JP6643822B2 - 異種間特異的psma×cd3二重特異性単鎖抗体 - Google Patents
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Description
(a)配列番号27に示されるCDR−L1、配列番号28に示されるCDR−L2、および配列番号29に示されるCDR−L3と;
(b)配列番号117に示されるCDR−L1、配列番号118に示されるCDR−L2、および配列番号119に示されるCDR−L3と;
(c)配列番号153に示されるCDR−L1、配列番号154に示されるCDR−L2、および配列番号155に示されるCDR−L3と
から選択されるCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVL領域を含むことが特に好ましい。
(a)配列番号12に示されるCDR−H1、配列番号13に示されるCDR−H2、および配列番号14に示されるCDR−H3と;
(b)配列番号30に示されるCDR−H1、配列番号31に示されるCDR−H2、および配列番号32に示されるCDR−H3と;
(c)配列番号48に示されるCDR−H1、配列番号49に示されるCDR−H2、および配列番号50に示されるCDR−H32と;
(d)配列番号66に示されるCDR−H1、配列番号67に示されるCDR−H2、および配列番号68に示されるCDR−H3と;
(e)配列番号84に示されるCDR−H1、配列番号85に示されるCDR−H2、および配列番号86に示されるCDR−H3と;
(f)配列番号102に示されるCDR−H1、配列番号103に示されるCDR−H2、および配列番号104に示されるCDR−H3と;
(g)配列番号120に示されるCDR−H1、配列番号121に示されるCDR−H2、および配列番号122に示されるCDR−H3と;
(h)配列番号138に示されるCDR−H1、配列番号139に示されるCDR−H2、および配列番号140に示されるCDR−H3と;
(i)配列番号156に示されるCDR−H1、配列番号157に示されるCDR−H2、および配列番号158に示されるCDR−H3と;
(j)配列番号174に示されるCDR−H1、配列番号175に示されるCDR−H2、および配列番号176に示されるCDR−H3と
から選択されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVH領域を含む。
(a)配列番号17または21に示されるVL領域、および配列番号15または19に示されるVH領域と;
(b)配列番号35または39に示されるVL領域、および配列番号33または37に示されるVH領域と;
(c)配列番号53または57に示されるVL領域、および配列番号51または55に示されるVH領域と;
(d)配列番号71または75に示されるVL領域、および配列番号69または73に示されるVH領域と;
(e)配列番号89または93に示されるVL領域、および配列番号87または91に示されるVH領域と;
(f)配列番号107または111に示されるVL領域、および配列番号105または109に示されるVH領域と;
(g)配列番号125または129に示されるVL領域、および配列番号123または127に示されるVH領域と;
(h)配列番号143または147に示されるVL領域、および配列番号141または145に示されるVH領域と;
(i)配列番号161または165に示されるVL領域、および配列番号159または163に示されるVH領域と;
(j)配列番号179または183に示されるVL領域、および配列番号177または181に示されるVH領域と
からなる群から選択されるVL領域およびVH領域を含む、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のCD3ε鎖エピトープに結合することが可能な第1の結合ドメインを特徴とすることがより好ましい。
a)配列番号394〜396のCDR H1〜3、および配列番号389〜391のCDR L1〜3と;
b)配列番号408〜410のCDR H1〜3、および配列番号403〜405のCDR L1〜3と;
c)配列番号422〜424のCDR H1〜3、および配列番号417〜419のCDR L1〜3と;
d)配列番号436〜438のCDR H1〜3、および配列番号431〜433のCDR L1〜3と;
e)配列番号445〜447のCDR H1〜3、および配列番号450〜452のCDR L1〜3と;
f)配列番号464〜466のCDR H1〜3、および配列番号459〜461のCDR L1〜3と;
g)配列番号478〜480のCDR H1〜3、および配列番号473〜475のCDR L1〜3と;
h)配列番号492〜494のCDR H1〜3、および配列番号487〜489のCDR L1〜3と;
i)配列番号506〜508のCDR H1〜3、および配列番号501〜503のCDR L1〜3と;
j)配列番号520〜522のCDR H1〜3、および配列番号515〜517のCDR L1〜3と;
k)配列番号534〜536のCDR H1〜3、および配列番号529〜531のCDR L1〜3と;
l)配列番号548〜550のCDR H1〜3、および配列番号543〜545のCDR L1〜3と;
m)配列番号556〜564のCDR H1〜3、および配列番号557〜559のCDR L1〜3と;
n)配列番号576〜578のCDR H1〜3、および配列番号571〜573のCDR L1〜3と;
o)配列番号590〜592のCDR H1〜3、および配列番号585〜587のCDR L1〜3と;
p)配列番号604〜606のCDR H1〜3、および配列番号599〜601のCDR L1〜3と;
q)配列番号618〜620のCDR H1〜3、および配列番号613〜615のCDR L1〜3と;
r)配列番号632〜634のCDR H1〜3、および配列番号627〜629のCDR L1〜3と;
s)配列番号646〜648のCDR H1〜3、および配列番号641〜643のCDR L1〜3と;
t)配列番号660〜662のCDR H1〜3、および配列番号655〜657のCDR L1〜3と;
u)配列番号674〜676のCDR H1〜3、および配列番号669〜671のCDR L1〜3と;
v)配列番号688〜690のCDR H1〜3、および配列番号683〜685のCL1〜3と;
w)配列番号702〜704のCDR H1〜3、および配列番号697〜699のCDR L1〜3と;
x)配列番号716〜718のCDR H1〜3、および配列番号711〜713のCDR L1〜3と;
y)配列番号729〜731のCDR H1〜3、および配列番号724〜726のCDR L1〜3と
からなる群から選択される配列群を、第2の結合ドメイン内におけるCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2、およびCDR L3として含む。
(a)配列番号399、413、427、441、455、469、483、497、511、525、539、553、567、581、595、609、623、637、651、665、679、693、707、721、734、799、817、863、849、835、785、899、935、1017、1031、917、1003、953、971、または989のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列と;
(b)配列番号400、414、428、442、456、470、484、498、512、526、540、554、568、582、596、610、624、638、652、666、680、694、708、736、735、800、818、864、850、836、786、882、900、936、1018、1032、918、1004、954、972、990、804、822、868、886、904、940、922、958、または976のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と;
(c)(a)または(b)のアミノ酸配列に対して、少なくとも90%同一であり、より好ましくは少なくとも95%同一であり、最も好ましくは少なくとも96%同一であるアミノ酸配列と
から選択される配列を含む。
(a)(1または複数の)ポリペプチドを、アミノ酸配列Gln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Met−Gly(配列番号341)またはGln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Ile−Gly(配列番号342)を含み、そのC末端を介して固相へと固定した、最大27アミノ酸によるCD3εの細胞外ドメインのN末端断片と接触させるステップと;
(b)前記断片から、結合した(1または複数の)ポリペプチドを溶出させるステップと;
(c)(b)の溶出物から、(1または複数の)ポリペプチドを単離するステップとを含む方法によっても達成することができる。
前記癌(cancer)は固体の腫瘍であることが好ましく、癌腫(carcinoma)または前立腺癌であることが好ましい。前記医薬組成物は、担体、安定化剤、および/または賦形剤による適切な製剤をさらに含むことが好ましい。
以下の非ヒト霊長動物:コモンマーモセット、ワタボウシタマリン、およびリスザルの血液試料を用いて、CD3イプシロンを同定した。製造元のプロトコール(Qiagen社製、QIAamp RNA Blood Miniキット)に従い、全細胞RNAを単離するため、ヘパリンで処理した新鮮な全血液試料を調製した。公表されているプロトコールに従い、抽出したmRNAをcDNAへと転写した。略述すると、沈殿させた10μlのRNAを、10倍濃度のヘキサヌクレオチドミックス(Roche社製)1.2μlと共に、70℃で10分間にわたりインキュベートし、氷上で保存した。4μlの5倍濃度superscript II緩衝液、0.2μlの0.1Mジチオトレイトール、0.8μlのsuperscript II(Invitrogen社製)、1.2μlのデオキシリボヌクレオシド三リン酸(25μM)、0.8μlのRNアーゼ阻害剤(Roche社製)、および1.8μlのDNアーゼ、およびRNアーゼ非含有水(Roth社製)からなる反応混合物を添加した。室温で10分間にわたり反応混合物をインキュベートした後に、42℃で50分間にわたるインキュベーション、また、90℃で5分間にわたるインキュベーションを行った。反応物を氷上で冷却した後に、0.8μlのRNアーゼH(1U/μl、Roche社製)を添加し、37℃で20分間にわたりインキュベートした。
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATGATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD
2.1.可溶性の異種タンパク質への融合によりその天然のCD3環境から分離されたCD3イプシロンのN末端を用いるマウスの免疫化
balb/c×C57black交配による10週齢のF1マウスを、ヒトおよび/またはコモンリスザルの成熟CD3イプシロン鎖の最N末端におけるアミノ酸1〜27を保有するCD3イプシロン−Fc融合タンパク質(CD3 1〜27−Fc)により免疫化した。この目的のために、マウス1匹当たり、300ulのPBS中に10ナノモルのチオエート修飾されたCpG−オリゴヌクレオチド(5’−tccatgacgttcctgatgct−3’)(配列番号343)を伴う40μgのCD3 1〜27−Fc融合タンパク質を腹腔内投与した。21日後、42日後、また、場合によって、63日後に、同じ方法で、マウスに追加投与による免疫化を施した。最初の追加投与による免疫化の10日後において、血液試料を採取し、ELISAにより、CD3 1〜27−Fc融合タンパク質に対する抗体血清力価を調べた。さらに、標準的なプロトコールに従うフローサイトメトリーにより、CD3陽性のヒトT細胞株であるHPBallに対する力価を調べた。血清力価は、免疫化しなかった動物におけるより、免疫化した動物において著明に高かった。
最後の注射の3日後において、標準的なプロトコールに従い、マウス脾臓細胞を回収し、全RNAを調製した。
PEG8000/NaCl沈殿および遠心分離により、個々の培養物上清から、クローニングされたscFvレパートリーを保有するファージライブラリーを回収した。約1011〜1012個のscFvファージ粒子を、0.4mlのPBS/0.1%BSA中に再懸濁させ、緩徐に撹拌しながら、氷上で1時間にわたり、105〜107個のJurkat細胞(CD3陽性ヒトT細胞株)と共にインキュベートした。これらのJurkat細胞は、ウシ胎仔血清(10%)、グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンにより強化したRPMI培地中であらかじめ培養し、遠心分離により回収し、PBS中で洗浄し、PBS/1%FCS(Naアジドを含有する)中に再懸濁させた。Jurkat細胞に特異的に結合しないscFvファージは、PBS/1%FCS(Naアジドを含有する)を伴う最大5回にわたる洗浄ステップにより除去する。洗浄後、pH2.2のHCl−グリシン中で細胞を再懸濁させる(その後のボルテクシングを伴う10分間にわたるインキュベーション)ことにより、細胞から結合実体を溶出させ、pH12の2Mトリスにより中和させた後に、溶出物を用いて、新鮮な未感染の大腸菌XL1 Blue培養物に感染させた(OD600>0.5)。ヒトscFv断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した大腸菌細胞を含有する大腸菌培養物を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これにVCMS 13ヘルパーファージを感染させて、抗体ディスプレイおよびin vitroにおける選択の第2ラウンドを開始させた。通常、計4〜5ラウンドにわたり選択を実施した。
選択後、大腸菌培養物から、4〜5ラウンドのパニングに対応するプラスミドDNAを単離した。可溶性のscFvタンパク質を作製するため、プラスミドからVH−VL−DNA断片を切り出した(XhoI−SpeI)。発現構築物(例えば、scFv)が、scFvとHis6タグとの間にFlagタグ(TGD YKDDDDK)を包含し、また、さらなるファージタンパク質を欠失させる点で元のpComb3H5BHisとは異なるプラスミドである、pComb3H5BFlag/His内における同じ制限部位により、これらの断片をクローニングした。ライゲーション後、プラスミドDNAの各プール(パニングのラウンドが異なる)を、熱ショックコンピテント大腸菌のTG1株またはXLI blue株100μl中へと形質転換し、カルベニシリンLB寒天上へと播種した。単一のコロニーを採取して、100ulのLBカルベニシリン(50ug/ml)中へと播種した。
