胞、膵臓癌細胞、ｉＰＳＣ若しくは患者特異的ｉＰＳＣ由来細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は胎性幹細胞（例えば、羊水幹細胞）によって再増殖させてもよい。脱細胞化された腎臓試料を、足細胞、尿細管細胞、ＭＳＣ、ｉＰＳＣ、胎性幹細胞（例えば、羊水幹細胞）、又は癌細胞によって再増殖させてもよい。脱細胞化された心臓試料を、心筋細胞、内皮細胞、ｉＰＳＣ、胎性幹細胞（例えば、羊水幹細胞）、又はＭＳＣによって再増殖させてもよい。脱細胞化された腸管試料を、腸管幹細胞、筋線維芽細胞、又はＣａｃｏ−２細胞によって再増殖させてもよい。

脱細胞化された組織試料は、スキャフォールドへの細胞によるスキャフォールドの播種及び好適な条件下での培養によって再増殖されてもよい。例えば、該細胞は、脱細胞化されたスキャフォールドの実質組織へと直接注入されてもよく、及び／又は脱細胞化されたスキャフォールドの表面に滴下されてもよい。播種されたスキャフォールドを、静的条件下で、例えば培養培地中で、又は動的条件下で、例えばバイオリアクター中で培養してもよい。

幾つかの実施の形態では、脱細胞化された組織スキャフォールドを、患者から得られた自己のヒト細胞によって、例えば該患者に移植するための人工組織を製造するために再増殖させてもよい。他の実施の形態では、脱細胞化されたヒトスキャフォールドを、同種異系のヒト細胞、すなわち異なるヒト個体から得られた細胞によって、例えば該患者に移植するための人工組織を製造するために再増殖させてもよい。幾つかの実施の形態では、同種異系のヒト細胞を、移植前に患者との免疫適合性に関してスクリーニングしてもよい。他の実施の形態では、脱細胞化されたヒトスキャフォールドを、非免疫原性細胞、例えば個体における免疫応答を誘発し得る表面抗原、例えばＨＬＡを除去する操作がなされた細胞によって再増殖させてもよい。

本発明の他の態様は、上に記載される方法によって製造された脱細胞化された組織スキャフォールドを提供する。

本明細書に記載されるように製造された脱細胞化された組織スキャフォールドは、無細胞性であり、起源組織試料の細胞外マトリクス細孔構造、構造及び形態を呈する。線維性起源組織試料から製造された脱細胞化された組織スキャフォールドは、増加したＥＣＭ成分を呈するとともに、起源組織に特徴的な変化した構造及び形態を呈する。

脱細胞化された組織スキャフォールドは、疾患モデリングに有用な可能性がある。好適なスキャフォールドは、上に記載される正常な組織試料又は病的な組織試料に由来し得る。

疾患モデリングの方法は、
上記のように製造された脱細胞化された組織スキャフォールドを準備し、任意に該スキャフォールドを、細胞によって再増殖させて、再細胞化された組織を製造することと、
上記スキャフォールド若しくは上記組織、又はその中の細胞に対する化合物、薬物、生物学的製剤、装置又は治療的介入の効果を特定することと、
を含むことができる。

本明細書に記載される方法は、組織線維症、組織癌及び転移、組織薬物毒性、移植後免疫応答、並びに自己免疫性肝炎等の組織疾患又は組織を冒す疾患のモデリングにおいて有用な可能性がある。

脱細胞化された組織スキャフォールドはまた、プロテオミクス、バイオマーカーの発見、及び診断用途のために有用な可能性がある。例えば、プロテアーゼの脱細胞化された組織スキャフォールドの成分、構造、又は形態に対する効果は、バイオマーカーの同定において有用な可能性がある。

本発明のもう一つの態様は、脱細胞化された組織スキャフォールドの製造のための装置であって、
（ｉ）以下の、
脱細胞化試薬中に浸漬された組織試料を収容するためのチャンバーと、
脱細胞化試薬を該チャンバー内に導入するための流入導管と、
脱細胞化試薬を該チャンバーから排出するための流出導管と、
を含むカセットと、
（ｉｉ）上記カセットの流入導管に接続可能である、脱細胞化試薬のための試薬貯蔵器と、
（ｉｉｉ）カセットを、１ｍｍ以上の変位及び３Ｈｚ以上の周波数での振動に供するための振動子と、
（ｉｖ）上記チャンバー内の試料を、高周波振動下で上記貯蔵器からの種々の脱細胞化試薬のセットを用いる１サイクル以上の処理方式に供するように、上記ポンプ及び上記振動子に指示を与えるようプログラムされたプロセッサと、
を備える、装置を提供する。

上記装置は、
（ｖ）上記チャンバー内で組織試料に曝露した後に脱細胞化試薬を貯蔵するための、上記流出導管に接続可能である１個以上の廃棄物貯蔵器、
を更に備えてもよい。

上記装置は、
（ｖｉ）脱細胞化試薬が流入導管へと入ることを可能にする取り入れ口と、
（ｖｉｉ）脱細胞化試薬が流出導管から出て行くことを可能にする取り出し口と、
を更に備えてもよい。

上記装置は、
（ｖｉｉｉ）試料チャンバー内の状態を測定又はモニタリングするための１個以上のセンサ、
を更に備えてもよい。

圧力、容量、フローパターン、温度、気体、ｐＨ、機械力、混濁度、生物学的分子の濃度、又は組織試料を浸漬する脱細胞化試薬の他のパラメータが測定され得る。

好適なセンサとして、圧力センサ、容量センサ、フローパターンセンサ、温度センサ、気体センサ、ｐＨセンサ、機械力センサ、及び混濁度センサが挙げられる。

幾つかの実施の形態では、上記装置は、
（ｉｘ）試料チャンバー内の状態を変更するための１個以上のアクチュエータ、
を更に備えてもよい。

上記１個以上のアクチュエータは、任意にプロセッサを介して１個以上のセンサに作動可能に連結されており、こうして、試料チャンバー内の温度、圧力、ｐＨ、混濁度、又は脱細胞化試薬の他のパラメータは、該センサによるパラメータの測定値が、予め決められた範囲から外れたことと呼応して変更され得る。

