JP6313208B2

JP6313208B2 - ピキア属酵母と様々なホップ品種群の組み合わせによるビールの風味向上

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Publication number: JP6313208B2
Application number: JP2014527691A
Authority: JP
Inventors: サレンズソフィー; ヘンドリクスウィーゲルスヤン
Original assignee: セーホーエル．ハンセンアクティーゼルスカブ
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2032-09-03
Also published as: US20170183612A1; DK2751250T3; NZ620946A; CA2847467C; US20140234480A1; EP2751250B1; WO2013030398A1; MX352345B; EA201490551A1; BR112014004375A2; EA031400B1; MX2014002251A; AU2012300785A1; CA2847467A1; CN103781896A; EP2751250A1; AU2012300785B2; PL2751250T3; JP2014525257A; US10544385B2

Description

本発明は、ビール醸造の分野及びビールの風味向上に関する。特に、本発明は、ホップとピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株との相互作用があって、ビールの風味を向上させるピキア属菌種（Pichia spp.）（種）を用いたホップ添加麦汁の発酵工程を含むビールの醸造方法に関する。

各ビールが、大麦麦芽、ホップ、酵母発酵、及び他の原料に由来する多くの風味化合物を含んでいる。しかしながら、発酵中に、最も重要な風味化合物が形成されるので、酵母発酵がビール醸造工程の中核を成す。発酵とは、酵母が麦汁中の単糖をエタノールと二酸化炭素に代謝する工程である。しかしながら、これらの成分は、ビールの風味全体に対して比較的わずかにしか貢献していない。
わずかな風味揮発成分の結果としてたらされるビールの香り及び風味特性は、発酵中に酵母によって産生される。他の重要な因子はホップである。醸造に使用される２種類のホップ：ビターホップとアロマホップ、が存在する。ビターホップは、ラガービールに使用されて、更なる苦味をビールに与える。アロマホップは、特殊なビールに使用されて、風味を向上させる。

種培養の使用は酵母産業において慣例である。しかしながら、ビール産業において、特定の酵母株を使用することには２つの主な目的：生産工程の効率を改善すること及び良質な最終製品を得ること、があるので、純粋な酵母株は、醸造において望まれるすべての最適な形質を兼ね備えていないことがほとんどである（Saerens et al. 2010）。更なる、飲食料品業界におけるより最近の傾向は、ヒトの健康をサポートする飲料の製造である。例えば、醸造業は、より低いアルコール及び糖質を有するビールの製造に注目した研究に力を入れた。

良質のビールを確保するために、「悪い」風味の低減及び望ましい風味の向上が醸造業の切迫した課題である。悪い風味の低減は、「バタースコッチ」臭を有するビールの望ましくない風味化合物であるジアセチルの減産に絞られる。ビールの最も望ましい風味化合物は、エステル及び高級アルコールであり、ビールにフルーティーな香りを与える（Verstrepen et al. 2003）。ビールの最も重要な風味活性エステルは、酢酸エチル（「溶媒」様の香り）及び酢酸イソアミル（「バナナ」の香り）などの酢酸エステル、並びにヘキサン酸エチル及びオクタン酸エチルなどのエチルエステル（「リンゴ」の香り）である。最も重要な高級アルコールは、イソアミルアルコール（「バナナ」の香り）である。より健康な飲食料品を求める需要拡大のため、アルコール飲料（特にビールとワイン）中のエタノール及び炭水化物の低減は、多くの商工業の着目するところである。低アルコールビール、減アルコールビール、及びノンアルコールビールの現在の製造法、すなわち、改変された発酵又は発酵後のエタノール除去は、それぞれ麦汁のような味又は風味成分の損失のいずれかをもたらす（Zufall and Wackerbauer 2000）。アルコール不含ラガービールにおいて、エタノールの不存在（０．１％未満）は、冷接触法で製造されるビール中のあらゆる「麦汁の（worty）」異臭を増強する。

