ES2843977T3 - Métodos para la producción de armazones de tejido descelularizados - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un armazón de tejido descelularizado, que comprende: (i) tratar una muestra de tejido con un reactivo osmótico y (ii) tratar la muestra con un detergente, en donde la muestra de tejido se somete a oscilación con un desplazamiento de 1 mm o más y una frecuencia de 3 a 100 Hz durante las etapas (i) y (ii), produciendo de este modo un armazón de tejido descelularizado.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la producción de armazones de tejido descelularizados
La presente invención se refiere a la producción de armazones de matriz extracelular (MEC), por ejemplo, para su uso en terapia, el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos, diagnósticos y el descubrimiento de biomarcadores.
La ingeniería de tejidos es un campo emergente con el objetivo de mejorar la calidad de vida de millones de personas en todo el mundo restaurando la función de órganos y proporcionando plataformas en 3D para estudiar enfermedades humanas ex vivo. Un reto clave en la ingeniería de tejidos es el desarrollo de estructuras en 3D ("armazones") que reproduzcan la arquitectura fisiológica y la composición de los tejidos y órganos.
Normalmente se usan cultivos celulares en 2D y modelos animales como modelos preclínicos para estudiar enfermedades en seres humanos. Aunque se ha obtenido información útil a partir de estos modelos, ambos sistemas se caracterizan por varias limitaciones, que incluyen: desdiferenciación celular temprana y senescencia temprana cuando se encuentran en cultivo, ausencia de comunicación cruzada tumoral-estromal bidireccional, expresión génica y de proteínas alterada, ausencia de correlación con la biología humana y la toxicidad específica de especie.
Los armazones biológicos compuestos por matriz extracelular (MEC) se producen mediante la descelularización de muestras de tejido. La integridad, la bioactividad y la organización en 3D de la MEC pueden conservarse en los armazones descelularizados. Sin embargo, la producción de armazones biológicos es compleja debido a la ausencia de pedículos/vasos que puedan canularse para posibilitar la perfusión-descelularización. Los protocolos publicados se caracterizan por agitación a baja velocidad y requieren una exposición prolongada (por ejemplo, de semanas) del tejido a los reactivos de descelularización. Además, estos protocolos no son eficaces para la descelularización completa de tejidos a pequeña escala y normalmente se daña la superficie exterior del tejido por la exposición continua a detergentes y enzimas.
Se han publicado procesos para la descelularización de tejidos y órganos completos en Crapo et al. Biomaterials 32 (12) 3233-3243 (2011). Se ha publicado la producción de un hígado descelularizado usando una serie de extracciones en el documento US2005/0249816. Se ha publicado el uso de descelularización en la reparación de tejidos del SNC en Wang et al. Expert Rev Neurother 15(5) 493-500 (2015). Se han publicado los efectos de los métodos de procesado en las propiedades mecánicas y biológicas de armazones de matriz extracelular dérmica porcina en Reing et al. Biomaterials 31 (3) 8626-8633 (2010). Se ha publicado la descelularización y la siembra con células de armazones biológicos de hígados completos en Faulk et al. J Clin Exp Hepatol 2014569-90.
Los presentes inventores han reconocido que pueden descelularizarse diversos tipos de tejidos sin dañar la matriz extracelular usando regímenes de tratamiento que se caracterizan por uno o más ciclos de tratamiento con conjuntos de diferentes agentes que dañan las células con oscilación a alta frecuencia. Estos regímenes pueden ser útiles en la producción reproducible de armazones acelulares que mantienen la arquitectura en 3D y la composición de la matriz extracelular y la morfología del tejido nativo.
Un aspecto de la invención proporciona un método para producir un armazón de tejido descelularizado que comprende:
(i) tratar una muestra de tejido con un reactivo osmótico y
(ii) tratar la muestra con un detergente,
en donde la muestra de tejido se somete a oscilación con un desplazamiento de 1 mm o más y una frecuencia de 3 a 100 Hz durante las etapas (i) y (ii),
produciendo de este modo un armazón de tejido descelularizado.
Un armazón de tejido descelularizado producido mediante los métodos reivindicados consiste en una matriz extracelular acelular (MEC) de la fuente de tejido y conserva la arquitectura tridimensional, la composición de la MEC y la bioactividad de la MEC del tejido de origen.
Puede producirse un armazón de tejido descelularizado usando los métodos descritos en el presente documento en menos de 6 horas, menos de 3 horas o menos de 2 horas.
Durante el tratamiento con el reactivo osmótico, el detergente y otros reactivos de descelularización, se somete la muestra de tejido a oscilación a alta frecuencia, es decir, oscilación a 3 Hz o más. Esta oscilación potencia la distribución de los reactivos en el tejido, aumenta la eficiencia de la lisis celular y/o mejora la descarga de los componentes celulares o inmunogénicos del tejido. Esto reduce el tiempo necesario para la descelularización completa, a la vez que se conservan las proteínas de la MEC, la arquitectura histológica en 3D y la capacidad de la MEC para inducir el asentamiento, la diferenciación y la proliferación de las células.
La oscilación puede ser en un solo plano, preferentemente en una sola dimensión lineal o línea. Puede emplearse cualquier dirección o plano de oscilación. Por ejemplo, la oscilación puede ser horizontal (es decir, perpendicular respecto a la fuerza de la gravedad) o vertical (es decir, paralela a la fuerza de la gravedad).
Puede hacerse oscilar la muestra a una frecuencia de 3 Hz o más, 5 Hz o más o 10 Hz o más y hasta 100 Hz, hasta 75 Hz, hasta 50 Hz o hasta 30 Hz. Los intervalos de frecuencia de oscilación adecuados incluyen uno cualquiera de los límites inferiores listados, en combinación con cualquiera de los límites superiores listados. Por ejemplo, puede hacerse oscilar la muestra a de 3 a 75 Hz, por ejemplo, de 10 a 50 Hz.
La oscilación puede someter la muestra a una fuerza g de 4 a 500 ms-2, preferentemente de 40 a 50 ms-2, por ejemplo, de 42 ms-2 a 47 ms-2. Por ejemplo, la oscilación en cualquier dirección puede efectuarse a de 1,8 ms-2 a 181,1 ms-2, preferentemente a aproximadamente 45,3 ms-2.
El desplazamiento de las oscilaciones puede ser de 1 mm o más, 5 mm o más, 7,5 mm o más o 10 mm o más y hasta 50 mm, hasta 30 mm o hasta 25 mm. Los intervalos de desplazamiento adecuados pueden incluir uno cualquiera de los límites inferiores listados, en combinación con cualquiera de los límites superiores listados. Por ejemplo, puede hacerse oscilar la muestra con un desplazamiento de 5 a 50 mm, preferentemente de 7,5 a 25 mm. Se conocen bien en la técnica motores de oscilación y otros aparatos para la oscilación de las muestras de tejido. Los medios adecuados incluyen disruptores de tejidos oscilantes. Por ejemplo, pueden hacerse oscilar muestras de tejido en una dirección vertical usando un dispositivo TissueLyser Lt ™ (Qiagen NV, NL) o en una dirección horizontal usando un dispositivo TissueLyser n™ (Qiagen, NV, NL).
Las muestras de tejido adecuadas para la descelularización como se describe en el presente documento incluyen secciones o bloques con una longitud, anchura o diámetro de 0,1-4 cm, por ejemplo, de 0,2-1,0 cm (por ejemplo, una sección con un volumen de 0,005 cm3 a 10 cm3, por ejemplo, de 0,008 cm3 a 1 cm3, por ejemplo, aproximadamente 0,125 cm3). La sección o el bloque puede tener cualquier forma. Preferentemente, la sección es de un tamaño adecuado para su manipulación en recipientes de laboratorio convencionales, tales como placas multipocillo y pueden ser, por ejemplo, aproximadamente cúbicas con caras de aproximadamente 0,5 cm.
Las secciones o pedazos pequeños no vascularizados pueden ser útiles para reproducir la complejidad del microambiente tisular en 3D a pequeña escala para el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos. Pueden obtenerse muestras adecuadas mediante biopsia en sacabocados, biopsia con aguja, escisión con bisturí o usando una máquina cortadora automática o no automática.
Las muestras de tejido adecuadas incluyen muestras de riñón, músculo, hueso, tejido adiposo, cartílago, pulmón, vejiga, córnea, piel, hígado, intestino, páncreas, próstata, mama, bazo, placenta y corazón. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede incluir una combinación de diferentes tejidos, tal como la cola de un animal. La muestra de tejido puede ser de tejido de mamífero, por ejemplo, tejido de cerdo, oveja, roedor, primate no humano o de ser humano. Preferentemente, la muestra de tejido es de tejido humano.
