JP7018175B2

JP7018175B2 - 共重合体、基材用表面処理剤および細胞培養基材

Info

Publication number: JP7018175B2
Application number: JP2017236336A
Authority: JP
Inventors: 近藤聡; 久野豪士; 佐藤雪絵
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2022-02-10
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: JP2019104783A

Description

本発明は、多能性幹細胞の効率的な細胞培養を可能とすると共に、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材の表面処理剤として有用な共重合体、およびそれを基材表面に有する細胞培養基材に関する。

細胞培養は生化学的な現象の理解や有用物質の産生などに用いられ、また近年、幹細胞の発見や培養技術の進歩により、再生医療を始めとする細胞を用いた治療に大きな注目が寄せられている。

細胞の多くは接着性を有しており、体内においてはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの生体高分子に接着し、増殖・分化することが知られている。同様に、細胞培養においても接着性を有する細胞の多くは、培養する際に何らかの基材に接着する必要がある。従来、基材としては表面処理したガラスあるいは高分子が用いられていた。例えば、ポリスチレンにγ線照射あるいはシリコーンコーティングを行なった基材がある。また、コラーゲンやフィブロネクチンのような生体高分子を表面に塗布した支持体も用いられる。

増殖する細胞は基材上で培養後、一般的に別の基材に植え継ぐ必要が有り、多くの場合にはタンパク質分解酵素が用いられている。タンパク質分解酵素は細胞表面にあるタンパク質を分解し、細胞と基材の間の結合および細胞間の結合を切る役目を担っている。一方、タンパク質分解酵素は細胞の生存率に大きな影響を与えることが知られており、タンパク質分解酵素を用いずに細胞を基材から分離する手法は細胞にダメージを与えない方法として重要である。再生医療においても同様に、体外で培養した細胞にダメージを与えずに、さらに細胞間の結合を切断しない方法で細胞又は組織化した細胞を基材から分離し、体内に戻すことが求められており、タンパク質分解酵素を用いずに基材から分離する方法が求められている。

上記問題を解決するために、温度応答性ポリマーを基材表面に被覆した細胞培養基材が特許文献１に開示されている。このような基材によれば、周囲環境の温度降下による温度応答性ポリマーのゾル転移で基材表面の接着力を弱めて、細胞を剥離させ、ダメージを与えることなく細胞を分別回収することができる。通常、細胞は体温付近で接着・培養する必要があり、培養後、体温以下で細胞を剥離できる基材が必要となる。

特許文献２および３には、水中におけるゾル転移温度［下限臨界溶液温度（Ｔ）］が体温以下の範囲にある温度応答性ポリマーとして、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が記載されている。

上記温度応答性ポリマーを細胞培養基材に用いる場合、下限臨界溶液温度以下に細胞培養基材の温度を下げる必要があるが、同時に細胞を低温化してしまう。細胞の低温化は細胞の活性低下を及ぼすため、冷却時間の短縮が必要である。

ＷＯ０１／０６８７９９号公報特公平６－１０４０６１号公報特開平５－２４４９３８号

本発明の目的は、多能性幹細胞の効率的な細胞培養を可能とすると共に、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材の表面処理剤として有用な共重合体、およびそれを被覆した細胞培養基材を提供することにある。

本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、温度応答性構造単位と細胞接着性構造単位を含有する共重合体を基材上に被覆することで、多能性幹細胞の効率的な細胞培養を可能にすると共に、短時間での細胞剥離を可能にすることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明によれば、下記（Ａ）および（Ｂ）を有する共重合体が提供される。

（Ａ）下記一般式（１）で表される繰り返し単位（ａ）

（式中、Ｒ^１は水素基またはメチル基であり、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立して、水素基、炭素数１～６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基である。）
（Ｂ）下記一般式（２）で表される繰り返し単位（ｂ）

（式中、Ｒ^４は水素基またはメチル基であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立して、水素基または水酸基である。）
また、本発明によれば、（Ａ）と（Ｂ）を含む共重合体を含む、基材用の表面処理剤が提供される。