そのN末端において、CD3イプシロンのN末端における最初の27アミノ酸を提示する異種タンパク質を、それらの表面において発現する真核細胞上におけるフローサイトメトリーにより、単離scFvの結合について調べた。
マウス抗CD3 scFvのVH領域を、ヒト生殖細胞系列抗体のアミノ酸配列に対して整列した。非ヒトVHに対して最も緊密な相同性を有するヒト生殖細胞系列抗体のVH配列を選択し、2つのアミノ酸配列の直接的なアライメントを実施した。ヒトVHフレームワーク領域と異なる非ヒトVHのフレームワーク残基(「異なるフレームワーク位置」)が多数存在した。これらの残基のうちの一部は、その標的に対する抗体の結合および活性に奇与しうる。
3.1.CD3 1〜27−Fcのクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ領域およびFcガンマ領域に融合させた、ヒトCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27のコード配列、ならびに6ヒスチジンタグを得た(該組換え融合タンパク質のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号230および229に列挙する)。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外部分のうちの最初の27アミノ酸のコード配列、次いで、インフレームで、ヒトIgG1のヒンジ領域およびFcガンマ部分のコード配列、次いで、インフレームで、6ヒスチジンタグのコード配列、ならびに終止コドンを含有するようにデザインした(図1)。遺伝子合成断片はまた、融合タンパク質をコードするcDNAの始点および終点には、制限部位を導入するようにもデザインした。5’端においてEcoRI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いる。標準的なプロトコールに従い、EcoRIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片を、pEF−DHFR(pEF−DHFRは、Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025;およびRaumら、Cancer Immunol Immunother 50(2001)、141〜150において説明されている)と称するプラスミド内へとクローニングした。製造元のプロトコールに従い、配列を検証したプラスミドを用いて、FreeStyle 293発現システム(ドイツ、カールスルーエ、Invitrogen GmbH社製)内においてトランスフェクションを行った。3日後において、トランスフェクタントの細胞培養物上清を回収し、ELISAアッセイにおいて、組換え構築物の存在について調べた。ヤギ抗ヒトIgG Fcガンマ断片特異性抗体(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社から購入した)を、PBS中において5μg/mlまで希釈し、ウェル当たり100μlで、MaxiSorp96ウェルELISAプレート(ドイツ、ヴィースバーデン、Nunc GmbH & Co.KG社製)上へとコーティングし、4℃で一晩にわたり静置した。ウェルを、0.05%Tween20を伴うPBS(PBS/Tween)により洗浄し、室温(RT)で60分間にわたり、PBS中3%のBSA(ウシアルブミン、画分V;ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)によりブロッキングした。その後、ウェルを、PBS/Tweenにより再度洗浄し、次いで、RTで60分間にわたり、細胞培養物上清と共にインキュベートした。洗浄後、ウェルを、RTで60分間にわたり、1%BSAを伴うPBS中において1:500に希釈した、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗His6抗体(ドイツ、マンハイム、SIGMAFAST社、Roche Diagnostics GmbH社)と共にインキュベートした。その後、ウェルを、200μlのPBS/Tweenにより洗浄し、また、製造元のプロトコールに従い、100μlのSIGMAFAST OPD(SIGMAFAST OPD[o−フェニレンジアミンジヒドロクロリド]基質溶液(ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製))を添加した。100μlの1M H2SO4を添加することにより反応を停止させた。PowerWaveXマイクロプレート分光光度計(米国、バーモント州、ウィヌースキー、BioTek Instruments社製)上で、490nmにおける発色反応を測定し、620nmにおけるバックグラウンドの吸収を差し引いた。図2に示す通り、陰性対照として用いた、モックトランスフェクトHEK 293細胞による非関連上清と比較して、構築物の存在が明確に検出された。
ELISAアッセイにより、CD3 1〜27−Fcに対する、ペリプラズム内で発現させた、CD3イプシロンに特異的な異種間特異的単鎖抗体の粗調製物の結合について調べた。ヤギ抗ヒトIgG Fcガンマ断片特異性抗体(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社)を、PBS中において5μg/mlまで希釈し、ウェル当たり100μlで、MaxiSorp 96ウェルELISAプレート(ドイツ、ヴィースバーデン、Nunc GmbH & Co.KG社製)上へとコーティングし、4℃で一晩にわたり静置した。ウェルを、0.05%Tween20を伴うPBS(PBS/Tween)により洗浄し、室温(RT)で60分間にわたり、PBS中3%のBSA(ウシアルブミン、画分V;ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)によりブロッキングした。その後、ウェルを、PBS/Tweenにより洗浄し、RTで60分間にわたり、CD3 1〜27−Fc構築物を発現する細胞培養物上清と共にインキュベートした。PBS/Tweenによりウェルを洗浄し、室温で60分間にわたり、上記で説明した通りにペリプラズム内で発現させた、異種間特異的単鎖抗体の粗調製物と共にインキュベートした。PBS/Tweenによる洗浄後、ウェルを、1%BSAを伴うPBS中において1:10000に希釈した、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗Flag M2抗体(ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)と共にインキュベートした。PBS/Tweenによりウェルを洗浄し、また、製造元のプロトコールに従い、100μlのSIGMAFAST OPD(SIGMAFAST OPD[o−フェニレンジアミンジヒドロクロリド]基質溶液(ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製))と共にインキュベートした。100μlの1M H2SO4を添加することにより発色反応を停止させ、PowerWaveXマイクロプレート分光光度計(米国、バーモント州、ウィヌースキー、BioTek Instruments社製)上で、490nmにおける発色反応を測定し、620nmにおけるバックグラウンドの吸収を差し引いた。マウス抗CD3単鎖抗体と比較して、CD3 1〜27−Fc構築物に対する、CD3イプシロンに特異的な異種間特異的単鎖抗体の強力な結合が観察された(図3)。
4.1.CD3 1〜27−EpCAMのクローニングおよび発現
異なる非チンパンジー霊長動物(マーモセット、タマリン、リスザル)およびブタから、CD3イプシロンを単離した。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、Flagタグを付したカニクイザルEpCAMのN末端に融合させた、成熟ヒト、成熟コモンマーモセット(common marmoset(Callithrix jacchus))、成熟ワタボウシタマリン(cottontop tamarin(Saguinus oedipus))、成熟コモンリスザル(common squirrel monkey(Saimiri sciureus))、および成熟家畜ブタ(domestic swine(Sus scrofa);陰性対照として用いた)のCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27のコード配列を得た(該組換え融合タンパク質のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号231〜240に列挙する)。遺伝子合成断片は、まず、標的発現ベクター内に既に存在する19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との、適正なリーディングフレーム内における融合を可能とするBsrGI部位、次いで、インフレームで、成熟CD3イプシロン鎖の細胞外部分のうちのN末端におけるアミノ酸1〜27のコード配列、次いで、インフレームで、Flagタグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟カニクイザルEpCAM膜貫通タンパク質を含有するようにデザインした(図4)。遺伝子合成断片はまた、融合タンパク質をコードするcDNAの終点において制限部位を導入するようにもデザインした。5’端においてBsrGI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、BsrGIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片を、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列を既に含有する、pEF−DHFR(pEF−DHFRは、Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025において説明されている)と称するプラスミドの派生物内へとクローニングした。製造元のプロトコールに従い、MATra−A試薬(ドイツ、ゲッティンゲン、IBA GmbH社製)、また、175mlの細胞培養フラスコ内における付着性293−HEK細胞用の12μgのプラスミドDNAを用いて、293−HEK細胞に一過性にトランスフェクトするのに、配列を検証したプラスミドを用いた。細胞培養の3日後において、標準的なプロトコールに従うFACSアッセイにより、トランスフェクタントを、組換え膜貫通タンパク質の細胞表面における発現について調べた。この目的のために、2.5×105個の細胞を、2%FCSを伴うPBS中に5μg/mlの抗Flag M2抗体(ドイツ、タウフキルヒエン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)と共にインキュベートした。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、結合した抗体を検出した。試料は、FACScalibur(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)上で測定した。トランスフェクトされた細胞上における、カニクイザルEpCAM、ならびにヒトCD3イプシロン鎖、マーモセットCD3イプシロン鎖、タマリンCD3イプシロン鎖、リスザルCD3イプシロン鎖、およびブタCD3イプシロン鎖それぞれのN末端におけるアミノ酸1〜27からなる、Flagタグを付した組換え膜貫通融合タンパク質の発現が、明確に検出された。
標準的なプロトコールに従うFACSアッセイにより、カニクイザルEpCAMに融合させた、ヒトCD3イプシロン鎖、マーモセットCD3イプシロン鎖、タマリンCD3イプシロン鎖、およびリスザCD3イプシロン鎖それぞれのN末端におけるアミノ酸1〜27に対する、ペリプラズム内で発現させた異種間特異的抗CD3単鎖抗体の粗調製物の結合について調べた。この目的のために、2.5×105個の細胞を、ペリプラズム内で発現させた異種間特異的抗CD3単鎖抗体の粗調製物(調製は、上記で説明した通り、また、標準的なプロトコールに従い実施した)と共に、また、陰性対照としてのマウス抗ヒトCD3単鎖抗体と共にインキュベートした。二次抗体として、2%FCSを伴う50μlのPBS中において5μg/mlのペンタHis抗体(ドイツ、ヒルデスハイム、Qiagen GmbH社製)を用いた。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体の結合を検出した。試料はFACSCalibur(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)上で測定した。図6(A〜E)に示す通り、カニクイザルEpCAMに融合させた、ヒト、マーモセット、タマリン、またはリスザルのCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27からなる、組換え膜貫通融合タンパク質を発現するトランスフェクタントに対する単鎖抗体の結合が観察された。陰性対照として用いた、カニクイザルEpCAMに融合させた、ブタのCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27からなる融合タンパク質に対する、異種間特異的単鎖抗体の結合は観察されなかった。複数の霊長動物に対する抗CD3単鎖抗体の異種間特異性が示された。抗Flag M2抗体により得られたシグナルと、異種間特異的単鎖抗体により得られたシグナルとは同等であり、これにより、CD3イプシロンのN末端におけるアミノ酸1〜27に対する、異種間特異的単鎖抗体の強力な結合活性が示された。