飲料の官能特性の改善と新しい飲料の開発は、バイオフレーバリング（bioflavoring）（Vanderhaegen et al. 2003）。この技術は、特別な酵母株の使用などの生物学的方法によって風味化合物及び風味前駆体の製造及び変換にある。伝統的に、醸造者は２つのタイプの醸造酵母：それぞれエールとラガーの製造のためのその利用に従って、エール酵母とラガー酵母、を区別した。エール及びラガー醸造酵母はサッカロミセス属：Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）（エール酵母）及びＳ．パストリアヌス（S. pastorianus）（ラガー酵母）、に属す。ラガー酵母はピルスナービールの製造に使用され、それは、世界中で製造されるビールの９０％を占める。他の１０％は、エール酵母によって作り出される特殊なビールである。ベルギーでは（そして現在、ＵＳＡでも）、他の１つの酵母種、ブレタノミセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）が、ランビックビール及びグーズビールの製造に使用される（Verachtert et al. 1989）。これは、多くの非サッカロミセス株が使用されて、自然発生的な発酵の「野生の」特徴を高めるワイン産業との大きな違いである（Domizio et al. 2011）。
これらの菌株は今日、Christian HansenやLallemandなどの会社を通してワイン産業に向けて市販されている。

国際特許出願ＷＯ２００９／１１０８０７は、発酵工程における使用のための酵母株及び非サッカロミセス属酵母株の使用による発酵の製品中の風味を向上する方法に関する。ＷＯ２００９／１１０８０７は、ワインの発酵に関し、ビール醸造における非サッカロミセス種の使用について言及しない。
どんな研究もビール中のエステル及び高級アルコールのレベルに対する非サッカロミセス種の効果を調べていない。また、ごく少数の研究しかビール中のホップ風味に対する酵母の影響に関して報告していない。現在までに３つの研究で、ビール中のホップテルペノイドの増強に対するサッカロミセス属（Saccharomyces）種又はブレタノミセス属（Brettanomyces）種のいずれかの影響を報告する（King and Dickinson, 2003, Daenen et al. 2007及びTakoi et al. 2010）。

国際特許出願ＷＯ２００８／０７７９８６は、発酵中にモノテルペンシンターゼをコードした遺伝子を発現する、遺伝子組み換え微生物を使用することによって高い及び／又は様々な芳香族テルペン量を有するアルコール飲料を製造する工程を記載する。このＷＯ２００８／０７７９８６の中で、ピキア属は、（例えば、サッカロミセス属などの他の酵母株と一緒に）アルコール飲料を発酵させることが理論的に可能な酵母株の一覧の中で言及されている（ビールは、ワイン、カバ、シャンパン、シードル及びサケなどの他のアルコール飲料と一緒に例として言及されている）。言い換えれば、ビール造りのためのピキア属菌種（Pichia spp.）の使用は、ＷＯ２００８／０７７９８６の中に正確及び明白に開示されていない。

独国特許ＤＤ２８８６１９Ａ５は、ビール麦汁を発酵させるためのピキア属酵母の使用を記載する。ビール麦汁にはホップが加えられていない。
発酵工程において化合物の存在及び量を制御する生物学的過程の理解は非常に望ましい。特に、醸造者にとって、ビール中の酢酸エステルの量とタイプを調整できるのは非常に有益である。ビール中のホップ風味と組み合わせて、エステル及び高級アルコール、特に酢酸イソアミルの量の調整は、醸造者が、彼らの製品中のこれらの望ましい風味の量をより正確に変更することを可能にする新技術の開発を可能にするだろう。そのため、そのような技術には、大きな商品価値があるだろう。それに加えて、風味向上は、低アルコールビール、減アルコールビール又はノンアルコールビールを製造する有用な方法であり得る。低アルコールビール、減アルコールビール又はノンアルコールビールの製造に関する問題は、エタノールの除去又は麦汁の低濃度のいずれかによる麦汁のような味又は香り化合物の損失である。

これにより、ビールにおいて望ましい風味向上のための改善された工程の必要性が存在している。

本発明によって解決すべき課題は、エステルや高級アルコールなどの望ましい風味化合物の存在が高められる新しいビール醸造方法の提供に関する。
解決策は、従来の醸造酵母によるホップ添加麦汁の発酵前又は発酵と同時に、ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させることを含む方法を使用することによって、当業者が改善された風味プロフィールを有するビールを作り出すことができるという、発明者による驚くべき知見に基づいている。
従って、本発明の第一の態様は、以下の工程：
ａ）麦汁を調製する工程；
ｂ）少なくとも１つのホップ品種を加えて、ホップ添加麦汁を得る工程；
ｃ）ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株である第一の酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させる工程；そして
ｄ）サッカロミセス属（Saccharomyces）種とブレタノミセス属（Brettanomyces）種から成る群に属する第二の酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させて、ビールを得る工程、
を含むビール醸造方法に関する。