El tejido humano para la descelularización puede obtenerse de órganos humanos que no son aptos para su uso clínico en trasplantes. Los órganos adecuados pueden obtenerse conforme a lo dispuesto en las legislaciones nacionales y las guías éticas pertinentes. Además de esto, el tejido humano puede obtenerse mediante resección de tejidos después de una cirugía.
En algunas realizaciones, el tejido muestreado puede ser tejido normal que no muestra la patología asociada con daño o enfermedad.
En otras realizaciones, el tejido muestreado puede ser tejido patológico que muestra la patología asociada con daño o enfermedad. Por ejemplo, el tejido muestreado puede ser adiposo, fibrótico, canceroso, estar inflamado o presentar uno u otros rasgos más asociados con enfermedad o daño. En algunas realizaciones, el tejido patológico puede presentar la patología asociada con enfermedad aguda o crónica, lo que incluye infecciones víricas, daño por alcohol o toxinas, fibrosis, amiloidosis y cáncer. Los ejemplos de tejido patológico incluyen tejido hepático fibrótico, cirrótico o canceroso (de diferentes etiologías), tejido renal amiloidótico, tejido cardíaco amiloidótico, tejido intestinal fibrótico, por ejemplo, de un paciente con enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o enteropatía inflamatoria (EI), tejido pancreático canceroso, tejido pulmonar fibrótico y tejido mamario canceroso.
Los armazones descelularizados producidos a partir de muestras de tejido patológico pueden tener una composición y estructura diferentes a la de los armazones producidos a partir de muestras de tejido sano. Por ejemplo, la morfología del armazón patológico o las cantidades o cantidades relativas de componentes de la MEC, tales como colágeno, tenascina y laminina, pueden estar alteradas en los armazones de muestras de tejido patológico en comparación con las muestras de tejido sano. Las manifestaciones características de una enfermedad (por ejemplo, proteína amiloidogénica) pueden estar asociadas con la MEC y pueden conservarse durante la descelularización, aumentando de este modo la sensibilidad del diagnóstico. Esto puede ser útil para obtener armazones modificados por una enfermedad específica para el modelado de la enfermedad, el cribado de fármacos y el diagnóstico.
Puede obtenerse tejido patológico de un individuo con una enfermedad.
Los métodos para obtener y almacenar el tejido y las muestras de tejido para la descelularización como se describe en el presente documento se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, puede heparinizarse el tejido para prevenir la coagulación y/o perfundirse con agentes crioprotectores. Los crioprotectores adecuados incluyen DMSO, etilenglicol, propilenglicol, glicerol, 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD) y sacarosa.
La muestra de tejido se descelulariza por medio de una serie de exposiciones secuenciales a reactivos de descelularización, que incluyen reactivos osmóticos, detergentes y opcionalmente proteasas y otras enzimas, mientras que somete a oscilación. La combinación de oscilación y exposición secuencial a reactivos de descelularización desprende las células y los restos celulares de la matriz extracelular (MEC) de la muestra de tejido y los retira sin dañar la MEC.
La muestra de tejido puede exponerse a un reactivo de descelularización sumergiendo el tejido en el reactivo. Posteriormente, se hace oscilar la muestra sumergida.
La muestra de tejido puede hacerse oscilar de manera continua durante la descelularización o puede detenerse la oscilación para posibilitar la eliminación del reactivo de descelularización anterior y la adición de nuevo reactivo de descelularización.
Cada etapa de exposición de la muestra de tejido a un reactivo de descelularización puede comprender uno o más tratamientos separados con el reactivo de descelularización. Por ejemplo, la etapa (ii) puede comprender uno, dos, tres o más tratamientos separados con un reactivo osmótico. La etapa (iii) puede comprender uno, dos, tres o más tratamientos separados con un detergente.
El orden de exposición a los diferentes reactivos de descelularización se basa en sus diferentes mecanismos de acción. Opcionalmente, las células en la muestra pueden inicialmente dañarse de manera mecánica para promover una intensa ruptura celular. La exposición a soluciones hipotónicas (etapa ii) intensifica la lisis celular, mientras que se eliminan por lavado los materiales celulares. El tejido se expone a detergente (etapa iii) para eliminar por lavado de manera eficaz los materiales celulares.
Un método puede comprender repetir la etapa (ii) y/o la etapa (iii) una o más veces. Por ejemplo, puede exponerse la muestra de tejido a múltiples ciclos de tratamiento con reactivos de descelularización. Por ejemplo, puede someterse la muestra de tejido a múltiples ciclos de tratamiento que comprenden las etapas (ii) y (iii), por ejemplo, la muestra de tejido puede someterse a al menos 2, al menos 3 o al menos 4 ciclos de tratamiento que comprenden las etapas (ii) y (iii).
El estrés osmótico provoca la lisis de las células en la muestra de tejido e intensifica los efectos del daño mecánico. El estrés osmótico puede inducirse exponiendo la muestra de tejido a uno o más reactivos osmóticos que tienen una presión osmótica diferente para las células en el tejido (es decir, un reactivo no isotónico). Puede exponerse el tejido a uno o más reactivos hipotónicos que tienen una menor presión osmótica que las células y se somete a las células a un ambiente hipotónico y/o a uno o más reactivos hipertónicos, que tienen una mayor presión osmótica que las células y se somete a las células a un ambiente hipertónico. En algunas realizaciones, se pueden preferir reactivos hipotónicos.
Los reactivos hipertónicos pueden ser útiles, por ejemplo, para disociar el ADN de las proteínas. Se conocen en la técnica reactivos hipertónicos adecuados e incluyen agua, solución salina (por ejemplo, NaCl >0,9 % (p/v), por ejemplo, NaCl del 3% al 10% (p/v)), que opcionalmente pueden estar tamponados con fosfato, borato o Tris, polietilenglicol y soluciones de dextrosa.
En algunas realizaciones preferidas, el agente osmótico es solución salina, por ejemplo, NaCl al 8,7 % (p/v).
Los reactivos hipotónicos pueden ser útiles, por ejemplo, para inducir la lisis celular por medio de efectos osmóticos sencillos, con cambios mínimos en las moléculas y la arquitectura de la MEC. Se conocen bien en la técnica reactivos hipotónicos adecuados e incluyen agua desionizada y solución salina con NaCl a <0,9 % (p/v).
En algunas realizaciones preferidas, el agente osmótico es agua desionizada.
Los detergentes solubilizan los lípidos y grasas en el tejido y facilitan la eliminación de restos celulares de la MEC. Los detergentes preferidos pueden incluir detergentes aniónicos, tales como BigCHAP, Bis (polietilenglicol bis[imidazoil carbonilo]), Brij®, Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P, Cremophor® EL (Sigma Aldrich), N-decanoil-N-metilglucamina, n-decil a-D-glucopiranósido, decil b-D-maltopiranósido, n-dodecil a-Dmaltósido, monodecil éter de heptaetilenglicol, n-hexadecil b-D-maltósido, monododeciléter de hexaetilenglicol, monohexadeciléter de hexaetilenglicol, monooctadeciléter de hexaetilenglicol, monotetradeciléter de hexaetilenglicol, Igepal CA-630, metil-6-O-(N-heptilcarbamoil)-a-D-glucopiranósido, monododeciléter de nonaetilenglicol, N-nonanoil-N-metilglucamina, monodeciléter de octaetilenglicol, monododeciléter de octaetilenglicol, monooctadeciléter de octaetilenglicol, monotetradeciléter de octaetilenglicol, octil-b-D-glucopiranósido, monodeciléter de pentaetilenglicol, monohexadeciléter de pentaetilenglicol, monohexiléter de pentaetilenglicol, monooctadeciléter de pentaetilenglicol, monooctiléter de pentaetilenglicol, éter de polietilenglicol, polioxietileno, Saponina, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85 (Sigma Aldrich), Tergitol, tetradecil-b-D-maltósido, monodeciléter de tetraetilenglicol, monododeciléter de tetraetilenglicol, monotetradeciléter de tetraetilenglicol, Triton® CF-21, Triton® CF-32, Triton® DF-12, Triton® DF-16, Triton® GR-5M, Triton X®-100, Triton X®-102, Triton X®-15, Triton X®-151, Triton X®-207, Triton®, TWEEN® (Sigma Aldrich), Tiloxapol, n-undecil b-D-glucopiranósido y combinaciones de los mismos. A efectos de la presente invención, servirá cualquier detergente zwitteriónico. Los detergentes zwitteriónicos preferidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: CHAPS, CHAPSO, Sulfobetaína 3-10 (SB 3-10), Sulfobetaína 3-12 (SB 3-12), Sulfobetaína 3-14 (SB 3-14), ASB-14, ASB-16, ASB-C80, Sulfobetaína no detergente (ND SB) 201, DDMAB, DDMAU, detergente EMPIGEN BB®, solución al 30 %, solución al 30 % de laurildimetilamina (LDAO), detergente ZWITTERGENT® 3-08, detergente ZWITTERGENT® 3-10, detergente ZWITTERGENT® 3-12, detergente ZWITTERGENT® 3-14, detergente ZWITTERGENT® 3-16 y combinaciones de los mismos.
