CN108026509B

CN108026509B - 用于产生去细胞化组织支架的方法和装置

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Publication number: CN108026509B
Application number: CN201680050591.0A
Authority: CN
Inventors: G·马扎; W·沃-阿卡德; M·平扎尼
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2036-07-29
Also published as: ES2843977T3; JP2018522561A; US20180214609A1; CN108026509A; DK3328992T3; EP3328992A1; JP6969069B2; US10792395B2; GB201513461D0; EP3328992B1; WO2017017474A1

Abstract

本发明涉及产生去细胞化组织支架的方法，其包括用渗透剂和洗涤剂处理组织样品，同时在这些处理步骤中使所述组织样品以1mm以上的位移和3Hz以上的频率进行振荡。该方法可以用于产生保持天然组织的三维架构和胞外基质组成及形态的脱细胞支架。

Description

用于产生去细胞化组织支架的方法和装置

本发明涉及例如用于治疗、药物建模、药物筛选、诊断和发现生物标志物的胞外基质(ECM)支架的产生。

组织工程学是针对通过恢复器官功能来改善全世界数百万人的生活品质和提供用于人类疾病的离体研究的三维平台的新兴领域。组织工程学的关键挑战在于囊括组织和器官的结构和组成的三维结构(“支架”)的开发。

二维细胞培养物和动物模型常用作研究人类疾病的临床前模型。虽然已通过这些模型获得了有用的信息，这两种体系的特点均在于包括以下的一些限制：培养物中的早期细胞去分化和早期衰老，缺乏肿瘤-基质双向交流，基因和蛋白表达受损，缺乏与人类生物学和物种特异性毒性的关联。

通过组织样品的去细胞化(decellularisation)产生了由胞外基质(ECM)构成的生物支架。ECM完整性、生物活性和三维构架能够在去细胞化的支架中得以维持。然而，由于缺乏能经插管而允许灌注-去细胞化的蒂/脉管，因此生物支架的产生具挑战性。报道的规程的特点在于低速搅动且要求延长(例如，数周)的组织对去细胞化试剂的暴露。此外，这些规程对于小规模组织的完全去细胞化不够有效，且组织的外表面往往由于对试剂与酶的持续暴露而受损。

本发明人认识到，可以利用处理方案在不损害胞外基质的情况下使一系列不同类型的组织去细胞化，所述处理方案的特征在于在高频振荡下采用多组不同细胞损伤试剂的一个或多个处理循环。这些方案可以用于可重复产生保持天然组织的三维架构和胞外基质组成及形态的脱细胞支架。

本发明的一个方面提供一种产生去细胞化组织支架的方法，其包括：

(i)提供组织样品，

(ii)用渗透剂处理所述样品，和

(iii)用洗涤剂处理所述样品，

其中，在步骤(ii)和(iii)期间，使所述组织样品以1mm以上的位移和3Hz以上的频率进行振荡，

由此产生去细胞化组织支架。

由所要求保护的方法产生的去细胞化组织支架由来自源组织的脱细胞胞外基质(ECM)组成并且保持了该源组织的ECM的三维架构、ECM组成和生物活性。

去细胞化组织支架可以使用本文所述的方法在小于6小时、小于3小时或小于2小时内产生。

在采用渗透剂、洗涤剂和其它去细胞化试剂的处理期间，组织样品经受高频振荡，即3Hz以上的振荡。这种振荡提高了试剂在组织内的分布，增加了细胞裂解的效率和/或改善了细胞组分或免疫原组分从所述组织的流出。这减少了完全去细胞化所需的时间，同时维持了ECM蛋白、三维组织架构和ECM诱导细胞归巢、分化和增殖的能力。

振荡可以在单个平面中，优选在单个线性维度或线中。可以采用任何振荡方向或平面。例如，振荡可以是水平(即，垂直于重力)或垂直的(即，平行于重力)。

样品可以以3Hz以上、5Hz以上或10Hz以上且至多100Hz、至多75Hz、至多50Hz或至多30Hz的频率振荡。合适的振荡频率范围包括所列出的下限与所列出的上限的组合中的任一个。例如，样品可以以3Hz至75Hz振荡，例如10Hz至50Hz。

振荡可以使样品经受4ms^-2至500ms^-2、优选40ms^-2至50ms^-2(例如42ms^-2至47ms^-2)的G力(g-force)。例如，任何方向上的振荡可以以1.8ms^-2至181.1ms^-2进行，优选约45.3ms^-2。

振荡的位移可以为1mm以上、5mm以上、7.5mm以上或10mm以上且至多50mm、至多30mm或至多25mm。合适的位移范围包括所列出的下限与所列出的上限的组合中的任一个。例如，样品可以以5mm至50mm、优选7.5mm至25mm的位移振荡。

用于振荡组织样品的合适的振荡电动机和其它设备是本领域公知的。合适的装置包括振荡型组织干扰器。例如，组织样品可以使用TissueLyser LT^TM装置(Qiagen NV,NL)在垂直方向振荡或使用TissueLyser II^TM装置(Qiagen,NV,NL)在水平方向振荡。

适合于本文所述的去细胞化的组织样品包括长、宽或直径为0.1cm至4cm(例如，0.2cm至1.0cm)的切片或块体(例如，体积为0.005cm³至10cm³、例如0.008cm³至1cm³、例如约0.125cm³的切片)。切片或块体可以是任何形状。优选地，切片为用于在标准实验室容器(例如多孔板)中操作的合适尺寸，并且可以例如为边长为约0.5cm的近长方体。

小的不带血管的切片或楔块可以用来以小规模再现三维组织微环境的复杂性以用于疾病建模和药物筛选。合适的组织可以通过穿刺活检、针活检、手术刀切割或使用自动或非自动切块机来获得。

合适的组织样品包括肾脏、肌肉、骨、脂肪、软骨、肺、膀胱、角膜、皮肤、肝、肠脏、胰腺、前列腺、乳腺、脾、胎盘和心脏组织。在某些实施方式中，组织样品可以包括不同组织的组合，例如动物尾部。

组织样品可以是哺乳动物组织，例如，猪、绵羊、啮齿动物、非人灵长类动物或人组织。优选地，组织样品是人组织。

用于去细胞化的人组织可以获自不适于在移植中临床应用的人器官。合适的器官可以根据相关国家法律和伦理指引获得。除此以外，人组织可以从手术后的组织再切片(resection)获得。

在某些实施方式中，样品组织可以是不显示出与损伤或疾病相关的病理的正常组织。

在其它实施方式中，组织样品可以是显示出与损伤或疾病相关的病理的病理组织。例如，取样组织可以是脂肪化、纤维化、癌性、炎性组织或者显示出与疾病或损伤相关的一个或多个其它特征。在某些实施方式中，病理组织可以显示出与包括病毒感染、酒精或毒素损伤、纤维化、淀粉样变性和癌症在内的急性或慢性疾病相关的病理。病理组织的实例包括纤维化、硬变或癌性肝组织(来自不同病因)、淀粉样变肾脏组织、淀粉样变心脏组织、纤维化肠脏组织(例如来自患克罗恩病、溃疡性大肠脏炎或炎性肠脏病(IBD)的患者)、癌性胰腺组织、纤维化肺组织和癌性乳腺组织。

由病理组织样品产生的去细胞化支架可以具有不同于来自健康组织样品的支架的架构和组成。例如，在来自病理组织样品的支架中，与健康组织样品相比，病理支架的形态或ECM组分(例如，胶原蛋白、腱生蛋白和层粘连蛋白)的量或相对量可能有所变化。疾病的特征(例如，淀粉样变蛋白)可能与ECM相关并可在去细胞化期间得以保留，由此增加诊断的灵敏性。这对于获得用于疾病建模、药物筛选和诊断的特异性疾病改性支架是有用的。