本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様による方法によって得ることができるビールに関する。
本発明の第三の態様は、ビールの風味向上のためのピキア属種の使用に関する。
本発明の第四の態様は、ビール醸造のためのピキア属種の使用に関する。

図１は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のアセトアルデヒド濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のアセトアルデヒド濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図３は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図４は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図５は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸イソブチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図６は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸イソブチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図７は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸イソアミル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図８は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸イソアミル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図９は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸ヘキシル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１０は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酢酸ヘキシル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１１は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のプロピオン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１２は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のプロピオン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１３は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酪酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１４は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の酪酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１５は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の吉草酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１６は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中の吉草酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１７は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のヘキサン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１８は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のヘキサン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図１９は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のオクタン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２０は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のオクタン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２１は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のデカン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２２は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のデカン酸エチル濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２３は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のイソブタノール濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２４は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のイソブタノール濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２５は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２０℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のイソアミルアルコール濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２６は、５日目（ｄ５）及び１３日目（ｄ１３）に採取した、２２℃での連続発酵と対照発酵による発酵産物中のイソアミルアルコール濃度を示す。ｃｏｎ＝対照発酵とｓｅｑ＝連続発酵。図２７は、完成されたビール中のアセトアルデヒド濃度を示す。図２８は、完成されたビール中の酢酸エチル濃度を示す。図２９は、完成されたビール中の酢酸イソアミル濃度を示す。図３０は、完成されたビール中のプロピオン酸エチル濃度を示す。図３１は、完成されたビール中の酪酸エチル濃度を示す。図３２は、完成されたビール中の吉草酸エチル濃度を示す。図３３は、完成されたビール中のヘキサン酸エチル濃度を示す。図３４は、完成されたビール中のオクタン酸エチル濃度を示す。図３５は、完成されたビール中のデカン酸エチル濃度を示す。図３６は、完成されたビール中のイソブタノール濃度を示す。図３７は、完成されたビール中のイソアミルアルコール濃度を示す。図３８は、ピキア属を用いて又は用いることなく調製したビール中のチオール３−メルカプトヘキサノールと酢酸３−メルカプトヘキシルの濃度を示す。

発明の詳細な説明
定義
「麦汁」という用語は、本明細書中では、当該技術分野における従来の意味を有し、ビール醸造の麦芽汁作製工程から抽出された甘い液体を指す。
「ビール」という用語は、本明細書中で使用される場合、少なくとも麦芽穀類（malted cereals）から調製されたもろみ（mashes）並びに非麦芽穀類から調製されたもろみ、そして、麦芽穀類と非麦芽穀類の混合物から調製されたもろみから調製されたビールを指す。「ビール」という用語はまた、添加物及びすべての予想されるアルコール度のビールによって調製されたビールも指す。

「減アルコールビール」という用語は、本明細書中では、１．２％〜４．２％アルコール含有量（ＡＢＶ）のアルコール度を有するビールを指す。
「低アルコールビール」という用語は、本明細書中では、０．５％〜１．２％ＡＢＶのアルコール度を有するビールを指す。
「ノンアルコールビール」という用語は、本明細書中では、０．５％ＡＢＶ未満のアルコール度を有するビールを指す。
「ホップ添加麦汁」という用語は、本明細書中では、麦汁の沸騰前又は沸騰後にホップが加えられた麦汁を指す。

「遺伝子組み換え生物」という用語は、本明細書中では、１９９６年にオーガニック貿易協会（Organic Trade Association）によって規定された意味を有し、自然界の条件又は過程の下では不可能な手段によって生物体の分子生物学又は細胞生理学を変更する技術を用いて作製された酵母などの微生物などの生物体を指す。「非遺伝子組み換え」という用語は、本明細書中では、異種遺伝子を含まない微生物を指す。