さらに、本発明によれば、（Ａ）と（Ｂ）を含む共重合体を含む膜を基材表面に有する細胞培養基材が提供される。

温度応答性構造単位と細胞接着性構造単位を含む共重合体は、基板への接着性を確保しつつ培養時における細胞の接着性を高め、それにより高い細胞培養効率を可能にする。さらに細胞培養後に、温度降下させた場合に、基材表面の親水化が促進され、細胞の剥離性が高まる。これにより、細胞にダメージを与えることなく、短時間で細胞を分別回収できる細胞培養基材が得られるようになる。

以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
１．共重合体
本発明の共重合体は前記（Ａ）、および前記（Ｂ）を含む。

共重合体中の全繰り返し単位［（ａ）＋（ｂ）］に対する繰り返し単位（ａ）の比率は５～９５ｍｏｌ％であることが好ましい。細胞の接着性を高める観点から、繰り返し単位（ａ）の比率は好ましくは１０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは４０ｍｏｌ％以上であり、さらに好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。一方で、温度低下の際に細胞の剥離性を高める観点から、繰り返し単位（ａ）の比率は９５ｍｏｌ％以下であることが好ましく、より好ましくは９０ｍｏｌ％以下である。細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、４０～９０ｍｏｌ％であることが好ましく、特に５０～９０ｍｏｌ％が好ましい。

本発明の共重合体を構成する（Ａ）は一般式（１）で表される繰り返し単位（ａ）からなる温度応答性構造単位である。

Ｒ^１は水素基またはメチル基であり、温度応答性構造単位の下限臨界溶液温度を体温以下にすることを目的に好ましくは水素基を用いる。

Ｒ^２およびＲ^３は各々独立して、水素基、炭素数１～６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、温度応答性構造単位の下限臨界溶液温度を体温以下にすると共に、細胞培養基材にした場合に細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは炭素数１～６の炭化水素基を用いる。

Ｒ^２およびＲ^３の組み合わせとしては、温度応答性構造単位の下限臨界溶液温度を体温以下にすることを目的に、一方が水素基であることが好ましい。

炭素数１～６の炭化水素基としてはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉｓｏ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉｓｏ－ブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、１－メチル－プロピル基、ｎ－ペンチル基、ｉｓｏ－ペンチル基、１－メチル－ブチル基、２－メチル－ブチル基、１，１－ジメチル－プロピル基、１，２－ジメチル－プロピル基、ｎ－ヘキシル基、ｉｓｏ－ヘキシル基を例示することができる。温度応答性構造単位の下限臨界溶液温度を体温以下にすることを目的に、好ましくはｉｓｏ－プロピル基を用いる。

重合反応によって繰り返し単位（ａ）を生成するモノマーとしては、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、及びＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドを例示することができる。温度応答性構造単位の下限臨界溶液温度を体温以下にすると共に、細胞培養基材にした場合に細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはＮ－イソプロピルアクリルアミドを用いる。

本発明の共重合体を構成する（Ｂ）は一般式（２）で表される繰り返し単位（ｂ）からなる細胞接着性構造単位である。

Ｒ^４は水素基またはメチル基である。細胞培養基材にする場合に、基材と物理的な相互作用によって被覆させるためには、メチル基が好ましい。

Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立して、水素基または水酸基である。細胞培養基材にした場合に細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、少なくとも１つ以上は水酸基であることが好ましい。

重合反応によって繰り返し単位（ｂ）を生成するモノマーとしては、Ｎ－フェニルメタクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－フェニルアクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）アクリルアミドを例示することができる。細胞培養基材にした場合に細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドを用いることが好ましく、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドがさらに好ましい。

共重合体中の繰り返し単位（ａ）及び（ｂ）の配列はランダム配列またはブロック配列であり、細胞培養基材にした場合に細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、繰り返し単位（ａ）からなるセグメント及び繰り返し単位（ｂ）からなるセグメントを含むブロック共重合体であることが好ましい。

