JP6569690B2

JP6569690B2 - 細胞培養用物品

Info

Publication number: JP6569690B2
Application number: JP2017009769A
Authority: JP
Inventors: 啓輔倉内; 直人荻原
Original assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Current assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2019-09-04
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: JP2018117541A

Description

本発明は、新規な細胞培養用物品に関する。

創薬研究や再生医療研究のツールの１つである細胞培養用物品の開発においては、基材への細胞の吸着による変性、失活を防ぐために、表面を細胞非吸着性に保つことが重要である。また、特にマイクロプレートのような限定された空間での培養では、表面を細胞非吸着性の素材にすることで、細胞の機能維持に有利とされており、スフェロイドと呼ばれる３次元的な細胞構造を形成させることができるという利点がある。

培養基材を親水性樹脂でコートすることで、表面を細胞非吸着性にする取り組みがなされている。例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメトキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ホスホコリン基を有する（メタ)アクリレートモノマーを原料とする共重合体などでのコートが報告されている（特許文献１〜４）。

また、基材と親水性高分子を直接結合させることで、このような溶出や長期保存安定性を解消する取り組みがなされている（特許文献５〜６）。

さらに、アクリルブロック部分とポリエチレンオキサイド部分とを有するブロック重合体と架橋剤とを反応させた塗膜の利用が開示されている（特許文献７）。

特開２０１４−０７９２２７号公報特許第５９５００５５号国際公開番号ＷＯ２０１５／１４６５５９特開２０１６−０４７９０２号公報特開２００９−０１７８０９号公報特開平６−３２７４６２号公報特許第５８３１６６６号

しかし、特許文献１〜４のように親水性樹脂でコートを行うと、培地への溶出の懸念や、長時間保管した状態での耐久性に問題が生じる可能性がある。また、特許文献５〜６に記載されるような方法は複数の加工工程が必要であり、工業的に煩雑であるという課題を抱えている。また、特許文献７に開示される細胞培養用部材は優れた細胞培養性能を発現するが、製造後の保管条件により細胞培養性能が低下してしまうという新たな課題が見つかった。
本発明の目的は、保管安定性の高い、細胞培養用物品を提供することにある。

本発明は、表面に塗膜を有する細胞培養用物品であって、
前記塗膜が、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とを有する酸価が１７．５〜４０ｍｇＫＯＨ／ｇである重合体（Ａ）と、重合体（Ａ）１００質量部に対して０．１質量部〜３０質量部の多価カルボジイミド（Ｂ）との反応物であり、
重合体（Ａ）に含まれる、ポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）の質量／［アクリル系ポリマー部分（Ａ１）の質量とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）の質量との合計］が０．１〜０．２５である、細胞培養用物品に関する。

また、本発明において、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とは、下記式（ＩＡ）〜（ＩＣ）のいずれかの構造を介して結合してなることが好ましい。

また、本発明において、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とは、下記式（ＩＡ）の構造を介して結合してなることが好ましい。

本発明により、保管安定性の高い、細胞培養用物品を提供することができた。

本発明の細胞培養用物品の一例を模式的に示し斜視図である。図１のＩＩ−ＩＩで切断した断面図である。

＜重合体（Ａ）＞
本発明における重合体（Ａ）は、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とを有する。ポリエチレンオキサイド部分は、以下、ＰＥＧ部分ということもある。重合体（Ａ）は、前記の部分を両方とも主鎖に有する構造、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）を主鎖とし、その側鎖部位にポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）を有する構造の少なくともいずれかを有し、前記構造を両方とも有すことができる。

本発明では、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とは、アクリロイル基およびまたはメタクリロイル基を少なくとも一つ有する（メタ）アクリル系モノマーを全モノマーの内１０％以上含むポリマー部分を指す。

アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）のブロック重合体は、下記式（ＩＡ）、（ＩＢ）又は（ＩＣ）のいずれかの構造（結合構造）を介して結合されていることが好ましい。その合成方法については、後述するが、特に限定されない。
なお、ブロック重合体は、下記式（ＩＡ）〜（ＩＣ）のいずれか一以上の結合構造を含むことが好ましいが、これら以外の結合構造を一部に含んでいてもよい。下記式（ＩＡ）の構造を介して結合してなる重合体であることがより好ましい。