病理组织可以获自患疾病的个体。

获得并储存用于本文所述的去细胞化的组织和组织样品的方法是本领域公知的。例如，组织可以经肝素化以避免凝集和/或经冷冻保护剂灌注。合适的冷冻保护剂包括DMSO、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)和蔗糖。

组织样品通过在经历振荡时对去细胞化试剂的一系列连续暴露而被去细胞化，所述去细胞化试剂包括渗透剂、洗涤剂和可选的蛋白酶及其它酶。振荡和对去细胞化试剂的连续暴露的组合使细胞和细胞碎片从组织样品的胞外基质(ECM)脱离并在不损伤ECM的情况下将其去除。

可以通过将组织浸入去细胞化试剂来使组织样品暴露于所述试剂。浸渍的样品其后进行振荡。

组织样品可以在整个去细胞化期间连续振荡，或者可以停止振荡以允许除去前一去细胞化试剂并添加新的去细胞化试剂。

将组织样品暴露于去细胞化试剂的每个步骤可以包括一次或多次利用去细胞化试剂的单独处理。例如，步骤(ii)可以包括1次、2次或3次以上的采用渗透剂的单独处理。步骤(iii)可以包括1次、2次或3次以上的采用洗涤剂的单独处理。

不同去细胞化试剂的暴露顺序基于其不同作用机理。可选地，样品中的细胞可以初始被机械性破坏以促进强力的细胞瓦解。对低渗溶液的暴露(步骤ii)增强细胞裂解，同时洗去细胞物质。对组织的暴露暴露于洗涤剂(步骤iii)以有效地洗去细胞物质。

一种方法可以包括重复步骤(ii)和/或步骤(iii)一次或多次。例如，组织样品可以暴露于采用去细胞化试剂处理的多次循环。例如，可以对组织样品进行多次包括步骤(ii)和(iii)的处理循环，例如可以对组织样品进行至少2次、至少3次或至少4次包括步骤(ii)和(iii)的处理循环。

渗透应力导致组织样品中的细胞裂解并放大机械性破坏的效果。渗透应力可以通过使组织样品暴露于具有对组织中的细胞的不同渗透压的一种或多种渗透剂(即，非等渗剂)而引入。组织可以暴露于具有低于细胞的渗透压并使细胞处于低渗环境的一种或多种低渗剂，和/或暴露于具有高于细胞的渗透压并使细胞处于高渗环境的一种或多种高渗剂。在某些实施方式中优选低渗剂。

高渗剂可能在例如从蛋白解离DNA时有用。合适的高渗剂是本领域公知的，包括水，可以可选地用例如磷酸盐、硼酸盐或Tris缓冲的盐水(例如，>0.9％(w/v)NaCl，例如3％至10％(w/v)NaCl)，聚乙二醇和右旋糖溶液。

在某些优选实施方式中，渗透剂是盐水，例如8.7％(w/v)NaCl。

低渗剂可能在例如以最小的ECM分子和结构变化通过简单渗透效应诱导细胞裂解时有用。合适的低渗剂是本领域公知的，包括去离子水和<0.9％(w/v)NaCl的盐水。

在某些优选实施方式中，渗透剂是去离子水。

洗涤剂溶解组织中的脂质和脂肪并促进从ECM去除细胞碎片。

优选的洗涤剂可以包括阴离子型洗涤剂，例如BigCHAP、二(聚乙二醇二[咪唑酰基羰基])、

35、

56、

72、

76、

92V、

97、

58P、

EL(Sigma、Aldrich)、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基a-D-吡喃葡萄糖苷、癸基b-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基a-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、正十六烷基b-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-a-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-b-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇醚、聚氧乙烯、皂甙、

20、

40、

60、

65、

80、

85(Sigma Aldrich)、Tergitol、十四烷基-b-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、

CF-21、

CF-32、

DF-12、

DF-16、

GR-5M、Triton

Triton

Triton

Triton

Triton

(Sigma Aldrich)、泰洛沙泊(Tyloxapol)、正十一烷基-b-D-吡喃葡萄糖苷及其组合。任何两性离子型洗涤剂将适用于本发明的目的。优选的两性离子型洗涤剂包括但不限于以下：CHAPS、CHAPSO、磺基甜菜碱3-10(SB3-10)、磺基甜菜碱3-12(SB 3-12)、磺基甜菜碱3-14(SB 3-14)、ASB-14、ASB-16、ASB-C80、非洗涤剂磺基甜菜碱(ND SB)201、DDMAB、DDMAU、EMPIGEN

洗涤剂、30％溶液、月桂基二甲基氧化胺(LDAO)30％溶液、

3-08洗涤剂、

3-10洗涤剂、

3-12洗涤剂、

3-14洗涤剂、

3-16洗涤剂及其组合。

优选的阴离子型洗涤剂包括十二烷基磷酸钠(SDS)和脱氧胆酸钠(SdC)。例如，组织样品可以暴露于0.01％至5％SDS，例如0.01％至1％SDS和/或0.1％至10％脱氧胆酸钠(SdC)，例如约4％脱氧胆酸钠。在某些优选实施方式中，洗涤剂可以包含4％SDS。

洗涤剂可以包含非离子型洗涤剂，例如鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸钠盐、胆酸、公牛或绵羊胆汁、脱氢胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N,N-二甲基十二胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨鹅去氧胆酸钠盐、甘胆酸水合物、甘胆酸钠盐水合物、甘胆酸钠盐、葡糖石胆酸3-硫酸二钠盐、葡糖石胆酸乙酯、N-月桂酰肌氨酸钠盐、N-月桂酰肌氨酸盐溶液、十二烷基硫酸锂、Lugol溶液、niaproof4、

QS-15、

QS-44溶液、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、l-癸烷磺酸钠、l-十二烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴代乙烷磺酸钠、络胆酸钠水合物、络胆酸钠、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、牛磺鹅去氧胆酸钠盐一水合物、牛磺鹅去氧胆酸钠盐水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐、Triton

Triton

GS-20溶液、三羟甲基氨基甲烷十二烷基硫酸盐(trizma dodecyl sulfate)、胆烷酸及其组合。

优选的非离子型洗涤剂包括聚乙二醇和Triton^TM X-100，例如聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基醚(也称为聚氧乙烯辛基苯基醚或TX-100；CAS 9002-93-1；C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n(n＝9-10))。例如，组织样品可以暴露于0.01％至10％TX-100或1％至3％TX-100，例如3％TX-100。

洗涤剂可以包括两性离子型洗涤剂，例如CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐)、磺基甜菜碱-10(3-(癸基二甲基氨基)丙磺酸盐)、磺基甜菜碱-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐)和三(正丁基)磷酸酯。例如，组织样品可以暴露于0.01％至5％两性离子型洗涤剂，例如0.01％至1％两性离子型洗涤剂。

多种其它合适的洗涤剂是本领域已知的且可获自商业来源(例如，Sigma AldrichCo LLC,MO,美国)。

组织可以暴露于两种以上不同洗涤剂。例如，步骤(iii)可以包括使组织样品暴露于阴离子型洗涤剂(例如SDS和/或SdC)和非离子型洗涤剂(例如TX-100)。

在某些实施方式中，样品可以暴露于SDS、SdC和TX-100，例如3％SDC、0.5％SDS和3％TX-100。

在某些实施方式中，组织样品可以暴露于具有诸如EDTA或EGTA等螯合剂的溶液中的洗涤剂，所述螯合剂螯合诸如Ca²⁺等二价金属离子并干扰对ECM的细胞附着。

在某些实施方式中，组织样品可以暴露于醇。所用的醇可以是任何醇，且优选的醇选自但不限于以下组：乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、异戊醇、正癸醇及其组合。