Los detergentes aniónicos preferidos incluyen dodecilsulfato de sodio (SDS) y desoxicolato de sodio (SdC). Por ejemplo, la muestra de tejido puede exponerse a SDS del 0,01 al 5%, por ejemplo, SDS al 0,01-1% y/o desoxicolato de sodio (SdC) del 0,1 al 10%, por ejemplo, desoxicolato de sodio a aproximadamente el 4%. En algunas realizaciones preferidas, el detergente puede comprender SDS al 4 %.
Los detergentes pueden incluir detergentes no iónicos, tales como ácido quenodesoxicólico, sal de sodio del ácido quenodesoxicólico, ácido cólico, bilis de buey u oveja, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, éster metílico del ácido desoxicólico, digitonina, digitoxigenina, N-óxido de N,N-dimetildodecilamina, sal sódica de docusato, sal sódica del ácido glucoquenodesoxicólico, hidrato del ácido glucocólico, hidrato de la sal sódica del ácido glucocólico, sal sódica del ácido glucocólico, sal disódica de 3-sulfato del ácido glucolitocólico, éster etílico del ácido glucolitocólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina, N-lauroilsarcosina en solución salina, dodecil sulfato de litio, solución de Lugol, niaproof 4, Triton®, Triton® QS-15, solución de Triton® QS-44, sal sódica del ácido 1-octanosulfónico, 1-butanosulfonato de sodio, 1-decanosulfonato de sodio, 1-dodecanosulfonato de sodio, 1-heptanosulfonato de sodio anhidro, 1-nonanosulfonato de sodio, 1-propanosulfonato de sodio monohidratado, 2-bromoetanosulfonato de sodio, coleato de sodio hidratado, coleato de sodio, desoxicolato de sodio, desoxicolato de sodio monohidratado, dodecilsulfato sódico, hexanosulfonato de sodio anhidro, octilsulfato de sodio, pentanosulfonato de sodio anhidro, taurocolato de sodio, sal sódica del ácido tauroquenodesoxicólico, sal sódica del ácido tauroquenodesoxicólico monohidratada, hidrato de la sal sódica del ácido tauroquenodesoxicólico, sal disódica de 3-sulfato del ácido taurolitocólico, sal sódica del ácido tauroursodesoxicólico, Triton X®-200, solución de Triton X®GS-20, dodecil sulfato de trizma, ácido ursodesoxicólico y combinaciones de los mismos.
Los detergentes no iónicos preferidos incluyen polietilenglicol y Triton™ X-100, por ejemplo, éter p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenílico de polietilenglicol (también denominado éter octil fenílico de polioxietileno o TX-100; CAS 9002-93-1; C14H22O(C2H4O)n. (n = 9-10)). Por ejemplo, puede exponerse la muestra de tejido a TX-100 del 0,01 al 10 % o TX-100 del 1 al 3 %, por ejemplo, TX-100 al 3 %.
Los detergentes pueden incluir detergentes zwitteriónicos, tales como CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato), sulfobetaína-10 (3-(decildimetilamonio)propanosulfonato), sulfobetaína-16 (n-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato) y Tri(n-butil)fosfato. Por ejemplo, la muestra de tejido puede exponerse a detergente zwitteriónico del 0,01 al 5 %, por ejemplo, detergente zwitteriónico al 0,01-1 %.
Se conocen en la técnica diversos detergentes adecuados diferentes y se encuentran disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Sigma Aldrich Co LLC, MO, EE. UU.).
El tejido puede exponerse a dos o más detergentes diferentes. Por ejemplo, la etapa (iii) puede comprender exponer la muestra de tejido a un detergente aniónico, tal como SDS y/o SdC y un detergente no iónico, tal como TX-100. En algunas realizaciones, la muestra puede exponerse a SDS, SdC y TX-100, por ejemplo, SDC al 3%; SDS al 0,5% y TX-100 al 3%.
En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede exponerse a un detergente en solución con un agente quelante, tal como EDTA o EGTA, que quela iones metálicos divalentes, tales como Ca2+ e impide la adhesión celular a la MEC.
En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede exponerse a un alcohol. El alcohol usado puede ser cualquier alcohol y los alcoholes preferidos se seleccionan entre, pero sin limitación, el grupo a continuación: alcohol etílico, alcohol metílico, alcohol n-propílico, alcohol isopropílico, alcohol n-butílico, alcohol sec-butílico, alcohol f-butílico, alcohol isoamílico, alcohol n-decílico y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un método de descelularización puede comprender además tratar la muestra de tejido con proteasa y/o nucleasa, por ejemplo, endonucleasa o exonucleasa. Preferentemente, la muestra de tejido se trata con proteasa.
La muestra puede tratarse con proteasa en una sola etapa o como parte de un ciclo de tratamiento repetido con agentes de descelularización.
Las proteasas degradan las proteínas en la muestra de tejido, dañan las estructuras celulares y subcelulares y rompen los enlaces celulares con la MEC. Se conocen bien en la técnica proteasas adecuadas e incluyen dispasa y tripsina. La muestra de tejido puede exponerse a tripsina al 0,0025-0,25 % (p/v), por ejemplo tripsina al 0,025 %. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede exponerse a una proteasa en solución con un agente quelante, tal como EDTA, que quela iones metálicos divalentes, tales como Ca2+ e impide la adhesión celular a la MEC.
En realizaciones preferidas, puede tratarse la muestra de tejido simultáneamente con proteasa y detergente.
Por ejemplo, la muestra puede tratarse con una solución que comprende SDS, SdC, TX-100 y/o tripsina. Estos componentes pueden usarse en cualquier combinación o concentración, por ejemplo, SdC al 0,1-10 %; SDS al 0,1­ 10 %; TX-100 al 0,1-20 %; tripsina-EDTA al 0,05-0,5 %, NaCl al 0,1-10 %, tal como SdC al 3 %; SDS al 0,5 %; TX-100 al 3 %; tripsina-EDTA al 0,025 %, NaCl al 4,3 %.
En algunas realizaciones, un método de descelularización puede comprender además tratar la muestra de tejido con ácido peracético (PAA), que desnaturaliza el ADN y/o hidróxido de amonio, que rompe los enlaces fosfodiéster. La muestra de tejido puede lavarse después del tratamiento con un reactivo de descelularización, por ejemplo, entre una o más de las etapas anteriores y/o entre ciclos.
La muestra de tejido puede lavarse con una solución de lavado adecuada, por ejemplo, una solución salina tamponada, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina al 0,1-10 % o agua desionizada. Por ejemplo, la muestra puede lavarse con PBS al 1 % después de exponerla a detergente y opcionalmente proteasa y/o después de la exposición a un agente osmótico.
Normalmente, la muestra de tejido se lava con PBS al 1 % durante 1 min a temperatura ambiente.
En algunas realizaciones, una etapa de lavado puede comprender dos o más exposiciones secuenciales a PBS. Antes de las etapas (ii) y (iii), puede someterse a las células en la muestra de tejido a daño mecánico para facilitar su eliminación. Las células pueden dañarse mecánicamente mediante cualquier técnica adecuada que dañe las células del tejido sin afectar a la matriz extracelular, entre las que se incluyen congelación/descongelación, tratamiento con ultrasonidos o ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU).
Preferentemente, la muestra de tejido se somete a al menos un ciclo de congelación/descongelación antes de la descelularización.
En algunas realizaciones, las técnicas de daño mecánico pueden no repetirse después del tratamiento inicial. Por ejemplo, el tratamiento de congelación/descongelación después de la exposición a otros reactivos de descelularización puede causar daño en la MEC.
En otras realizaciones, puede someterse a las células en la muestra de tejido a daño mecánico una o más veces después del tratamiento inicial, por ejemplo, después de una o más repeticiones de las etapas (ii) y/o (iii). Por ejemplo, la muestra de tejido puede someterse a HIFU o tratamiento con ultrasonidos una o más veces.