上記の式（ＩＡ）で示される結合構造を有するブロック重合体の合成方法の一例を挙げる。
例えば、ラジカル重合開始剤として４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（例えば、和光純薬工業株式会社の市販品「Ｖ−５０１」等）を用いてアクリル系ポリマーを合成すると、末端にカルボキシル基を有するアクリル樹脂が得られる。これに、ＰＥＧ部分を構成する原料としてポリエチレングリコールを加え、エステル化反応をさせることで、アクリル系ポリマー部分と、ＰＥＧ部分とが上記式（ＩＡ）で結合してなるブロック重合体を得ることができる。

あるいは、上記の式（ＩＡ）で示される結合構造を有するブロック重合体は、アクリル系ポリマーを合成する際のラジカル重合開始剤として、下記式（ＩＩ）で示される、ＰＥＧ部分（Ａ２）とアゾ基を含む構造単位を有する高分子アゾ重合開始剤を用いて好ましく合成することができる。式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立に１以上の整数である。高分子アゾ重合開始剤は、高分子セグメントとアゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）が繰り返し結合した構造を有しており、本実施形態では、高分子セグメントとしてＰＥＧブロックを含む高分子アゾ開始剤を用いることで、容易にブロック重合体を合成できる。

高分子アゾ重合開始剤を用いる場合、該開始剤中に含まれるアゾ基のモル数に対する、アクリル系モノマーの全モル数の比率を適宜変更することによって、ブロック重合体の質量平均分子量の調整ができる。例えば、高分子アゾ重合開始剤中に含まれるアゾ基のモル数に対する、アクリル系モノマーの全モル数の比率が２００であると、２００量体のアクリル系ポリマーがＰＥＧ鎖の間に組み込まれることになり、ポリマーの絡み合いによる高い凝集力を付与することができる。

高分子アゾ重合開始剤の質量平均分子量は、５，０００〜１０万程度であることが好ましく、１万〜５万程度であることがより好ましい。また、該開始剤のＰＥＧ部分の分子量は、８００〜１万程度であることが好ましく、１，０００〜８，０００程度であることがより好ましい。
また、好ましくはｍは１５〜２００、より好ましくはｍは２０〜１００であり、好ましくはｎは３〜５０、より好ましくはｎは４〜３０である。

前記高分子アゾ重合開始剤は、ＰＥＧ部分（Ａ２）を有しているため、水、アルコール、及び有機溶剤に可溶であり、溶液重合、乳化重合、又は分散重合によりブロック重合体の合成が可能である。また、分子鎖骨格中に重合開始部分（ラジカル発生部分：―Ｎ＝Ｎ−）を有しているため、別途重合開始剤を使用する必要がなく、さらには末端反応性マクロモノマーに比べてラジカルの反応性、及び安定性が高いという特徴を有している。
前記高分子アゾ重合開始剤は、・Ｃ（ＣＨ₃）ＣＮ−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＯ−（ＣＨ₂）₂−Ｃ（ＣＨ₃）ＣＮ・にて示されるようなラジカルを生じ、後述するアクリル系モノマーを重合させる。そして、アクリル系モノマーから形成されるアクリル系ポリマー部分（Ａ１）と前記ラジカル由来の部分とが結合した主鎖を形成し、ブロック重合体を形成する。ＰＥＧ部分（Ａ２）は、ラジカルの一部に由来する。
高分子アゾ重合開始剤の具体例としては、和光純薬製の高分子アゾ開始剤ＶＰＥ０２０１（上記式（ＩＩ）の（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_ｍの部分の分子量が約２０００、ｎが６程度）などが例示される。

高分子アゾ重合開始剤の他に、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルのようなアゾ開始剤や、過酸化ベンゾイルのうようなの有機過酸化物開始剤を併用することができる。これらの開始剤を併用することにより、開始効率を高め、効率よくアクリル系ポリマー部分（Ａ１）にＰＥＧに組み込むことができ、残留モノマーを減らすことができる。

ブロック重合体合成時には、用途に応じてラウリルメルカプタン、ｎ−ドデシルメルカプタン等のメルカプタン類、α−メチルスチレンダイマー、リモネン等の連鎖移動剤を使用して、分子量や末端構造を制御しても良い。