上記カセットは、組織試料が脱細胞化試薬中に浸漬されるチャンバーを備える。該カセットは、単独のチャンバー又は複数のチャンバー、例えば２個、３個、４個、５個、６個、又はそれより多くのチャンバーを含んでよい。幾つかの実施の形態では、該チャンバーは、６個、１２個、１８個、２４個、３０個、３６個、４２個若しくは４８個、又はそれより多くのチャンバーを含んでよい。複数のチャンバーは、カセット内に任意の配列で、例えば２次元（すなわち、水平若しくは鉛直）アレイ又は３次元アレイで配置されていてよい。複数のチャンバーは、複数の組織試料を並行に処理するために有用な可能性がある。

上記カセットは、任意の好適なサイズを有してよい。例えば、カセットは、１００ｍｍ〜４００ｍｍ×５００ｍｍ〜６００ｍｍ×５０ｍｍ〜８０ｍｍ（幅×長さ×高さ）、例えば３０５ｍｍ×６５０ｍｍ×６５ｍｍの寸法を有してもよい。

幾つかの実施の形態では、上記チャンバーは、組織試料を収容し得る。チャンバー内の組織試料は、貯蔵器から該チャンバー内に流入導管を通じて導入された脱細胞化試薬中に浸漬され得る。

上記カセットは、脱細胞化試薬を流入導管へと導入するための取り入れ口と、脱細胞化試薬を流出導管から除去するための取り出し口とを更に備えてよい。

好ましくは、上記カセットは、単独の取り入れ口と、単独の取り出し口とを備える。これは、必要となる接続数を減らすことによって外部汚染の危険性を最小化するのに有用な可能性がある。

幾つかの好ましい実施の形態では、カセット中の複数のチャンバーは、流入導管を介して取り入れ口に連結され、かつ流出導管を介して取り出し口に連結されていてよい。例えば、流入導管は、分岐することで、取り入れ口と複数のチャンバーとを作動可能に接続することができ、すなわち該導管は、一体となった形で取り入れ口に接続されていてよく、さらにまた異なる分岐に分かれてよく、ここで各々のチャンバーは、流入導管の異なる分岐に作動的に接続されているので、取り入れ口を通ってカセット内に入る脱細胞化試薬の流れは、導管の異なる分岐の間で分かれて、異なるチャンバーに入る。同様に、流出導管は、分岐することで、複数のチャンバーと取り出し口とを接続することができ、ここで各々のチャンバーは流出導管の異なる分岐に作動可能に接続されており、それらは合流して取り出し口において一体となった導管を形成する。異なるチャンバーから出て流出導管の分岐へと向かう脱細胞化試薬の流れは、単独の流れに合流し、その流れは取り出し口を通過する。

分岐した流入導管及び流出導管は、取り入れ口を介してカセット内に入る脱細胞化試薬の流れがチャンバー間で均等に分かれることによって、カセット中の複数のチャンバーの均一な充填を可能にする。

幾つかの好ましい実施の形態では、上記カセットは、３枚のプレート（下部プレート、中央プレート、及び上部プレート）を含み得る。

それらのプレートは、ガスケット又はＯリングによって隔離されていてよく、該ガスケット又はＯリングは、それらのプレート間を密閉して、試薬の漏れ及び交差汚染を防ぎ、滅菌性を維持する。

上記プレートは、それらが一緒になってカセットを形成した時に、チャンバー、並びに流入導管及び流出導管を形成する形状を有し得る。

カセットの中央プレートは、組織試料の１個以上のチャンバーを備えてよい。例えば、中央プレートは、チャンバーのアレイを備えてよい。

チャンバーのサイズは、収容される試料のサイズによって決定される。中央プレートにおけるチャンバーの数は、種々のサイズの組織試料の収容を可能にするために増加又は減少させてよい。

カセットの下部プレートは、取り入れ口、及び該取り入れ口と中央プレートにおける１個以上のチャンバーとを接続する流入導管を備えてよい。取り入れ口（inflow port）は、試料チャンバーが流入導管を通じて脱細胞化試薬で充填されることを可能にするための開位置、及び他の時は流入導管からの漏れを防ぐための閉位置を有する。

カセットの下部プレートは、取り出し口、及び中央プレートにおける１個以上のチャンバーと該取り出し口とを接続する流出導管を更に備えてよい。取り出し口（outflow port）は、脱細胞化試薬が試料チャンバーから流出導管を通じて排出されることを可能にするための開位置、及び他の時は流出導管からの試薬の漏れを防ぐための閉位置を有する。

流入導管及び流出導管は、下部プレートの本体中のチャネル、トンネル又は溝から形成されてもよい。

下部プレートは、中央プレートにおけるチャンバー内の組織試料が下部プレートにおける導管に入ることを防ぐ一方で、脱細胞化試薬が該導管から該チャンバーに到達可能となる形状を有してよい。例えば、下部プレートは、各々のチャネルの中心部に突出部又は邪魔板を備えていてよい。

幾つかの実施の形態では、上記カセットは、チャネルの中心部内に、下部プレートにおける導管と中央プレートにおけるチャンバーとの間での液体の移動を可能にするが、中央プレートにおけるチャンバー内の組織試料が下部プレートにおける導管に入ることを防ぐ膜を備えてよい。該膜は、下部プレートに、中央プレートに、又はそれらのプレートの間に配置されていてよい。

組み立てられたカセットにおいて、中央プレートにおける１個以上のチャンバーは、各々のチャンバーが流入導管の分岐、及び流出導管の分岐に作動的に連結されるように下部プレートにおける導管の上に配置されている。

上記カセットは、１個以上のセンサ及び／又はアクチュエータを更に備えてよい。例えば、該センサ及び／又はアクチュエータは、カセットの下部プレート、中央プレート、及び／又は上部プレートに位置してよい。

上部プレートは、下部プレートにおける導管のパターンに対応する導管のパターンを有し得る。これらの導管は、脱細胞化試薬の充填及び排出の間に、試料チャンバーからのガス交換を可能にする。充填の間には、流出導管が閉じている場合に、上部プレートの導管は、カセット内部から押し退けられる空気のための通路を提供する。同様に、排出に際して流入導管が閉じている場合に、空気は、カセットから排出される試薬を押し退けねばならない。該導管は、滅菌的ガス交換を可能にし、かつカセット中の過圧化を防ぐことを可能にする好適なフィルタに接続されていてよい。