本文脈において、用語「突然変異体」は、例えば遺伝子工学、放射線及び／又は化学剤処理を用いた本発明の株由来の株として理解されるべきである。突然変異体は、機能的に同等の突然変異体、例えば、母株と実質的に同一の、又は（例えば、望ましいビール風味化合物の向上に関する）改善された特性を有する突然変異体である。そのような突然変異体は、本発明の一部である。特に、用語「突然変異体」は、例えばエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ＵＶライトのような化学的変異原との処理を含む、任意の従来使用される変異誘発処理に本発明の株をかけることによって得られる株、又は自然発生突然変異体を指す。変異体は、いくつかの突然変異誘発処理にかけられてもよかったが（１つの処理とはスクリーニング／選択工程がそのあとに続く１つの突然変異誘発工程と理解されるであろう）、しかし、現在では、２０未満、１０未満、又は５未満の処理（又はスクリーニング／選択工程）しか実施しないことが好ましい。現在の好ましい変異体では、母株と比較して、酵母ゲノムのヌクレオチドの５％未満、１％未満又はたった０．１％未満しか別のヌクレオチドに交換されていないか、又は欠失していない。

本文脈において、用語「バリアント」は、例えば、実質的に同一の、又は（例えば、望ましいビール風味化合物の向上に関する）改善された特性を有する、本発明の株と機能的に同等の株として理解されるべきである。適当なスクリーニングを使用することで同定されうるそのようなバリアントは、本発明の一部である。

用語「一つの（a）」及び「一つの（an）」及び「その（the）」の使用並びに本発明に記載する本文脈における（特に、以下の請求項の構成において）同様の指示語は、本明細書において他に示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形又は複数形の両方をカバーすると解釈される。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含む（containing）」は、他に注意がない限り、非制限用語（すなわち、「これだけに限定されるものではないが、含む」（including, but not limited to）」を意味）として解釈される。本明細書中の数値範囲の記載は、本明細書において他に示されない限り、その範囲内にある各々別個の値を個々に示す簡略化した方法として有用であることを単に意図し、各々別個の値は、それが個々に本明細書に記載されたように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書において他に示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適当な順序で行われ得る。本明細書において提供される任意の、及び全ての例、又は例示のための用語（例えば、「など（such as）」）は、本発明をよりよく示すことを単に意図されたものであって、他に記載されない限り、本発明の範囲において限定を課すものではない。本明細書における如何なる用語も、本発明の実施において不可欠である、請求項に記載されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本発明の実施と態様
ビールの醸造工程は、当業者にとって周知であり、以下のように概説できる：モルトは、乾燥させた、発芽穀物粒（主にオオムギ又はコムギ）から調製され、非麦芽添加物を含み得るグリストへと粉砕される。グリストは、マッシュされて（水と混ぜられて、浸される）、麦芽中の酵素でデンプンを糖に変換させる。穀物粒子と添加物は、ロータリングと呼ばれる工程において液体麦汁と分離される。モルトの作製とマッシュする工程は、麦芽抽出物に水を加えることによって省略することができる。ホップ及び／又は例えば、ハーブや糖などの他の材料の添加後に、麦汁を沸騰させ（ホップは沸騰後に加えられてもよい）、冷やされ、そして、空気にさらされる。次に、麦汁は、発酵タンクに移され、醸造酵母の添加によって発酵する。典型的に５〜１０日間続く一次発酵には、更なる醸造酵母を使用する二次発酵工程がその後に続き得る。発酵後に、新鮮なビール又は「グリーン」ビールが調整され、任意に濾過及び炭酸ガス添加される。

ホップは、苦味とモルトの甘味とのバランスをとるためにモルトに加えられ、望ましい風味と香りをビールに与える。これだけに限定されるものではないが、以下の品種を含めたいくつかの品種が存在する：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ及びＴｒａｄｉｔｉｏｎ。これだけに限定されるものではないが、以下の品種を含めた更なる品種が存在する：Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅ。

本発明の発明者らは、様々なホップ品種の麦汁への添加に組み合わせられると、特定のピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株が、ビール醸造の発酵工程で有用な有利な特性を有することを思いがけなく発見した。特に、サッカロミセス属（Saccharomyces）及びブレタノミセス属（Brettanomyces）の酵母を含めたビール醸造に慣習的に使用されている酵母株を用いたホップ添加麦汁の発酵に連続して、ホップ添加麦汁をピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株を用いて発酵するとき、ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株は、ホップからの望ましい風味を向上させる。