在某些实施方式中，去细胞化方法可以进一步包括用蛋白酶和/或核酸酶(例如，核酸内切酶或核酸外切酶)处理组织样品。优选地，组织样品用蛋白酶处理。

样品可以在单个步骤中或作为采用去细胞化试剂处理的重复循环的一部分用蛋白酶处理。

蛋白酶降解组织样品中的蛋白，破坏细胞和亚细胞结构并打断与ECM的细胞连结。合适的蛋白酶是本领域公知的且包括分散酶和胰蛋白酶。组织样品可以暴露于0.0025％至0.25％(w/v)胰蛋白酶，例如0.025％胰蛋白酶。

在某些实施方式中，组织样品可以暴露于具有诸如EDTA等螯合剂的溶液中的蛋白酶，所述螯合剂螯合诸如Ca²⁺等二价金属离子并干扰对ECM的细胞附着。

在优选实施方式中，组织样品可以用蛋白酶和洗涤剂同时处理。

例如，样品可以用包含SDS、SdC、TX-100和/或胰蛋白酶的溶液处理。这些组分可以以任何组合或浓度使用，例如0.1％至10％SdC；0.1％至10％SDS；0.1％至20％TX-100；0.05％至0.5％胰蛋白酶-EDTA,0.1％至10％NaCl，例如3％SdC；0.5％SDS；3％TX-100；0.025％胰蛋白酶-EDTA,4.3％NaCl。

在某些实施方式中，去细胞化方法可以进一步包括用使DNA变性的过乙酸(PAA)和/或使磷酸二酯键断裂的氢氧化铵处理组织样品。

在用去细胞化试剂处理后，例如在一个或多个上述步骤之间和/或在循环之间，可以将组织样品洗涤。

组织样品可以用合适的洗涤溶液洗涤，例如缓冲盐水，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.1％至10％盐水溶液或去离子水。例如，样品可以在暴露于洗涤剂和可选的蛋白酶之后和/或暴露于渗透剂之后用1％PBS洗涤。

典型地，组织样品在环境温度用1％PBS洗涤1分钟。

在某些实施方式中，洗涤步骤可以包括两次以上的连续暴露于PBS。

在步骤(ii)和(iii)之前，组织样品中的细胞可以受到机械性破坏以促进其去除。细胞可以在不影响胞外基质的情况下通过任何合适的破坏组织细胞的技术而被机械性破坏，包括冷冻/融化、超声或高强度聚焦超声(HIFU)。

优选地，组织样品在去细胞化之前进行至少一个冷冻/融化循环。

在某些实施方式中，在初始处理之后可以不重复机械性破坏技术。例如，在暴露于其它去细胞化试剂之后的诸如冷冻/熔化处理可能导致ECM损伤。

在其它实施方式中，在初始处理之后(例如，在重复步骤(ii)和/或(iii)一次或多次后)可以对组织中的细胞进行一次或多次机械性破坏。例如，组织样品可以进行一次或多次HIFU或超声。

优选地，通过对组织样品进行一次或多次冷冻/融化循环来将细胞机械性破坏。例如，可以将组织一次或多次在-20℃以下、优选-50℃以下、-60℃以下、-70℃以下冷冻然后融化。冷冻组织可以方便地在4℃至37℃融化。在某些实施方式中，组织可以在约4℃融化以使可能损伤ECM的组织内温度梯度最小化。例如，组织可以在约-80℃冷冻24小时以上然后在约4℃融化。在某些优选实施方式中，组织样品可以在37℃融化例如45分钟至1小时，然后浸入37℃的PBS中例如15分钟。

经过冷冻/融化的组织样品优选是干燥的，以避免ECM损伤。在某些实施方式中，可以在冷冻/融化步骤前，例如通过暴露于室温5至30分钟，来将组织样品干燥。

组织样品可以在等渗缓冲液例如盐水(诸如0.90％(w/v)NaCl或PBS)中进行冷冻/融化。

机械性破坏促进组织内的强烈细胞瓦解。由机械性破坏所致的细胞裂解可以通过步骤(ii)和(iii)中的采用渗透剂和洗涤剂的处理而增强。

在第一组实施方式的某些实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(a)0至50次(例如，直至上清液澄清)，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于盐水，例如2分钟，

(g)重复步骤(f)0至10次直至组织不含任何试剂和蛋白酶，

(h)重复步骤(a)至(e)0至10次(例如，直至组织完全发白)，

(i)使所述样品暴露于盐水，例如5分钟，

(j)重复步骤(i)0至10次。

在第一组的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(a)4次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于盐水，例如2分钟，

(g)重复步骤(f)4次，

(h)重复步骤(a)至(e)。

(i)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(j)重复步骤(i)2次。

合适的组织样品包括肝(例如，人肝)或肠脏(例如，人肠脏)。

合适的方案如表2所示(HL3和HI5)。

在第一组的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟

(b)重复步骤(a)10次

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟

(e)重复步骤(d)

(f)使所述样品暴露于盐水，例如2分钟，

(g)重复步骤(f)4次

(h)重复步骤(a)至(e)。

(i)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(j)重复步骤(i)2次

合适的组织样品包括肝，例如人肝。

合适的方案如表2所示(HL43)。

在第一组的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(d)11次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于盐水，例如2分钟，

(g)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(h)重复步骤(g)2次。

合适的组织样品包括肝，例如人肝。

合适的方案如表2所示(HL36)。

在第一组的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(a)5至10次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂，例如2分钟，

(d)重复步骤(a)5至10次，

(e)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，

(f)可选地重复步骤(a)至(e)1次以上。

合适的组织包括肾脏(例如，人肾脏)或心脏(例如，人心脏)。

样品在所述步骤之间可以使用PBS进行洗涤。

合适的方案如表2所示。

在第一组实施方式中，组织样品可以例如使用TissueLyser LT^TM以50Hz垂直振荡。

在第二组实施方式的某些实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(a)19次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于盐水，例如2分钟，

(g)重复步骤(f)4次。

(h)重复步骤(a)至(e)2次。

(i)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(j)重复步骤(i)2次。

合适的方案如表2所示(HL4)。

在第二组实施方式的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，和

(b)重复步骤(a)9次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)重复步骤(c)至(e)，

(g)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，和

(h)重复步骤(g)2次。

合适的方案如表2所示(HL43)。

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(a)9次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(g)重复步骤(f)2次。

合适的方案如表2所示(HL36)。

在第二组的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(b)重复步骤(a)19次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于盐水，例如2分钟，

(g)重复步骤(f)5次，

(h)重复步骤(a)至(d)5次，

(i)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(j)重复步骤(i)2次。

合适的方案如表2所示(HL-C1)。

在第二组的其它实施方式中，步骤(ii)和(iii)可以包括：

(a)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，和

(b)重复步骤(a)4次，

(c)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如2分钟，

(d)使所述样品暴露于洗涤剂和蛋白酶，例如4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使所述样品暴露于过乙酸(PAA)2分钟，

(g)重复步骤(f)1次，

(h)使所述样品暴露于氢氧化铵(NH₄OH)2分钟，

(i)重复步骤(h)2次，

(j)使样品暴露于去离子水，例如2分钟，

(k)重复步骤(j)10次，

(l)重复步骤(c)和(d)，

(m)使所述样品暴露于盐水(例如PBS)，例如5分钟，

(n)重复步骤(m)2次。

合适的方案如表2所示(HP1)。

在第二组实施方式中，组织样品可以例如使用TissueLyser II^TM以30Hz水平振荡。

合适的盐水溶液、洗涤剂和蛋白酶溶液以及其它去细胞化试剂在上文更详细地进行了描述。

在去细胞化后，组织样品可以被消毒，例如通过暴露于消毒剂。合适的消毒剂包括γ-照射、电解水和化学试剂(例如过乙酸(PAA))。组织样品可以暴露于0.01％过乙酸和4％乙醇，例如30分钟至2小时。例如，去细胞化的组织样品可以浸于消毒剂中并可选地如本文所述进行振荡。

在去细胞化和消毒之后，可以对去细胞化的组织样品进行测试，例如，细胞的缺失和/或ECM组分(例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、透明质酸、纤连蛋白、生长因子和胞外蛋白酶)的存在。