上部プレート内の各々の導管の中心部には、液体が上部プレートにおけるチャネルに入ることを防ぐように設計された突出部が存在する。該突出部は、試薬が上部プレートへと進まずに、中央プレートにおける試料チャンバー内に滴り戻ることが促されるように配置されている。例えば、該突出部は、事実上の円錐形状であって頂点が中央プレート側を向いた形状を有してよい。さらに、チャネルの中心部内には膜が配置されていてよい。該膜は、例えばプレート間での気体の移動を可能にし得るが、液体の移動は可能にし得ない。

上部プレートは、脱細胞化試薬が上部プレートにおける導管に入ることを防ぐ一方で、脱細胞化試薬が該導管から該チャンバーに到達可能となる形状を有してよい。例えば、上部プレートは、各々のチャネルの中心部に突出部又は邪魔板を備えていてよい。

上部プレートは、中央プレートにおける１個以上のチャンバーへの到達を可能にする１個以上の試料採取口を更に備えていてよい。この試料採取口は、試薬組成を評価するために各々のチャンバーから試薬の試料採取をするために有用な場合がある。例えば、試薬又は試料中の対象となる特定分子のレベルをモニターすることができる。チャンバーの滅菌性も、試料採取口を通じてモニターすることができる。

試薬貯蔵器は、脱細胞化試薬のための容器である。上記装置は、処理方式において使用される各々の脱細胞化試薬に関する個別の試薬貯蔵器を備えていてよい。好ましくは、上記装置は、組織試料を少なくとも４種の異なる脱細胞化試薬で処理することを可能にする少なくとも４個の試薬貯蔵器を備える。

試薬貯蔵器は、該貯蔵器からの試薬が１個以上のチャンバーへと流入導管を通じて導入され得るように取り入れ口に作動的に連結されていてよい。例えば、該試薬貯蔵器は、カセットの取り入れ口へと、配管及びマニホールドによって標準的な技法に従って接続されていてよい。試薬貯蔵器をカセットの取り入れ口に接続するのに好適な配管、アダプタ及びコネクタは、商業的供給元から容易に入手可能である。

試薬貯蔵器は、上記のような脱細胞化試薬、例えば浸透圧剤、界面活性剤、洗浄溶液、及びプロテアーゼを収容し得る。

上記装置は、廃棄試薬貯蔵器を更に備えていてよい。廃棄試薬貯蔵器は、取り出し口に作動的に連結されていてよい。廃棄試薬貯蔵器は、取り出し口からの使用済み脱細胞化試薬を受容し得る。

廃棄脱細胞化試薬を廃棄物貯蔵器へと除去する間に、好ましくは、該カセットにおいて、空気が、取り入れ口を介してチャンバー及び導管中の除去される試薬と置き換わる。廃棄試薬貯蔵器は、カセットの取り出し口へと、配管及びマニホールドによって標準的な技法に従って接続されていてよい。廃棄試薬貯蔵器をカセットの取り出し口に接続するのに好適な配管、アダプタ、及びコネクタは、商業的供給元から容易に入手可能である。

上記カセットは振動子に作動的に連結されている。例えば、該カセットを、振動子に接続されている支持台座に載置してよい。

振動子は、カセットが高周波振動（例えば、３Ｈｚ以上）に供されるように適合されている。好適な振動子は、当該技術分野でよく知られている。

好ましくは、上記装置の他の構成要素、例えば試薬貯蔵器、ポンプ、配管、及びプロセッサは振動されない。

使用時に、脱細胞化試薬は、試薬貯蔵器から移動し、取り入れ口を通じてカセット内に入る。取り入れ口から、脱細胞化試薬は流入導管を通じてチャンバーに移動し、そこで脱細胞化試薬が組織試料を浸漬する。組織試料の処理後に、脱細胞化試薬は、流出導管を通じて取り出し口へと移動する。脱細胞化試薬は、取り出し口を通じてカセットから出て行き、廃棄物貯蔵器に入る。その後に新たな脱細胞化試薬が、本明細書に記載される脱細胞化方式に従って、流入導管を通じて該チャンバー内に導入され得る。

上記装置中での脱細胞化試薬の移動は、ポンプ、空気圧、又は重力を含むあらゆる好適な手段によって駆動され得る。幾つかの好ましい実施の形態では、上記装置は、脱細胞化試薬の移動を駆動するためのポンプを備える。好ましくは、上記装置の各々の試薬貯蔵器は、個別のポンプを有している。このポンプは、各々の貯蔵器における脱細胞化試薬の移動を個別に制御することを可能にする。

上記装置は、組織試料のためのチャンバーにおいて滅菌環境を維持するように適合されていてよい。滅菌性は、脱細胞化の間に、当該技術分野で既知の様々な技法を用いて、例えば空気流の制御及び濾過、及び／又は不所望な微生物の増殖を防ぐための抗生物質、抗真菌薬若しくは他の抗微生物薬の灌流を用いて維持され得る。好適な抗微生物性化合物は、当該技術分野でよく知られている。

上記装置は、脱細胞化方式の動作パラメータ（例えば、圧力、容量、フローパターン、温度、気体、ｐＨ、機械力）をモニターするように適合されていてよい。例えば、そのシステムは、脱細胞化（正：decellularisation）試薬及び／又は組織試料をモニターするセンサを備えていてよい。センサを使用することで、該装置中を移動する脱細胞化試薬の圧力、該システム中の周囲温度及び／又は組織試料若しくは脱細胞化試薬の温度、該装置中を移動する脱細胞化試薬のｐＨ及び／又は流速、及び／又はチャンバー内の組織試料の生物学的パラメータをモニターすることができる。そのような特徴をモニターするためのセンサを有することに加え、上記装置は、そのような特徴を維持又は調節するためのコントロール又はアクチュエータを備えてよい。

コントロールとして、温度計、サーモスタット、電極、圧力センサ、溢出弁、脱細胞化試薬への流体接続の開閉、及び流れの速度及び方向の変更に対する弁等の構成要素が挙げられ得る。

