JP6885582B2

JP6885582B2 - トランスグルタミナーゼ活性促進剤

Info

Publication number: JP6885582B2
Application number: JP2017031647A
Authority: JP
Inventors: 秀須藤
Original assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-02-23
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2037-02-23
Also published as: JP2018135307A

Description

本発明は、トランスグルタミナーゼ活性促進剤に関する。

トランスグルタミナーゼはヒトを含めた動物の臓器中に分布する。分子量は３万から１０万程度のタンパク質である。
主な作用は皮膚最外層に存在する遊離のグルタミン酸残基とリシン残基との反応を触媒し，ε−リシン（γ−グルタミル）結合からなる架橋を形成することにより，表面構造を緻密化することである。反応系の組成によって３つの反応様式がある。いずれの場合もペプチド鎖中のグルタミン酸残基のγ−カルボキシアミド基がアシル供与体となるが，アミン化合物が存在する場合にはそのアミノ基がアシル受容体となり，アミン化合物のペプチドへの付加反応が起こる。ペプチド中のリジン残基のε−アミノ基がアシル受容体として反応すると，ε−リシン−イソペプチド結合によるペプチド鎖間の架橋が形成される。
以上の反応は、角化過程でインボルクリンやロリクリンなど疎水性のタンパク質が共有結合で架橋されて、不溶性のコーニファイドエンベロップ(cornified envelope(角質肥厚膜))と呼ばれる細胞膜の裏打ちタンパク質となり角層の安定化に寄与する。この形成において最も重要な役割を担うトランスグルタミナーゼの活性欠乏は、魚鱗癬など皮膚バリアを失う重篤な疾患となる。近年は、セラミドも単独では充分なバリア効果を発揮できず当該酵素による架橋が角質バリアの充実に重要であることも明らかになりつつある。
したがって、トランスグルタミナーゼの発現の促進や活性の増強は、表皮角質細胞を正常化し、乾燥肌やアトピー性皮膚炎症状の軽減、及び魚鱗癬の予防や治療に有効である。
また、トランスグルタミナーゼ産生促進は、毛髪においてはキューティクルやコルテックスの生合成が進ませ、毛質が太く丈夫なものに改善されると共に毛根における固定構造が強化され脱毛が起こりにくくなり、また、皮膚においては、皮膚角層の生合成が促進されることにより、肌質が改善され、ハリや潤いのある肌が得られることが期待される。(特許文献１)

トランスグルタミナーゼ産生促進剤として、マツヨイグサ属植物抽出物、パントテインスルホン酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等の外用剤が提案されている。(特許文献２〜３)
しかし、トランスグルタミナーゼの量が増えても、その活性の上昇が起こらなければその効果は得られない。
一方、不飽和脂肪酸は血液凝固防止作用、抗高脂血症作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、美白作用が知られ食品、化粧品等に応用されている。(特許文献４〜５)

特開平０８−２０５２３号公報特開２００４−９１３７６号公報特開平１１−１００３２０号公報特開平０５−２７９２４０号公報国際公開番号第２０１２／１０２３６４号

本発明の目的はトランスグルタミナーゼの活性を促進し、表皮角質細胞を正常化し、乾燥肌やアトピー性皮膚炎症状の軽減、及び魚鱗癬の予防や治療、肌質改善に有効な皮膚外用剤や毛髪改善、脱毛予防剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、不飽和脂肪酸が上記目的を達することがわかった。特にパルミトレイン酸、γリノレン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸より選ばれる１種又は２種以上の不飽和脂肪酸がその効果が非常に強いことがわかった。
これらの不飽和脂肪酸或いは不飽和脂肪酸で構成されるトリグリセライドを多く含む、魚油、肝油、海洋性微細藻類、微生物より任意の精製を経て使用することができる。
具体的に例示すれば、γ−リノレン酸の場合は、ボラージ油、黒スグリ油、および糸状菌等の菌体、パルミトレイン酸は珪藻、アラキドン酸はモルティエラ糸状菌、ハエカビ属菌体、エイコサペンタエン酸はシュワネラ属菌、ドコサヘキサエン酸はマイクロアルジェ属菌体等を例示することができる。
また、トランスグルタミナーゼはカルシウムイオン依存性であるが、表皮のカルシウムイオンの分布は顆粒層で最も高いが、角層との間にあるタイトジャンクション等の障壁によって角層でのカルシウム濃度は低い。
発明者の検討によってこれらの不飽和脂肪酸はカルシウムイオンが高濃度よりむしろ低濃度において、トランスグルタミナーゼの活性を促進することがわかり、皮膚外用剤として塗布した場合に最も皮膚外用剤の影響を受ける角層でのトランスグルタミナーゼ活性促進作用が強いことがわかった。
このことは本発明品が他のトランスグルタミナーゼ活性促進に比較して、より早く、より強く効果を発揮する要因と考えられる。
なお、トランスグルタミナーゼ産生促進剤と本発明のトランスグルタミナーゼ活性促進剤を併用することは本発明の効果をより強くすることは当然である。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
これらの不飽和脂肪酸の製剤への配合量は、０．０００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜３．０重量％である。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができる。