本発明の共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は特に限定はないが、基材への被覆に好適に用いることができることから、３，０００以上１，０００，０００以下が好ましく、４，０００以上５００，０００以下がさらに好ましく、５，０００以上１００，０００以下が最も好ましい。３，０００以上の場合は溶出が起こりにくく、また、１，０００，０００以下は溶液粘度が低く、被覆に際し好適である。

本発明の共重合体の合成方法としては、特に限定はないが、ラジカル重合を用いると簡便に且つ効率よく重合体を得ることができる。より具体的なラジカル重合法として、フリーラジカル重合を利用したバルク重合、溶液重合、乳化重合などの公知の方法をあげることができる。ラジカル重合をより効率的に開始させるために、任意の量のラジカル開始剤を添加できる。反応に好適に用いられるラジカル開始剤として、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどの無機過酸化物を例示でき、重合促進剤と呼ばれるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチレンエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルパラトルイジンなどのアミン化合物と組み合わせて用いることにより低温で迅速な重合が可能できる。さらに、ラジカル開始剤としてジラウロイルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、ジーｔｅｒｔ－ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシドなどの有機過酸化物、また、α、α’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル）（Ｖ－７０）や１，１’－アゾビス（シクロヘキサン－１－カルボニトリル）（Ｖ－４０）などのアゾ化合物を例示することができる。中でも、副反応を抑制する観点から、アゾ化合物が好適に用いられる。

本発明の共重合体は、フリーラジカル重合を行うことにより製造できる他、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合法を用いることによっても製造できる。ＲＡＦＴ剤としては、一般的にトリチオカーボネート化合物やジチオベンゾエート化合物などのＲＡＦＴ重合に適した公知のものを使用することができる。ＲＡＦＴ剤の選択については、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第４５巻、５３２１－５３４２頁（２０１２年）などの公知文献を参考にするとよい。

通常、窒素ガスやアルゴンガスなどの不活性ガス雰囲気下または脱酸素下で重合を行うことで再現性よく本発明の共重合体を製造でき、溶媒を用いると重合反応が円滑に進行する。溶媒としては、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４－ジオキサンなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの溶媒を二種以上混合して用いることもできる。重合反応は通常０℃～１００℃に範囲内で円滑に進行する。

重合するモノマーの順番としては、以下にＮ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドを例に説明するが、これらのモノマーに限定されるものではない。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドを同時に重合（ランダム共重合）する方法、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを重合し、未反応モノマーを除いた後、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドを共重合する方法、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドを重合し、未反応モノマーを除いた後、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを共重合する方法を例示することができる。

また、共重合体の合成方法としては、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドのブロックポリマーをそれぞれ合成し、クリック反応等で互いに結合する方法を用いることができる。
２．表面処理剤
本発明の基材用の表面処理剤は、上記共重合体を含むものである。より好ましくは、シャーレ、マルチウェルプレート、フラスコなどの細胞培養基材用の表面処理剤である。本発明の表面処理剤は、基材に塗布するだけで表面処理を行うことができるものである。

本発明の表面処理剤は、上記共重合体以外に、本共重合体を溶解することができる各種溶剤を含むものであってもよい。共重合体を溶解できる溶剤としては特に限定はされないが、適用後に蒸発して残留しない溶媒が好ましく、また、残留しても培養細胞に及ぼす影響が小さい、エタノール、水とエタノールの混合溶媒が特に好ましい。本発明の表面処理剤は、通常、溶液状のものであるが、上記の溶媒で溶解可能な粉末状であってもよい。

本発明の表面処理剤の対象基材としては、特に限定はないが、前記共重合体は疎水性相互作用で基材に接着することから、好ましくは各種疎水性ポリマー材料が用いられる。疎水性ポリマー材料としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等の各種シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレンテレフラレート、ポリカーボネート等が挙げられる。また、金属基材、セラミック基材あるいはガラス基材にシランカップリング剤で表面処理したものも用いることができる。