5.1.ヒト野生型CD3イプシロンのクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトCD3イプシロン鎖のコード配列を得た(ヒトCD3イプシロン鎖のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号242および241に列挙する)。遺伝子合成断片は、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、ヒトCD3イプシロンをコードするcDNAの始点および終点における制限部位を含有するようにデザインした。5’端においてEcoRI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、EcoRIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片を、pEF NEOと称するプラスミド内へとクローニングした。pEF NEOは、従来の分子クローニングにより、DHFRのcDNAを、ネオマイシン耐性を有するcDNAにより置換することにより、pEF DHFR(Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025)から派生させた。配列を検証したプラスミドを用いて、37℃、湿度95%、および7%CO2において、安定化L−グルタミンを伴い、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%HEPES、1%ピルビン酸、1%非必須アミノ酸(すべて、ドイツ、ベルリン、Biochrom AG社製)を補充した、RPMI中で培養されたマウスT細胞株であるEL4(ATCC受託番号TIB−39)にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、SuperFectトランスフェクション試薬(ドイツ、ヒルデン、Qiagen GmbH社製)、および2μgのプラスミドDNAにより実施した。24時間後にPBSで細胞を洗浄し、600μg/mlの選択用G418(オーストリア、パシング、PAA Laboratories GmbH社製)を伴う前述の細胞培地中において再度これを培養した。トランスフェクションの16〜20日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7〜14日後、標準的なプロトコールに従うFACS解析により、ヒトCD3イプシロンの発現について細胞を調べた。2.5×105個の細胞を、2%FCSを伴うPBS中に5μg/mlの抗ヒトCD3抗体であるUCHT−1(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)と共にインキュベートした。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体の結合を検出した。試料は、FACScalibur(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)上で測定した。トランスフェクトされたEL4細胞上におけるヒト野生型CD3の発現を、図7に示す。
異種間特異的単鎖抗CD3抗体の結合を検出する手段を改善するため、H2C HLP、A2J HLP、およびE2M HLPを、マウスIgG1およびヒトラムダ定常領域を伴うIgG1抗体へと転換した。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、それぞれのIgG1抗体の重鎖および軽鎖をコードするcDNA配列を得た。各特異性抗体のための遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド(配列番号244および243)、次いで、インフレームで、それぞれの重鎖可変領域、またはそれぞれの軽鎖可変領域のコード配列、次いで、インフレームで、それぞれ、マウスIgG1の重鎖定常領域のコード配列(配列番号246および245)、またはヒトラムダ軽鎖定常領域のコード配列(配列番号248および247)を含有するようにデザインした。融合タンパク質をコードするcDNAの始点および終点には、制限部位を導入した。5’端におけるEcoRI、また、3’端におけるSalIの制限部位を、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、EcoRIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片を、重鎖構築物はpEF DHFR(Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025)と称するプラスミド内へ、軽鎖構築物はpEF ADA(pEF ADAは、Raumら、Cancer Immunol Immunother 50(3)(2001)、141〜150において説明されている)と称するプラスミド内へとクローニングした。製造元のプロトコールに従い、配列を検証したプラスミドを用いて、FreeStyle 293発現システム(ドイツ、カールスルーエ、Invitrogen GmbH社製)内において、それぞれの軽鎖構築物および重鎖構築物の共トランスフェクションを行った。3日後において、トランスフェクタントの細胞培養物上清を回収し、アラニン走査実験に用いた。
遺伝子合成により、成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外ドメインのアミノ酸1〜27のうちの各アミノ酸について、ヒトCD3イプシロンの野生型配列の1つのコドンを、それぞれ、アラニンをコードするコドン(GCC)へと置換したヒトCD3イプシロン鎖をコードする、27のcDNA断片を得た。置換されたコドンを除き、該cDNA断片は、前述のヒト野生型CD3のcDNA断片と同一であった。各構築物では、上記で説明したヒト野生型CD3のcDNA断片と比較して、1つのコドンだけが置換された。制限部位であるEcoRIおよびSalIは、野生型構築物と比較して同一の位置において、cDNA断片内へと導入した。すべてのアラニン走査構築物をpEF NEO内へとクローニングし、配列を検証したプラスミドをEL4細胞内へとトランスフェクトした。上記で説明した通りに、トランスフェクタントによるトランスフェクションおよびその選択を実施した。結果として、発現構築物のパネルが得られ、そこでは、ヒトCD3イプシロン鎖の第1のアミノ酸である、1位におけるグルタミン(Q、Gln)が、アラニンにより置換された。アラニンにより置換された最後のアミノ酸は、成熟ヒト野生型CD3イプシロンの27位におけるトレオニンであった。グルタミン1とトレオニン27との間の各アミノ酸について、野生型のアミノ酸をアラニンへと置換したそれぞれのトランスフェクタントが作製された。
5.2で説明したキメラIgG抗体、およびCD3イプシロンに特異的な異種間特異的単鎖抗体を、アラニン走査実験で調べた。標準的なプロトコールに従うFACSアッセイにより、5.3で説明した、ヒトCD3イプシロンのアラニン突然変異体構築物をトランスフェクトしたEL4細胞株に対する抗体の結合について調べた。それぞれのトランスフェクタントによる2.5×105個の細胞を、キメラIgG抗体を含有する50μlの細胞培養物上清と共に、または、ペリプラズム内で発現させた単鎖抗体による50μlの粗調製物と共にインキュベートした。ペリプラズム内で発現させた単鎖抗体による粗調製物と共にインキュベートした試料には、2%FCSを伴う50μlのPBS中に5μg/mlの二次抗体として、抗Flag M2抗体(ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)を用いた。キメラIgG抗体と共にインキュベートした試料には、二次抗体は不要であった。すべての試料について、2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体分子の結合を検出した。試料はFACSCalibur(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)上で測定した。ヒトCD3イプシロンのアラニン突然変異体をトランスフェクトしたEL4細胞株に対する、キメラIgG分子、または異種間特異的単鎖抗体の示差的な結合が検出された。アイソタイプ対照、または非関与の特異性を有する、ペリプラズム内で発現させた単鎖抗体による粗調製物を、それぞれ陰性対照として用いた。ヒトCD3イプシロンのアラニン突然変異体の発現レベルについての陽性対照として、UCHT−1抗体を用いた。成熟CD3イプシロン鎖の15位におけるアミノ酸チロシン、17位におけるアミノ酸バリン、19位におけるアミノ酸イソロイシン、24位におけるアミノ酸バリン、または26位におけるアミノ酸ロイシンに対するアラニン突然変異体をトランスフェクトしたEL4細胞株は、発現レベルが極めて低かった(データは示さない)ため、評価しなかった。ヒトCD3イプシロンのアラニン突然変異体をトランスフェクトしたEL4細胞株に対する、異種間特異的単鎖抗体、およびキメラIgGフォーマットにおける単鎖抗体の結合を、図8(A〜D)において、それぞれの全試料の幾何平均による蛍光値から、それぞれの陰性対照の幾何平均による蛍光値を減じた、任意の単位による相対結合として示す。次いで、異なる発現レベルを補正するため、特定のトランスフェクタントに対する全試料による値を、それぞれのトランスフェクタントに対するUCHT−1抗体の幾何平均による蛍光値で除した。最後に、ある特異性抗体についての野生型試料による値と比較するため、それぞれの特異性抗体についての全試料による値を、野生型試料による値で除し、これにより、野生型試料による値を、任意の1結合単位に設定した。
6.1.N末端における6つのヒスチジンタグ(His6タグ)を伴うヒトCD3イプシロン鎖のクローニングおよび発現
遺伝子合成により、N末端においてHis6タグを伴うヒトCD3イプシロン鎖をコードするcDNA断片を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、インフレームで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、His6タグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟ヒトCD3イプシロン鎖のコード配列を含有するようにデザインした(該構築物のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号256および255に列挙する)。遺伝子合成断片はまた、cDNAの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。5’端においてEcoRI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、EcoRIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片をpEF NEOと称するプラスミド(上記で説明した)内へとクローニングした。配列を検証したプラスミドを用いて、マウスT細胞株であるEL4にトランスフェクトした。細胞培養の34日後において、トランスフェクタントを、以下で説明するアッセイに用いた。
CD3イプシロンに特異的な結合特異性抗体であるH2C HLPとのキメラIgG抗体を、N末端においてHis6タグを伴うかまたは伴わないヒトCD3イプシロンに対する結合について調べた。標準的なプロトコールに従うFACSアッセイにより、EL4細胞株にトランスフェクトしたHis6−ヒトCD3イプシロン、および野生型のヒトCD3イプシロンのそれぞれに対する該抗体の結合について調べた。2.5×105個のトランスフェクタント細胞を、キメラIgG抗体を含有する50μlの細胞培養物上清、または、2%FCSを伴うPBS中に5μg/mlずつの各対照抗体50μlと共にインキュベートした。構築物の発現についての陰性対照としては、適切なアイソタイプ対照、また、陽性対照としては、CD3特異性抗体であるUCHT−1をそれぞれ用いた。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体の結合を検出した。試料は、FACScalibur(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)上で測定した。野生型のヒトCD3イプシロンをトランスフェクトしたEL4細胞株と比較して、N末端においてHis6タグを伴うヒトCD3イプシロンに対して、結合特異性抗体であるH2C HLPとのキメラIgGによる結合の喪失が明確に検出された。これらの結果は、ヒトCD3イプシロン鎖に対する異種間特異的抗CD3結合特異性抗体であるH2Cの結合には、CD3イプシロンのフリーなN末端が不可欠であることを示した。
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトMCSPのC末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメイン(アミノ酸1538〜2322)を得た(ヒトMCSPのC末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメイン(ヒトD3と称する)を発現するための組換え構築物のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号250および249に列挙する)。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、FLAGタグ、次いで、インフレームで、クローニングを目的とする複数の制限部位を含有し、また、9アミノ酸による人工的リンカー(SRTRSGSQL)をコードする配列、次いで、インフレームで、ヒトMCSPのC末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメインのコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした。制限部位は、該DNA断片の始点および終点に導入した。5’端におけるEcoRI、また、3’端におけるSalIの制限部位を、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、該断片を、EcoRIおよびSalIにより消化させ、pEF−DHFR(pEF−DHFRは、Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025において説明されている)内へとクローニングした。配列を検証したプラスミドを用いて、CHO/dhfr−(ATCC受託番号CRL 9096)にトランスフェクトした。細胞は、37℃、湿度95%、および7%CO2のインキュベーター内において、安定化グルタミンを伴い、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(すべて、ドイツ、ベルリン、Biochrom AG社から購入した)を補充し、また、細胞培養グレードの試薬原液(ドイツ、タウフキルヒエン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)によるヌクレオシドを、10μg/mlアデノシン、10μg/mlデオキシアデノシン、および10μg/mlチミジンの最終濃度まで補充した、RPMI 1640中で培養した。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、PolyFectトランスフェクション試薬(ドイツ、ヒルデン、Qiagen GmbH社製)、および5μgのプラスミドDNAにより実施した。24時間にわたる培養後にPBSで1回細胞を洗浄し、安定化グルタミン、および1%のペニシリン/ストレプトマイシンを伴うRPMI 1640中で再度培養した。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約14日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7〜14日後、FACS解析により、構築物の発現についてトランスフェクタントを調べた。2.5×105個の細胞を、2%FCSを伴うPBS中に5μg/mlまで希釈された、50μlの抗Flag−M2抗体(ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社製)と共にインキュベートした。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体の結合を検出した。試料は、FACScalibur(ドイツ、ハイデルベルク、BD biosciences社製)上で測定した。