一定の状態（例えば、温度）を保証するために、チャンバー、貯蔵器、及び配管は、ウォータージャケットを備えていてもよく、又は加熱板上に置かれていてもよい。

上記装置は、チャンバー内の組織試料の脱細胞化を制御するためのプロセッサを備えていてよい。該プロセッサは、振動速度、振動期間、ポンプ速度、ポンプ活動時間、並びに温度、圧力、ｐＨ、及び流速のモニタリング及びフィードバックベースの制御を含む脱細胞化方式の変量を定義するプログラム可能な制御ユニット（例えば、ラップトップコンピュータ若しくは独立型コンピュータ、又は一体型コンピュータデバイス）であってよい。該プロセッサは、上記装置中の１個以上のセンサからの情報を受け取り、処理することができる。該プロセッサは、情報及び命令をバイオリアクター及び／又は組織試料へと返送することができる。

上記プロセッサは、予めプログラムされた様々な脱細胞化法の記憶及び実行、全ての好適な条件の制御、並びにプロセス変量の手動操作を可能にし得る。例えば、該プロセッサは、各々の脱細胞化試薬のための曝露時間及び振動速度を、その特定の組織試料について本明細書に記載される脱細胞化方法に応じて、組織試料の重量に基づき計算するように適合又はプログラムされていてよい。該プロセッサは、そのシステム中の１個以上のポンプ及び／又はバルブ制御によって脱細胞化試薬を変更することができ、かつ脱細胞化試薬の流速又は圧力を変化させることができる。

幾つかの実施の形態では、上記プロセッサは、試料チャンバー内の状態を、センサ、例えば生物学的分子をモニターするセンサに呼応して変更することができる。例えば、試料チャンバー内の特定分子の濃度が規定の閾値を超えた場合に、試薬を変更することができる。

本発明の様々な更なる態様及び実施の形態が、本開示を考慮して当業者に明らかとなる。

本発明の他の態様及び実施の形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置き換えられる「含む、備える（comprising）」の用語を有する上に記載される態様及び実施の形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置き換えられる「含む、備える（comprising）」の用語を有する上に記載される態様及び実施の形態を提供する。

本出願は、別段の指示がない限り、あらゆる上の態様及び上に記載される実施の形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、別段の指示がない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。

上の実施の形態の変形、更なる実施の形態及びそれらの変形は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。

本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。

ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として、また以下に記載される図面を参照して解説する。

脱細胞化前（左上）及び脱細胞化後（左下）の５ｍｍ^３の肝臓組織キューブを示す図である。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）組織学的染色は、脱細胞化後の細胞の除去を示した。ＳＲ（シリウスレッド）染色は、脱細胞化された組織におけるコラーゲンの保持（赤色）及び細胞物質の除去（黄色）を示した。 細胞外マトリクスタンパク質（ＥＣＭ）の免疫組織化学分析を示す図である。コラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶ（構造タンパク質）は、ラミニン及びフィブロネクチン（基底膜タンパク質）と同様に脱細胞化後に保持された。 ＤＮＡの定量化を示す図である。脱細胞化法は、ＤＮＡ含量が顕著に減少しており効率的であった（ｐ＜０．０１）。 脱細胞化後のコラーゲンの定量的測定を示す図である。コラーゲンの定量化は、脱細胞化された組織におけるコラーゲンの量が、新鮮な組織と比べて保持されていることを示した。 典型的な小葉性構造によって囲まれる門脈路を含む１５０倍率のＳＥＭ画像を示す図である。さらに、ＳＥＭ画像はスキャフォールドの無細胞状態を確認し、一旦は肝細胞により占拠された空間（すなわち、肝細胞不含空間）を明確に規定する。 脱細胞化前（左上）及び脱細胞化後（左下）の５ｍｍ^３の硬変肝臓組織キューブを示す図である。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）組織学的染色は、脱細胞化後の細胞の除去を示した。ＳＲ（シリウスレッド）染色は、脱細胞化された組織におけるコラーゲンの保持（赤色）及び細胞物質の除去（黄色）を示した。 ＤＮＡ（硬変肝臓）の定量化を示す図である。脱細胞化法は、ＤＮＡ含量が顕著に減少しており効率的であった（ｐ＜０．０１）。 脱細胞化前及び脱細胞化後の膵臓組織の組織学的比較を示す図である。ＳＲ（シリウスレッド）染色は、脱細胞化された組織におけるコラーゲンの保持（赤色）及び細胞物質の除去（黄色）を示した。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）組織学的染色は、脱細胞化後の細胞の除去を示した。 ＤＮＡ（膵臓）の定量化を示す図である。脱細胞化法は、ＤＮＡ含量が顕著に減少しており効率的であった（ｐ＜０．０１）。 脱細胞化前（左）及び脱細胞化後（右）のヒト腸管の組織学的比較を示す図であり、それは、脱細胞化法後に組織の全ての層においてコラーゲン構造が保持されることを示している。 ＤＮＡ（腸管）の定量化を示す図である。脱細胞化法は、ＤＮＡ含量が顕著に減少しており効率的であった（ｐ＜０．０１）。 Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｉｎｖｅｎｔｏｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１４ソフトウェアを使用して作製された上部プレート（Ａ）、中央プレート（Ｂ）、及び下部プレート（Ｃ）の３Ｄ ＣＡＤモデルを示す図である。パネル（Ｄ）は、３Ｄプリントされて完全に組み立てられたカセットを示している。パネル（Ｅ）及び（Ｆ）は、それぞれ、下部プレートと中央プレートとを結合したもの、及び下部プレート単独を示している。