次に、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）と、ＰＥＧ部分（Ａ２）とが上記式（ＩＢ）の構造を介して結合してなるブロック重合体の合成方法について説明する。
例えば、アクリル系ポリマーブロックとポリエチレンオキサイドブロックとが、上記式（ＩＢ）の構造を介して結合してなるブロック重合体は、アクリル系モノマーを、ヒドロキシ基を有するアゾ重合開始剤を用いて重合し、末端にヒドロキシ基を有するアクリル系ポリマーブロックを得る工程、及び前記アクリル系ポリマーブロックおよびポリエチレングリコールと、２官能のイソシアネート化合物とをウレタン化反応させる工程を含む方法により製造することができる。

例えば、ラジカル重合開始剤として２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチルプロパンアミド］（例えば、和光純薬工業株式会社の市販品「ＶＡ−０８６」等）を用いてアクリル系ポリマーを合成すると、末端にヒドロキシル基を有するアクリル樹脂が得られる。これに、ＰＥＧ部分を構成する原料としてポリエチレングリコールを加え、２官能イソシアネート化合物を用いてウレタン化反応させることで、アクリル系ポリマー部分と、ＰＥＧ部分とが結合してなるブロック重合体を得ることができる。
ウレタン化反応の際用いられる２官能イソシアネート化合物としては、例えば、２，２’−ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、及びイソホロンジイソシアネート等を挙げることができる。

さらに、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）と、ＰＥＧ部分（Ａ２）とが上記式（ＩＣ）の構造を介して結合してなるブロック重合体の合成方法について説明する。
例えば、アクリル系ポリマーブロックとポリエチレンオキサイドブロックとが、上記式（ＩＣ）の構造により結合してなるブロック重合体は、アクリル系モノマーを、カルボキシル基を有するアゾ重合開始剤を用いて重合し、カルボキシル基を有するアクリル系ポリマーブロックを得る工程、及び前記アクリル系ポリマーブロックにポリエチレングリコールをエステル化反応させる工程を含む方法により製造することができる。

例えば、ラジカル重合開始剤として２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］４水和物（例えば、和光純薬工業株式会社の市販品「ＶＡ−０５７」等）を用いてアクリル系ポリマーを合成すると、末端にカルボキシル基を有するアクリル樹脂が得られる。これに、ＰＥＧ部分を構成する原料としてポリエチレングリコールを加え、エステル化反応をさせることで、アクリル系ポリマー部分と、ＰＥＧ部分とが結合してなるブロック重合体を得ることができる。

なお、式（ＩＢ）〜（ＩＣ）のいずれかの構造を介して結合してなるブロック重合体を得る際に、上記のような高分子ではないアゾ重合開始剤を用いる場合も、高分子アゾ重合開始剤を用いる際に併用し得るものとして記載した「他の開始剤」も適宜併用することができる。また、連鎖移動剤も適宜使用できる。

次に、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）を主鎖とし、その側鎖部位にポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）を有する重合体について説明する。このような重合体は、ポリエチレンオキサイドを有する（メタ）アクリル系モノマーを他のモノマーと共重合することで得ることができる。

ポリエチレンオキサイドを有する（メタ）アクリル系モノマーとしては特に限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
なお、これらのモノマーは、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）も形成するが、ポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）も形成するものである。そこで、これらのモノマーは、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）には含めないこととする。

本発明では、アクリル系ポリマー部分（Ａ１）を形成する全モノマーの水／１−オクタノール分配係数（ＬｏｇＰ）の平均値が０以上、２以下であることが望ましい。ＬｏｇＰの平均値が０以上、２以下である場合、水に対する溶解性が制御され、脂溶性が向上する。その結果、培養や保管中の細胞用の培地への溶出が抑制され、基材への密着性もよくなる傾向にある。

ＬｏｇＰは、化学物質の性質を表す数値の一つであり、添加量に依存しない一定の値である。対象とする物質が、水と１−オクタノールの混合液において、水相とオクタノール相が接した系中で平衡状態にある場合を対象として、各相の濃度をその常用対数で示したものである。ＬｏｇＰが大きくなると、比較的に疎水性が増大する傾向があり、ＬｏｇＰが小さくなると、比較的に親水性が増大する傾向がある。