以下の反応条件:94℃で3分間にわたる1サイクル、94℃で0.5分間、52℃で0.5分間、また、72℃で1.75分間にわたる40サイクル、72℃で3分間にわたる最終サイクルを用いて、マカクザル皮膚のcDNAについての3つのPCRセット(ドイツ、ハイデルベルク、BioCat GmbH社製、型番C1534218−Cy−BC)により、マカクザルMCSPのC末端ドメイン、膜貫通ドメイン、切断細胞外ドメイン(マカクザルD3と称する)のcDNA配列を得た。以下のプライマー:
順方向プライマー:5’−GATCTGGTCTACACCATCGAGC−3’(配列番号361)
逆方向プライマー:5’−GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG−3’(配列番号362)
順方向プライマー:5’−TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG−3’(配列番号363)
逆方向プライマー:5’−CGATCAGCATCTGGGCCCAGG−3’(配列番号364)
順方向プライマー:5’−GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC−3’(配列番号365)
逆方向プライマー:5’−GCCTTCACACCCAGTACTGGCC−3’(配列番号366)
を用いた。
順方向プライマー:5’−tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg−3’(配列番号367)
逆方向プライマー:5’−agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg−3’(配列番号368)
が用いられる。
各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のCD3イプシロンに対して異種間特異的な結合ドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のMCSPに対して異種間特異的な結合ドメインを含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表1に記載の通りにデザインする。
段階1:6カラム容量中における20%の緩衝液B
段階2:6カラム容量中における100%の緩衝液B
に従う2段階勾配の緩衝液B(pH7.2の20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.1MNaCl、0.5Mイミダゾール)を用いて、結合したタンパク質を溶出させた。段階2により溶出させたタンパク質画分を、さらなる精製のためにプールした。すべての化学物質は研究グレードであり、Sigma社(ダイゼンホーフェン)またはMerck社(ダルムシュタット)から購入した。
ヒトおよびマカクザルのMCSP D3およびCD3のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、FACS解析を実施した。この目的のために、ヒトMCSP D3をトランスフェクトしたCHO細胞(実施例7で説明した)、およびヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株であるHPB−ALL(ブラウンシュヴァイク、DSMZ社製、ACC483)を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザル抗原に対する結合反応性は、作製したマカクザルMCSP D3トランスフェクタント(実施例8で説明した)、およびマカクザルT細胞株である4119LnPx(エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Fickenscher教授による恵与;Knappe Aら、およびFickenscher H.、Blood 2000、95、3256〜61において公表されている)を用いることにより調べた。各細胞株200,000個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物による精製タンパク質(2μg/ml)、または、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清50μlと共に、氷上において30分間にわたりインキュベートした。2%FCSを伴うPBS中で2回にわたり細胞を洗浄し、マウス抗His抗体(Qiagen社製、ペンタHis抗体;2%FCSを伴う50μlのPBS中で1:20に希釈)により、構築物の結合を検出した。洗浄後、2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたFcガンマ特異性抗体(Dianova社製)により、結合した抗His抗体を検出した。トランスフェクトされなかったCHO細胞の上清を、T細胞株に対する結合についての陰性対照として用いた。非関与の標的特異性を有する単鎖構築物を、MCSP−D3をトランスフェクトしたCHO細胞に対する結合についての陰性対照として用いた。
実施例7および8で説明したMCSP D3陽性細胞株を用いて、in vitroクロム51(51Cr)放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図中で指定した通り、刺激ヒトCD4/CD56枯渇PBMC、刺激ヒトPBMC、またはマカクザルT細胞株である4119LnPxを用いた。
50%ヒト血漿中において37℃および4℃で24時間にわたり、作製した二重特異性単鎖抗体をインキュベートし、その後、生体活性を調べることにより、ヒト血漿中における、該二重特異性単鎖抗体の安定性を解析した。MCSP陽性CHO細胞株(実施例14または15に従いクローニングされるMCSPを発現する)を標的として、また、刺激ヒトCD8陽性T細胞をエフェクター細胞として用いる、in vitroクロム51(51Cr)放出細胞傷害作用アッセイにおいて生体活性を調べた。
従来のCD3結合分子による治療開始後における、B細胞性非ホジキンリンパ腫(B−NHL)患者におけるT細胞再分布
従来のCD19×CD3結合分子は、二重特異性のタンデムscFvフォーマット(Loffler(2000、Blood、95巻、6号)、またはWO99/54440)によるCD3結合分子である。それは、(i)正常ヒトB細胞および悪性ヒトB細胞の表面上におけるCD19、ならびに(ii)ヒトT細胞上におけるCD3を指向する2つの異なる結合部分からなる。T細胞上におけるCD3を、B細胞上におけるCD19と架橋することにより、この構築物は、T細胞の細胞傷害活性により再指向される、正常B細胞および悪性B細胞の溶解を誘発する。
15ランプ、15フラット、30ランプ、30フラット、および60フラットの患者コホートでは、CD19×CD3結合分子(WO99/54440で開示される)注入の開始前において、また、この0.75、2、6、12、24、30、48時間後において、ならびに解析用に4℃で出荷された、EDTAを含有するVacutainer(商標)試験管(Becton Dickinson社製)を用いる、従来のCD19×CD3結合分子注入終了後の治療8、15、17、22、24、29、36、43、50、57日目、および4週間目において、血液試料(6mlずつ)を得た。15ステップの患者コホートでは、CD19×CD3結合分子注入の開始前において、また、この6、24、30、48時間後において、ならびにCD19×CD3結合分子注入終了後の治療8、15、22、29、36、43、50、57日目、および4週間目において、血液試料(6mlずつ)を得た。用量レベル0.5、1.5、および5μg/m2/24時間では、CD19×CD3結合分子注入の開始前において、また、この6、24、48時間後において、ならびにCD19×CD3結合分子注入終了後の治療8、15、22、29、36、43、50、57日目、および4週間目において、血液試料(6mlずつ)を得た。一部の場合には、作業上の理由により、これらの時点に若干の変更が生じた。血液試料採取後の24〜48時間以内において、リンパ球部分集団についてのFACS解析を実施した。血液試料中における白血球部分集団の絶対数は、CoulterCounter(商標)(Coulter社製)上における血球分類解析により決定した。
適合させたFicoll(商標)勾配分離プロトコールにより、PBMC(末梢血単核細胞)の単離を実施した。室温で、3mlのBiocoll(商標)液(Biochrom社製)をあらかじめ充填した、10mlのLeucosep(商標)試験管(Greiner社製)内へと、血液を移した。遠心分離は、スイングアウトローター内において、1700×gおよび22℃で15分間にわたり、減速せずに実施した。Biocoll(商標)層の上部にあるPBMCを単離し、FACS緩衝液(PBS/2%FBS[ウシ胎仔血清;Biochrom社製])により1回洗浄し、遠心分離し、FACS緩衝液中で再懸濁させた。すべての洗浄ステップにおける遠心分離は、スイングアウトローター内において、800×gおよび4℃で4分間にわたり実施した。必要な場合、単離したPBMCを、室温で5分間にわたり、3mlの赤血球溶解緩衝液(8.29gのNH4Cl、1.00gのKHCO3、0.037gのEDTA、および1.01のH2O再蒸留、pH7.5)中においてインキュベートすることにより、赤血球を溶解させた後で、FACS緩衝液による洗浄ステップを実施した。
Invitrogen社(1型番MHCD1301、2型番MHCD1401)、Dako社(5型番C7224)、またはBecton Dickinson社(3型番555516、4型番345766)からモノクローナル抗体を購入し、製造元の推奨に従い用いた。以下の抗体組合せ:抗CD131/抗CD142(FITC)×抗CD563(PE)×抗CD34(PerCP)×抗CD195(APC)により、5×105〜1×106個の細胞を染色した。V字型の96ウェル多重滴定プレート(Greiner社製)内において細胞をペレット化し、上清を除去した。FACS緩衝液中において希釈した、特異性抗体を含有する総容量100μl中において、細胞ペレットを再懸濁させた。4℃の暗所で30分間にわたりインキュベーションを実施した。その後、FACS緩衝液により2回にわたり試料を洗浄し、FACS緩衝液中において細胞ペレットを再懸濁させ、フローサイトメトリー解析を行った。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson社製)により、データ採取を実施した。各測定につき、規定のリンパ球部分集団1×104個ずつを採取した。CellQuestPro(商標)(Becton Dickinson社製)プログラムにより統計学的解析を実施し、リンパ球部分集団の百分率を求め、細胞表面分子の発現強度を分類した。その後、FACSにより決定された、総リンパ球(すなわち、CD13/14染色により骨髄細胞を除外した、B細胞およびT細胞およびNK細胞)に対する単一のリンパ球部分集団の百分率を、血球分類解析によるリンパ球カウントと相関させて、T細胞(CD3+、CD56−、CD13/14−)およびB細胞(CD19+、CD13/14−)の細胞絶対数を計算した。
標的抗原としてのCD33を認識する、本発明の二重特異性CD3結合分子は、カニクイザルの末梢血から、循環CD33陽性単球を枯渇させる
CHO細胞において、配列番号268のコードヌクレオチド配列を用いて発現させることにより、CD33−AF5 VH−VL×I2C VH−VL(アミノ酸配列:配列番号267)を作製した。(i)コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、N末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、(ii)停止コドンを後続させる、C末端におけるHis6タグのコード配列の両方を、配列番号268のヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるDNA断片を、発現ベクターであるpEF−DHFR(Raumら、Cancer Immunol Immunother 50(2001)、141〜150)の多重クローニング部位内へと挿入した。説明される通り(Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025)に、DHFR欠損CHO細胞を安定的にトランスフェクトし、CD3結合分子であるCD33−AF5 VH−VL×I2C VH−VLを培養物上清内へと分泌するDHFR陽性トランスフェクタントを選択し、また、メトトレキサートによる遺伝子増幅を行い、発現レベルを上昇させた。カニクイザルにおいて用いられるCD33−AF5 VH−VL×I2C VH−VLについての解析的なSECプロファイルは、被験物質が、ほぼもっぱら単量体からなることを明らかにした。カニクイザルCD33をトランスフェクトしたCHO細胞を標的細胞として用い、また、マカクザルT細胞株である4119LnPxをエフェクター細胞供給源として用いる、実施例16.5で説明される細胞傷害作用アッセイにおいて、被験物質の効力を測定した(図25)。エフェクターT細胞による最大半量の標的細胞溶解に必要なCD33−AF5 VH−VL×I2C VH−VLの濃度(EC50)は、2.7ng/mlと決定された。