Preferentemente, las células se dañan mecánicamente sometiendo la muestra de tejido a uno o más ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el tejido se puede congelar a -20 °C o menos, preferentemente a -50 °C o menos, -60 °C o menos, -70 °C o menos y, a continuación, se descongela una o más veces. El tejido congelado puede descongelarse convenientemente a de 4°C a 37 °C. En diversas realizaciones, el tejido se puede descongelar a aproximadamente 4 °C para minimizar los gradientes de temperatura dentro del tejido que pueden dañar la MEC. Por ejemplo, el tejido puede congelarse a aproximadamente -80 °C durante 24 horas o más y después, descongelarse a 4 °C. En algunas realizaciones preferidas, la muestra de tejido puede descongelarse a 37 °C, por ejemplo, durante de 45 a 1 hora y después, sumergirse en PBS a 37 °C, por ejemplo, durante 15 minutos. Las muestras de tejido que se someten a congelación/descongelación están preferentemente secas para prevenir el daño de la MEC. En algunas realizaciones, puede secarse una muestra de tejido antes de la etapa de congelación/descongelación, por ejemplo, mediante exposición durante 5 a 30 minutos a temperatura ambiente.
La muestra de tejido puede someterse a congelación/descongelación en un tampón isotónico, por ejemplo, solución salina, tal como NaCl al 0,90 % (p/v) o PBS.
El daño mecánico promueve una intensa ruptura celular en el tejido. La lisis celular provocada por el daño mecánico puede amplificarse mediante tratamiento con el reactivo osmótico y el detergente en las etapas (ii) y (iii).
En algunas realizaciones de un primer conjunto de realizaciones, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos y
(b) repetir la etapa (a) 0-50 veces (por ejemplo, hasta que el sobrenadante es transparente)
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 2 minutos,
(g) repetir la etapa (f) 0-10 veces hasta que el tejido está limpio de cualquier reactivo y proteasa
(h) repetir las etapas (a) a (e) 0-10 veces (por ejemplo, hasta que el tejido sea completamente blanco), (i) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 5 minutos,
(j) repetir la etapa (i) 0-10 veces.
En otras realizaciones del primer conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos y
(b) repetir la etapa (a) 4 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 2 minutos,
(g) repetir la etapa (f) 4 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (e).
(i) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos,
(j) repetir la etapa (i) 2 veces.
Las muestras adecuadas incluyen hígado, por ejemplo, hígado humano o intestino, por ejemplo, intestino humano. En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL3 y HI5).
En otras realizaciones del primer conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos
(b) repetir la etapa (a) 10 veces
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos
(e) repetir la etapa (d)
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 2 minutos;
(g) repetir la etapa (f) 4 veces
(h) repetir las etapas (a) a (e).
(i) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos,
(j) repetir la etapa (i) 2 veces
Las muestras adecuadas incluyen hígado, por ejemplo, hígado humano.
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL43).
En otras realizaciones del primer conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos,
(b) repetir la etapa (d) 11 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 2 minutos
(g) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos,
(h) repetir la etapa (g) 2 veces;
Las muestras adecuadas incluyen hígado, por ejemplo, hígado humano.
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL36).
En otras realizaciones del primer conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos
(b) repetir la etapa (a) de 5 a 10 veces
(c) exponer la muestra a detergente, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) repetir la etapa (a) de 5 a 10 veces,
(e) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS,
(f) opcionalmente repetir las etapas (a) a (e) una o más veces.
Las muestras de tejido adecuadas incluyen riñón, por ejemplo, riñón o corazón humano, por ejemplo, corazón humano.
La muestra puede lavarse entre dichas etapas usando PBS.
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado.
En el primer conjunto de realizaciones, puede oscilarse verticalmente la muestra de tejido a 50 Hz, por ejemplo, usando un TissueLyser LT™.
En algunas realizaciones de un segundo conjunto de realizaciones, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos,
(b) repetir la etapa (a) 19 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 2 minutos;
(g) repetir la etapa (f) 4 veces.
(h) repetir las etapas (a) a (e) 2 veces.
(i) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos,
(j) repetir la etapa (i) 2 veces
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL4).
En otras realizaciones del segundo conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos y
(b) repetir la etapa (a) 9 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) repetir las etapas (c) a (e),
(g) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos y
(h) repetir la etapa (g) 2 veces.
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL43).
En otras realizaciones del segundo conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos,
(b) repetir la etapa (a) 9 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos y
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos y
(g) repetir la etapa (f) 2 veces.
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL36).
En otras realizaciones del segundo conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos y
(b) repetir la etapa (a) 19 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, durante 2 minutos
(g) repetir la etapa (f) 5 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (d) 5 veces.
(i) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos y
(j) repetir la etapa (i) 2 veces
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HL-C1).
En otras realizaciones del segundo conjunto, las etapas (ii) y (iii) pueden comprender:
(a) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos y
(b) repetir la etapa (a) 4 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa, por ejemplo, durante 4 minutos
(e) repetir la etapa (d)
(f) exponer la muestra a ácido peracético (PAA) durante 2 minutos
(g) repetir la etapa (f) 1 vez
(h) exponer la muestra a hidróxido de amonio (NH4OH) durante 2 minutos
(i) repetir la etapa (h) 2 veces
(j) exponer la muestra a agua desionizada, por ejemplo, durante 2 minutos y
(k) repetir la etapa (j) 10 veces.
(l) repetir las etapas (c) y (d),
(m) exponer la muestra a solución salina, por ejemplo, PBS, por ejemplo, durante 5 minutos,
(n) repetir la etapa (m) 2 veces
En la tabla 2 se muestra un régimen adecuado (HP1).
En el segundo conjunto de realizaciones, la muestra de tejido puede oscilarse horizontalmente a 30 Hz, por ejemplo, usando un TissueLyser II™.
Se han descrito anteriormente soluciones salinas, detergentes y soluciones de proteasa adecuadas y otros reactivos de descelularización.
Después de la descelularización, la muestra de tejido puede esterilizarse, por ejemplo, mediante exposición a un agente de esterilización. Los agentes de esterilización adecuados incluyen irradiación y, agua electrolizada y agentes químicos, tales como ácido peracético (PAA). La muestra de tejido puede exponerse a ácido peracético al 0,01 % y etanol al 4%, por ejemplo, durante de 30 minutos a 2 horas. Por ejemplo, la muestra de tejido descelularizada puede sumergirse en el agente de esterilización y opcionalmente someterse a oscilación, como se describe en el presente documento.
Después de la descelularización y la esterilización, la muestra de tejido descelularizada puede evaluarse, por ejemplo, respecto de la ausencia de células y/o la presencia de componentes de la MEC, tales como colágeno, laminina, elastina, proteoglucanos, ácido hialurónico, fibronectina, factores de crecimiento y proteasas extracelulares.
En el caso de las muestras de tejido amiloidótico, la muestra de tejido descelularizada puede evaluarse, respecto de la presencia de fibrillas amiloidóticas.
Se conocen bien en la técnica técnicas adecuadas, incluyendo visualización macroscópica, microscopía y técnicas inmunohistoquímicas.
La muestra de tejido descelularizada, por ejemplo, muestras de tejido humano, pueden carecer de miofilamentos detectables, células endoteliales, células de músculo liso y restos y núcleos celulares en secciones de histología usando procedimientos de tinción histológica convencionales.
Las muestras de tejido descelularizadas producidas como se describe en el presente documento conservan la morfología y la arquitectura del órgano en 3D y la bioactividad de la muestra de tejido fuente.
En algunas realizaciones, puede confirmarse mediante microscopía electrónica la arquitectura y la morfología de una muestra de tejido descelularizada producida mediante los métodos descritos anteriormente.
Dependiendo del tejido fuente, la muestra de tejido descelularizada puede comprender una MEC normal o puede ser una MEC modificada por una enfermedad. Por ejemplo, la muestra de tejido descelularizada puede comprender una o más alteraciones estructurales que son características de una enfermedad o patología tisular.
Las muestras de tejido descelularizadas permiten una unión, migración, proliferación y organización tridimensional eficaz de las células que se cultivan en el armazón. La muestra de tejido descelularizada también puede proporcionar moléculas bioactivas y propiedades bioinductoras, que mantienen el fenotipo celular y las propiedades funcionales y favorecen la producción de matriz específica de tejido.
Después de la producción de la muestra de tejido descelularizada como se describe en el presente documento, un método puede comprender incubar la muestra con una proteasa, tal como una elastasa o una metaloproteinasa de matriz (MMP). Esto puede ser útil para identificar biomarcadores relacionados con la MEC.
Después de la producción de la muestra de tejido descelularizada como se describe en el presente documento, un método puede comprender someter a la muestra descelularizada a análisis proteómico, por ejemplo, usando técnicas de electroforesis y/o espectrometría de masas. Esto también puede ser útil para identificar biomarcadores relacionados con la MEC.