ＬｏｇＰの測定は、一般にＪＩＳ日本工業規格Ｚ７２６０−１０７（２０００）に記載のフラスコ浸とう法により実施することができる。また、ＬｏｇＰは実測に代わって、計算化学的手法あるいは経験的方法により見積もることも可能である。ＬｏｇＰの計算に用いる方法やソフトウェアについては公知のものを用いることができるが、本発明ではＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ社のシステム：ＣｈｅｍｄｒａｗＰｒｏ１１．０に組み込まれたプログラムを用い、ＬｏｇＰを求めている。

水／１−オクタノール分配係数（ＬｏｇＰ）が０以上２以下であるモノマーとしては、特に限定はされないが、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチルアクリレート等のアルキルエステル（メタ）アクリレート；（メタ）アクリルメトキシメチル（メタ)アクリレート、２−メトキシエチル（メタ)アクリレート、エトキシメチル（メタ)アクリレート、エトキシエチル（メタ)アクリレート、プロポキシメチル（メタ)アクリレート、プロポキシエチル（メタ)アクリレート、２−（２−メトキシエトキシ）エチル(メタ)アクリレート、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル(メタ)アクリレート、２−（２−エトキシエトキシ）エチル(メタ)アクリレート、２−［２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ］エチル(メタ)アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等のアルコキシ基含有モノマー；
（メタ）アクリロニトリル、酢酸ビニル、ブタジエン、イソプレンなどのビニル基含有モノマー；Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム、１−ビニルイミダゾール、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどのアミド基含有モノマー；（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸２−カルボキシエチル等のカルボキシル基含有モノマーなどが挙げられる。
これらは単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。これらの化合物のうち、特に２−メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレートが経済性や操作性の点から好ましい。

本発明では、使用するアクリル系モノマーのＬｏｇＰが０〜２の範囲であれば、ホモポリマー部分の原料として使用することができる。また、使用する（メタ）アクリル系モノマーのＬｏｇＰが０〜２の範囲外であっても、その他の（メタ）アクリル系モノマーを含めたＬｏｇＰの質量平均値が０〜２の範囲であれば、コポリマー部分の原料として使用することができる。

ＬｏｇＰが０〜２の範囲外のモノマーの中で、例えば、アルキル基の炭素数が５〜２０のアクリレート、アルキル基の炭素数が４〜２０のメタクリレート、スチレンなどのビニル基含有モノマー、マレイン酸等のカルボキシル基含有モノマー、４−ヒドロキシスチレン、Ｎ−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の水酸基含有モノマーなどが挙げられる。

本発明で用いられる重合体（Ａ）の酸価は１０〜５０ｍｇＫＯＨ／ｇであり、２０〜４０ｍｇＫＯＨ／ｇであることが好ましい。酸価がこの範囲であることにより、重合体（Ａ）と後述する多価カルボジライト（Ｂ）が適切な密度で架橋されると共にポリエチレンオキサイドの運動性が保持され、細胞培養用物品の細胞培養性能が保管条件によって変化し難くなる。

重合体（Ａ）を構成する親水性に富むポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）と疎水性に富むアクリル系ポリマー部分（Ａ１）のバランスにより、細胞の非接着性を効果的に制御し得る。重合体（Ａ）は、ポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）の質量／［アクリル系ポリマー部分（Ａ１）の質量とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）の質量との合計］は、０．０５〜０．３であることが好ましく、０．１〜０．２５であることがより好ましい。即ち、５〜３０質量％であることが好ましく、１０〜２５質量％であることがより好ましい。

重合体（Ａ）の質量平均分子量Ｍｗは、取り扱い性および細胞毒性の観点から、３，０００〜１，０００，０００であることが好ましく、より好ましくは、５，０００〜５００，０００である。

重合体（Ａ）のガラス転移温度は、−７０℃〜５０℃であることが好ましく、より好ましくは、−６０℃〜−３０℃である。重合体（Ａ）のガラス転移温度を−７０℃〜５０℃の範囲に調製することで、均一なコート膜を作成することができ、細胞の吸着性を抑えることができる。