以下に不飽和脂肪酸のトランスグルタミナーゼの活性促進効果を以下の方法で確認した。
＜トランスグルタミナーゼ活性測定＞
24well-plateを用い、2継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を50−70％コンフルエントとなるようにHuMedia-KG2培地（フェノールレッド不含）で培養後、カルシウム濃度を1.8mMに変更し、翌日、試験を実施した。各種不飽和脂肪酸濃度、カルシウム濃度を変更した培地に加え、Biotinilated-X-cadaverine(Thermo Fisher Scientific)を添加し、一定時間作用した後、PBS(-)で洗浄し、中性ホルマリン固定した。再度洗浄の後、Streptavidin-conjugated Alexa Fluor488(Thermo Fisher Scientific)を加えて1時間放置し、洗浄後、POWERSCAN(登録商標)H1(DS PHARMA BIOMEDICAL)を用い、Ex488/Em516, Area scan(3×3)の条件(n=3)で蛍光を測定した。蛍光画像の観察には、Chamber Slide(Thermo Fisher Scientific)を用い、蛍光顕微鏡(OLYMPUS FSX100)を使って行った。

実験１
不飽和脂肪酸の作用濃度は５００μＭ、検体作用時のカルシウム濃度は０．１５ｍＭ、作用時間は４０分間で実験した結果を図１に示す。
実験２
エイコサペンタエン酸に関して作用濃度を変えて実験した。検体作用時のカルシウム濃度は０．１５ｍＭ、作用時間は４０分間で実験した結果を図２に示す。
実験３
エイコサペンタエン酸に関して作用濃度を５００μＭ、検体作用時のカルシウム濃度は０．１５ｍＭ、作用時間を変化させて実験した結果を図３に示す。
実験４
エイコサペンタエン酸に関して作用濃度を５００μＭ、作用時間は４０分間、検体作用時のカルシウム濃度を変化させて実験した結果を図４に示す。
なお、いずれのコントロールも不飽和脂肪酸を配合せず、実験した結果である。

実験１の結果、５００μＭの作用濃度で、オレイン酸、リノール酸、パルミトレイン酸、γリノレン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸はトランスグルタミナーゼの活性を促進することがわかった。特にパルミトレイン酸、γリノレン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸はトランスグルタミナーゼの活性促進効果が非常に強いことが分かった。
パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸はトランスグルタミナーゼの活性を促進する効果は認められなかった。
実験２の結果、エイコサペンタエン酸のトランスグルタミナーゼの活性促進は明確な濃度依存性があることがわかった。
実験３の結果、エイコサペンタエン酸のトランスグルタミナーゼの活性促進は作用時間に比例していることがわかった。
実験４の結果、カルシウム濃度が低いときにトランスグルタミナーゼの活性促進が強いことが分かった。
皮膚は表皮の顆粒層で、細胞死に伴うカルシウムイオンの細胞内への流入が起こるが、タイトジャンクション等の存在によって角層はカルシウム濃度が低い。エイコサペンタエン酸をはじめとする本願発明の不飽和脂肪酸は、角層等のカルシウム濃度が低い部位でもトランスグルタミナーゼの活性を促進することがわかった。

また、パルミトレイン酸、γリノレン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、乾燥肌、アトピー性皮膚炎に改善がみられた。また、毛髪用の外用剤としては毛髪改善、脱毛予防の効果が確認できた。

実験１の結果を示す。縦軸はＲＦＵ（相対蛍光強度）であり、横軸は左よりコントロール、オレイン酸、リノール酸、パルミトレイン酸、γリノレン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸の結果である。実験２の結果を示す。縦軸はＲＦＵ（相対蛍光強度）であり、横軸は左よりコントロール、エイコサペンタエン酸１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、５００μＭの結果である。実験３の結果を示す。縦軸はＲＦＵ（相対蛍光強度）であり、横軸は左よりコントロール（作用時間１０分間）、エイコサペンタエン酸５００μＭで作用時間１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、６０分間、８０分間の結果であり、一番右はコントロール（作用時間８０分間）である。実験４の結果を示す。縦軸はＲＦＵ（相対蛍光強度）であり、横軸は左よりコントロール、エイコサペンタエン酸５００μＭでカルシウムイオン濃度が０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．６ｍＭ、０．９ｍＭ、１．８ｍＭの結果である。

Claims

不飽和脂肪酸のうち、パルミトレイン酸、γリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸から選ばれる１種以上を有効成分として含有するトランスグルタミナーゼ活性促進剤。