Después de la producción del armazón de tejido descelularizado como se describe en el presente documento, un método puede comprender repoblar el armazón descelularizado con células para producir una muestra de tejido artificial.
Las células adecuadas incluyen células sanas o enfermas, tales como células primarias humanas y de líneas celulares tisulares (por ejemplo, células sinusoidales tisulares), células endoteliales, iPSC o células derivadas de iPSC específicas del paciente, células madre embrionarias (hESC), células madre mesenquimales (hMSC), células madre fetales (por ejemplo, células madre del líquido amniótico), células cancerosas, células progenitoras endoteliales (EPC) y células madre hepáticas bipotenciales.
Las muestras de hígado descelularizadas pueden repoblarse con hepatocitos primarios, células estrelladas hepáticas o células de Kupffer. Las muestras de intestino descelularizadas pueden repoblarse con células epiteliales, miofibroblastos, células endoteliales, células cancerosas intestinales, iPSC o células derivadas de iPSC específicas del paciente, células madre embrionarias (hESC), células madre mesenquimales (hMSC), células madre fetales (por ejemplo, células madre del líquido amniótico) o células madre hepáticas bipotenciales. Las muestras pancreáticas descelularizadas pueden repoblarse con células beta de islote, células endoteliales, células estrelladas pancreáticas, células de cáncer pancreático, iPSC o células derivadas de iPSC específicas del paciente, células madre embrionarias (ESC), células madre mesenquimales (MSC) o células madre fetales (por ejemplo, células madre del líquido amniótico). Las muestras de riñón descelularizadas pueden repoblarse con podocitos, células tubulares, MSC, iPSC, células madre fetales (por ejemplo, células madre de líquido amniótico) o células cancerosas. Las muestras de corazón descelularizadas pueden repoblarse con cardiomiocitos, células endoteliales, iPSC, células madre fetales (por ejemplo, células madre de líquido amniótico) o MSC. Las muestras de intestino descelularizadas pueden repoblarse con células madre intestinales, miofibroblastos o células Caco-2.
La muestra de tejido descelularizada puede repoblarse sembrando el armazón con células dentro del armazón y cultivando en condiciones adecuadas. Por ejemplo, las células pueden inyectarse directamente en el parénquima del armazón descelularizado y/o depositarse sobre la superficie del armazón descelularizado. El armazón sembrado puede cultivarse en condiciones estáticas, por ejemplo, en un medio de cultivo o en condiciones dinámicas, por ejemplo, en un biorreactor.
En algunas realizaciones, el armazón de tejido descelularizado puede repoblarse con células humanas autólogas obtenidas de un paciente, por ejemplo, para producir tejido artificial para implante en el paciente. En otras realizaciones, el armazón humano descelularizado puede repoblarse con células humanas alogénicas, es decir, células procedentes de un individuo humano diferente, por ejemplo, para producir tejido artificial para implante en el paciente. En algunas realizaciones, puede evaluarse sistemáticamente la inmunocompatibilidad de las celulas humanas alogénicas con el paciente antes del implante. En otras realizaciones, el armazón humano descelularizado puede repoblarse con células no inmunogénicas, por ejemplo, células que se han modificado por ingeniería genética para eliminar antígenos de superficie, tales como HLA, que puedan provocar una respuesta inmunitaria en un individuo.
La divulgación también proporciona un armazón de tejido descelularizado producido mediante un método descrito anteriormente.
Los armazones de tejido descelularizados producidos como se describe en el presente documento son acelulares y presentan la estructura de poro, la arquitectura y la morfología de la matriz extracelular de la muestra de tejido. Los armazones de tejido descelularizados producidos a partir de muestras de tejido fuente fibrótico presentan los componentes de la ECM aumentados y la arquitectura y morfología alteradas características del tejido de origen. Los armazones de tejido descelularizados pueden ser útiles para el modelado de enfermedades. Los armazones adecuados pueden proceder de muestras de tejido normales o de muestras de tejido patológico, como se ha descrito anteriormente.
Un método de modelado de la enfermedad puede comprender:
proporcionar un armazón de tejido descelularizado producido como se ha descrito anteriormente, opcionalmente, repoblar el armazón con células para producir un tejido recelularizado y
determinar el efecto de un compuesto, fármaco, agente biológico, dispositivo o intervención terapéutica sobre el armazón o el tejido o las células en el mismo.
Los métodos descritos en el presente documento pueden ser útiles en el modelado de enfermedades tisulares o de enfermedades que afectan al tejido, tales como fibrosis tisular, cáncer y metástasis tisulares, toxicidad farmacológica en tejidos, respuestas inmunitarias posteriores a un trasplante y hepatitis autoinmunitaria.
Los armazones de tejido descelularizados también pueden ser útiles para proteómica, descubrimiento de biomarcadores y aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el efecto de una proteasa en los componentes, la arquitectura o la morfología de un armazón de tejido descelularizado puede ser útil en la identificación de biomarcadores.
Varios aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a la vista de la presente divulgación.
Otros aspectos y realizaciones de la invención proporcionan los aspectos y realizaciones descritos anteriormente con la expresión "que comprende" reemplazada por la expresión "que consiste en" y los aspectos y realizaciones descritos anteriormente con la expresión "que comprende" reemplazada por la expresión "que consiste esencialmente en".
Ha de entenderse que la solicitud divulga todas las combinaciones de cualquiera de los aspectos anteriores y de las realizaciones descritas anteriormente entre sí, a menos que el contexto exija lo contrario. De manera similar, la solicitud divulga todas las combinaciones de las características preferidas y/u opcionales, ya sea de manera individual o junto con cualquiera de los otros aspectos, a menos que el contexto exija lo contrario.
Las modificaciones de las realizaciones anteriores, las realizaciones adicionales y las modificaciones de las mismas serán evidentes para el experto tras leer la presente divulgación y como tales, estas se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Cuando se usa en el presente documento, "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" ha de interpretarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se expusiera de manera individual en el presente documento.
A continuación se ilustrarán ciertos aspectos y realizaciones de la invención a modo de ejemplo y por referencia a las figuras descritas a continuación.
La figura 1 muestra cubos de tejido hepático de 5 mm3 antes (parte superior izquierda) y después (parte inferior izquierda) de la descelularización. La tinción histológica de HE (hematoxilina y eosina) mostró la eliminación de células después de la descelularización. La tinción de SR (rojo sirio) mostró conservación del colágeno (rojo) y la eliminación de los materiales celulares (amarillo) en el tejido descelularizado.
La figura 2 muestra el análisis por inmunohistoquímica de las proteínas de la matriz extracelular (MEC). El colágeno I, III, IV (proteínas estructurales) se conservaron después de la descelularización, así como la laminina y la fibronectina (proteínas de la membrana basal).
La figura 3 muestra la cuantificación del ADN. El procedimiento de descelularización fue eficaz con una reducción notable en el contenido de ADN (p <0,01).
La figura 4 muestra la medición cuantitativa del colágeno después de la descelularización. La cuantificación del colágeno mostró conservación de la cantidad de colágeno en el tejido descelularizado, cuando se comparó con tejido fresco.
La figura 5 muestra una imagen de SEM a un aumento de 150x que incluye un tracto portal rodeado por una estructura lobular típica. Además, la imagen por SEM confirmó la acelularidad del armazón y espacios claramente definidos una vez ocupados por hepatocitos (es decir, espacios sin hepatocitos).
La figura 6 muestra cubos de tejido hepático cirrótico de 5 mm3 antes (parte superior izquierda) y después (parte inferior izquierda) de la descelularización. La tinción histológica de HE (hematoxilina y eosina) mostró la eliminación de células después de la descelularización. La tinción de SR (rojo sirio) mostró conservación del colágeno (rojo) y la eliminación de los materiales celulares (amarillo) en el tejido descelularizado.
La figura 7 muestra la cuantificación del ADN (hígado cirrótico). El procedimiento de descelularización fue eficaz con una reducción notable en el contenido de ADN (p <0,01).
La figura 8 muestra la comparación histológica de tejido pancreático antes y después de la descelularización. La tinción de SR (rojo sirio) mostró conservación del colágeno (rojo) y la eliminación de los materiales celulares (amarillo) en el tejido descelularizado. La tinción histológica de HE (hematoxilina y eosina) mostró la eliminación de células después de la descelularización.
La figura 9 muestra la cuantificación del ADN (páncreas). El procedimiento de descelularización fue eficaz con una reducción notable en el contenido de ADN (p <0,01).