MCSP−G4 VH−VL×I2C VH−VLによる持続的注入の開始前、また、この0.75、2、6、12、24、30、48、72時間後において、ならびに解析用に4℃で出荷された、EDTAを含有するVacutainer(商標)試験管(Becton Dickinson社製)を用いる治療の7および4日後(また、120μg/m2/24時間の用量レベルでは、9日後)において、血液試料(1mlずつ)を得た。一部の場合では、作業上の理由により、これらの時点に若干の変更が生じた。血液試料採取の24〜48時間以内において、リンパ球部分集団についてのFACS解析を実施した。血液試料中における白血球部分集団の絶対数は、ルーチンの獣医学実験室における血球分類解析により決定した。
用いられる容量に適合させながら、上記の実施例13で説明したプロトコールと同様に、PBMC(末梢血単核細胞)を単離した。
Becton Dickinson社(1型番345784、2型番556647、3型番552851、6型番557710)、Beckman Coulter社(4型番IM2470)、およびMiltenyi社(5型番130−091−732)から、カニクイザル抗原と反応するモノクローナル抗体を購入し、製造元の推奨に従い用いた。以下の抗体組合せ:抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)、および抗CD141(FITC)×抗CD335(PE)×抗CD166(Alexa Fluor 647(商標))により、5×105〜1×106個の細胞を染色した。さらなるステップは、上記の実施例13において説明した通りに実施した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson社製)により、データ採取を実施した。各測定につき、規定のリンパ球部分集団1×104個ずつを採取した。CellQuestPro(商標)(Becton Dickinson社製)プログラムにより統計学的解析を実施し、リンパ球部分集団の百分率を求め、細胞表面分子の発現強度を分類した。その後、FACSにより決定された、総リンパ球(すなわち、CD14染色により骨髄細胞を除外した、B細胞およびT細胞およびNK細胞)に対する単一のリンパ球部分集団の百分率を、血球分類解析によるリンパ球カウントと相関させて、T細胞(CD3+、CD56−、CD14−)の細胞絶対数を計算した。血球分類解析による単球カウントを、FACSにより決定された、全単球(CD14+)に対するCD33陽性単球(CD33+、CD14+)の対応する比率で乗じることにより、CD33陽性単球の絶対数を計算した。
本発明の代表的な異種間特異的CD3結合分子による治療開始後のカニクイザルにおけるT細胞再分布の軽減
CHO細胞において、配列番号194のコードヌクレオチド配列を用いて発現させることにより、MCSP−G4 VH−VL×I2C VH−VL(アミノ酸配列:配列番号193)を作製した。(i)コンセンサスのコザック配列内に埋め込まれた開始コドンを含む、N末端における免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、また、(ii)停止コドンを後続させる、C末端におけるHis6タグのコード配列の両方を、配列番号194のヌクレオチド配列にインフレームで結合させた後で、遺伝子合成により結果として得られるDNA断片を、発現ベクターであるpEF−DHFR(Raumら、Cancer Immunol Immunother 50(2001)、141〜150)の多重クローニング部位内へと挿入した。説明される通り(Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)、7021〜7025)に、DHFR欠損CHO細胞を安定的にトランスフェクトし、CD3結合分子であるMCSP−G4 VH−VL×I2C VH−VLを培養物上清内へと分泌するDHFR陽性トランスフェクタントを選択し、また、メトトレキサートによる遺伝子増幅を行い、発現レベルを上昇させた。カニクイザルを治療するための被験物質は、200リットルの発酵槽内で作製した。MCSP−G4 VH−VL×I2C VH−VLのC末端におけるHis6タグを標的とするIMACアフィニティークロマトグラフィー、その後の予備的なサイズ除外クロマトグラフィー(SEC)に基づき、回収物からタンパク質を精製した。内毒素を含まない、最終的な被験物質の総収量は、40mgであった。被験物質は、70%の単量体、30%の二量体、また、より高次の多量体による少量の汚染物質からなった。カニクイザルMCSPをトランスフェクトしたCHO細胞を標的細胞として用い、また、マカクザルT細胞株である4119LnPxをエフェクター細胞供給源として用いる、実施例11で説明した細胞傷害作用アッセイにおいて、被験物質の効力を測定した(図27)。エフェクターT細胞による最大半量の標的細胞溶解に必要なMCSP−G4 VH−VL×I2C VH−VLの濃度(EC50)は、1.9ng/mlと決定された。
MCSP−G4 VH−VL×I2C VH−VLによる持続的注入の開始前、また、この0.75、2、6、12、24、30、48、72時間後において、ならびに解析用に4℃で出荷された、EDTAを含有するVacutainer(商標)試験管(Becton Dickinson社製)を用いる治療の7日後において、血液試料(1mlずつ)を得た。一部の場合では、作業上の理由により、これらの時点に若干の変更が生じた。血液試料採取の24〜48時間以内において、リンパ球部分集団についてのFACS解析を実施した。血液試料中における白血球部分集団の絶対数は、ルーチンの獣医学実験室における血球分類解析により決定した。
用いられる容量に適合させながら、上記の実施例13で説明したプロトコールと同様に、PBMCを単離した。
Becton Dickinson社(1型番345784、2型番556647、3型番552851)、Beckman Coulter社(4型番IM2470)から、カニクイザル抗原と反応するモノクローナル抗体を購入し、製造元の推奨に従い用いた。以下の抗体組合せ:抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)により、5×105〜1×106個の細胞を染色した。さらなるステップは、上記の実施例13において説明した通りに実施した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson社製)により、データ採取を実施した。各測定につき、規定のリンパ球部分集団1×104個ずつを採取した。CellQuestPro(商標)(Becton Dickinson社製)プログラムにより統計学的解析を実施し、リンパ球部分集団の百分率を求め、細胞表面分子の発現強度を分類した。その後、FACSにより決定された、総リンパ球(すなわち、CD14染色により骨髄細胞を除外した、B細胞およびT細胞およびNK細胞)に対する単一のリンパ球部分集団の百分率を、血球分類解析によるリンパ球カウントと相関させて、T細胞(CD3+、CD56−、CD14−)の細胞絶対数を計算した。
16.1.ヒトCD33を発現するCHO細胞の作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、GenBankで公表されているヒトCD33のコード配列(受託番号NM_001772)を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、成熟ヒトCD33タンパク質のコード配列、次いで、インフレームで、セリン−グリシンジペプチド、ヒスチジン6タグのコード配列、および終止コドンを含有するようにデザインした(該構築物のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号305および306に列挙する)。遺伝子合成断片はまた、該断片の始点および終点において制限部位を導入するようにもデザインした。5’端においてEcoRI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。標準的なプロトコールに従い、EcoRIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片を、pEF−DHFR(pEF−DHFRは、Raumら、Cancer Immunol Immunother 50(2001)、141〜150において説明されている)と称するプラスミド内へとクローニングした。標準的なプロトコール(Sambrookら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(2001))に従い、前述の手順を実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをDHFR欠損CHO細胞内へとトランスフェクトした。Kaufmann R.J.(1990)、Methods Enzymol.185、537〜566により説明される通り、DHFR欠損CHO細胞(ATCC No.CRL 9096)内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート(MTX)濃度を、最高20nM MTXの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザルの骨髄に由来するcDNAに対する3つのPCRセットにより、マカクザルCD33のcDNA配列を得た。以下の反応条件:94℃で3分間にわたる1サイクル、次いで、94℃で1分間、53℃で1分間、また、72℃で2分間にわたる35サイクル、次いで、72℃で3分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを用いた:
1.順方向プライマー:5’−gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg−3’(配列番号369)
逆方向プライマー:5’−gatttgtaactgtatttggtacttcc−3’(配列番号370)
2.順方向プライマー:5’−attccgcctccttggggatcc−3’(配列番号371)
逆方向プライマー:5’−gcataggagacattgagctggatgg−3’(配列番号372)
3.順方向プライマー:5’−gcaccaacctgacctgtcagg−3’(配列番号373)
逆方向プライマー:5’−agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg−3’(配列番号374)
異種間特異的結合分子のクローニング
一般に、各々が、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のCD3イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒト、および非チンパンジー霊長動物のCD33に対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表5に示す通りにデザインした。
ヒトおよびマカクザルのCD33およびCD3のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるために、ヒトCD33またはマカクザルCD33の細胞外ドメインを発現するCHO細胞(実施例16.1および16.2を参照されたい)を用い、実施例10において、MCSPおよびCD3に対する異種間特異的二重特異性抗体について説明した解析と同様のFACS解析を実施した。
実施例16.1および16.2で説明したCD33陽性細胞株を用いて、in vitroクロム51(51Cr)放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図中で指定した通り、刺激ヒトCD4/CD56枯渇PBMC、またはマカクザルT細胞株である4119LnPxを用いた。ヒトCD33またはマカクザルCD33の細胞外ドメインを発現するCHO細胞(実施例16.1および16.2を参照されたい)を標的細胞として用い、実施例11において、MCSPおよびCD3に対する異種間特異的二重特異性抗体の生体活性の解析について説明した状況と同様の細胞傷害作用アッセイを実施した。
17.1.N末端におけるアミノ酸1〜27に対応する、環境に依存しない単離ヒトCD3イプシロンエピトープを提示するアフィニティーカラムの作製
真核細胞内において該構築物を発現させるため、上記で説明した、ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ領域およびFcガンマ領域に融合させた、ヒトCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27からなる構築物であるCD3 1〜27−Fc(実施例3;該組換え融合タンパク質のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号230および229に列挙する)を発現させるためのプラスミドを、DHFR欠損CHO細胞内へとトランスフェクトした。Kaufmann R.J.(1990)、Methods Enzymol.185、537〜566により説明される通り、DHFR欠損CHO細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート(MTX)濃度を、最高20nM MTXの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。静置培養による2代にわたる継代後、7日間にわたり、ヌクレオシド非含有HyQ PF CHO液体ダイズ培地(4.0mMのL−グルタミン、および0.1%のプルロニックF−68(HyClone社製)を伴う)を伴うローラーボトル内で培養した。遠心分離により細胞を除去し、発現したタンパク質を含有する上清を−20℃で保存した。融合タンパク質を単離するため、ウシ、ウマ、およびマウスの血清タンパク質に対する交差反応が最小限度である、市販のアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG fc断片特異性抗体(Jackson ImmunoResearch Europe社製)を用いる標準的なプロトコールに従い、ヤギ抗ヒトfcアフィニティーカラムを調製した。このアフィニティーカラムを用いて、Aekta Explorer System(GE Amersham社製)上において、細胞培養物上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸により溶出させた。溶出物を中和させ、濃縮した。アミン非含有結合緩衝液に対して透析した後で、精製された融合タンパク質を、N−ヒドロキシ−スクシンイミドNHSで活性化した1mlのHiTrapカラム(GE Amersham社製)に結合させた。
異種間特異的二重特異性単鎖分子を発現する細胞による、200mlの細胞培養物上清を、0.2μmの滅菌フィルターにより濾過し、Aekta Explorer System(GE Amersham社製)を用いるCD3ペプチドアフィニティーカラムに適用した。