＜多価カルボジイミド（Ｂ）＞
本発明で用いられる多価カルボジイミド（Ｂ）とは分子内にカルボジイミド基を複数有する化合物のことを指す。カルボジイミドは酸成分と架橋可能であることから、特定の酸価を有する重合体（Ａ）と混合した後、細胞培養用物品の基材に塗工することで、重合体（Ａ）の培地への溶出を抑制したり、保管条件により細胞培養性能が変化しないようにしたりすることができる。

多価カルボジイミド（Ｂ）としては特に限定はされないが、例えば、日清紡績株式会社のカルボジライトシリーズを用いることができ、Ｖ−０２、Ｖ−０４、Ｖ−０６などの水性タイプ、Ｖ−０１、Ｖ−０３、Ｖ−０５、Ｖ―０７、Ｖ―０９などの油性タイプ等が挙げられる。

本発明において、架橋剤は、一種のみを単独で用いてもよいし、複数を併用しても良い。架橋剤の使用量は、重合体（Ａ）中に含まれる官能基の種類やモル数を考慮して決定すればよく、特に限定されるものではないが、通常は重合体（Ａ）１００質量部に対して０．１質量部〜３０質量部の範囲で用いられる。重合体（Ａ）中に含まれる官能基のモル数よりも少ない範囲で配合することで、未反応の架橋剤が遊離する懸念をなくすことができる。

＜細胞培養用物品＞
本発明に係る細胞培養用物品、細胞培養用物品の基材の表面に、上述の重合体（Ａ）と多価カルボジイミド（Ｂ）とを含有するコーティング剤を塗工して塗膜を形成する工程、及び、得られた塗膜を硬化する工程を少なくとも含む。

＜コーティング剤＞
コーティング剤は、上記重合体（Ａ）と、この重合体（Ａ）を溶解又は分散する溶媒を含むものであることが好ましい。
溶媒は、特に限定はされないが、水、又はメタノール、エタノール、アセトン、メチルエチルケトン（以下、ＭＥＫという）等の有機溶媒等が挙げられ、互いに混和する２種以上の溶媒を組み合わせて使用してもよい。なかでも、水を含む水系の溶媒、又はエタノールを用いることが好ましい。

コーティング剤中の重合体（Ａ）の含有量は、特に限定されず、例えばその塗工方法に応じた粘度となるように、あるいは、望ましい膜厚となるように、適宜調製することができる。
具体的には、共重合体（Ａ）の含有量は、０．５〜１０質量％程度であることが好ましく、１〜３質量％程度であることがより好ましい。

さらに、コーティング剤は、一般的な塗料に用いられる、その他の任意の成分を含むことができる。例えば、着色した塗膜を形成するために着色剤を含んでいてもよいし、界面活性剤、増粘剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、顔料等の公知の成分を１種以上配合することができる。

＜塗膜形成＞
コーティング剤の塗布方法は、特に限定されず、成型体又は基材に対しては、刷毛、浸漬、ローラ、スプレー、注入、及び塗工機など、種々の塗布方法を適用できる。また、フィルムに対する塗布方法としては、ディップコート、コンマコート、グラビアコート、カーテンコート、ダイコート、リップコート、マイクログラビアコート、スロットダイコート、リバースコート、及びキスコート等が挙げられる。
さらに、用途によっては、インクジェット印刷法を用い、塗工箇所を任意に選択してパターン印刷を行うことも好ましい。
塗膜は、細胞培養用物品の細胞接触面の全てに形成されていることが好ましいが、その使用の実態に応じて、一部のみに形成されていてもよい。

コーティング剤を塗布したのち、塗膜の硬化が行われる。硬化は、加熱により行われることが好ましく、その条件（温度及び時間）は、使用する重合体（Ａ）の特性、及び多価カルボジイミド（Ｂ）の種類、量に応じて適宜設定すればよい。例えば、温度は１００〜２００℃の範囲であることが好ましい。
塗膜の厚みは、特に限定されないが、乾燥後の厚みで１ｍｍ以下であることが好ましく、０．０５μｍ〜２０μｍであることが好ましく、０．１μｍ〜１０μｍであることがより好ましい。