La figura 10 muestra la comparación histológica de intestino humano antes (izquierda) y después (derecha) de la descelularización, mostrando conservación de las estructuras de colágeno en todas las capas del tejido después del procedimiento de descelularización.
La figura 11 muestra la cuantificación del ADN (intestino). El procedimiento de descelularización fue eficaz con una reducción notable en el contenido de ADN (p <0,01).
La figura 12 muestra modelos CAD en 3D de las lacas de cabeza (A), centro (B) y base (C) producidas usando el programa informático Autodesk Inventor Professional 2014. El panel (D) representa el casete impreso en 3D completamente montado. Los paneles (E) y F) representan la placa de base y central unidas y la placa de base sola, respectivamente.
Descripción detallada
En la figura 12 se muestra un ejemplo de un dispositivo para descelularizar muestras de tejido como se describe en el presente documento. El dispositivo consiste en una serie de depósitos para reactivos (no mostrados) que alojan los reactivos de descelularización necesarios durante el funcionamiento del proceso. Los depósitos se conectan a un casete 2 mediante tubos (no mostrados). Los tubos se asocian con una bomba impulsora de reactivos (no mostrada). Los reactivos entran en el casete 2 a través de un puerto 7 de entrada que está situado en una placa 3 de base del casete 2, antes de viajar a lo largo de un conducto 8 de entrada y de dividirse a partes iguales entre múltiples cámaras 6 de muestra ubicadas en una placa 4 central del casete 2. Para entrar en las cámaras 6 de muestra, los reactivos de descelularización deben o bien fluir a través de membranas adecuadas (no mostradas) y/o por las extrusiones 12 que conservan la muestra dentro de las cámaras 6 ubicadas en la placa 4 central. Posteriormente, el casete 2 completo se hace oscilar mediante el motor de oscilación (no mostrado), de acuerdo con el protocolo de descelularización. Posteriormente, se drenan los reactivos del casete 2 a través del conducto 9 de flujo saliente en la placa de base, antes de salir del casete a través del puerto 10 de salida y de avanzar hacia el depósito de desechos externo (no mostrado) a través de tubos y una o más bombas de impulsión asociadas (no mostradas). Durante el drenaje, los reactivos retirados se reemplazan con aire filtrado que entra en el casete a través de una serie de conductos en la placa 5 de cabeza del casete 2. Se impide que los reactivos entre en estos conductos mediante membranas hidrófobas (no mostradas) y/o extrusiones 20 en la placa 5 de cabeza. Durante las fases estacionarias del proceso, pueden tomarse muestras de los reactivos y/o tejidos mediante puertos de muestreo integrados (no mostrados) para ensayos de proceso fuera de línea. El proceso completo se controla por medio de un procesador (no mostrado) que permite controlar todos los aspectos del proceso, tanto predeterminados como en respuesta a bucles de retroalimentación.
Experimentos
1. Determinación de la fuerza G
El nuevo sistema usado para la descelularización de tejido biológico se considera un oscilador armónico simple, ya que sobre el sistema solo actúa una fuerza en un movimiento periódico, donde la fuerza de restauración es directamente proporcional al desplazamiento y actúa en la dirección opuesta a la del desplazamiento, con una amplitud y frecuencia constantes. A partir de esta afirmación, se puede construir una ecuación, que permitirá a los presentes inventores calcular la fuerza G experimentada por el tejido y los reactivos durante la descelularización. Por lo tanto, un tejido biológico que se somete a movimiento armónico con una frecuencia de f Hz y una amplitud Ü m y asumiendo que comienza con desplazamiento cero (es decir, x=0 y t=0) ocupará la posición x = Úsen (f*2*n*t) (considerando que la diferencia de densidad entre el tejido y su solución circundante sea despreciable). Además, una partícula (o tejido en este caso) que se mueve con movimiento armónico simple tendrá la ecuación x"= -w2x, donde w=2*pi*f. Al sustituir estas ecuaciones en la segunda ley de Newton, fuerza (F) es igual a la masa (m) multiplicada por la aceleración (a) [F = ma], se obtiene como resultado la ecuación F = -m[(2*n*f)2]*Úsen(f*2*n*t). Esta alcanza el extremo cuando |sen|=1. Por lo tanto, se encontrará en su máximo/mínimo cuando F = +/-Úm[(2*n*f)2]. Finalmente, al dividir la ecuación entre la fuerza experimentada por la gravedad (mg), la ecuación para la fuerza G = (Ú/g) * [(2*n*f) 2].
2. Reactivos
Abreviaturas; SdC Desoxicolato de sodio; PBS/AA/PBS antibiótico antimicótico; T/E Tripsina al 0,025 %/EDTA al 0,025 %; SDS Dodecilsulfato de sodio; TX100 Triton X 100; TA temperatura ambiente; pAa Ácido peracético; EtOH Etanol.
Solución de desoxicolato de sodio (SDS) al 4 %: se añaden 40 g de desoxicolato de sodio, BioXtra, >98,0 % (Sigma-Aldrich) a 1 l de agua desionizada (MilliQ de Millipore) y se agitó usando un agitador magnético durante 1 h.
Solución salina al 8,7%: se añaden 87 g de cloruro de sodio, > 99% (Sigma-Aldrich) a 1 l de agua desionizada (MilliQ de Millipore) y se agitó usando un agitador magnético durante 1 h.
Solución de mezcla de reactivo (SDC al 3%; SDS al 0,5%; TX100 al 0,3%; T/E al 0,025 %; NaCl al 4,3 %): se añaden 30 g de desoxicolato de sodio, BioXtra, >98,0 % (Sigma-Aldrich), 5 g de dodecilsulfato de sodio, BioXtra, >99,0 (Sigma-Aldrich), 3 ml de Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 10 ml de Tripsina-EDTA al 0,25% de Gibco® (Life Technologies) y 43 g de cloruro de sodio (Sigma-Aldrich) a agua desionizada (MilliQ de Millipore) hasta formar 1 l y se agita usando un agitador magnético.
Ácido peracético (PAA) al 0,1 %: se añade 1 ml de solución de ácido peracético puro, ~39 % en ácido acético (Sigma-Aldrich) a 1 l de agua desionizada (MilliQ de Millipore) y se agita usando un agitador magnético durante 1 h. Hidróxido de amonio (NH4OH) al 0,1 %: se añade 1 ml de solución de hidróxido de amonio, reactivo ACS, base de NH3 al 28,0-30,0% (Sigma-Aldrich) a 1 l de agua desionizada (MilliQ de Millipore) y se agita usando un agitador magnético durante 1 h.
3. Métodos
3.1 Descelularización de tejidos
Los protocolos para descelularizar tejido biológico se describen en otra parte del presente documento y se muestran en las tablas 2 y 3.
Después de completarse un protocolo, se seleccionan muestras aleatorias y; se fijan en formalina al 10% para estudios histológicos y de inmunohistoquímica, se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan en un congelador a -80 °C hasta que se necesitan para los ensayos de cuantificación de ADN, colágeno y elastina, se fijan en glutaraldehído 2,5 para la obtención de imágenes por SEM o se almacenan en PBS al 1 % a 4 °C hasta que se necesitan para los experimentos de bioingeniería.
Inicialmente, se descongelan los cubos de hígado en un baño de agua a 37 °C durante 1 hora (h), seguido de la adición de 1,2 ml de PBS al 1 % durante 15 minutos (min). Una vez descongelados, los cubos se transfieren a tubos de 2 ml con bloqueo de seguridad (Eppendorf). Se añade una cantidad estándar de 1,5 ml de cada solución a su tubo/protocolo respectivo.
3.2 Histología e inmunohistoquímica
Se recogieron muestras de tejido fijadas previamente en formol al 10%, se lavaron en agua destilada, se deshidrataron en una serie de baños de alcohol industrial desnaturalizado (IDA) (Acquascience) y xileno y finalmente, se incluyeron en parafina. Posteriormente, se seccionaron las muestras en secciones de 5 pm usando un micrótomo Leica RM2035 (Leica Biosystems). Posteriormente se hicieron pasar todas las secciones a través de tres baños de xileno de grado histológico (Acquascience) durante un mínimo de 5 minutos y después a través de tres baños de IDA (Acquascience) durante un mínimo de 2 min, finalizando en agua corriente.
3.3 Histología
Las secciones se tiñeron a temperatura ambiente como se indica a continuación:
Hematoxilina y eosina: Se trataron las secciones con hematoxilina de fórmula Harris (Leica Biosystems) durante 10 min y después se lavaron con agua corriente durante 5 min. A continuación, se tiñeron las secciones con eosina (Leica Biosystems) durante 3 min y después se lavan nuevamente con agua. Después, se deshidrataron las secciones a través de IDA (alcohol industrial desnaturalizado) tan rápido como fuese posible y después se colocaron en xileno de grado histológico (Acquascience) hasta que se montaron.