以下の実施例に概説した発酵全体の完全な風味分析から、計測したほとんどすべての化合物が、対照発酵と比較して連続発酵において高濃度で存在していることが明らかだった。発酵開始時におけるピキア属菌種（Pichia spp.）の添加が連続発酵と対照発酵との唯一の相違点であったので、これは、ピキア属菌種（Pichia spp.）株が最終的なビールの風味プロフィールに対して多大な効果を有することを意味する。酢酸イソアミル及び酢酸イソブチル、並びにプロピオン酸エチル及び吉草酸エチルなどのすべての望ましい風味化合物に大きな増大が見られたので、これは、醸造業におけるピキア属菌種（Pichia spp.）の使用の大きな可能性を示している。特に、低アルコールビール、減アルコールビール、及びノンアルコールビールに関しては、果実風味の向上は、通常存在している麦汁風味をマスクできる。これは新興成長市場であるので、これらのビール発酵におけるピキア属菌種（Pichia spp.）の使用に関して大きな可能性が得られる。

本発明のビール醸造方法は、以下の：
ａ）麦汁を供する工程、
ｂ）少なくとも１つのホップ品種を加えて、ホップ添加麦汁を得る工程、
ｃ）ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株である第一の酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させる工程、及び
ｄ）サッカロミセス属（Saccharomyces）種とブレタノミセス属（Brettanomyces）種から成る群に属する第二の酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させて、ビールを得る工程、
を含む。

この方法によって、当業者は、実施例に示されているように、様々な品種のホップを加えることによって、風味化合物を高め、ビールの風味プロフィールを最適化できる。
本発明の１つの好ましい実施形態において、工程ｃ）と工程ｄ）は連続して実施される、すなわち、ホップ添加麦汁には最初に、発酵に好適な条件下でピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株が植菌され、それに続いてホップ添加麦汁には、発酵に好適な条件下で第二の酵母株が植菌される。

より好ましい実施形態において、工程ｃ）における発酵は、工程ｄ）における第二の酵母株の植菌の前に、少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間、例えば少なくとも３６時間、例えば少なくとも４８時間、例えば少なくとも６０時間、例えば少なくとも７２時間継続される。最も好ましい実施形態において、工程ｃ）における発酵は、少なくとも３６時間継続される。

ビールの様々な風味プロフィールが、様々な品種のホップを使用することによって達成されることは、本発明の一部である。少なくとも１品種のホップが、以下の品種から成る一覧から選択され得るが、更なる品種のホップの使用もまた、本発明の一部である：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ及びＴｒａｄｉｔｉｏｎ。好ましい実施形態において、少なくとも１つのホップ品種は、Ｓａａｚ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、Ｃａｓｃａｄｅ及びＡｍａｒｉｌｌｏから成る群から選択される。
少なくとも１品種のホップはまた、以下の品種から成る一覧から選択される：Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅ。

本発明の別の好ましい実施形態において、工程ｃ）における発酵は、約１２℃〜約２８℃の温度にて実施される。より好ましい実施形態において、工程ｃ）の発酵温度は、約２０℃〜約２２℃である。最も好ましくは、工程ｃ）の発酵温度は、約２０℃である。
好ましくは、ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株は、第二の酵母株による発酵中、発酵培養物中に残されている。しかしながら、ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株はまた、第二の酵母株の植菌前に、当業者に知られている技術によって取り除かれてもよい。

本発明の別の実施形態において、工程ｃ）と工程ｄ）は、工程ｃ）の第一の酵母株と工程ｄ）の第二の酵母株の同時植菌によって同時に実施される。
好ましい実施形態において、工程ｄ）における第二の発酵工程は、少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間ほど、少なくとも４８時間ほど、少なくとも７２時間ほど、少なくとも９６時間ほど、少なくとも１２０時間ほど継続される。
本発明の好ましい実施形態において、ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株は、非遺伝子組み換え酵母株である。
本発明の別の好ましい実施形態において、ピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株は、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）酵母株である。

好ましくは、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）酵母株は、University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, New Zealandによって、National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Australiaにて２００６年８月２４日に寄託され、それぞれ受入番号Ｖ０６／０２２７１１及びＶ０６／０２２７１２が与えられた、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１及びＰＫ−ＫＲ２株、並びにその変異体及びバリアントから成る群から選択される。その菌株は、国際特許出願ＷＯ２００９／１１０８０７に記載されている。