在淀粉样变组织样品的情形中，可以测试去细胞化的组织样品的淀粉样变原纤维(amyloidotic fibril)。

包括宏观可视化、显微术和免疫组织化学技术在内的合适的技术是本领域公知的。

去细胞化组织样品(例如人组织样品)在使用标准组织学染色程序的组织学切片中可能缺乏可检测的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞以及细胞碎片和核。

如本文所述产生的去细胞化组织样品保留了源组织样品的三维器官形态和架构以及ECM生物活性。

在某些实施方式中，如上文所述方法产生的去细胞化组织样品的架构和形态可以通过电子显微镜确认。

取决于源组织，去细胞化组织样品可以包含正常ECM或者可以为疾病改性的ECM。例如，去细胞化组织样品可以包含作为组织疾病或病理的特征的一个或多个结构变化。

去细胞化组织样品允许在支架内培养的细胞的有效附着、迁移、增殖和三维构建。去细胞化组织样品还提供了维持细胞表型和功能性质的生物活性分子和生物诱导性质，并且促使产生组织特异性基质。

在产生本文所述的去细胞化组织样品之后，一种方法可以包括将样品与诸如弹性蛋白酶或基质金属蛋白酶(MMP)等蛋白酶一起温育。这可以用于鉴定ECM相关的生物标志物。

在产生本文所述的去细胞化组织样品之后，一种方法可以包括使去细胞化样品进行蛋白质组学分离，例如使用电泳和/或质谱技术。这也可用于鉴定ECM相关的生物标志物。

在产生本文所述的去细胞化组织支架之后，一种方法可以包括用细胞再注入(re-populate)去细胞化支架以产生人工组织样品。

合适的细胞包括健康细胞或患病细胞，例如人原生和细胞系组织细胞(例如，组织窦细胞(Tissue Sinusoidal Cell))、内皮细胞、iPSC或源自患者特异性iPSC的细胞、胚胎干细胞(hESC)、间充质干细胞(hMSC)、胎儿干细胞(例如，羊水干细胞)、癌细胞、内皮祖细胞(EPC)和双潜能肝干细胞。

去细胞化肝样品可以用原生干细胞、肝星状细胞或库普弗细胞(Kupffer cell)再注入。去细胞化肠脏样品可以用上皮细胞、成肌纤维细胞、内皮细胞、肠癌细胞、iPSC或源自患者特异性iPSC的细胞、胚胎干细胞(hESC)、间充质干细胞(hMSC)、胎儿干细胞(例如，羊水干细胞)或双潜能肝干细胞再注入。去细胞化胰腺样品可以用胰岛-β细胞、内皮细胞、胰腺星状细胞、胰腺癌细胞、iPSC或源自患者特异性iPSC的细胞、胚胎干细胞(hESC)、间充质干细胞(hMSC)或胎儿干细胞(例如，羊水干细胞)再注入。去细胞化肾脏样品可以用足细胞、小管细胞、MSC、iPSC、胎儿干细胞(例如，羊水干细胞)或癌细胞再注入。去细胞化心脏样品可以用心肌细胞、内皮细胞、iPSC、胎儿干细胞(例如，羊水干细胞)或MSC再注入。去细胞化肠脏样品可以用肠脏干细胞、成肌纤维细胞或Caco-2细胞再注入。

去细胞化组织样品可以通过用细胞接种至支架内并在合适的条件下培养来再注入。例如，细胞可以直接注入至去细胞化支架的实质内和/或置于去细胞化支架的表面上。经接种的支架可以在静态条件下(例如在培养基中)或在动态条件下(例如在生物反应器中)培养。

在某些实施方式中，去细胞化组织支架可以用获自患者的自体人细胞再注入，以便例如产生用于植入该患者内的人工组织。在其它实施方式中，去细胞化人支架可以用异基因人细胞(即，源自不同的人个体的细胞)再注入，以便例如产生用于植入患者内的人工组织。在某些实施方式中，可以在植入前针对与患者的免疫相容性对异基因人细胞进行筛选。在其它实施方式中，去细胞化人支架可以用非免疫原细胞再注入，例如已经经工程化而去除了可能引发个体中的免疫响应的表面抗原(如HLA)的细胞。

本发明的其它方面提供了通过上文所述的方法产生的去细胞化组织支架。

如本文所述产生的去细胞化组织支架是脱细胞的且展示出源组织样品的胞外基质孔结构、架构和形态。由纤维化源组织样品产生的去细胞化组织支架展示出增加的ECM组分和改变的源组织的特征性架构及形态。

去细胞化组织支架可用于疾病建模。如上所述，合适的支架可以源自正常组织样品或病理组织样品。

疾病建模方法可以包括：

提供如上文所述产生的去细胞化组织支架，可选地用细胞再注入该支架以产生再细胞化组织，并且

确定化合物、药物、生物试剂、装置或治疗介入对所述支架或组织或者其内的细胞的效果。

本文所述的方法可以用于对组织疾病或影响组织的疾病建模，例如组织纤维化、组织癌症和转移癌、组织药物毒性、移植后免疫响应和自体免疫性肝炎。

去细胞化组织支架还可用于蛋白组学、生物标志物发现和诊断应用。例如，蛋白酶对去细胞化组织支架的组分、架构或形态的影响可用于鉴定生物标志物。

本发明的另一方面提供了用于产生去细胞化组织支架的装置，其包括：

(i)盒，该盒包括：

一个或多个容纳浸于去细胞化试剂中的组织样品的腔室，

将去细胞化试剂导入所述腔室的流入导管，和

将去细胞化试剂导出所述腔室的流出导管，

(ii)去细胞化试剂的试剂储库，该储库可连接于所述盒的流入导管，

(iii)用于使盒以1mm以上的位移和3Hz以上的频率振荡的振荡器，和

(iv)处理器，该处理器经编程以引导泵和振荡器，从而对腔室中的样品执行在高频振荡下的一个或多个处理循环的方案，所述处理用来自储库的不同去细胞化试剂的组进行。

所述装置可以进一步包括：

(v)一个或多个废料储库，该废料储库用于储存与所述腔室中的组织样品接触之后的去细胞化试剂，所述废料储库可连接于所述流出导管。

所述装置可以进一步包括：

(vi)允许去细胞化试剂进入所述流入导管的入口，和

(vii)允许去细胞化试剂从所述流出导管离开的出口。

所述装置可以进一步包括：

(viii)用于测量或监测样品室中的条件的一个或多个传感器。

可以确定浸渍组织样品的去细胞化试剂的压力、体积、流动模式、温度、气体、pH、机械力、浊度、生物分子浓度或者其它参数。

合适的传感器包括压力、体积、流动模式、温度、气体、pH、机械力和浊度传感器。

在某些实施方式中，所述装置可以进一步包括：

(ix)改变样品室中的条件的一个或多个执行器(actuator)。

所述一个或多个执行器可以与所述一个或多个传感器可操作性连接(可选地通过处理器)，以便响应于落在预定范围外的传感器参数测定而改变样品室中的去细胞化试剂的温度、压力、pH、浊度或其它参数。

所述盒包括其中组织样品浸于去细胞化试剂中的腔室。所述盒可以包括单个腔室或多个腔室，例如2、3、4、5或6个以上的腔室。在某些实施方式中，腔室可以包括6、12、18、24、30、36、42或48个以上的腔室。多个腔室可以以任何排列安置于盒内，例如二维阵列(即，水平或垂直的)或三维阵列。多个腔室可用于并行处理多个组织样品。