本明細書に記載される組織試料の脱細胞化のための装置の一実施形態は、図１２に示されている。上記装置は、プロセス操作の間に必要とされる脱細胞化試薬を収容する一連の試薬貯蔵器（図示せず）からなる。それらの貯蔵器は、配管（図示せず）を介してカセット２へと接続している。該配管は、試薬駆動ポンプ（図示せず）と結合されている。試薬は、カセット２の下部プレート３に位置する取り入れ口７を介してカセット２へと入り、その後に流入導管８に沿って移動し、そしてカセット２の中央プレート４に位置する複数の試料チャンバー６の間で均等に分けられる。試料チャンバー６へと入るためには、脱細胞化試薬は、好適な膜（図示せず）を流れ通らねばならず、及び／又は中央プレート４に位置するチャンバー６内の試料を保留する突出物１２を通り過ぎねばならない。次いでカセット２全体を、脱細胞化プロトコルに従って振動モーター（図示せず）によって振動させる。次いで試薬は、下部プレートにおける流出導管９を介してカセット２から排出された後、取り出し口１０を通じて該カセットから出て行き、配管及び結合された１個以上の駆動ポンプ（図示せず）を介して外部廃棄物貯蔵器（図示せず）へと進む。排出の間に、除去される試薬は、カセット２の上部プレート５における一連の導管を介して該カセットへと入る濾過された空気と置き換わる。試薬は、疎水性膜（図示せず）、及び／又は上部プレート５における突出物２０によって、これらの導管に入ることが妨げられる。このプロセスの停止状態の間に、試薬及び／又は組織を、オフラインプロセスのアッセイのために一体型の試料採取口（図示せず）を介して試料採取することもできる。プロセス全体は、該プロセスの全ての局面の予め決められた制御及びフィードバックループに応じた制御の両方を可能にするプロセッサ（図示せず）を介して制御される。

実験
１． Ｇ力の測定
生物学的組織を脱細胞化するために使用される新規システムは、単振動子であるとみなされる。それというのも、復元力が変位と正比例し、変位の方向と反対方向に作用する一定の振幅及び振動数での周期運動において該システムに作用する力が１つだけ存在するからである。このことから、脱細胞化の間に組織及び試薬が受けるＧ力の計算を可能にする等式を構築することができる。したがって、振動数ｆ（Ｈｚ）及び振幅Ｕ＾（ｍ）を有する単弦運動を受ける生物学的組織は、変位０（すなわち、ｘ＝０及びｔ＝０）から始めると仮定して、ｘ＝Ｕ＾ｓｉｎ（ｆ×２×π×ｔ）の位置を占めることとなる（組織とそれを取り囲む溶液との間の密度差の考慮は無視することができる）。さらに、単弦運動下に移動する粒子（又はこの場合には組織）は、等式ｘ’’＝−ｗ２ｘ（式中、ｗ＝２×π×ｆ）を有することとなる。これらの等式を、力（Ｆ）が質量（ｍ）と加速度（ａ）とをかけたものと等しくなる（Ｆ＝ｍａ）というニュートン第二法則に代入すると、等式Ｆ＝−ｍ［（２×π×ｆ）２］×Ｕ＾ｓｉｎ（ｆ×２×π×ｔ）が得られる。これは、｜ｓｉｎ｜＝１の場合に極値化される。したがって、Ｆ＝±Ｕ＾ｍ［（２×π×ｆ）２］の場合にその極大値／極小値にあることとなる。最後に、その等式を、重力によって与えられる力（ｍｇ）によって割ることによって、Ｇ力についての等式は、（Ｕ＾／ｇ）×［（２×π×ｆ）２］に等しくなる。

２． 試薬
略語：ＳｄＣ デオキシコール酸ナトリウム；ＰＢＳ／ＡＡ ＰＢＳ＋抗生物質性抗真菌薬；Ｔ／Ｅ ０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ０．０２５％；ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＸ１００ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００；ＲＴ 室温；ＰＡＡ 過酢酸
；ＥｔＯＨ エタノール。

デオキシコール酸ナトリウム溶液（ＳｄＣ）４％：４０ｇのデオキシコール酸ナトリウム（ＢｉｏＸｔｒａ、≧９８．０％（Sigma-Aldrich社））を、１Ｌの脱イオン水（Millipore社製のＭｉｌｌｉＱ）に添加し、マグネチックスターラーを使用して１時間にわたり撹拌する。

食塩水溶液８．７％：８７ｇの塩化ナトリウム（＞９９％（Sigma-Aldrich社））を、１Ｌの脱イオン水（Millipore社製のＭｉｌｌｉＱ）に添加し、マグネチックスターラーを使用して１時間にわたり撹拌する。

試薬混合物溶液（ＳｄＣ ３％、ＳＤＳ ０．５％、ＴＸ１００ ０．３％、Ｔ／Ｅ ０．０２５％、ＮａＣｌ ４．３％）：３０ｇのデオキシコール酸ナトリウム（ＢｉｏＸｔｒａ、≧９８．０％（Sigma-Aldrich社））、５ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＢｉｏＸｔｒａ、≧９９．０％（Sigma-Aldrich社））、３ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Sigma-Aldrich社）、１０ｍｌの０．２５％のＧｉｂｃｏ（商標）トリプシン−ＥＤＴＡ（Life technologies社）及び４３ｇの塩化ナトリウム（Sigma-Aldrich社）を、脱イオン水（Millipore社製のＭｉｌｌｉＱ）に添加して合計１Ｌにし、マグネチックスターラーを使用して撹拌する。

過酢酸（ＰＡＡ）０．１％：１ｍｌの過酢酸溶液（高純度級、酢酸中約３９％（Sigma-Aldrich社））を、１Ｌの脱イオン水（Millipore社製のＭｉｌｌｉＱ）に添加し、マグネチックスターラーを使用して１時間にわたり撹拌する。

水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ）０．１％：１ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（ＡＣＳ試薬、２８．０％〜３０．０％のＮＨ_３ベース（Sigma-Aldrich社））を、１Ｌの脱イオン水（Millipore社製のＭｉｌｌｉＱ）に添加し、マグネチックスターラーを使用して１時間にわたり撹拌する。

３．方法
３．１ 組織の脱細胞化
生物学的組織を脱細胞化するためのプロトコルは、本明細書の他の場所に記載されており、かつ表２及び表３に示される。

プロトコルの完了後に、無作為な試料を選択し、組織学的研究、及び免疫組織化学研究のために１０％ホルマリン中に固定化し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃の冷凍庫で、ＤＮＡ、コラーゲン、及びエラスチンの定量化アッセイに必要となるまで貯蔵し、ＳＥＭイメージングのために２．５％グルタルアルデヒド中に固定化するか、又は１％ＰＢＳ中４℃で、生物工学実験のために必要となるまで貯蔵する。