本発明のさらに別の好ましい実施形態において、第二の酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、及びブレタノミセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）から成る群から選択される。好ましくは、第二の酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母株である。
本発明の好ましい実施形態において、ビールは、低アルコールビール、減アルコールビール又はノンアルコールビールである。

別の好ましい実施形態において、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、吉草酸エチル、オクタン酸エチル、及びデカン酸エチルから成る群から選択される少なくとも１つの風味化合物の含有量を、少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％ほど、例えば少なくとも１５０％ほど、例えば少なくとも２００％ほど、例えば少なくとも２５０％ほど、例えば少なくとも３００％ほど高める。

好ましくは、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、及び吉草酸エチルから成る群から選択される少なくとも１つの風味化合物の含有量を、少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％ほど、例えば少なくとも１５０％ほど、例えば少なくとも２００％ほど、例えば少なくとも２５０％ほど、例えば少なくとも３００％ほど高める。

本発明のさらに別の好ましい実施形態において、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母の使用は、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、吉草酸エチル、オクタン酸エチル、及びデカン酸エチルから成る群から選択される少なくとも２種類以上の風味化合物の含有量を、少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％ほど、例えば少なくとも１５０％ほど、例えば少なくとも２００％ほど、例えば少なくとも２５０％ほど、例えば少なくとも３００％ほど高める。

好ましくは、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、及び吉草酸エチルから成る群から選択される少なくとも２種類以上の風味化合物の含有量を、少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％ほど、例えば少なくとも１５０％ほど、例えば少なくとも２００％ほど、例えば少なくとも２５０％ほど、例えば少なくとも３００％ほど高める。

別のとても好ましい実施形態において、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、チオールである酢酸３−メルカプトヘキシルの含有量を、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％ほど、例えば少なくとも３０％ほど、例えば少なくとも４０％ほど、例えば少なくとも５０％ほど高める。

「少なくとも１種類の風味化合物の含有量を高める」及び「チオールである酢酸３−メルカプトヘキシルの含有量を高める」という用語は、以下で議論するように、ピキア属菌種（Pichia spp.）を使用することの特有の特性と見なされ得る。
本発明の好ましい実施形態において、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種がＳａａｚであり、且つ、工程ｃ）における発酵が約２０℃の温度にて実施されるとき、少なくとも１つのホップ品種がＣａｓｃａｄｅ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ又はＡｍａｒｉｌｌｏであるときに比べて、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、デカン酸エチルのレベルを少なくとも５０％高める。

本発明の別の好ましい実施形態において、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種がＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎであり、且つ、工程ｃ）における発酵が約２０℃の温度にて実施されるとき、少なくとも１つのホップ品種がＣａｓｃａｄｅ又はＡｍａｒｉｌｌｏであるときに比べて、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、デカン酸エチルのレベルを少なくとも５０％高める。

本発明の更なる実施形態において、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種がＣａｓｃａｄｅ又はＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎであり、且つ、工程ｃ）における発酵が約２０℃の温度にて実施されるとき、少なくとも１つのホップ品種がＡｍａｒｉｌｌｏ及びＳａａｚであるときに比べて、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、吉草酸エチルのレベルを少なくとも５０％高める。
よりさらなる実施形態において、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種がＣａｓｃａｄｅであり、且つ、工程ｃ）における発酵が約２０℃の温度にて実施されるとき、少なくとも１つのホップ品種がＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、Ａｍａｒｉｌｌｏ又はＳａａｚであるときに比べて、工程ｃ）におけるピキア属酵母株の使用は、ヘキサン酸エチル及びオクタン酸エチルのレベルを少なくとも５０％高める。

本発明のさらに他の態様において、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種が以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ及びＴｒａｄｉｔｉｏｎから成る群から選択される品種のいずれかである場合に、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、工程ｂ）におけるホップ品種が以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ及びＴｒａｄｉｔｉｏｎから成る群から選択されるその他の品種であるときに工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用の結果としてもたらす風味プロフィールと異なった、様々な風味化合物、つまり、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、及び吉草酸エチルのレベルから成る風味プロフィールをもたらす。