また、基材の形状は、特に限定はないが、例えば、板状、ビーズ上および繊維状の形状のほか、板状の基材に設けられた穴や溝や突起なども挙げられる。

本発明の表面処理剤を基材に塗布する方法としては、例えば、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることができる。
３．細胞培養基材
本発明の細胞培養基材は、上記共重合体を含む膜を基材表面に有する細胞培養基材である。共重合体を含む膜は、上記表面処理剤を基材に塗布した後に、乾燥することによって基材表面に得られる。

膜の厚さは１ｎｍ以上１μｍ以下であることが好ましい。細胞培養基材に被覆した時に細胞の接着性を高める観点から、好ましくは２００ｎｍ以下、更に好ましくは１００ｎｍ以下である。一方で、細胞培養基材を被覆している膜上に細胞が接着した後に、細胞剥離に必要とあれる冷却時間を短縮する観点から、１ｎｍ以上であることが好ましく、更に好ましくは５ｎｍ以上、更に好ましくは１０ｎｍ以上である。

上記膜は、温度応答性構造単位（Ａ）と細胞接着性構造単位（Ｂ）を含む共重合体を含む。細胞接着性（Ｂ）は細胞培養基材に対して接着性を有するとともに、タンパク質などの付着を可能とし、細胞の接着培養が可能となる。一方、温度応答性構造単位（Ａ）は培養温度、例えば３７℃以上では疎水性を示すことによりタンパク質などの付着を可能とし、細胞の接着培養が可能となる。細胞培養後に温度降下させることで、膜表面が親水性に変化し、細胞剥離を促すことができるため、剥離に必要な冷却時間を短縮することが可能になる。

上記膜は、他の成分との混合物であってもよい。

本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の表面に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の株化細胞に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、それらから分化誘導した細胞等を用いることができる。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。

共重合体のポリマー組成は、核磁気共鳴測定装置（日本電子製、商品名ＪＮＭ－ＧＸ２７０）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（^１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。

共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）およびＭｗとＭｎの比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置としては東ソー（株）製ＨＬＣ（登録商標）－８３２０ＧＰＣを用い、カラムとしては、東ソー製ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＧＭＨ_ＨＲ－Ｈを用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液として１０ｍＭ臭化リチウム含有Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製し、１５０μＬ注入して測定した。分子量の検量線は、分子量既知の標準ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）試料を用いて校正した。なお、ＭｎとＭｗはポリメタクリル酸メチル換算の値として求めた。

実施例１
［共重合体（１）の合成］
三方コックを備えた試験管にＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ）１．６ｇ、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド（ＨＰｈＭＡ）１．０ｇ、α、α’－アゾビスイソブチルニトリル（ＡＩＢＮ）３３ｍｇを加え、ＤＭＦ１０ｍＬで溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間攪拌し重合した。重合反応後、反応溶液を大量のエーテルに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した後、溶媒を除去することによって、共重合体（１）を得た。

得られた共重合体（１）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（１）の調製］
得られた共重合体（１）０．１０ｇをエタノール４９．９ｇに溶解し、共重合体（１）の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作成した。さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液１ｍＬとエタノール３ｍＬを混合し、０．０５ｗｔ％のエタノール溶液を調製した。この溶液を基材用表面処理剤として細胞培養用６ウェルプレート（コーニング製、材質：ポリスチレン）に０．４２ｍＬずつ加え、２時間減圧下で乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、共重合体が被覆された細胞培養基材（１）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（１）を用い、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３，０００個／ウェルの密度で播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５％で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を用いた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ－２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ（登録商標）－５１１溶液（（株）ニッピ製）（４．８μＬ／ウェル）を添加し培養した。

細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を４℃に冷却し、ピペッティングを行い、再度位相差顕微鏡で観察した。細胞は剥離し、凝集塊として回収できた。

実施例２
［共重合体（２）の合成］
三方コックを備えた試験管にＩＰＡＡｍ２．０ｇ、ＨＰｈＭＡ０．３７ｇ、ＡＩＢＮ３３ｍｇを加え、ＤＭＦ１０ｍＬで溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間攪拌し重合した。重合反応後、反応溶液を大量のエーテルに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過した後、溶媒を除去することによって、共重合体（２）を得た。