Picrosirio: Se trataron secciones de tejido con picrosirio recién filtrado F38 (R.A.Lamb; CI-35780) durante 20 min. Después se deshidrataron las secciones a través de IDA (Acquascience) tan rápido como fuese posible y después se colocaron en xileno de grado histológico (Acquascience) hasta que se montaron.
Van Gieson elástica: Se trataron las secciones con permanganato de potasio al 0,5% durante 5 min y se lavaron minuciosamente con agua destilada. A continuación, se trataron con ácido oxálico al 1 % durante 1 minuto, se lavaron con agua destilada seguido de alcohol puro. Después, las secciones se tiñeron con elástica de Miller pura (R.A. Lamb; LAMB/080D) durante 2 h, se lavaron minuciosamente con alcoholes metilados industriales (IMS) al 70 % (Fisher Scientific) y después se colocaron en agua corriente. Las secciones se estudiaron bajo el microscopio y, en caso necesario, se diferenciaron en ácido-alcohol al 0,5 % (HCl al 1 % en IDA ac. al 70 %). Como etapa final, las secciones se tiñeron con van Gieson (Leica Biosystems) durante 5 min. Después se deshidrataron las secciones a través de IDA (Acquascience) tan rápido como fuese posible y después se colocaron en xileno de grado histológico (Acquascience) hasta que se montaron.
3.4 Inmunohistoquímica
Los portaobjetos se incubaron con tripsina al 0,5 % (MP Biomedical) / quimiotripsina al 0,5 % (Sigma) / cloruro de calcio al 1 % (BDH) en solución salina al 10 % tamponada con Tris (TBS) durante 30 minutos a 37 °C. Después se lavaron los portaobjetos en TBS al 10 % a pH 7,6 con Tween-20 al 0,04 % (Sigma) durante 5 min. Posteriormente se bloquearon los portaobjetos en solución de bloqueo de peróxido (Novocastra) durante 5 minutos y se incubaron durante 1 hora en los siguientes anticuerpos primarios: colágeno I (pAb de conejo dirigido contra coll1 (ab34710), diluido a 1:200; Abcam), colágeno III (pAb de conejo dirigido contra coll3 (ab7778), diluido a 1:500; Abcam), colágeno IV (mAb de ratón dirigido contra coll4 (M0785), diluido a 1:25; Dako), fibronectina (mAb de ratón dirigido contra fibronectina (MAB1937), diluido a 1:100; Millipore) y laminina (mAb de ratón dirigido contra la cadena a5 de laminina (MAB1924), diluido a 1:200; Millipore). Posteriormente se colocaron los portaobjetos durante 25 minutos en post-primario Novolink™ (Novocastra), 25 min en solución de polímero Novolink™ (Novocastra) y se reveló con 3,3'-diaminobencidina Novolink™ (Novocastra). Finalmente, se contratiñeron los portaobjetos con hematoxilina de Mayer (Sigma) durante 1 min.
Todas las secciones se montaron con DPX (Leica Biosystems); se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron usando un microscopio Zeiss Axioskop 40. Se capturaron imágenes con una cámara Axiocam IcC5 usando Zeiss Axiovision (versión 4.8.2). Todas las imágenes se analizaron y mejoraron usando Fiji v1.49d (sevidor de ImageJ de Jenkins).
3.5 Cuantificación de ADN
Los cubos de tejido descelularizados usados para todos los protocolos se recogieron del congelador a -80 °C y se descongelaron en un baño de agua a 37 °C durante 1 h. Posteriormente se pesaron los cubos de hígado y en caso necesario, se cortaron hasta alcanzar un peso de entre 15 y 25 mg. Posteriormente se colocaron los cubos en tubos para microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadieron veinte pl de proteinasa K a cada uno y después se mezclaron minuciosamente usando un agitador vorticial. Posteriormente se colocaron los cubos en un bloque de calentamiento a 56 °C durante al menos 16 h o hasta que los cubos se lisaron por completo. Posteriormente, se extrajo el ADN usando el kit pasa sangre y tejido DNAeasy de QIAGEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se eluyó con 200 pl de tampón de AE y se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-2000. 3.6 Cuantificación de colágeno
Se cuantificó el contenido de colágeno del tejido nativo y del tejido descelularizado usando el kit de ensayo de colágeno total según el manual del fabricante (QuickZyme Biosciences, Países Bajos). En resumen, las muestras se hidrolizaron en HCl 6 M a 95 °C durante 20 horas, los hidrolizados se mezclaron con una solución de cromógeno que tiñe los restos de hidroxiprolina y el color se reveló a 60 °C durante 1 hora. La absorbancia para cada muestra se determinó a 555 nm usando un lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech, Alemania) y se calculó la cantidad de colágeno mediante el uso de una curva patrón de hidrolizados de colágeno puro.
3.7 Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Las muestras se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % en tampón fosfato al 0,1 M y se dejó reposar durante 24 horas a 4 °C. Después del lavado con tampón fosfato 0,1 M, se cortaron las muestras en segmentos de aproximadamente 1 cm de longitud y se crioprotegieron en sacarosa al 25 %, glicerol al 10 % en PBS 0,05 M (pH 7,4) durante 2 horas, después se congelaron rápidamente en nieve blanda de nitrógeno y se fracturaron a aproximadamente -160 °C. A continuación, se volvieron a colocar las muestras en el crioprotector a temperatura ambiente y se dejaron descongelar. Después de lavar en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4), el material se fijó en OsO4 al 1 % / tampón fosfato 0,1 M (pH 7,3) a 3 °C durante 1,5 horas y se lavaron nuevamente en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Después de enjuagar con dH2O, se deshidrataron los especímenes en una serie graduada de etanol-agua hasta etanol al 100 %, se secaron hasta un punto crítico usando CO2 y finalmente se montaron sobre tetones de aluminio usando etiquetas de carbono adhesivas. El material fracturado se montó para presentar las superficies fracturadas a través del parénquima hasta el haz y se recubrieron con una fina capa de Au/Pd (de aproximadamente 2 nm de espesor) usando un recubridor de haz de iones Gatan. Las imágenes se tomaron con un microscopio electrónico de barrido 7401 FEG (Jeol, EE. UU.).
3.8 Procedimiento de bioingeniería
Los armazones biológicos se mantuvieron durante una noche en medio completo [día -1]. Las células se resuspendieron a una concentración de 2 millones de células por cada 50 j l (2x106/50 jl) por armazón (n>12 por línea celular). Las células se extrajeron en una jeringa de insulina de 0,5 ml y se liberaron gota a gota hasta cubrir finalmente el tejido descelularizado. Los armazones sembrados se mantuvieron durante 2 h en un ambiente humidificado a 37 °C con CO2 al 5 %, lo que permite la unión celular, seguida de la adición de medio de cultivo completo [día 0]. El medio de cultivo se cambió en el día 1 y posteriormente cada 3 días. En los días 7, 14 y 21 después de la siembra, se colocaron los armazones en formaldehído al 10 % y se evaluaron mediante histología e inmunohistoquímica o se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % para el análisis por SEM.
4. Resultados
Los cubos de hígado sano descelularizados (HL3, HL4, HL36 y HL43) eran translúcidos a simple vista y de color blanco (figura 1). La red vascular también se encontraba visible y el tejido mantenía su estructura cúbica. Además, se inspeccionó histológicamente el tejido hepático tanto nativo como descelularizado en busca de material nuclear (tinción de HE) y de restos celulares (tinción de SR). Los protocolos de descelularización fueron exitosos a la hora de eliminar todo el material celular (figura 1). Esto se confirmó mediante cuantificación de la cantidad de ADN restante en los cubos de hígado descelularizados, que era significativamente menor (p <0,001) que la del tejido hepático fresco (figura 3).
Para investigar la retención de proteínas de la MEC, se llevó a cabo un análisis de inmunohistoquímica. Se investigaron cinco proteínas de la MEC, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, fibronectina y laminina (figura 2). El colágeno I y II pueden observarse revistiendo el área del tracto portal, mientras que el colágeno IV y la fibronectina eran evidentes en los lóbulos hepáticos. La tinción con laminina fue positiva alrededor de los vasos y el conducto biliar. De manera similar, la cuantificación del colágeno demostró que los cubos de hígado descelularizados tenían la capacidad de conservar en colágeno en comparación con el tejido fresco (figura 4).