18.1.薬物動態アッセイで用いられるCD3 1〜27−Fcの作製
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ領域およびFcガンマ領域に融合させた、ヒトCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27のコード配列を得た(該組換え融合タンパク質のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号309および310に列挙する)。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外部分のうちの最初の27アミノ酸のコード配列、次いで、インフレームで、ヒトIgG1のヒンジ領域およびFcガンマ部分のコード配列、ならびに終止コドンを含有するようにデザインした。遺伝子合成断片はまた、前出の実施例3.1で説明した通りにデザインおよびクローニングした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをDHFR欠損CHO細胞内へとトランスフェクトした。前出の実施例9で説明した通り、DHFR欠損CHO細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。融合タンパク質を単離するため、ウシ、ウマ、およびマウスの血清タンパク質に対する交差反応が最小限度である、市販のアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG Fc断片特異性抗体(Jackson ImmunoResearch Europe社製)を用いる標準的なプロトコールに従い、ヤギ抗ヒトfcアフィニティーカラムを調製した。このアフィニティーカラムを用いて、Aekta Explorer System(GE Amersham社製)上において、細胞培養物上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸により溶出させた。溶出物を中和させ、濃縮した。
アッセイは、Sektor Imagerデバイス(MSD社製)上で測定される、炭素プレート上におけるルテニウム標識による検出を用いるECL−ELISA法に基づく。第1のステップでは、炭素プレート(MSD社製High Bind 96ウェルプレート;型番L15xB−3)を、実施例18.1で説明した、50ng/mlで5μl/ウェルの精製CD3 1〜27−Fcによりコーティングした。次いで、プレートを、25℃で一晩にわたり乾燥させた。その後、プレートを、150μl/ウェルのPBS中に5%のBSA(Pesel&Lorei社製;型番100568)により、インキュベーター内において振とうしながら(700rpm)、25℃で1時間にわたりブロッキングした。次のステップでは、PBS中に0.05%のTweenにより、3回にわたりプレートを洗浄した。アッセイで検出される、それぞれの異種間特異的二重特異性単鎖分子について、100ng/mlから始める1:4の希釈系列により、PBS中50%のマカクザル血清中における標準曲線を作製した。品質管理(QC)試料は、PBS中に50%のマカグザル血清中において、試料血清中の予測濃度に応じ、それぞれの異種間特異的二重特異性単鎖分子1ng/ml〜50ng/mlの範囲で作製した。標準試料、QC試料、または未知の試料を、10μl/ウェルで炭素プレートへと移し、インキュベーター内において振とうしながら(700rpm)、25℃で90分間にわたりインキュベートした。その後、PBS中に0.05%のTweenにより3回にわたりプレートを洗浄した。検出には、25μl/ウェルのペンタHis−ビオチン抗体(Qiagen社製;PBS中に0.05%のTween中において200μg/ml)を添加し、インキュベーター内において振とうしながら(700rpm)、25℃で1時間にわたりインキュベートした。第2の検出ステップでは、25μl/ウェルのストレプトアビジン−Sulfo Tag液(MSD社製;型番R32AD−1;ロット番号W0010903)を添加し、インキュベーター内において振とうしながら(700rpm)、25℃で1時間にわたりインキュベートした。その後、PBS中に0.05%のTweenにより3回にわたりプレートを洗浄した。最後に150μl/ウェルのMSD Reading Buffer(MSD社製;型番R9ZC−1)を添加し、Sektor社製Imagerデバイスによりプレートを読み取った。
19.1.CD3 1〜27−EpCAMのクローニングおよび発現
異なる非チンパンジー霊長動物(マーモセット、タマリン、リスザル)およびブタから、CD3イプシロンを単離した。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、Flagタグを付したカニクイザルEpCAMのN末端に融合させた、成熟ヒト、成熟コモンマーモセット(Common marmoset(Callithrix jacchus))、成熟ワタボウシタマリン(cottontop tamarin(Saguinus oedipus))、成熟コモンリスザル(common squirrel monkey(Saimiri sciureus))、および成熟家畜ブタ(domestic swine(Sus scrofa);陰性対照として用いた)のCD3イプシロン鎖のN末端におけるアミノ酸1〜27のコード配列を得た(該組換え融合タンパク質のcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号231〜240に列挙する)。遺伝子合成断片は、まず、標的発現ベクター内に既に存在する19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との、適正なリーディングフレーム内における融合を可能とするBsrGI部位、次いで、インフレームで、成熟CD3イプシロン鎖の細胞外部分のうちのN末端におけるアミノ酸1〜27のコード配列、次いで、インフレームで、Flagタグのコード配列、次いで、インフレームで、成熟カニクイザルEpCAM膜貫通タンパク質のコード配列を含有するようにデザインした。5’端においてBsrGI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、以下のクローニング手順で用いた。次いで、標準的なプロトコールに従い、BsrGIおよびSalIを介して、遺伝子合成断片を、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列を既に含有する、pEF−DHFR(pEF−DHFRは、Raumら、Cancer Immunol Immunorther 50(2001)、141〜150において説明されている)と称するプラスミドの派生物内へとクローニングした。真核細胞内において該構築物を発現させるため、配列を検証したプラスミドを用いて、DHFR欠損CHO細胞内へとトランスフェクトした。Kaufmann R.J.(1990)、Methods Enzymol.185、537〜566により説明される通り、DHFR欠損CHO細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施した。メトトレキサート(MTX)濃度を、最高20nM MTXの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
異種間特異的単鎖抗CD3抗体の結合を検出する手段を改善するため、特異性抗体であるI2C VHVLを、マウスIgG1およびマウスカッパ定常領域を伴うIgG1抗体へと転換する。標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、IgG1抗体の重鎖をコードするcDNA配列を得た。遺伝子合成断片は、まず、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、次いで、19アミノ酸の免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、インフレームで、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のコード配列、次いで、インフレームで、それぞれ、GenBankで公表されているマウスIgG1の重鎖定常領域のコード配列(受託番号AB097849)、またはGenBankで公表されているマウス軽鎖カッパ定常領域のコード配列(受託番号D14630)を含有するようにデザインした。
標準的なプロトコールに従うFACSアッセイにより、実施例19.1で説明した、カニクイザルEpCAMに融合させた、ヒトCD3イプシロン鎖、マーモセットCD3イプシロン鎖、タマリンCD3イプシロン鎖、およびリスザルCD3イプシロン鎖それぞれのN末端におけるアミノ酸1〜27に対する、作製されたI2C IgG1構築物の結合について調べた。この目的のために、2.5×105個の細胞を、実施例19.2で説明したI2C IgG1構築物を含有する、50μg/mlの細胞培養物上清と共にインキュベートした。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体の結合を検出した。FACS−Calibur装置上において、フローサイトメトリーを実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した(ハイデルベルク、Becton Dickinson biosciences社製)。「Current Protocols in Immunology」(Coligan、Kruisbeek、Margulies、Shevach、およびStrober、Wiley−Interscience、2002)において説明される通りに、FACSによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
実施例19.2で説明した、CD3イプシロンに特異的な結合特異性抗体であるI2CとのキメラIgG1抗体を、N末端においてHis6タグを伴うかまたは伴わないヒトCD3イプシロンに対する結合について調べた。標準的なプロトコールに従うFACSアッセイにより、実施例6.1で説明した、His6−ヒトCD3イプシロンをトランスフェクトしたEL4細胞株、また、実施例5.1で説明した、野生型のヒトCD3イプシロンをトランスフェクトしたEL4細胞株のそれぞれに対する該抗体の結合について調べた。2.5×105個のトランスフェクタシト細胞を、I2C IgG1構築物を含有する50μlの細胞培養物上清、または、2%FCSを伴うPBS中に5μg/mlずつの各対照抗体50μlと共にインキュベートした。構築物の発現についての陰性対照としては、適切なアイソタイプ対照、また、陽性対照としては、CD3特異性抗体であるUCHT−1をそれぞれ用いた。His6タグの検出は、ペンタHis抗体(Qiagen社製)により実施した。2%FCSを伴うPBS中において1:100に希釈した、アフィニティー精製R−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fcガンマ断片特異的F(ab’)2断片(英国、サフォーク州、ニューマーケット、Jackson ImmunoResearch Europe社製)により、抗体の結合を検出した。FACS−Calibur装置上において、フローサイトメトリーを実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した(ハイデルベルク、Becton Dickinson biosciences社製)。「Current Protocols in Immunology」(Coligan、Kruisbeek、Margulies、Shevach、およびStrober、Wiley−Interscience、2002)において説明される通りに、FACSによる染色および蛍光強度の測定を実施した。
21.1.CD33およびCD3に対する異種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
一般に、各々が、ヒトCD3イプシロンおよびマカクザルCD3イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン、ならびにヒトCD33およびマカクザルCD33に対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表6に示す通りにデザインした。
ヒトおよびマカクザルのCD33およびCD3のそれぞれに結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、ヒトCD33またはマカクザルCD33の細胞外ドメインを発現するCHO細胞(実施例16.1および16.2を参照されたい)を用い、実施例10において、MCSPおよびCD3に対する異種間特異的二重特異性抗体について説明した解析と同様のFACS解析を実施する。
実施例16.1および16.2で説明したCD33陽性細胞株を用いて、in vitroクロム51(51Cr)放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図中で指定した通り、刺激ヒトCD4/CD56枯渇PBMC、またはマカクザルT細胞株である4119LnPxを用いた。ヒトまたはマカクザルのCD33細胞外ドメインを発現するCHO細胞(実施例16.1および16.2を参照されたい)を標的細胞として用い、実施例11において、MCSPおよびCD3に対する異種間特異的二重特異性抗体に対する解析について説明した手順と同様の細胞傷害作用解析を実施した。