得られた共重合体（２）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（２）の調製］
得られた共重合体（２）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養基材（１）の調製］と同様の方法で調製を行い、細胞培養基材（２）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（２）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

実施例３
［共重合体（３）の合成］
三方コックを備えた試験管にＩＰＡＡｍ５．１ｇ、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．２ｇ、ＡＩＢＮ２５ｍｇを加え、１，４－ジオキサン５０ｍＬで溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した白色固体を回収し、ヘキサン洗浄を２回行った後に、乾燥した。

三方コックを備えた試験管に、先に得られた重合体０．５６ｇ、ＨＰｈＭＡ０．１４ｇ、ＡＩＢＮ８ｍｇを加え、ＤＭＦ１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液をエーテル５００ｍＬに注ぎ、析出した白色固体をろ過により回収し、乾燥して、共重合体（３）を得た。

得られた共重合体（３）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（３）の調製］
得られた共重合体（３）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養基材（１）の調製］と同様の方法で調製を行い、細胞培養基材（３）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（３）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

実施例４
［共重合体（４）の合成］
三方コックを備えた試験管に、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエートのプロパーギルエステル体９５ｍｇ、ＩＰＡＡｍ６．８ｇ、ＡＩＢＮ８ｍｇを加え、１，４－ジオキサン２０ｍｌに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した桃色固体をろ過により回収し、乾燥して、末端アルキンを有するＮ－イソプロピルアクリルアミド重合体を得た。

一方、三方コックを備えた試験管に、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３－アジドプロピルエステル体０．１８ｇ、ＨＰｈＭＡ５．３ｇ、ＡＩＢＮ２６ｍｇを加え、ＤＭＦ２０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液を純水５００ｍＬに注ぎ、析出した桃色固体をろ過により回収し、乾燥して、末端アジドを有するＮ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド重合体を得た。

続いて、三方コックを備えた試験管に、前記末端アルキンを有するＮ－イソプロピルアクリルアミド重合体０．６５ｇ、上記末端アジドを有するＮ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド重合体０．３０ｇを加え、窒素置換を行った。窒素バブリングを行ったＤＭＦ９ｍＬを加え溶解させた。臭化銅（Ｉ）１４ｍｇ、２，２’－ビピリジル３１ｍｇ、ＤＭＦ１ｍＬで別途調製した溶液を窒素気流下で試験管に加え、室温で４８時間反応させた。反応終了後、三方コックを取り外し、空気を触れさせて銅触媒を失活させた。反応液を活性アルミナを詰めたカラムに通して銅触媒を取り除き、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液をメタノール／アセトン混合溶媒へ溶解させて、ヘキサンを少しずつ加え、析出する重合体を回収した。再沈殿精製を３回繰り返し、共重合体（４）を得た。

得られた共重合体（４）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（４）の調製］
得られた共重合体（４）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養基材（１）の調製］と同様の方法で調製を行い、細胞培養基材（４）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（４）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

実施例５
［共重合体（５）の合成］
三方コックを備えた試験管に、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエートのプロパーギルエステル体９５ｍｇ、ＩＰＡＡｍ６．８ｇ、ＡＩＢＮ８ｍｇを加え、１，４－ジオキサン２０ｍｌに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した桃色固体をろ過により回収し、乾燥して、末端アルキンを有するＮ－イソプロピルアクリルアミド重合体を得た。

一方、三方コックを備えた試験管に、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３－アジドプロピルエステル体０．１８ｇ、Ｎ－フェニルメタクリルアミド（ＰｈＭＡ）４．８ｇ、ＡＩＢＮ２６ｍｇを加え、ＤＭＦ２０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液を純水５００ｍＬに注ぎ、析出した桃色固体をろ過により回収し、乾燥して、末端アジドを有するＮ－フェニルメタクリルアミド重合体を得た。