本発明さらなる実施形態において、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種が以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ、Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅから成る群から選択される品種のいずれかである場合に、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用は、工程ｂ）におけるホップ品種が以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ、Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅから成る群から選択されるその他の品種であるときに、工程ｃ）におけるピキア属菌種（Pichia spp.）酵母株の使用の結果として生じる風味プロフィールと異なった、様々な風味化合物、つまり、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、及び吉草酸エチルのレベルから成る風味プロフィールをもたらす。

第二の態様において、本発明は、第一の態様の方法によって得ることができるビールに関する。
本発明によるビールは、検出可能な量のピキア属菌種（Pichia spp.）酵母を含んでいてもよい。あるいは、場合によっては、酵母は発酵後にビールから取り除かれる。しかしながら、実施例で本明細書中に示したように、ピキア属菌種（Pichia spp.）の使用は、従来技術とは異なった風味プロフィールをビールに与えるので、これにより、ピキア属菌種（Pichia spp.）と様々なホップ品種を使用して調製されたビールはそれ自体が新規になる。

ピキア属菌種（Pichia spp.）を用いて醸造されたビールは、様々なホップ品種が使用されると、様々な風味プロフィールを含む。例として、デカン酸エチルのレベルは、２０℃にて実施される発酵において、Ｓａａｚホップが使用されるとき、Ｃａｓｃａｄｅ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ又はＡｍａｒｉｌｌｏが使用されるときと比較して、少なくとも５０％超増強され、そして、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎが使用されるとき、Ｃａｓｃａｄｅ又はＡｍａｒｉｌｌｏが使用されるときと比較して、少なくとも５０％増強される（図２１を参照のこと）。吉草酸エチル濃度は、２０℃にて実施される発酵において、Ｃａｓｃａｄｅ又はＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎホップが使用されるとき、Ａｍａｒｉｌｌｏ又はＳａａｚが使用されるときと比較して、少なくとも５０％増強される（図１５を参照のこと）。ヘキサン酸エチル及びオクタン酸エチル濃度は、２０℃にて実施される発酵において、Ｃａｓｃａｄｅホップが使用されるとき、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、Ａｍａｒｉｌｌｏ又はＳａａｚホップが使用されるときと比較して、少なくとも１５％増強される（図１７及び１９を参照のこと）。

ピキア属菌種（Pichia spp.）を使用して醸造されたビールが、ＷＯ２００９／１１０８０７においてワインについて記載されたものなどの検出可能な量のチオール（特に酢酸３−メルカプトヘキシル（３ＭＨＡ）及び３−メルカプトヘキサン−１−オール（３ＭＨ））を含むこともまた、企図される。

実施例１
材料と方法
発酵の構築
実験室レベル発酵試験を５００ｍｌの麦汁を用いて実施した。コムギ麦芽エキス（Brewferm）を用いて麦汁を調製した。麦芽エキスを、１０°Ｐの初期糖度に達するように水と混合した。４種類の様々なホップ品種：ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ｓａａｚ、及びＣａｓｃａｄｅ、ごとに４回３リットルの麦汁を沸騰させた。ホップペレットを、密閉したコーヒーフイルターの状態で麦汁に加え、そして、これを３０分間沸騰させて、ホップの風味を抽出し、ビールに苦味を加えた。ホップペレットを、２３ＥＢＵに達するように加えた。沸騰させた後に、麦汁からコーヒーフイルターを取り出し、そして、麦汁を１Ｌ容のボトルに移し、そしてそれをウォーターロックによって閉じた。

ホップ品種ごとに、４つの発酵を実施した。２つの発酵温度：２０℃と２２℃、を使用した。発酵温度ごとに、２つの別々の植菌をおこなった：第一の瓶にはピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１（連続植菌用）を植菌し、そして、第二のボトルには、供給業者の推薦に従って市販のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）コムギ酵母株、ＳａｆｂｒｅｗＷＢ−０６（Lesaffre）（対照発酵）を植菌した。両酵母株を、１ｍｌあたり５００万細胞ずつ植菌した。表１には、発酵構築の概要を示す。