所述盒可以具有任何合适的尺寸。例如，盒的尺寸可以是100-400mm、500-600mm×50-80mm(宽×长×高)，例如305mm×650mm×65mm。

在某些实施方式中，腔室可以含有组织样品。腔室中的组织样品可以浸于通过流入导管从储库引入腔室内的去细胞化试剂中。

所述盒可以进一步包括用于将去细胞化试剂引入流入导管的入口和用于将去细胞化试剂从流出导管除去的出口。

优选地，所述盒包括单个入口和单个出口。这可能有助于通过减少所需的连接数而使外部污染风险最小化。

在某些优选实施方式中，所述盒中的多个腔室可以经流入导管与入口相连并经流出导管与出口相连。例如，流入导管可以分支而将入口可操作性连接至多个腔室，即导管可以以单一形式与入口相连然后可以分为不同分支，每个腔室可操作性连接至流入导管的不同分支，从而通过入口进入所述盒的去细胞化试剂流在不同导管分支之间分流并进入不用腔室。类似地，流出导管可以分支以将多个腔室连接至出口，每个腔室可操作性地连接至流出导管的不同分支，后者汇合而在出口处形成单一导管。离开不同腔室进入流出导管的分支的去细胞化试剂流汇合为单股流通过出口。

分支的流入和流出导管使得能够通过将经入口进入盒的去细胞化试剂流在腔室之间平均地分流而均匀填充腔室。

在某些优选实施方式中，盒可以包括三个板(底板、中心板和顶板)。

所述板可以通过在板间形成密封以避免试剂的泄露和交叉污染并维持无菌性的垫片或O型环隔开。

所述板可经成型以便在被放在一起形成盒时形成腔室以及流入和流出导管。

所述盒的中心板可以包含一个或多个组织样品用腔室。例如，中心板可以包含腔室阵列。

腔室的尺寸由待容纳的样品的尺寸决定。中心板的腔室的数目可以增加或减少以便能够容纳不同尺寸的组织样品。

所述盒的底板可以包含入口和将该入口连接至中心板中的一个或多个腔室的流入导管。流入口具有允许样品室被去细胞化试剂经流入导管填充的开放位置和避免其它时候从流入导管泄露的闭合位置。

所述盒的底板可以进一步包含出口和将中心板中的一个或多个腔室连接至该出口的流出导管。流出口具有允许去细胞化试剂经流出导管从样品室排出的开放位置和避免在其它时候试剂从流出导管泄露的闭合位置。

流入和流出导管可以由底板本体中的通道、坑道或沟槽形成。

底板可以经成型而避免中心板中的腔室内的组织样品进入底板中的导管，同时允许去细胞化试剂从导管通入腔室。例如，底板可以包含在每个通道中心处的挤出部(extrusion)或挡板。

在某些实施方式中，所述盒可以包括处于通道中心处的膜，该膜允许液体在底板的导管和中心板的腔室之间移动，但防止中心板中的腔室中的组织样品进入底板中的导管。所述膜可以位于底板中、中心板中或者两板间。

在组装的盒中，中心板中的一个或多个腔室位于底板中的导管上方，从而每个腔室可操作性连接至流入导管的分支和流出导管的分支。

所述盒可以进一步包括一个或多个传感器和/或执行器。例如，所述传感器和/或执行器可以位于所述盒的底板、中心板和/或顶板中。

顶板可以包括与底板中的导管模式相对应的导管模式。这些导管允许在去细胞化试剂的填充和排出期间从样品室的气体交换。在填充期间，当流出导管闭合时，顶板导管为从盒内被置换的空气提供了路径。类似地，在排出且流入导管闭合时，空气必须置换正从盒中排出的试剂。所述导管可以与适当的过滤器连接以允许无菌气体交换和避免盒中的超压(over-pressurisation)。

在顶板内的每个导管的中心，存在设计用于防止液体进入顶板中通道的挤出部。所述挤出部经安置以促进试剂滴回到中心板中的样品室内且不会穿过顶板。例如，挤出部可以具有顶点朝向中心板的近圆锥形。另外，可以在通道的中心处安置膜。所述膜可以例如允许板间的气体运动但不允许液体移动。

顶板可以经成型以避免去细胞化试剂进入顶板中的导管，同时允许去细胞化试剂从导管通入腔室。例如，顶板可以在每个通道的中心处包括挤出部或挡板。

顶板可以进一步包含能够通入中心板中的一个或多个腔室中的一个或多个采样口。这可用于从每个腔室的试剂采样以便评估试剂组成。可以监测所关注的特定分子(例如，试剂或样品中的分子)的水平。腔室的无菌性也可经采样口监测。

试剂储库是去细胞化试剂的容器。所述装置可以包括用于在处理方案中使用的每种去细胞化试剂的单独的试剂储库。优选地，所述装置包括至少4个试剂储库，以允许用至少4种不同去细胞化试剂处理组织样品。

试剂储库可以可操作性连接至入口，从而来自储库的试剂可以经流入导管引入一个或多个腔室。例如，可根据标准技术通过软管(tubing)和岐管将试剂储库连接至所述盒的入口。将试剂储库连接至所述盒的入口的适当软管、适配器和连接器可方便地获自商业来源。

试剂储库可以包含如上所述的去细胞化试剂，例如渗透剂、洗涤剂、洗涤溶液和蛋白酶等。

所述装置可以进一步包括废试剂储库。废试剂储库可以可操作性连接至出口。废试剂储库可以从出口接收已使用的去细胞化试剂。

在废去细胞化试剂移至废料储库的过程中，优选地经盒中的入口以空气置换腔室和导管中被移走的试剂。可根据标准技术通过软管和岐管将废试剂储库连接至所述盒的出口。将废试剂储库连接至所述盒的出口的适当软管、适配器和连接器可方便地获自商业来源。

所述盒可操作性连接于振荡器。例如，所述盒可位于与振荡器相连的支撑性底架中。

振荡器经适配以使盒进行高频振荡(例如，3Hz以上)。合适的振荡器是本领域公知的。

优选地，所述装置的其它组成部分(例如，试剂储库、泵、软管和处理器等)不进行振荡。

在使用时，去细胞化试剂从试剂储库移动并经入口进入所述盒。从入口处，去细胞化试剂经流入导管移动至腔室，在此处其浸渍组织样品。在处理组织样品后，去细胞化试剂经流出导管移动至出口。去细胞化试剂经出口离开所述盒并进入废料储库。其后，根据本文所述的去细胞化方案，新鲜的去细胞化试剂可以经流入导管被引入腔室内。

去细胞化试剂通过装置的移动可以由任何方便的手段所驱动，包括泵、空气压力或重力。在某些优选实施方式中，装置包括驱动去细胞化试剂移动的泵。优选地，装置的每个试剂储库具有单独的泵。这使得每个储库中的去细胞化试剂的移动能被分别控制。

装置可以经适配以维持组织样品用腔室中的无菌环境。在去细胞化期间可以使用各种本领域已知的技术来维持无菌性，例如控制和过滤空气流和/或用抗生素、抗真菌剂或其它抗微生物剂灌注以避免不希望的微生物生长。合适的抗微生物化合物是本领域公知的。

装置可以经适配以监测去细胞化方案的行动的参数(例如，压力、体积、流动模式、温度、气体、pH、机械力)。例如，系统可以包括监测去细胞化试剂和/或组织样品的传感器。传感器可以用于监测移动穿过装置的去细胞化试剂的压力；系统的环境温度和/或组织样品或去细胞化试剂的温度；移动穿过装置的去细胞化试剂的pH和/或流速；和/或腔室中的组织样品的生物学参数。除了具有监测所述特征的传感器之外，装置还可以包括用于维持或调解这些特征的控制器或执行器。

控制器可以包括诸如温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、用于开放和关闭与去细胞化试剂的液体连通并改变流动速度及方向的阀等部件。

为确保恒定条件(例如，温度)，可以将腔室、储库和软管经水夹套(water-jacketed)或者置于加热板上。

装置可以包括控制腔室中的组织样品的去细胞化的处理器。处理器可以是可编程控制单元(例如，便携式计算机或独立式计算机，或者集成计算机装置)，其限定去细胞化方案的变量(包括振荡速率、振荡时段、泵速、泵活动持续时间)以及检测和基于反馈控制温度、压力、pH和流速。处理器可以从装置的一个或多个传感器接收并处理信息。处理器可以将信息和指令传回生物反应器和/或组织样品。