最初に肝臓キューブを３７℃の水浴中で１時間（ｈｒ）にわたり解凍させ、引き続き１．２ｍｌの１％ＰＢＳを１５分間（ｍｉｎ）にわたり添加する。解凍されたら、該キューブを２ｍｌのセーフロックチューブ（Eppendorf社）中に移す。各々の溶液の標準化された１．５ｍｌ分を、その評価の高いチューブ／プロトコルに添加する。

３．２ 組織学及び免疫組織化学
事前に１０％のホルマリン中で固定化された組織試料を、回収し、蒸留水中で洗浄し、一連の工業用変性アルコール（ＩＤＡ）（Acquascience社）浴及びキシレン浴中で脱水し、最後にパラフィン中に包埋させた。次いで、それらの試料を、Ｌｅｉｃａ ＲＭ２０３５ミクロトーム（Leica Biosystems社）を使用して５μｍの切片にスライスした。次いで、全ての切片を３つの組織学グレードのキシレン（Acquascience社）浴に最短で５分間にわたり通過させ、その後に３つのＩＤＡ（Acquascience社）浴に最短で２分間にわたり通過させ、最後に水道水中で終えた。

３．３ 組織学
切片を、室温で以下のように染色した：
ヘマトキシリン及びエオシン：切片を、ハリスの処方のヘマトキシリン（Leica biosystems社）で１０分間にわたり処理した後、水道水中で５分間にわたり洗浄した。次に、該切片をエオシン（Leica biosystems社）で３分間にわたり染色した後、再び水で洗浄した。次いで、該切片をＩＤＡ（工業用変性アルコール）（Acquascience社）によってできるだけ素早く脱水した後、マウントするまで組織学グレードのキシレン（Acquascience社）中に入れた。

ピクロシリウスレッド：切片を、濾過したてのピクロシリウスレッド−Ｆ３８（R.A. Lamb社；ＣＩ−３５７８０）で２０分間にわたり処理した。次いで、該切片をＩＤＡ（Acquascience社）によってできるだけ素早く脱水した後、マウントするまで組織学グレードのキシレン（Acquascience社）中に入れた。

エラスチカワンギーソン：切片を０．５％の過マンガン酸カリウムで５分間にわたり処理し、蒸留水で入念に洗浄した。次に、それらの切片を、１％のシュウ酸で１分間にわたり処理し、蒸留水で洗浄した後、無水アルコールで洗浄した。次いで、切片をニートのミラーのエラスチカ（Elastic）（R.A. Lamb社；ＬＡＭＢ／０８０Ｄ）で２時間にわたり染色し、７０％の工業用メチル化アルコール（ＩＭＳ）（Fisher scientific社）で入念に洗浄した後、水道水中に入れた。該切片を、顕微鏡下で調査し、必要に応じて０．５％酸−アルコール（７０％ＩＤＡ水溶液中１％ＨＣｌ）中で弁色した。最終工程として、該切片をワンギーソン（Leica biosystems社）で５分間にわたり染色した。次いで、該切片をＩＤＡ（Acquascience社）によってできるだけ素早く脱水した後、マウントするまで組織学グレードのキシレン（Acquascience社）中に入れた。

３．４ 免疫組織化学
スライドを、１０％のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中０．５％トリプシン（MP Biomedical社）／０．５％キモトリプシン（Sigma社）／１％塩化カルシウム（BDH社）中にて３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、スライドを、０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０（Sigma社）を含むｐＨ７．６の１０％ＴＢＳ中で５分間にわたり洗浄した。その後に、そのスライドを、過酸化物ブロッキング溶液（Novocastra社）中で５分間にわたりブロッキングし、以下の一次抗体：コラーゲンＩ（ｃｏｌｌ１に対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ３４７１０）、１：２００希釈；abcam社）、コラーゲンＩＩＩ（ｃｏｌｌ３に対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ７７７８）、１：５００希釈；abcam社）、コラーゲンＩＶ（ｃｏｌｌ４に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍ０７８５）、１：２５希釈；Dako社）、フィブロネクチン（フィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ１９３７）、１：１００希釈；Millipore社）及びラミニン（ラミニンα５鎖に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ１９２４）、１：２００希釈；Millipore社）中で１時間にわたりインキュベートした。次いで、該スライドを、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ（商標）のポストプライマリー（Novocastra社）中で２５分間、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ（商標）のポリマー溶液（Novocastra社）中で２５分間置き、そしてＮｏｖｏｌｉｎｋ（商標）の３，３’−ジアミノベンジジン（Novocastra社）で発色させた。該スライドを、最終的にマイヤーのヘマトキシリン（Sigma社）で１分間にわたり対比染色した。

全ての切片をＤＰＸ（leica biosystems社）でマウントし、カバースリップを載せ、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ４０を使用して観察した。画像をＡｘｉｏｃａｍ ＩｃＣ５でＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ（バージョン４．８．２）を用いてキャプチャした。全ての画像をＦｉｊｉ ｖ１．４９ｄ（ＩｍａｇｅＪ Ｊｅｎｋｉｎｓサーバ）を使用して解析し、強調させた。

３．５ ＤＮＡの定量化
全てのプロトコルのために使用される脱細胞化された組織キューブを−８０℃の冷凍庫から取り出し、３７℃の水浴中で１時間にわたり解凍させた。次いで、それらの肝臓キューブの重量を量り、必要に応じて１５ｍｇから２５ｍｇの間の重量で切り出した。次いで、それらのキューブを１．５ｍｌ容の微量遠心分離チューブ中に入れた。２０μｌのプロテイナーゼＫを各々に添加した後、ボルテックスを用いて入念に混合した。次いで、それらのキューブを、少なくとも１６時間にわたって、又はキューブが完全に溶解されるまで、５６℃の加熱ブロック中に入れた。次いで、ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用して製造業者の指示に従って抽出した。抽出されたＤＮＡを、２００μｌのバッファーＡＥ中で溶出させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−２０００分光光度計を使用して定量化した。

３．６ コラーゲンの定量化
生得の組織及び脱細胞化された組織のコラーゲン含量を、トータルコラーゲン定量アッセイキットを使用して製造業者のマニュアル（QuickZyme Biosciences社（オランダ））に従って定量化した。簡潔には、試料を６ＭのＨＣｌ中にて９５℃で２０時間にわたり加水分解させ、加水分解物を、ヒドロキシプロリン残基を染色するクロモゲン溶液と混合し、６０℃で１時間にわたり発色させた。各々の試料の吸光度を、５５５ｎｍでＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（BMG labtech社（ドイツ））を使用して測定し、そしてコラーゲン量を、純粋なコラーゲン加水分解物の標準曲線を使用することによって計算した。