Además, se analizaron los cubos de hígado descelularizados mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Las imágenes de SEM confirmaron la acelularidad del armazón y mostraron la presencia de espacios claramente definidos previamente ocupados por hepatocitos (es decir, espacios sin hepatocitos). La malla tridimensional de fibras de tejido conectivo que estructuran los espacios sin hepatocitos, así como los tractos portales y la estructura lobular, se observaron excepcionalmente conservados (figura 5). Para investigar adicionalmente las propiedades mecánicas de los armazones, se midió la rigidez del tejido nativo y del tejido descelularizado usando microscopía de fuerza atómica (AFM). Esto no reveló diferencias significativas en la rigidez entre el tejido nativo y el tejido descelularizado.
Los armazones de hígado descelularizados se repoblaron con diferentes tipos de células parenquimatosas y no parenquimatosas hepáticas. Se observó que estas células mostraban una excelente viabilidad, movilidad y remodelado de la matriz extracelular. Además, los armazones modificados por bioingeniería mostraron una diferencia notable en la expresión génica cuando se compararon con el sistema en 2D convencional.
El tejido hepático cirrótico descelularizado (HLC1) era, de manera similar, de color blanco. Del mismo modo, la red vascular también se encontraba visible y el tejido mantenía su estructura cúbica. Además, se inspeccionó histológicamente el tejido hepático cirrótico tanto nativo como descelularizado en busca de material nuclear (tinción de HE) y de restos celulares (tinción de SR). Los protocolos de descelularización fueron exitosos a la hora de eliminar todo el material celular (figura 6). Esto se confirmó mediante cuantificación de la cantidad de ADN restante en los cubos de hígado descelularizados, que era significativamente menor (p <0,001) que la del tejido hepático fibrótico fresco (figura 7).
El tejido hepático cirrótico descelularizado también tenía la capacidad de conservar la arquitectura hepática distorsionada que caracteriza al tejido fibrótico. Esto puede observarse en la tinción tanto de SR como de h E, que muestran nódulos bien conservados y septos fibróticos.
El tejido pancreático descelularizado se inspeccionó histológicamente en busca de material nuclear (tinción de HE) y restos celulares (tinción de SR). Los protocolos de descelularización fueron exitosos a la hora de eliminar la mayoría del material celular (figura 8). Esto se confirmó mediante cuantificación de la cantidad de ADN restante en los cubos pancreáticos descelularizados, que era significativamente menor (p <0,001) que la del tejido pancreático (figura 9). También se conservó la arquitectura pancreática. La tinción tanto de SR como de h E muestran claramente la conservación de la MEC donde se ubican los islotes de Langerhans (figura 8).
Finalmente, se inspeccionó histológicamente el tejido intestinal descelularizado en busca de restos celulares (tinción de SR). Los protocolos de descelularización fueron exitosos a la hora de eliminar todo el material celular (figura 10). Esto se confirmó mediante cuantificación de la cantidad de ADN restante en los cubos intestinales descelularizados, que era significativamente menor (p <0,001) que la del tejido intestinal (figura 11). También se conservó la microarquitectura intestinal. La tinción de SR muestra de manera visible la conservación de las cuatro capas intestinales; la mucosa vellosa, la submucosa, la muscular externa y la adventicia (figura 10).
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Tabla 1 Tabla 2
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Tabla 3
Figure imgf000017_0002
continuación
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un armazón de tejido descelularizado, que comprende:
(i) tratar una muestra de tejido con un reactivo osmótico y
(ii) tratar la muestra con un detergente,
en donde la muestra de tejido se somete a oscilación con un desplazamiento de 1 mm o más y una frecuencia de 3 a 100 Hz durante las etapas (i) y (ii),
produciendo de este modo un armazón de tejido descelularizado.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra se somete a oscilación a de 3 a 75 Hz.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la oscilación somete a la muestra de tejido a una fuerza G de 4 a 500 ms-2
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la oscilación tiene un desplazamiento de 5 a 50 mm.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de tejido es de riñón, músculo, hueso, tejido adiposo, cartílago, pulmón, vejiga, córnea, piel, hígado, bazo, placenta, intestino, páncreas, próstata, mama o corazón.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente osmótico es un agente hipotónico, opcionalmente agua desionizada.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el detergente comprende p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil éter de polietilenglicol (Triton X100™), SDS y/o SdC.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de tejido se trata con el detergente en combinación con una proteasa, opcionalmente tripsina.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células en la muestra de tejido se dañan mecánicamente en la etapa (i), opcionalmente congelando y descongelando la muestra de tejido.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende uno cualquiera de: A)
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) de 0 a 50 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina,
(g) repetir la etapa (f) 0-10 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (e) 0-10 veces,
(i) exponer la muestra a solución salina y
(j) repetir la etapa (i) 0-10 veces; o
B)
(a) exponer la muestra de tejido a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 4 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina,
(g) repetir la etapa (e) 4 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (e),
(i) exponer la muestra a solución salina y
(j) repetir la etapa (i) 2 veces; o
C)
(a) exponer la muestra de tejido a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 10 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina,
(g) repetir la etapa (f) 4 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (e),
(i) exponer la muestra a solución salina y
(j) repetir la etapa (i) 2 veces; o
D)
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 11 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(e) exponer la muestra a solución salina durante 2 minutos,
(f) exponer la muestra a solución salina durante 5 minutos y
(g) repetir la etapa (f) 2 veces;
opcionalmente en donde la muestra de tejido es una muestra de hígado.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) de 5 a 10 veces,
(c) exponer la muestra a detergente,
(d) repetir la etapa (a) de 5 a 10 veces,
(e) exponer la muestra a solución salina,
(f) opcionalmente repetir las etapas (a) a (e) una o más veces; opcionalmente en donde la muestra de tejido es una muestra de riñón o de corazón.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la muestra de tejido se hace oscilar verticalmente a 50 Hz.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende uno cualquiera de:
A)
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 19 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina
(g) repetir la etapa (f) 4 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (e) 2 veces,
(i) exponer la muestra a solución salina,
(j) repetir la etapa (i) 2 veces; o
B)
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 9 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos
(e) repetir la etapa (d)
(f) repetir las etapas (c) a (e),
(g) exponer la muestra a solución salina,
(h) repetir la etapa (g) 2 veces; o
C)
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 10 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina y
(g) repetir la etapa (f) 2 veces; o
D)
(a) exponer la muestra a agua desionizada
(b) repetir la etapa (a) 20 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a solución salina,
(g) repetir la etapa (f) 5 veces,
(h) repetir las etapas (a) a (d) 5 veces,
(i) exponer la muestra a solución salina y
(j) repetir la etapa (i) 2 veces; o
E)
(a) exponer la muestra a agua desionizada,
(b) repetir la etapa (a) 4 veces,
(c) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 2 minutos,
(d) exponer la muestra a detergente y proteasa durante 4 minutos,
(e) repetir la etapa (d),
(f) exponer la muestra a ácido peracético (PAA),
(g) repetir la etapa (f) 1 vez,
(h) exponer la muestra a hidróxido de amonio (NH4OH),
(i) repetir la etapa (h) 2 veces,
(j) exponer la muestra a agua desionizada,
(k) repetir la etapa (j) 10 veces,
(l) repetir las etapas (c) y (d),
(m) exponer la muestra a solución salina,
(n) repetir la etapa (m) 2 veces;
opcionalmente en donde la muestra de tejido es una muestra de hígado, páncreas o intestino.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la muestra de tejido se hace oscilar horizontalmente a 30 Hz.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de tejido se expone al agente osmótico y/o al detergente durante 2 a 4 minutos en cada repetición de las etapas (ii) y (iii).
16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende
(i) esterilizar el armazón después de la descelularización y/o
(ii) repoblar el armazón descelularizado con células para producir un armazón recelularizado.
17. Un método de modelado de enfermedades que comprende:
producir un armazón de tejido descelularizado mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, opcionalmente repoblar la muestra con células para producir un tejido recelularizado y, determinar el efecto de un compuesto, un fármaco, un agente biológico, un dispositivo o una intervención terapéutica sobre el armazón.
18. Un método para identificar un biomarcador de la MEC que comprende:
producir un armazón de tejido descelularizado mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
exponer el armazón a una proteasa y
determinar la degradación de uno o más componentes del armazón por la proteasa y
identificar uno o más componentes degradados por la proteasa como biomarcadores de la MEC.
19. Un método para diagnosticar la presencia de un tejido enfermo en un individuo, que comprende:
producir un armazón descelularizado mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 a partir de un tejido del individuo y
determinar la estructura y/o la composición del armazón,
en donde la estructura y/o la composición aberrantes del armazón indican que el tejido está enfermo en el individuo.
Ċ
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