处理器可以允许储存并实施一系列的预编程的去细胞化方法，控制所有适当的条件，以及手动操作过程变量。例如，基于组织样品的重量，根据本文针对特定组织样品的描述的去细胞化方法，处理器可以经适配和编程来计算每种去细胞化试剂的暴露次数和振荡速度。处理器可以经系统中的一个或多个泵和/或阀门控制器来改变去细胞化试剂并改变去细胞化试剂的流速或压力。

在某些实施方式中，处理器可以响应于传感器(例如，检测生物分子的传感器)来改变样品室中的条件。例如，在样品室内的特定分子浓度超过限定的阈值时可以改变试剂。

本发明的各种其它方面和实施方式将基于本公开对于本领域技术人员显而易见。

本发明的其它方面和实施方式提供了用术语“由…组成”代替术语“包含/包括”的上文所述的实施方式以及用术语“基本由…组成”代替术语“包含/包括”的上文所述的实施方式。

应该理解，除非上下文另外指明，本申请公开了上文所述的任何上述方面和实施方式彼此之间的所有组合。类似地，除非上下文另外指明，本申请公开了单独的优选和/或可选特征或者其与任何其它方面的所有组合。

上述实施方式的变化形式、其它实施方式及其改型对于本领域技术人员在其阅读本公开后将变得显而易见，且因此这些也落入本发明的范围。

本说明书所提及的所有文献和序列数据库条目均通过援引以其整体并入本文用于所有目的。

本文中使用的“和/或”应被当作两个指定的特征或组分的每一个与另一个一同或不与其一同的具体公开。例如，“A和/或B”应被当作(i)A、(ii)B和(iii)A和B各自的具体公开，如同其各自在本文中分开陈述一样。

现在将借助实施例并参照下文所述的附图对本发明的特定方面和实施方式进行说明。

图1显示了在去细胞化之前(上左)和之后(下左)的5mm³肝组织块。H&E(苏木精和曙红)组织学染色显示细胞在去细胞化后被去除。SR(天狼星红)染色显示了去细胞化组织中的胶原蛋白(红色)的保留和细胞物质(黄色)的去除。

图2显示了胞外基质蛋白(ECM)的免疫组织化学分析。胶原蛋白I、III、IV(结构蛋白)以及层粘连蛋白和纤连蛋白(基底膜蛋白)在去细胞化后得以保留。

图3显示了DNA定量。去细胞化程序有效且具有显著的DNA含量减少(p<0.01)。

图4显示了去细胞化后的胶原蛋白的定量测定。胶原蛋白定量显示出去细胞化组织中的胶原蛋白的量与新鲜组织相比的保持。

图5显示了包括由典型小叶结构围绕的汇管的150x SEM图像。另外，SEM图像确认了支架脱细胞度(acellularity)并明确限定了曾由干细胞占据的空间(即，无肝细胞空间)。

图6显示了在去细胞化之前(上左)和之后(下左)的5mm³硬变肝组织块。H&E(苏木精和曙红)组织学染色显示细胞在去细胞化后被去除。SR(天狼星红)染色显示了去细胞化组织中的胶原蛋白(红色)的保留和细胞物质(黄色)的去除。

图7显示了DNA定量(硬变肝)。去细胞化程序有效且具有显著的DNA含量减少(p<0.01)。

图8显示了去细胞化之前和之后的胰腺组织的组织学比较。SR(天狼星红)染色显示了去细胞化组织中的胶原蛋白(红色)的保留和细胞物质(黄色)的去除。H&E(苏木精和曙红)组织学染色显示细胞在去细胞化后被去除。

图9显示了DNA定量(胰腺)。去细胞化程序有效且具有显著的DNA含量减少(p<0.01)。

图10显示了去细胞化之前(左)和之后(右)的人肠脏的组织学比较，显示出在去细胞化程序后的组织的所有层中的胶原蛋白结构的保留。

图11显示了DNA定量(肠脏)。去细胞化程序有效且具有显著的DNA含量减少(p<0.01)。

图12显示了使用Autodesk Inventor Professional 2014软件生成的顶板(A)、中心板(B)和底板(C)的3D CAD模型。图(D)描绘了3D打印的完全组装的盒。图(E)和(F)分别描绘了结合的底板和顶板以及单独的底板。

具体实施方式

如上所述的用于将组织样品去细胞化的装置的实施方式如图12所示。该装置由容纳工艺操作期间所需的去细胞化试剂的一系列试剂储库(未示出)组成。所述储库与盒2经软管(未示出)连接。软管与试剂驱动泵(未示出)相连。试剂经位处盒2的底板3中的入口7进入盒2，然后行经流入导管8并在位于盒2的中心板4中的多个样品室6之间平均分配。为进入样品室6，去细胞化试剂必须流经适当的膜(未示出)和/或经过将样品维持在位于中心板4中的腔室6内的挤出部12。根据去细胞化规程，整个盒2随后由振荡电动机(未示出)振荡。其后试剂经底板中的流出导管9从盒2排出，然后经出口10离开盒并经软管和相连的驱动泵(未示出)行进至外部废料储库(未示出)。在排出期间，移除的试剂被经过滤的空气置换，后者经盒2的顶板5中的一系列导管进入盒。经顶板5中的疏水膜(未示出)和/或挤出部20防止试剂进入这些导管。在工艺的静止阶段期间，可以经整合的采样口(未示出)对试剂和/或组织采样以用于离线过程检测。整个工艺经处理器(未示出)控制，该处理器允许对所述工艺的所有方面以预定方式或响应于反馈环路进行控制。

实验

1.确定G力

用于对生物组织去细胞化的新系统被认为是简单谐振子(harmonicoscillator)，因为仅存在一种以恒定幅度和频率在周期性运动中作用于系统的力，其中恢复力与位移成正比并且作用于与位移相反的方向。由该论述可以建立方程式，这将允许对去细胞化期间由组织和试剂所经受的G力进行计算。因此，以频率f Hz和幅度

进行谐运动的生物组织(并假定其在0位移处起始(即，x＝0且t＝0))将占据位置

(认为组织及其周围溶液之间的密度差可以忽略)。此外，在简谐运动下移动的颗粒(在本情形中是组织)将具有方程式x”＝-w2x，其中w＝2*pi*f。将这些方程代入牛顿第二定律(力(F)等于质量(m)乘以加速度(a)[F＝ma])，得到方程式

将其在|sin|＝1时极限化。因此，当

时，其将处于其最大值/最小值。最后，将该方程除以重力所经受的力(mg)，

2.试剂

缩写：SdC脱氧胆酸钠；PBS/AA PBS+抗生素抗真菌剂；T/E 0.025％胰蛋白酶/EDTA0.025％；SDS十二烷基硫酸钠；TX100Triton X 100；RT室温；PAA过乙酸；EtOH乙醇。

脱氧胆酸钠(SDS)溶液4％：将40g脱氧胆酸钠(BioXtra,≥98.0％(Sigma-Aldrich))添加至1L去离子水(MilliQ，Millipore)中，并使用磁搅拌器搅拌1小时。

盐水溶液8.7％：将87g氯化钠(>99％(Sigma-Aldrich))添加至1L去离子水(MilliQ，Millipore)中，并使用磁搅拌器搅拌1小时。

试剂混合溶液(SDC3％；SDS 0,5％；TX1000.3％；T/E0.025％；NaCl 4.3％)：将30g脱氧胆酸钠(BioXtra,≥98.0％(Sigma-Aldrich))、5g十二烷基硫酸钠(BioXtra,≥99.0(Sigma-Aldrich))、3ml Triton X-100(Sigma-Aldrich)、10ml 0.25％