＜成型＞
また、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン系樹脂などの熱可塑性樹脂を押出し成型する際、重合体（Ａ）と多価カルボジイミド（Ｂ）とを含有する組成物を共に押出し成型した後、金型を用いる等して所望の形状に成型してもよい。
あるいは、前記の熱可塑性樹脂をシート状に成型した後、ブロック重合体（Ａ）と多価カルボジイミド（Ｂ）とを含有する組成物のシート状反応物を、接着剤層を介して積層し、その後金型を用いる等して所望の形状に成型してもよい。あるいは、ブロック重合体（Ａ）と多価カルボジイミド（Ｂ）とを含有するシート状組成物を、接着剤層を介して積層した後、もしくは積層する際に硬化することもできる。

図１は、本発明の細胞培養用物品の一例を模式的に示し斜視図である。図２に、その一部を拡大して断面図（図１のＩＩ−ＩＩで切断）として示すように、細胞培養用物品（４）は、細胞培養用物品の基材（マイクロウェルプレート）（３）の細胞接触面、つまりその内表面に、塗膜（１０）を有する。

細胞培養用物品の基材の形状としては、マイクロウェルプレートの他に、軟質のバッグ、硬質のボトル、シャーレ、平たいままのプレートやシート等の細胞培養用容器が挙げられる。さらに、前記細胞培養用容器の他に、細胞培養の際に用いられる検査用チップやピペットなどのような治具も挙げられる。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。なお、実施例における、「部」および「％」は、「質量部」および「質量％」をそれぞれ表し、Ｍｗは質量平均分子量、Ｔｇはガラス転移温度を意味する。

＜酸価の測定方法＞
共栓三角フラスコ中にダイヤフラムポンプで合成溶媒を取り除いた樹脂約１ｇを精密に量り採り、トルエン／エタノール（容量比：トルエン／エタノール＝２／１）混合液１００ｍＬを加えて溶解する。これに、フェノールフタレイン試液を指示薬として加え、３０秒間保持する。その後、溶液が淡紅色を呈するまで０．１Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で滴定する。酸価は次式により求めた（単位：ｍｇＫＯＨ／ｇ）。
酸価（ｍｇＫＯＨ／ｇ）＝（５．６１１×ａ×Ｆ）／Ｓ
ただし、
Ｓ：試料の採取量（ｇ）
ａ：０．１Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液の消費量（ｍＬ）
Ｆ：０．１Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液の力価

＜質量平均分子量（Ｍｗ）の測定方法＞
Ｍｗの測定は昭和電工社製ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）「ＧＰＣ−１０１」を用いた。ＧＰＣは溶媒（ＴＨＦ；テトラヒドロフラン）に溶解した物質をその分子サイズの差によって分離定量する液体クロマトグラフィーである。本発明における測定は、カラムに「ＫＦ−８０５Ｌ」（昭和電工社製：ＧＰＣカラム：８ｍｍＩＤ×３００ｍｍサイズ）を直列に２本接続して用い、試料濃度１ｗｔ％、流量１．０ｍｌ／ｍｉｎ、圧力３．８ＭＰａ、カラム温度４０℃の条件で行い、質量平均分子量（Ｍｗ）の決定はポリスチレン換算で行った。データ解析はメーカー内蔵ソフトを使用して検量線および分子量、ピーク面積を算出し、保持時間１５〜３０分の範囲を分析対象として質量平均分子量を求めた。

＜ガラス転移温度（Ｔｇ）の測定方法＞
溶剤を乾燥除去して重合体を単離し、メトラー・トレド社製「ＤＳＣ−１」を使用し、重合体約５ｍｇをアルミニウム製標準容器に秤量し、温度変調振幅±１℃、温度変調周期６０秒、昇温速度２℃／分の条件にて、−８０〜２００℃まで測定し、可逆成分の示差熱曲線からガラス転移温度を求めた。