３．７ 走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）
試料を、０．１Ｍリン酸緩衝液中２．５％グルタルアルデヒド中で固定化し、４℃で２４時間にわたり静置した。０．１Ｍのリン酸緩衝液で洗浄した後に、試料を約１ｃｍ長の区分で切り、０．０５ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２５％ショ糖、１０％グリセロール中で２時間にわたり凍結保護し、次いでスラッシュ窒素中で急速凍結させ、約−１６０℃で割断した。次に、試料をその後、室温で上記凍結保護剤中に戻し入れ、解凍させた。０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で洗浄した後に、該材料を、１％ＯｓＯ_４／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中にて３℃で１時間半にわたり固定化し、再び０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で洗浄した。ｄＨ_２Ｏですすいだ後に、試験片を１００％エタノールまでの段階的な系列のエタノール−水中で脱水し、ＣＯ_２を用いて臨界点乾燥させ、最後に粘着性カーボンテープを使用してアルミニウムスタブ上にマウントした。割断した材料を、割断表面が実質組織全体にわたって光線に当たるようにマウントし、Gatan社のイオンビームコーターを使用してＡｕ／Ｐｄの薄膜（約２ｎｍ厚）でコートした。画像を、７４０１ ＦＥＧ走査型電子顕微鏡（Jeol社（米国））で記録した。

３．８ 生体工学的手法
生物学的スキャフォールドを、完全培地中で一晩保持した（−１日目）。細胞を、スキャフォールド（細胞系統当たりｎ≧１２）につき、５０μｌ当たり２００００００個の細胞（２×１０^６／５０μＬ）の濃度で再懸濁した。細胞を０．５ｍｌのインスリン用シリンジ中に吸い上げ、そして一滴一滴放出して、最終的に脱細胞化された組織を覆った。播種されたスキャフォールドを、加湿環境中で３７℃において５％ＣＯ_２で２時間にわたり保持し、細胞を付着させ、その後に完全培養培地を添加した（０日目）。培養培地を１日目に変更し、その後に３日毎に変更した。播種後７日目、１４日目、及び２１日目に、該スキャフォールドを１０％ホルムアルデヒド中に入れ、組織学及び免疫組織化学によって評価するか、又は２．５％グルタルアルデヒド中で固定化して、ＳＥＭ分析を行った。

４．結果
脱細胞化された健康な肝臓キューブ（ＨＬ３、ＨＬ４、ＨＬ３６、及びＨＬ４３）は、全て肉眼で見て半透明であり、色は白色であった（図１）。血管網も目に見え、組織はそのキューブ状構造を維持していた。さらに、生得の肝臓組織及び脱細胞化された肝臓組織の両方を、核物質（Ｈ＆Ｅ染色）及び細胞残部（ＳＲ染色）について組織学的に調べた。脱細胞化プロトコルは、全ての細胞物質の除去に成功した（図１）。これは、脱細胞化された肝臓キューブ中に残存するＤＮＡの量の定量化によって確認され、その量は、新鮮な肝臓組織のその量よりも有意に（ｐ＜０．００１）低かった（図３）。

ＥＣＭタンパク質の保持を調査するために、免疫組織染色を実施した。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、及びラミニンといった５種のＥＣＭタンパク質を調査した（図２）。コラーゲンＩ、及びコラーゲンＩＩＩは、門脈領域内壁に見出すことができ、その一方で、コラーゲンＩＶ、及びフィブロネクチンは、肝小葉内に明らかに認められた。ラミニン染色は、血管及び胆管の付近で陽性であった。同様に、コラーゲンの定量化により、脱細胞化された肝臓キューブが、新鮮な組織と比べた場合、コラーゲンを保持し得ることが裏付けられた（図４）。

さらに、脱細胞化された肝臓キューブを、走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）により分析した。ＳＥＭ画像は、スキャフォールドの無細胞性を確認し、肝細胞によって一旦占拠された明確に規定される空間（すなわち、肝細胞不含空間）の存在を示した。門脈路及び小葉構造と同様に、肝細胞不含空間を組織する結合組織線維の三次元網目構造が非常に保持されていることが分かった（図５）。スキャフォールドの機械的特性を更に調査するために、生得の組織及び脱細胞化された組織の剛性を、原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）を使用して測定した。これにより、生得の組織と脱細胞化された組織との間で剛性に有意差がないことが明らかになった。

脱細胞化された肝臓スキャフォールドを、様々な種類のヒト肝臓の実質細胞及び非実質細胞によって再増殖させた。これらの細胞は、優れた生存能力、運動性、及び細胞外マトリクスのリモデリングを示すことが分かった。さらに、生体工学により作られたスキャフォールドは、標準的な２Ｄシステムと比べた場合、遺伝子発現に顕著な差を示した。

脱細胞化された硬変肝臓組織（ＨＬＣ１）の色は、同様に白色であった。同様に、血管網も目に見え、組織はそのキューブ状構造を維持していた。さらに、生得の肝臓組織及び脱細胞化された硬変肝臓組織の両方を、核物質（Ｈ＆Ｅ染色）及び細胞残部（ＳＲ染色）について組織学的に調べた。脱細胞化プロトコルは、全ての細胞物質の除去に成功した（図６）。これは、脱細胞化された肝臓キューブ中に残存するＤＮＡの量の定量化によって確認され、その量は、新鮮な硬変肝臓組織のその量よりも有意に（ｐ＜０．００１）低かった（図７）。

脱細胞化された硬変肝臓組織は、線維性組織を特徴付ける歪んだ肝臓構造を維持することも可能であった。これは、ＳＲ染色及びＨ＆Ｅ染色の両方で見ることができ、それらの染色により、よく保持された結節及び線維性隔壁が示されている。