胰蛋白酶-EDTA(Life technologies)和43g氯化钠(Sigma-Aldrich)添加至去离子水(MilliQ，Millipore)中以制成总计1L，并使用磁搅拌器搅拌。

过乙酸(PAA)0.1％：将1ml过乙酸溶液(Purum纯，乙酸中约39％(Sigma-Aldrich))添加至1L去离子水(MilliQ，Millipore)中，并使用磁搅拌器搅拌1小时。

氢氧化铵(NH₄OH)0.1％：将1ml氢氧化铵溶液(ACS试剂，基于NH3 28.0％-30.0％(Sigma-Aldrich))添加至1L去离子水(MilliQ，Millipore)中，并使用磁搅拌器搅拌1小时。

3.方法

3.1组织去细胞化

用于将生物组织去细胞化的规程如本文其它部分所述，且示于表2和3中。

在完成规程后，选择随机样品并将其固定在10％福尔马林中用于组织学和免疫组织化学研究，在液氮中速冻(snap-frozen)并在-80℃冰箱中储存直至需用于DNA、胶原蛋白和弹性蛋白定量检测，在2.5戊二醛中固定以用于SEM成像，或在4℃于1％PBS中储存直至需用于生物工程试验。

首先将肝方块在水浴中于37℃融化1小时(hr)，随后添加1.2ml的1％PBS 15分钟(min)。一旦融化后，将方块转移至2ml安全锁试管(Eppendorf)。将标准化的1.5ml的每种溶液添加至其对应的试管/规程。

3.2组织学和免疫组织化学

将此前固定在10％福尔马林中的组织样品取出，在蒸馏水中洗涤，在一系列工业变性乙醇(IDA)(Acquascience)和二甲苯浴中脱水，最终包埋在石蜡中。然后使用LeicaRM2035切片机(Leica Biosystems)将样品切成5μm切片。然后使所有切片在最少5分钟内通过三次组织学级二甲苯(Acquascience)浴，然后在最少2分钟内通过三次IDA(Acquascience)浴，最后至自来水中。

3.3组织学

在室温将切片如下染色：

苏木精和曙红：将切片用苏木精Harris配方(Leica biosystems)处理10分钟，然后在自来水中洗涤5分钟。接下来，将切片用曙红(Leica biosystems)染色3分钟，然后再用水洗。然后将切片通过IDA(工业变性乙醇)(Acquascience)尽快地脱水，然后置于组织学级二甲苯(Acquascience)中直至封固。

天狼星红：将切片用新鲜过滤的天狼星红–F38(R.A.Lamb；CI-35780)处理20分钟。然后将切片通过IDA(Acquascience)尽快地脱水，然后置于组织学级二甲苯(Acquascience)中直至封固。

弹性范基林(Elastic Van Gieson)：将切片用0.5％高锰酸钾处理5分钟并用蒸馏水充分洗涤。接下来，将其用1％草酸处理1分钟，用蒸馏水洗继而用纯乙醇洗涤。然后用不掺水Miller’s弹性-(R.A.Lamb；LAMB/080D)染色2小时，用70％工业甲基化酒精(IMS)(Fisher scientific)充分洗涤，然后置于自来水中。将切片在显微镜下检查，并在必要时在0.5％酸-醇(在70％IDA水溶液中的1％HCl)中进行区分。作为最后一步，将切片用范基林(Leica biosystems)染色5分钟。然后将切片通过IDA(Acquascience)尽快地脱水，然后置于组织学级二甲苯(Acquascience)中直至封固。

3.4免疫组织化学

将切片于37℃在10％Tris缓冲盐水(TBS)中的0.5％胰蛋白酶(MP Biomedical)/0.5％糜蛋白酶(Sigma)/1％氯化钙(BDH)中温育30分钟。然后将切片用0.04％Tween-20(Sigma)在pH 7.6的10％TBS中洗涤5分钟。稍后将切片在过氧化物封闭溶液(Novocastra)中封闭5分钟，并在下述一抗中温育1小时：胶原蛋白I(兔pAb抗coll1(ab34710)，稀释为1:200；abcam)，胶原蛋白III(兔pAB抗coll3(ab7778)，稀释为1:500；abcam)，胶原蛋白IV(小鼠mAb抗coll4(M0785)，稀释为1:25；Dako)，纤连蛋白(小鼠mAb抗纤连蛋白(MAB1937)，稀释为1:100；Millipore)和层粘连蛋白(小鼠mAb抗层粘连蛋白α5-链(MAB1924)，稀释为1:200；Millipore)。然后将切片置于Novolink^TM post primary(Novocastra)25分钟，于Novolink^TM聚合物溶液(Novocastra)中25分钟，并用Novolink^TM 3,3’二氨基联苯胺(Novocastra)显色。最后将切片用Mayer苏木精复染1分钟。

将所有切片用DPX(leica biosystems)封固；盖上盖玻片并使用Zeiss Axioskop40观察。使用Zeiss Axiovision(4.8.2版)以Axiocam IcC5捕获图像。使用Fiji v1.49d(ImageJ Jenkins服务器)分析并增强所有图像。

3.5DNA定量

从-80℃冰箱取出用于所有规程的去细胞化组织块并在37℃水浴中融化1小时。然后将肝块称重，并在必要时切割为重15mg至25mg。然后将方块置于1.5ml微离心管中。向各管加入20μl蛋白酶K，然后使用涡旋机充分混合。然后将方块置于56℃的加热块中至少16小时或者直至方块完全裂解。然后使用QIAGEN DNAeasy血液和组织试剂盒根据制造商说明提取DNA。将提取的DNA在200μl缓冲AE中洗脱并使用NanoDrop ND-2000分光光度计定量。

3.6胶原蛋白定量

使用全胶原蛋白检测试剂盒根据制造商手册(QuickZyme Biosciences,荷兰)对天然组织和去细胞化组织的胶原蛋白含量定量。简言之，将样品在6M HCl中于95℃水解20小时，将水解物与色素原溶液混合从而使羟基脯氨酸残基染色，并在60℃显色1小时。使用FLUOstar Omega微孔板阅读器(BMG labtech,德国)测定每个样品的吸光度，并通过使用纯胶原蛋白水解物的标准曲线计算胶原蛋白量。

3.7扫描电子显微术(SEM)

将样品在0.1M磷酸盐缓冲液中的2.5％戊二醛中固定并在4℃留置24小时。用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤后，将样品切割为长约1cm的片段并在0.05M PBS中的25％蔗糖、10％甘油(pH 7.4)进行2小时冷冻保护，然后在氮气雪泥中快速冷冻并在-160℃片解。接下来，将样品放回室温的冷冻保护剂中并使其融化。在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中洗涤后，将材料于3℃在1％OsO4/0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.3)中固定1.5小时，并再次在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中洗涤。用dH2O润洗后，将样品在分级的乙醇-水系列液(达100％乙醇)中脱水，使用CO₂在临界点干燥，最后使用粘性碳触头(carbon tap)封固在铝桩(aluminum stub)上。片解的材料经封固以使沿实质的片解表面呈现于射束，并用Gatan离子束涂布机涂布以Au/Pd薄层(约2nm厚)。使用7401FEG扫描电子显微镜(Jeol,美国)记录图像。

3.8生物工程程序

将生物支架在完全培养基中留置过夜[第-1天]。使细胞以2百万细胞/50μl(2×10⁶/50μL)/个支架的浓度重悬(每个细胞系n≥12)。将细胞抽吸至0.5ml胰岛素注射器中并逐滴释放以最终覆盖去细胞化组织。经接种的支架在37℃的具有CO₂的湿润环境中保持2h以便细胞附着，随后添加完全培养基[第0天]。在第1天更换培养基并随后每3天时更换。在接种后第7天、第14天和第21天，将支架置于10％甲醛中并通过组织学或免疫组织化学评估，或者固定在2.5％戊二醛中以进行SEM分析。