＜重合体の合成＞
［実施例１]
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒としてメチルエチルケトン（以下、ＭＥＫと略す）１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてメトキシエチルアクリレートを９１質量部、アクリル酸を３．５質量部、ブレンマーＰＭＥ−１０００を５．５部、重合開始剤としてＶＰＥ０２０１（和光純薬工業社製：マクロアゾ開始剤）を１１．１質量部、溶媒としてＭＥＫを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後１時間熟成させた後、をＭＥＫ２質量部で溶解した溶液を添加し、６時間熟成した。その後、室温に冷却し反応を停止した。その後、ダイヤフラムポンプでＭＥＫを除去した後、エタノールを加えて希釈することで、固形分１０質量％のブロック重合体溶液を得た。
得られた重合体のＭｗは８６，４００、Ｔｇは−５０℃、酸価は２４．６であった。エタノールを加えて固形分１０質量％まで希釈したカルボジライトＶ−０２を、重合体溶液１００質量部に対して、１３．３部加えよく撹拌し、コーティング剤を得た。
得られたコーティング剤について後述する方法に従って、水溶性、細胞毒性を評価するとともに、細胞培養用部材を形成し、スフェロイドの形成性（初期、６０℃保管後）を評価した。

［実施例２〜１３、比較例１〜４]
実施例１と同様の方法で、表１の組成および仕込み量に従って、重合体を合成した。その特性値を表１に示す。
さらに実施例１と同様にして、固形分１０質量％の重合体溶液１００質量部に対して、表１に示す量の架橋剤（固形分１０質量％）を加え、コーティング剤を得、同様に評価した。
なお、本明細書において、実施例１０〜１３は参考例である。

ＡＡ：アクリル酸、ＬｏｇＰ＝０．３８
ＭＡＡ：メタクリル酸、ＬｏｇＰ＝０．３８
ＭＥＡ：メトキシエチルアクリレート、ＬｏｇＰ＝０．４８
ＭＭＡ：メチルメタクリレート、ＬｏｇＰ＝１．１１
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート、ＬｏｇＰ＝２．２３
ブレンマーＰＭＥ−１０００（日油株式会社製）：メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート

ＶＰＥ−０２０１：ポリエチレングリコールユニット含有高分子アゾ重合開始剤（和光純薬工業株式会社製）
ＡＩＢＮ：アゾビスイソブチロニトリル

Ｖ−０２：カルボジライトＶ−０２（日清紡ケミカル株式会社製）
Ｖ−０４：カルボジライトＶ−０４（日清紡ケミカル株式会社製）

＜評価＞
（１）水への溶解性
実施例及び比較例で調製したコーティング剤を、精密秤量した容器に約２ｇずつ添加し、１５０℃で１０分乾燥した。オーブンから取出し、容器ごと精密秤量した後、容器にイオン交換水５ｇを加え一晩静置した。容器からイオン交換水を吸引排出した後、再度１５０℃で１０分乾燥し、容器を精密秤量した。下記式で水への溶解度を算出し、水への溶解性を４段階の評価基準に基づいて評価した。
細胞培養は水をベースとした培地で行われることがほとんどであるため、水溶性が乏しいということは、実際に使用される培地に対して、コート層が安定であることを示す。
水への溶解度＝１００−［（ｚ−ｘ）／（ｙ−ｘ）］×１００
ｘ：容器の質量
ｙ：イオン交換水で処理する前の質量
ｚ：イオン交換水で処理した後の質量

○：水への溶解度≦５％
○△：５％＜水への溶解度≦2０％
△：５％＜水への溶解度≦2０％
×：５０％＜水への溶解度

（２）細胞毒性
Ｕ字底９６ウェルプレートに、実施例及び比較例で調製したコーティング剤を各ウェルに約０．５ｍｌずつ注入した。これを吸引排出した後、６０℃で２４時間乾燥させることにより、コーティング剤で内面が被覆されたプレートを調製した。
これを電子線滅菌した後、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを培地とし、マウス線維芽細胞用細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）を１ウェルあたり１×１０⁴個播種し、５％ＣＯ²／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養した。
細胞毒性は、１、２、５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μｌのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００ｍｌの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。
細胞毒性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
○：８０％≦細胞毒性
△：２０％≦細胞毒性＜８０％
×：細胞毒性＜２０％