雄チンパンジー1匹を、静脈内単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体構築物(Schlereth(2005)、Cancer Res 65、2882)による用量漸増下に置いた。従来の単鎖CD19/CD3二重特異性抗体構築物(Loffler(2000、Blood、95巻、6号)、またはWO99/54440)における場合と同様、前記EpCAM/CD3構築物のCD3アームもまた、ヒトCD3およびチンパンジーCD3による、従来の環境に依存するエピトープを指向する。0日目において、動物には、被験物質を伴わない50ml PBS/5%HSAを施した後に、7、14、21、および28日目に、それぞれ、50ml PBS/5%HSAに加えて、1.6、2.0、3.0、および4.5μg/kgの単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体構築物を施した。注入時間は、1回の投与当たり2時間であった。毎週、各回の注入を行うため、2〜3mg/kgの筋肉内テラゾールによりチンパンジーを鎮静させ、これに挿管し、その平均血圧を安定させながら、これをイソフルラン/O2麻酔にかけた。循環血液細胞についてFACS解析を行うため、図43に示した時点において、対側肢に第2の静脈内カテーテルを配置し、(ヘパリン化させた)全血液試料を採取した。標準的な赤血球溶解後、チンパンジーCD2と反応するFITC標識化抗体(Becton Dickinson社製)によりT細胞を染色し、フローサイトメトリーにより、全リンパ球に対するT細胞の比率を決定した。図43に示す通り、各回において単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体構築物を投与するたびに、循環標的B(リンパ腫)細胞を本質的に有さないB−NHL患者における単鎖CD19/CD3二重特異性抗体構築物について観察された通り、循環T細胞の急速な減少が誘導された。ヒトおよびチンパンジーの循環血液中にEpCAM陽性標的細胞は存在しないので、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体構築物に曝露すると、循環T細胞が減少したことは、該構築物のCD3アームが、標的細胞を介する架橋形成の不在下において、純粋に、従来の環境に依存するCD3エピトープと相互作用することを介して、T細胞が受容するシグナルだけを原因としうる。循環標的B(リンパ腫)細胞を本質的に有さないB−NHL患者において、それらを単鎖CD19/CD3二重特異性抗体構築物に曝露することによりT細胞の再分布が誘導されたのと同様、チンパンジーにおいても、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体構築物に曝露すると、T細胞の再分布が生じたことは、環境に依存するCD3エピトープに対する結合イベントに続いて、CD3の立体構造が変化し、さらに結果として、血管内皮に対してT細胞の付着が一過性に増大することにより説明できる(実施例13を参照されたい)。この知見は、環境に依存するCD3エピトープを指向する従来のCD3結合分子により(もっぱらこの相互作用を介して)、実施例13で説明した、ヒトにおけるCNS有害事象の危険性と関連する、末梢血におけるT細胞の再分布パターンがもたらされうる。
23.1.大腸菌XL1 Blue細胞内における、scFv構築物の細菌内発現
既に述べた通り、VLセグメントおよびVHセグメントを含有するpComb3H5Bhis/Flagにより形質転換した大腸菌XL1 Blue細胞は、遺伝子III断片を切除し、また、1mM IPTGにより誘導した後で、十分な量で可溶性のscFvを生成する。scFv鎖はペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
i)WO2004/106380で説明されるScFvである4−10、3−106、3−114、3−148、4−48、3−190、および3−271;
ii)本明細書で説明される、ヒト抗CD3イプシロン結合クローンに由来するscFvであるH2C、F12Q、およびI2C。
典型的には、4℃で一晩にわたり、プラスチック製の96ウェルプレート(Nunc社製、MaxiSorp)のウェルに、ヒトCD3イプシロン(アミノ酸1〜27)−Fc融合タンパク質をコーティングすることにより、ELISA実験を実施した。次いで、抗原コーティング液を除去し、PBS/0.05%Tween20によりウェルを1回洗浄し、その後、少なくとも1時間にわたり、PBS/3%BSAによりブロッキングした。ブロッキング液を除去した後に、PPPおよび対照溶液をウェルに添加し、典型的には室温で1時間にわたりインキュベートした。次いで、PBS/0.05%Tween20により、3回にわたりウェルを洗浄した。ビオチンで標識化した抗FLAGタグ抗体(典型的には、1μg/ml PBSの最終濃度;Sigma社製、M2抗Flag−Bio抗体)を用いて、また、ペルオキシダーゼにより標識化したストレプトアビジン(1μg/ml PBS;Dianova社製)により、固定化した抗原に対するscFvの結合を検出した。ABTS基質溶液を添加することによりシグナルを発生させ、405nmの波長で測定した。ヒトIgG1(Sigma社製)によりコーティングしたELISAプレート上において、同一の試薬および同一の時間経過で同一のアッセイを実施することにより、ブロッキング剤および/またはヒトCD3イプシロン(アミノ酸1〜27)−Fc融合タンパク質のヒトIgG1部分に対する被験試料の非特異的結合を検討した。陰性対照としては、PBSを用いた。
24.1.CHO細胞上におけるヒトPSMA抗原のクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトPSMA抗原の配列(「AY101595」、ヒト前立腺特異的膜抗原の完全長mRNA;米国国立バイオテクノロジー情報センター、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)を用いて、合成分子を得た。遺伝子合成断片はまた、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位、また、該DNAの始点および終点において制限部位を含有するようにもデザインした。5’端においてXbaI、また、3’端においてSalIの制限部位を導入し、Mackらに記載されているpEFDHFRと称する発現プラスミド(Mackら、Proc Natl Acad.Sci USA(1995)、92、7021〜5;およびRaumら、Cancer Immunol Immunother(2001)、50(3))内へのクローニングステップで用いた。配列を検証した後で、該プラスミドを用い、以下の通りにCHO/dhfr−細胞にトランスフェクトした。配列を検証したプラスミドを用いて、CHO/dhfr−細胞(ATCC受託番号CRL9096;37℃、湿度95%、および7%CO2のインキュベーター内において、ドイツ、ベルリン、Biochrom AG社から購入した、安定化グルタミンを伴い、すべて、ドイツ、ベルリン、Biochrom AG社から購入した、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充し、また、ドイツ、タウフキルヒェン、Sigma−Aldrich Chemie GmbH社から購入した、細胞培養グレードの試薬原液によるヌクレオシドを、10μg/mlアデノシン、10μg/mlデオキシアデノシン、および10μg/mlチミジンの最終濃度まで補充した、RPMI 1640中で培養した)にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、PolyFectトランスフェクション試薬(ドイツ、ヒルデン、Qiagen GmbH社製)、および5μgのプラスミドDNAにより実施した。24時間にわたる培養後にPBSで1回細胞を洗浄し、前述の細胞培地中で再度培養したが、該培地にはヌクレオシドを補充せず、透析したFCS(ドイツ、ベルリン、Biochrom AG社から購入した)を用いた。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約14日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7〜14日後、FACSにより、構築物の発現が陽性であるかどうかについてトランスフェクタントを調べた。Kaufmann R.J.(1990)、Methods Enzymol.185、537〜566により説明される通り、DHFR欠損CHO細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施する。メトトレキサート(MTX)濃度を、最高20nM MTXの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導する。
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザルの前立腺に由来するcDNAに対する5つのPCRセットにより、マカクザル(カニクイザル)PSMAのcDNA配列を得た。以下の反応条件:94℃で2分間にわたる1サイクル、次いで、94℃で1分間、52℃で1分間、また、72℃で1.5分間にわたる40サイクル、次いで、72℃で3分間にわたる最終サイクル、および以下のプライマーを用いた:
4.順方向プライマー:5’−cactgtggcccaggttcgagg−3’(配列番号375)
逆方向プライマー:5’−gacataccacacaaattcaatacgg−3’(配列番号376)
5.順方向プライマー:5’−gctctgctcgcgccgagatgtgg−3’(配列番号377)
逆方向プライマー:5’−acgctggacaccacctccagg−3’(配列番号378)
6.順方向プライマー:5’−ggttctactgagtgggcagagg−3’(配列番号379)
逆方向プライマー:5’−acttgttgtggctgcttggagc−3’(配列番号380)
7.順方向プライマー:5’−gggtgaagtcctatccagatgg−3’(配列番号381)
逆方向プライマー:5’−gtgctctgcctgaagcaattcc−3’(配列番号382)
8.順方向プライマー:5’−ctcggcttcctcttcgggtgg−3’(配列番号383)
逆方向プライマー:5’−gcatattcatttgctgggtaacctgg−3’(配列番号384)
一般に、各々が、ヒト、およびマカクザルのCD3抗原に対して結合特異性を有するドメイン、ならびにヒト、およびマカクザルのPSMA抗原に対して結合特異性を有するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表7に示す通りにデザインした。
ヒトPSMAおよびマカクザルPSMA、ならびにヒトCD3およびマカクザルCD3に結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、FACS解析を実施した。この目的のために、実施例24.1で説明した通りにヒトPSMAをトランスフェクトしたCHO細胞、また、ヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株であるHPB−ALL(ブラウンシュヴァイク、DSMZ社製、ACC483)を用いて、ヒト抗原に対する結合を確認した。マカクザル抗原に対する結合反応性は、実施例24.2で説明した通りに作製したマカクザルPSCAトランスフェクタント、また、マカクザルT細胞株である4119LnPx(エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Fickenscher教授による恵与;Knappe Aら、およびFickenscher H.、Blood 2000、95、3256〜61において公表されている)を用いることにより調べた。フローサイトメトリーによる解析は、実施例10で説明した手順と同様に実施した。
実施例24.1および24.2で説明したPSMA陽性細胞株を用いて、in vitroクロム51放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、刺激ヒトCD8陽性T細胞、またはマカクザルT細胞株である4119LnPxを用いた。実施例11において、MCSPおよびCD3に対する異種間特異的二重特異性抗体の生体活性解析について説明した手順と同様に、細胞傷害作用アッセイを実施した。
各々が、ヒトCD3抗原およびマカクザルCD3抗原に結合するドメイン、ならびにヒトPSMA抗原に結合するドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表8に示す通りにデザインした。
PSMAおよびCD3に結合する能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるため、FACS解析を実施した。この目的のために、PSMA陽性細胞を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザルCD3に対する結合反応性は、マカクザルT細胞株である4119LnPx(エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Fickenscher教授による恵与;Knappe Aら、およびFickenscher H.、Blood 2000、95、3256〜61において公表されている)を用いることにより調べた。フローサイトメトリーによる解析は、実施例10で説明した手順と同様に実施した。
PSMA陽性細胞株を用いて、in vitroクロム51(51Cr)放出細胞傷害作用アッセイにより、作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を解析した。エフェクター細胞としては、刺激ヒトCD4/CD56枯渇PBMCまたはマカクザルT細胞株である4119LnPxを用いた。実施例11において、MCSPおよびCD3に対する異種間特異的二重特異性抗体の生体活性解析について説明した手順と同様に、細胞傷害作用アッセイを実施した。
ヒト生殖細胞系列抗体のVH配列であるVH3 3−11(http://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/)を、CDRH1(配列番号394)、CDRH2(配列番号395)、およびCDRH3(配列番号396)のフレームワーク環境として選択する。同様に、ヒト生殖細胞系列抗体のVH配列であるVH1 1−02(http://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/)を、CDRH1(配列番号408)、CDRH2(配列番号409)、およびCDRH3(配列番号410)のフレームワーク環境として選択するほか、ヒト生殖細胞系列抗体のVH配列であるVH11−03(http://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/)も、CDRH1(配列番号445)、CDRH2(配列番号446)、およびCDRH3(配列番号447)のフレームワーク環境として選択する。各ヒトVHには、末端の約15〜20ヌクレオチドの連なりにおいて重複する複数の縮退オリゴヌクレオチドを合成しなければならない。この目的に適う第2のプライマーはいずれも、アンチセンスプライマーである。VH3 3−11には、以下のオリゴヌクレオチドのセット:
5’PM3−VH−A−XhoI(配列番号737)
CCG GAT CTC GAG TCT GGC GGC GGA CTG GTG AAG CCT GGC GRG TCC CTG ARG CTG TCC TGT
3’PM3−VH−B(配列番号738)