脱細胞化された膵臓組織を、核物質（Ｈ＆Ｅ染色）及び細胞残部（ＳＲ染色）について組織学的に調べた。脱細胞化プロトコルは、ほとんどの細胞物質の除去に成功した（図８）。これは、脱細胞化された膵臓キューブ中に残存するＤＮＡの量の定量化によって確認され、その量は、新鮮な膵臓組織のその量よりも有意に（ｐ＜０．００１）低かった（図９）。膵臓構造も保持された。ＳＲ染色及びＨ＆Ｅ染色の両方とも、ランゲルハンス島が位置している箇所のＥＣＭの保持を明確に示している（図８）。

最後に、脱細胞化された腸管組織を、細胞残部（ＳＲ染色）について組織学的に調べた。脱細胞化プロトコルは、全ての細胞物質の除去に成功した（図１０）。これは、脱細胞化された腸管キューブ中に残存するＤＮＡの量の定量化によって確認され、その量は、新鮮な腸管組織のその量よりも有意に（ｐ＜０．００１）低かった（図１１）。腸管微細構造も保持された。ＳＲ染色は、全ての４つの腸管層、つまり繊毛性粘膜、粘膜下組織、外筋層、及び外膜の保持を明らかに示している（図１０）。

Claims (43)

1. 脱細胞化された組織スキャフォールドの製造方法であって、
   （ｉ）組織試料を準備する工程と、
   （ｉｉ）前記試料を浸透圧試薬で処理する工程と、
   （ｉｉｉ）前記試料を界面活性剤で処理する工程と、
   を含み、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を繰り返し、前記組織試料を、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の間に、１ｍｍ以上の変位及び３Ｈｚ〜１００Ｈｚの周波数を有する線形一次元の振動に供し、前記振動が前記組織試料に６ｍｓ^−２〜５０ｍｓ^−２のｇ力を与えることで、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する、方法。
2. 前記試料を、３Ｈｚ〜７５Ｈｚでの振動に供する、請求項１に記載の方法。
3. 前記振動は、５ｍｍ〜５０ｍｍの変位を有する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記組織試料は、０．００８ｃｍ^３〜１０ｃｍ^３の体積を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記組織試料は、０．００８ｃｍ^３〜１ｃｍ^３の体積を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記組織試料は、腎臓、筋肉、骨、脂肪、軟骨、肺、膀胱、角膜、皮膚、肝臓、脾臓、胎盤、腸管、膵臓、前立腺、乳房、又は心臓である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記組織試料は、ヒト組織試料である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記組織試料は、非病的組織である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記組織試料は、損傷又は疾患と関連する病状を呈する病的組織である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程（ｉｉ）は、浸透圧試薬に対する１回以上の曝露を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程（ｉｉｉ）は、界面活性剤に対する１回以上の曝露を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記試料を、それぞれが工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む１回以上の処理サイクルに供する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記浸透圧試薬は、低張剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記低張剤は、脱イオン水である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記界面活性剤は、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム（ＳｄＣ）を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記組織試料を、プロテアーゼと組み合わせて界面活性剤で処理する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記プロテアーゼは、トリプシンである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記組織試料を、ＳＤＳ、ＳｄＣ、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））、及びトリプシンを含む溶液で処理する、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記試料を、工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｉｉｉ）の後に洗浄する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記組織試料中の細胞を、工程（ｉ）において機械的に傷害する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記細胞を、前記組織試料の凍結及び解凍によって機械的に傷害する、請求項２３に記載の方法。
25. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を０回〜５０回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）を０回〜１０回繰り返す工程と、
    （ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を０回〜１０回繰り返す工程と、
    （ｉ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｊ）工程（ｉ）を０回〜１０回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. （ａ）前記組織試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を４回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｅ）を４回繰り返す工程と、
    （ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と、
    （ｉ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
27. （ａ）前記組織試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を１０回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）を４回繰り返す工程と、
    （ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と、
    （ｉ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
28. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を１１回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｇ）前記試料を食塩水に５分間にわたり曝露する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記組織試料は、肝臓試料である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を５回〜１０回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤に曝露する工程と、
    （ｄ）工程（ａ）を５回〜１０回繰り返す工程と、
    （ｅ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｆ）任意に、工程（ａ）〜（ｅ）を１回以上繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記組織試料は、腎臓試料又は心臓試料である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記組織試料を、５０Ｈｚで鉛直方向に振動させる、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を１９回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）を４回繰り返す工程と、
    （ｈ）工程（ａ）〜（ｅ）を２回繰り返す工程と、
    （ｉ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
34. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を９回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す工程と、
    （ｇ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
35. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を１０回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
36. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を２０回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）を５回繰り返す工程と、
    （ｈ）工程（ａ）〜（ｄ）を５回繰り返す工程と、
    （ｉ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｊ）工程（ｉ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
37. （ａ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）を４回繰り返す工程と、
    （ｃ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに２分間にわたり曝露する工程と、
    （ｄ）前記試料を界面活性剤及びプロテアーゼに４分間にわたり曝露する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｆ）前記試料を過酢酸（ＰＡＡ）に曝露する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）を１回繰り返す工程と、
    （ｈ）前記試料を水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ）に曝露する工程と、
    （ｉ）工程（ｈ）を２回繰り返す工程と、
    （ｊ）前記試料を脱イオン水に曝露する工程と、
    （ｋ）工程（ｊ）を１０回繰り返す工程と、
    （ｌ）工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す工程と、
    （ｍ）前記試料を食塩水に曝露する工程と、
    （ｎ）工程（ｍ）を２回繰り返す工程と、
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記組織試料は、肝臓試料、膵臓試料、又は腸管試料である、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記組織試料を、３０Ｈｚで水平方向に振動させる、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記組織試料を、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各々の繰り返しにおいて、前記浸透圧試薬及び／又は界面活性剤に２分間〜４分間にわたり曝露する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記スキャフォールドを脱細胞化の後に滅菌することを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記脱細胞化されたスキャフォールドを細胞によって再増殖させることで、再細胞化されたスキャフォールドを製造することを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. ＥＣＭバイオマーカーの同定方法であって、
    請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法により製造された脱細胞化された組織スキャフォールドを準備することと、
    前記スキャフォールドをプロテアーゼに曝露することと、
    前記スキャフォールドの１種以上の成分のプロテアーゼによる分解を測定することと、
    前記プロテアーゼにより分解された１種以上の成分をＥＣＭバイオマーカーとして同定することと、
    を含む、方法。

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