続いて、三方コックを備えた試験管に、前記末端アルキンを有するＮ－イソプロピルアクリルアミド重合体０．６５ｇ、上記末端アジドを有するＮ－フェニルメタクリルアミド重合体０．３０ｇを加え、窒素置換を行った。窒素バブリングを行ったＤＭＦ９ｍＬを加え溶解させた。臭化銅（Ｉ）１４ｍｇ、２，２’－ビピリジル３１ｍｇ、ＤＭＦ１ｍＬで別途調製した溶液を窒素気流下で試験管に加え、室温で４８時間反応させた。反応終了後、三方コックを取り外し、空気を触れさせて銅触媒を失活させた。反応液を活性アルミナを詰めたカラムに通して銅触媒を取り除き、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液をメタノール／アセトン混合溶媒へ溶解させて、ヘキサンを少しずつ加え、析出する重合体を回収した。再沈殿精製を３回繰り返し、共重合体（５）を得た。

得られた共重合体（５）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（５）の調製］
得られた共重合体（５）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養基材（１）の調製］と同様の方法で調製を行い、細胞培養基材（５）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（５）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

比較例１
［重合体（６）の合成］
三方コックを備えた試験管にＨＰｈＭＡ５．３ｇ、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．２ｇ、ＡＩＢＮ２５ｍｇを加え、ＤＭＦ３０ｍＬで溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液を純水５００ｍＬに注ぎ、析出した白色固体を回収した後、乾燥して、重合体（６）を得た。

得られた重合体（６）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（６）の調製］
得られた重合体（６）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養基材（１）の調製］と同様の方法で調製を行い、細胞培養基材（６）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（６）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に位相差顕微鏡で細胞の様子を観察した。いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を４℃に冷却し、ピペッティングを行い、再度位相差顕微鏡で観察した。細胞は接着し、１４４時間後までは増殖したものの、冷却操作によって剥離しなかった。温度応答性構造単位（Ａ）非存在下では温度低下によるヒトｉＰＳ細胞の回収はできなかった。

比較例２
［重合体（７）の合成］
三方コックを備えた試験管にＩＰＡＡｍ５．１ｇ、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．２ｇ、ＡＩＢＮ２５ｍｇを加え、１，４－ジオキサン３０ｍＬで溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した白色固体を回収した後、乾燥して、重合体（７）を得た。

得られた重合体（７）のポリマー組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［細胞培養基材（７）の調製］
得られた重合体（７）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養基材（１）の調製］と同様の方法で調製を行い、細胞培養基材（７）を調製した。
［細胞培養および剥離評価］
細胞培養基材（７）を用いたこと以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

細胞播種から２４時間後に位相差顕微鏡で細胞接着を確認し、新しい前記培地に交換を行ったが、９６時間後には細胞死が発生しており、培養が継続できなかった。以降の評価は中止した。細胞接着性構造単位（Ｂ）非存在下ではヒトｉＰＳ細胞の培養はできなかった。

比較例３
基材に共重合体を被覆せず、コーニング製細胞培養用６ウェルプレートをそのまま用い、その他は実施例１と同様にして評価した。
［細胞培養および剥離評価］
基材に共重合体を被覆せず、コーニング製細胞培養用６ウェルプレートをそのままを用いた以外は実施例１［細胞培養および剥離評価］と同様の方法で評価を行った。

細胞播種から２時間後、９６時間後、１４４時間後に位相差顕微鏡で細胞の様子を観察した。いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を４℃に冷却し、ピペッティングを行い、再度位相差顕微鏡で観察した。細胞は接着し、１４４時間後までは増殖したものの、冷却操作によって剥離しなかった。共重合体非存在下では温度低下によるヒトｉＰＳ細胞の回収はできなかった。

Claims

下記（Ａ）および（Ｂ）を含む共重合体を含む膜を基材表面に有する細胞培養基材。
（Ａ）下記一般式（１）で表される繰り返し単位（ａ）

（式中、Ｒ^１は水素基またはメチル基であり、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立して、水素基、炭素数１～６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基である。ただし、Ｒ ^２またはＲ ^３がフェニル基の場合を除く。）
（Ｂ）下記一般式（２）で表される繰り返し単位（ｂ）

（式中、Ｒ^４は水素原子またはメチル基であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立して、水素原子または水酸基である。）