CCA GTA CAT GTA GTA GTC GGA GAA GGT GAA GCC GGA GGC GRY ACA GGA CAG CYT CAG GGA
5’PM3−VH−C(配列番号739)
TAC TAC ATG TAC TGG RTG CGC CAG RCC CCT GRG AAG SGG CTG GAA TGG GTG KCC ATC ATC TCC GAC GGC
3’PM3−VH−D(配列番号740)
GGC GTT GTC CCG GGA GAT GGT GAA CCG GCC CTT GAT GAT GTC GGA GTA GTA GGT GTA GTA GCC GCC GTC GGA GAT GAT
5’PM3−VH−E(配列番号741)
TCC CGG GAC AAC GCC AAG AAC ARC CTG TAC CTG CAG ATG ARC TCC CTG ARG KCC GAG GAC ACC GCC RTG TAC TAC TGC RCC CGG GGC
3’PM3−VH−F−BstEII(配列番号742)
CGA TAC GGT GAC CAG GGT GCC CTG GCC CCA GTA ATC CAT GGC GCC GTG TCT CAG CAG AGG GAA GCC CCG GGY GCA GTA GTA
を用いる。VH1 1−02のオリゴヌクレオチドとしては、以下:
5’PM4−VH−A−XhoI(配列番号743)
CTT GAT CTC GAG TCT GGC GCC GAA STG RWG RAG CCT GGC GCC TCC GTG AAG STG TCC TGC AAG GCC TCC GGC TAC
3’PM4−VH−B(配列番号744)
CCA TTC CAG GCC CTG CYC AGG CSY CTG CCG CAS CCA GTT GAT GTC GAA GTA GGT GAA GGT GTA GCC GGA GGC CTT
5’PM4−VH−C(配列番号745)
CAG GGC CTG GAA TGG ATS GGC GGC ATC TCC CCT GGC GAC GGC AAC ACC AAC TAC AAC GAG AAC TTC AAG
3’PM4−VH−D(配列番号746)
AT GTA GGC GGT GGA GMT GGA CKT GTC TMT GGT CAK TGT GRC CYT GCC CTT GAA GTT CTC GTT GTA
5’PM4−VH−E(配列番号747)
C TCC ACC GCC TAC ATS SAG CTG TCC CGG CTG ASA TCT GAS GAC ACC GCC GTG TAC TWC TGC GCC AGG GAC GGC
3’PM4−VH−F−BstEII(配列番号748)
AGA CAC GGT CAC CGT GGT GCC CTG GCC CCA AGA GTC CAT GGC GTA GTA AGG GAA GTT GCC GTC CCT GGC GCA
を用いる。VH1 1−03のオリゴヌクレオチドとしては、以下:
5’PM8−VH−A−XhoI(配列番号749)
CTT GAT CTC GAG TCC GGC SCT GAG STG RWG AAG CCT GGC GCC TCC GTG AAG RTG TCC TGC AAG GCC TCC GGC TAC
3’PM8−VH−B(配列番号750)
CCA TTC CAG CMS CTG GCC GGG TKY CTG TYT CAC CCA GTG CAT CAC GTA GCC GGT GAA GGT GTA GCC GGA GGC CTT GCA
5’PM8−VH−C(配列番号751)
CCC GGC CAG SKG CTG GAA TGG ATS GGC TAC ATC AAC CCT TAC AAC GAC GTG ACC CGG TAC AAC GGC AAG TTC AAG
3’PM8−VH−D(配列番号752)
TTC CAT GTA GGC GGT GGA GGM GKA CKT GTC KCT GGT AAK GGT GRC TYT GCC CTT GAA CTT GCC GTT GTA
5’PM8−VH−E(配列番号753)
TCC ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC RGC CTG ASG TCT GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGG GGC
3’PM8−VH−F−BstEII(配列番号754)
CGA TAC GGT GAC CAG AGT GCC TCT GCC CCA GGA GTC GAA GTA GTA CCA GTT CTC GCC CCT GGC GCA GTA GTA
を用いる。これらのプライマーセットの各々は、対応するVH配列全体にわたる。
5’PM3−VL−A−SacI(配列番号755)
CTT GAT GAG CTC CAG ATG ACC CAG TCC CCC ARS TYC MTG TCC RCC TCC GTG GGC GAC AGA GTG ACC
3’PM3−VL−B(配列番号756)
GCC GGG CTT CTG CTG AWA CCA GGC CAC GTT GGT GTC CAC GTT CTG GGA GGC CTT GCA GGT GAY GGT CAC TCT GTC GCC
5’PM3−VL−C(配列番号757)
CAG CAG AAG CCC GGC MAG KCC CCT AAG KCC CTG ATC TAC TCC GCC TCC TAC CGG TAC TCT
3’PM3−VL−D(配列番号758)
CAG GGT GAA GTC GGT GCC GGA CYC GGA GCC GGA GAA CCG GKM AGG CAC GYC AGA GTA CCG GTA GGA
5’PM3−VL−E(配列番号759)
ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC TCC ARC STG CAG YCT GAG GAC YTC GCC RMG TAC TWC TGC CAG CAG TAC GAC
3’PM3−VL−F−BsiWI/SpeI(配列番号760)
CGA GTA ACT AGT CGT ACG CTT GAT TTC CAG CTT GGT CCC TCC GCC GAA GGT GTA AGG GTA GGA GTC GTA CTG CTG GCA
を用いる。VkII A17の場合、オリゴヌクレオチドは以下:
5’PM4−VL−A−SacI(配列番号761)
CTT GAT GAG CTC CTG ATG ACC CAG TCC CCC CTG TCC CTG CCT GTG AYC CTG GGC SAM CMG GCC TCC ATC TCC TGC CGG
3’PM4−VL−B(配列番号762)
AAA CCA GTG CAG GTA GGT ATT GCC GTT GGA GTG CAC CAG GGA CTG GGA GGA CCG GCA GGA GAT GGA GGC
5’PM4−VL−C(配列番号763)
ACC TAC CTG CAC TGG TTT CWG CAG AGG CCT GGC CAG TCC CCT ARG CKG CTG ATC TAC ACC GTG TCC AAC CGG
3’PM4−VL−D(配列番号764)
CAG GGT GAA GTC GGT GCC GGA GCC GGA GCC AGA GAA CCT GTC AGG CAC GCC GGA GAA CCG GTT GGA CAC GGT
5’PM4−VL−E(配列番号765)
GGC ACC GAC TTC ACC CTG AAG ATC TCC CGG GTG GAG GCC GAA GAT STG GGC GTG TAC TWT TGC TCC CAG TCC ACC
3’PM4−VL−F−BsiWI/SpeI(配列番号766)
ACT CAG ACT AGT CGT ACG CTT GAT TTC CAG CTT GGT CCC TCC GCC GAA GGT AGG CAC GTG GGT GGA CTG GGA GCA
の通りである。VkII A1の場合、オリゴヌクレオチドは以下:
5’PM8−VL−A−SacI(配列番号767)
CTT GAT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA SYC TCC CTG SCT GTG ACT CTG GGC CAG CSG GCC TCC ATC TCT TGC CGG
3’PM8−VL−B(配列番号768)
CCA GTG CAT GAA GGT GTT GTC GTA GGA GTC GAT GGA CTC GGA GGC CCG GCA AGA GAT GGA GGC
5’PM8−VL−C(配列番号769)
ACC TTC ATG CAC TGG TWT CAG CAG ARG CCT GGC CAG YCT CCT MRC CKG CTG ATC TWC CGG GCC TCT ATC CTG GAA
3’PM8−VL−D(配列番号770)
CAG GGT GAA GTC GGT GCC GGA GCC AGA GCC GGA GAA CCG GKC AGG GAY GCC GGA TTC CAG GAT AGA GGC CCG
5’PM8−VL−E(配列番号771)
ACC GAC TTC ACC CTG AMA ATC TMC CST GTG GAG GCC GAS GAC GTG GSC RYC TAC TAC TGC CAC CAG
3’PM8−VL−F−BsiWI/SpeI(配列番号772)
ACT CAG ACT AGT CGT ACG CTT GAT TTC CAG CTT GGT CCC TCC GCC GAA GGT GTA AGG GTC CTC GAT GGA CTG GTG GCA GTA GTA
を用いる。これらのプライマーセットの各々は、対応するVL配列全体にわたる。
25.1.ヒト/ラットPSMAキメラを発現するCHO細胞の作製
PSMA異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子の結合エピトープをマッピングするため、2つの異なる種に由来するPSMAにより、キメラPSMAタンパク質を作製した。この手法は、1つの種に由来するPSMAタンパク質だけが抗体により認識されることを必要とする。本実施例では、被験PSMA異種間特異的二重特異性単鎖抗体分子が結合しないドブネズミのPSMAを用いて、ヒトPSMAとのキメラを作製した。したがって、PSMA異種間特異的二重特異性単鎖抗体の結合エピトープを含有する領域内においてキメラを作製することにより、それぞれのPSMA構築物に対する前記単鎖抗体の結合を喪失させる。
PSMA異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物の結合エピトープを決定するため、FACS解析を実施した。この目的のため、実施例25.1で説明したヒト/ラットキメラPSMA分子をトランスフェクトしたCHO細胞を用いた。二重特異性単鎖抗体構築物を発現するCHO細胞の上清によるFACS解析は、本明細書で説明する通りに実施した。PSMA異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物の結合の検出は、マウスペンタHis抗体、また、第2段階の試薬として、フィコエリトリンにコンジュゲートしたFcガンマ特異的抗体を用いて実施した。トランスフェクトされなかった細胞の上清を、陰性対照として用いた。
2つのPSMA BiTE抗体であるPM 76−B10×I2CおよびPM 76−A9×I2Cは、ラットPSMAと交差反応性であったため、ヒト−ラットPSMAキメラを用いてマッピングから除外した。同様に、ヒト−ラットPSMAキメラに対する、PSMA BiTE抗体であるPM F1−A10×I2Cの結合シグナルは微弱にすぎ、エピトープマッピングのための信頼性に欠けていた。これらの3つのPSMA BiTE抗体を、ペプチド走査に基づく代替的なエピトープマッピング法(Pepscan社)にかけた。Pepscanでは、所与のタンパク質の重複するペプチドを用い、ELISA(酵素結合免疫吸着)法により、固定化させたペプチドに対する抗体の結合を解析する。PSMA BiTE抗体によるエピトープマッピング実験は、Pepscan社(オランダ、レリスタッド)で実施した。該方法についての詳細な説明は、別所(Bernardら、2004、J.Biol.Chem.、279、24313〜22;Teelingら、2006、J Immunol.、177、362〜71)にみられる。略述すると、ヒトPSMAの細胞外アミノ酸配列全体にわたり、15マーの各近傍ペプチドと14アミノ酸ずつ重複する、693の異なる15マーのペプチドを合成した。これらのペプチドを、384ウェルプレートのフォーマットによるELISAウェルにコーティングした。この一連の実験のため、それぞれのBiTE抗体候補の抗PSMAscFv(BiTE抗体PM 76−A9×I2CのためのscFv MP9076−A9;BiTE抗体PM76−B10×I2CのためのscFv MP9076−B10;BiTE抗体PM F1−A10×I2CのためのscFv F1−A10)を大腸菌内で作製し、ELISA用のペリプラズム粗抽出物として用いた。この目的で、7mlのペリプラズム粗抽出物を、ドライアイスに添えて、Pepscan社(オランダ)へと送付した。このアッセイでは、scFvによる対応物を用いることにより、BiTE抗体のうちの、第2のPSMAに結合特異性でない抗体に由来するシグナルを拾い上げることから、標的結合剤のPSMA結合エピトープについての誤解を招来する危険性を最小化した。該scFvをペプチドと共にインキュベートし、抗His抗体を用いて特異的結合を検出した。384ウェルELISAリーダーにより結合シグナルを測定した。図54、55、および56に結果を示す。
Claims (1)
- 配列番号2、4、6、または8に含まれるアミノ酸配列の一部であり、少なくとも、アミノ酸配列Gln−Asp−Gly−Asn−Gluを含む、ヒトのCD3ε(イプシロン)鎖エピトープ、およびコモンマーモセット、ワタボウシタマリン、またはコモンリスザルのいずれか一つのCD3ε(イプシロン)鎖エピトープに結合することが可能な、抗原との相互作用部位である第1の結合ドメインと、前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合することが可能な第2の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子。
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