（３）スフェロイド形成性（初期、６０℃で保管後）
スフェロイド形成性は、上記（２）と同様の方法で作製した１日以内のウェルプレートと、６０℃のオーブンで１月保管した後のウェルプレートとをそれぞれ用い、上記（２）と同様の方法でマウス線維芽細胞用細胞株を５日目まで培養した。５日目の細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を観察し、以下の基準で評価した。
なお、スフェロイドが形成するということは細胞の塗膜への吸着性が低いことを示している。また、スフェロイドが形成可能であるということは、薬剤の適性を見る際にも有用であることが知られている。
○：９６ウェルの全てに、１つのスフェロイドを形成し、集まっていない細胞はなかった。
○△：９６ウェルの全てに１つのスフェロイドを形成したが、９６ウェルのうち、集まっていない細胞のあるウェルがあった。
△：９６ウェルのうち、複数個のスフェロイドを形成したウェルがあった。
×：９６ウェルのうち、スフェロイドを形成しないウェルがあった。

表１に示すように、本発明の細胞培養用物品は、耐水性が高く、細胞毒性が低く、高温保管の後でも細胞の非接着性が保つことができる。これは、樹脂の極性や酸価、架橋剤が適切に選択されたためであると考えられる。

ポリエチレンオキサイド部分を有さない重合体を用いた比較例１は、スフェロイドの形成能に乏しく、細胞の非吸着性が不十分であることが分かった。これは、ポリエチレンオキサイド部分を有していなかったため、塗膜の極性が小さくなり、細胞が吸着してしまったためと考えられる。

酸価が５０ｍｇＫＯＨ／ｇより大きな共重合体を用いた比較例２は、耐水性に問題があり、スフェロイドの形成能に乏しく、細胞の非吸着性が不十分であることが分かった。耐水性が悪化した原因は、酸性官能基を共重合体中に多く含みすぎたためであると考えられる。また、細胞非吸着性が悪化したのは、酸性官能基が細胞と特異的な相互作用を有してしまったためであると考えられる。

酸価が１０ｍｇＫＯＨ／ｇより小さな重合体を用いた比較例３は、高温保管後のスフェロイド形成能に乏しいことが分かった。これは、酸性官能基と架橋剤との反応による架橋密度が小さくなったため、高温保管時に塗膜が不安定になり、細胞培養用物品の塗膜表面に均一性が損なわれたからではないかと考えられる。

架橋剤として多価カルボジイミド（Ｂ）を使用していない比較例４は耐水性に問題があり、また、高温保管時のスフェロイド形成能に乏しいことが分かった。耐水性が悪化した原因は、樹脂が架橋されていないため、容易に溶出できてしまったためであると考えられる。また、細胞非吸着性が悪化したのは、架橋構造を持たないため、高温保管時にコート層が安定に存在できず、液だれなどコート層の形状面での問題が発生してしまったためであると考えられる。

（３）：細胞培養用物品の基材
（４）：細胞培養用物品
（１０）：塗膜

Claims

表面に塗膜を有する細胞培養用物品であって、
前記塗膜が、
アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とを有する酸価が１７．５〜４０ｍｇＫＯＨ／ｇである重合体（Ａ）と、重合体（Ａ）１００質量部に対して０．１質量部〜３０質量部の多価カルボジイミド（Ｂ）との反応物であり、
重合体（Ａ）に含まれる、ポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）の質量／［アクリル系ポリマー部分（Ａ１）の質量とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）の質量との合計］が０．１〜０．２５である、
細胞培養用物品。
重合体（Ａ）中のアクリル系ポリマー部分（Ａ１）を形成するモノマーの水／１−オクタノール分配係数（ＬｏｇＰ）の平均値が０以上、２以下であることを特徴とする、請求項１記載の細胞培養用物品。
重合体（Ａ）の質量平均分子量が３，０００〜１，０００，０００である、請求項１または２に記載の細胞培養用物品。
重合体（Ａ）のガラス転移温度が−７０〜５０℃である、請求項１〜３いずれか１項に記載の細胞培養用物品。
アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とが、下記式（ＩＡ）〜（ＩＣ）のいずれかの構造を介して結合してなる、請求項１〜４いずれか１項に記載の細胞培養用物品。
アクリル系ポリマー部分（Ａ１）とポリエチレンオキサイド部分（Ａ２）とが、下記式（ＩＡ）の構造を介して結合してなる、請求項１〜５いずれか１項に記載の細胞培養用物品。