4.结果

去细胞化的健康肝块(HL3、HL4、HL36和HL43)均为宏观上半透明且为白色(图1)。脉管网络也是可见的，且组织保持其立方结构。另外，对天然肝组织和去细胞化肝组织均进行核物质(H&E染色)和细胞残余物(SR染色)的组织学检视。去细胞化规程成功地消除了所有细胞物质(图1)。这通过对去细胞化肝块中残留的DNA量的定量所证实，该残留DNA量显著低于(p<0.001)新鲜肝组织的DNA量(图3)。

为了研究ECM蛋白的保留，进行了免疫组织化学。研究了5种ECM蛋白：胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、纤连蛋白和层粘连蛋白(图2)。可以看到胶原蛋白I和III衬于汇管区域，而胶原蛋白IV和纤连蛋白在肝小叶内明显可见。层粘连蛋白在血管和胆管周围呈阳性。类似地，胶原蛋白定量表明，去细胞化肝块与新鲜组织相比能够保留胶原蛋白(图4)。

此外，通过扫描电子显微镜(SEM)分析了去细胞化肝块。SEM图像证实了支架的脱细胞性并显示出曾由肝细胞所占据的边界清晰的空间(即，无肝细胞空间)的存在。据发现，构建该无肝细胞空间的结缔组织纤维以及汇管和小叶结构的三维网络结构非常好地得以保留(图5)。为了进一步研究支架的机械性质，使用原子量显微术(AFM)测定了天然组织和去细胞化组织的刚性。这显示出在天然组织和去细胞化组织之间没有显著的刚性上的差异。

去细胞化肝支架用不同类型的人肝实质细胞和非实质细胞再注入。发现这些细胞展示出优异的生存能力、移动性和胞外基质的重塑(remodelling)。此外，生物工程化支架显示出与标准二维体系在基因表达方面的显著差异。

去细胞化硬变肝组织(HLC1)类似地在颜色上为白色。同样地，脉管网络也可见且组织保持其立方结构。另外，对天然和去细胞化的硬变肝组织进行核物质(H&E染色)和细胞残余物(SR染色)的组织学检视。去细胞化规程成功地消除了所有细胞物质(图6)。这通过对去细胞化肝块中残留的DNA量的定量所证实，该残留DNA量显著低于(p<0.001)新鲜硬变肝组织的DNA量(图7)。

去细胞化硬变肝组织也能保留表征纤维化组织的变形的肝架构。这在SR和H&E染色中均可见，其显示出保存良好的结节和纤维化隔膜。

对去细胞化胰腺组织进行了核物质(H&E染色)和细胞残余物(SR染色)的组织学检视。去细胞化规程成功地消除了所有细胞物质(图8)。这通过对去细胞化胰腺块中残留的DNA量的定量所证实，该残留DNA量显著低于(p<0.001)新鲜胰腺组织的DNA量(图9)。胰腺构架也得以保留。SR和H&E染色均清楚地显示出胰岛所处的ECM的保留(图8)。

最后，对去细胞化肠脏组织进行了细胞残余物(SR染色)的组织学检视。去细胞化规程成功地消除了所有细胞物质(图10)。这通过对去细胞化肠脏块中残留的DNA量的定量所证实，该残留DNA量显著低于(p<0.001)新鲜肠脏组织的DNA量(图11)。肠脏微构架也得以保留。SR染色可视化显示出所有4个肠脏层的保留：绒毛粘膜、粘膜下层、外肌层和外膜(图10)。

表1

表2

Claims

1.一种产生去细胞化组织支架的方法，其包括：

(I)提供组织样品，

(II)用渗透剂处理所述组织样品，和

(III)用洗涤剂处理由步骤(II)得到的所述组织样品，

其中，重复步骤(II)和(III)，并且其中，在步骤(II)和(III)期间，使所述组织样品以1mm以上的位移和3至100Hz的频率在单个线性维度上进行振荡，所述振荡使组织样品受到6ms^-2至50ms^-2的G力，

由此产生去细胞化组织支架。

2.如权利要求1所述的方法，其中，以3Hz至75Hz使所述组织样品进行振荡。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述振荡具有5mm至50mm的位移。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述组织样品是肾脏、肌肉、骨、脂肪、软骨、肺、膀胱、角膜、皮肤、肝、脾、胎盘、肠脏、胰腺、前列腺、乳腺或心脏。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述渗透剂是低渗剂。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述低渗剂是去离子水。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述洗涤剂包括聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基醚(Triton X100^TM)。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述洗涤剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述洗涤剂包括脱氧胆酸钠(SdC)。

10.如权利要求1所述的方法，其中，用蛋白酶与所述洗涤剂组合处理所述组织样品。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述组织样品中的细胞在步骤(I)中被机械性损伤。

13.如权利要求12所述的方法，其中，通过冷冻和融化所述组织样品而使所述细胞机械性损伤。

14.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)0至50次，

(c)使由步骤(b)得到的所述组织样品暴露于洗涤剂和蛋白酶2分钟，

(d)使由步骤(c)得到的所述组织样品暴露于洗涤剂和蛋白酶4分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(g)重复步骤(f)0至10次，

(h)重复步骤(a)至(e)0至10次，

(i)使由步骤(h)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(j)重复步骤(i)0至10次。

15.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)4次，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(g)重复步骤(f)4次，

(h)重复步骤(a)至(e)，

(i)使由步骤(h)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(j)重复步骤(i)2次。

16.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)10次，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(g)重复步骤(f)4次，

(h)重复步骤(a)至(e)，

(i)使由步骤(h)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(j)重复步骤(i)2次。

17.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)11次，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水2分钟，

(g)使由步骤(f)得到的所述组织样品暴露于盐水5分钟，和

(h)重复步骤(g)2次。

18.如权利要求14至17中任一项所述的方法，其中，所述组织样品是肝样品。

19.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)5至10次，

(c)使由步骤(b)得到的所述组织样品暴露于洗涤剂，

(d)重复步骤(a)5至10次，

(e)使由步骤(d)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(f)可选地重复步骤(a)至(e)一次以上。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述组织样品是肾脏或心脏组织。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述组织样品以50Hz垂直振荡。

22.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)19次，

(d)使由步骤(c)得到的所述组织样品暴露于洗涤剂和蛋白酶2分钟，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(g)重复步骤(f)4次，

(h)重复步骤(a)至(e)2次，

(i)使由步骤(h)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(j)重复步骤(i)2次。

23.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)9次，

(e)重复步骤(d)，

(f)重复步骤(c)至(e)，

(g)使由步骤(f)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(h)重复步骤(g)2次。

24.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)10次，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(g)重复步骤(g)2次。

25.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)20次，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(g)重复步骤(f)5次，

(h)重复步骤(a)至(d)5次，

(i)使由步骤(h)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(j)重复步骤(i)2次。

26.如权利要求1所述的方法，其包括：

(a)使由步骤(I)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(b)重复步骤(a)4次，

(e)重复步骤(d)，

(f)使由步骤(e)得到的所述组织样品暴露于过乙酸(PAA)，

(g)重复步骤(f)1次，

(h)使由步骤(g)得到的所述组织样品暴露于氢氧化铵(NH₄OH)，

(i)重复步骤(h)2次，

(j)使由步骤(i)得到的所述组织样品暴露于去离子水，

(k)重复步骤(j)10次，

(l)重复步骤(c)和(d)，

(m)使由步骤(l)得到的所述组织样品暴露于盐水，

(n)重复步骤(m)2次。

27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中，所述组织样品是肝、胰腺或肠脏组织。

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述组织样品以30Hz垂直振荡。

29.如权利要求1所述的方法，其中，所述组织样品在每次重复步骤(II)和(III)时暴露于所述渗透剂和/或洗涤剂2至4分钟。

30.如权利要求1所述的方法，其包括在去细胞化后将所述支架除菌。

31.如权利要求1所述的方法，其包括对去细胞化支架重新注入细胞以产生再细胞化支架。