表１．発酵の構築

連続植菌のために、コムギ酵母株（ＳａｆｂｒｅｗＷＢ−０６）を、２日後にピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）を植菌した発酵に植菌して、発酵を完成させた。すべての発酵を１３日後に終了させた。５日目と１３日目にサンプルを採取した。
ヘッドスペースＧＣ−ＦＩＤ分析
炎イオン化検出（ＧＣ−ＦＩＤ）と組み合わせたヘッドスペースガスクロマトグラフィーを、発酵産物中のアセトアルデヒド、酢酸エステル、エチルエステル、及び高級アルコールの計測に使用した。発酵サンプルを遠心分離し、その後、２ｍｌをバイアル内に回収した。次に、サンプルを、ヘッドスペースサンプラーを備えた較正済みPerkin Elmer GC Systemで分析した。ＧＣは、ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲカラム（長さ、３０ｍ；内径、０．２５ｍｍ；層の厚さ、０．５μｍ；Agilent Technologies, Germany）を備えていた。分割／非分割インジェクターを使用し、且つ、１８０℃に維持した。サンプルを、注入前にヘッドスペース自動サンプラー内で７０℃にて３０分間加熱した（針温度：１１０℃）。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。６０℃にて開始した後、２分後にオーブン温度を４５℃／分にて６０℃から２３０℃まで上げ、それを最終的に２３０℃にて５分間維持した。ＧＣ−プログラム中、キャリアガス（Ｈｅ）の一定流速（１０ｍＬ／分）を維持した。ＦＩＤ温度はそれぞれ２２０℃にて一定に維持した。結果をＴｕｒｂｏｃｈｒｏｍソフトウェアで分析した。

エタノール分析
エタノールを、Boehringer MannheimのＥｔｈａｎｏｌＥｎｚｙｍａｔｉｃＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓキットで計測した。

結果
ビールの風味に対する様々なホップ品種と組み合わせた連続植菌の効果を調査するために、実験室レベル発酵を、様々なホップ品種を含み、且つ、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）を植菌したコムギ麦汁で２日間実施し、その後、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）コムギビール酵母を加えた。対照として、Ｓ．セレビシエコムギビール酵母だけを用いた発酵を実施した。連続発酵と対照発酵の両方を１３日後に終了した。サンプルを、５日目と１３日目に採取し、それに続いて、風味化合物とエタノール濃度について分析した。
すべての発酵産物の風味分析を、材料と方法に記載したヘッドスペースＧＣ−ＦＩＤで実施した。結果を、図１及び２（アルデヒド）、図３〜１０（酢酸エステル）、図１１〜１６（短鎖エチルエステル）、図１７〜２２（中鎖エチルエステル）、並びに図２３〜２６（高級アルコール）に示している。
エタノール濃度を、キットで評価した（材料と方法を参照のこと）。エタノール濃度の結果を、表２に示している。

表２．２０℃と２２℃における連続発酵と対照発酵の１３日目の発酵産物のエタノール濃度

結論
様々なホップ品種を用いた５００ｍｌの小規模のコムギビール発酵における、第一の酵母としてのピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、そして、第二の酵母株としてのサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ビール酵母の連続植菌は、Ｓ．セレビシエビール酵母だけを用いた「通常の」対照ビール発酵と比較して、ホップ品種ごとに顕著な風味の相違を示した。ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）とサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の連続植菌がビール発酵において風味向上効果を有することが示されたのは、これが最初である。そのうえ、風味プロフィールの相違は、様々なホップ品種を使用することで、計測したすべての風味化合物に見られた。

アセトアルデヒド濃度は、対照発酵と比較して、連続植菌において常に高かった（図１〜２を参照のこと）。しかしながら、発酵の終了時点では、連続発酵と対照発酵の両方で同様の値を得ている。醸造者はビール中での高濃度すぎるこの化合物を望んでいないので、連続植菌の影響は無視できる。

最も大きな風味の相違はエステルに関して見られた。我々が酢酸エステル濃度、特に望ましい果実風味化合物である酢酸イソアミルの濃度を詳しく調べると、それは、対照と比較して、連続植菌において、非常に増強された。２０℃における発酵は、２２℃における発酵に比べて、より有益であるように思えた。Ａｍａｒｉｌｌｏホップの添加を伴った発酵において、濃度が最も高かった。酢酸イソブチル濃度もまた、連続発酵において大きく増強された。この場合もやはり、２０℃における発酵が、２２℃における発酵に比べて、この化合物の製造により好ましかった。高濃度だと不利益な化合物であるが、他の酢酸エステルで容易にマスクできる酢酸エチルもまた、対照と比較して、たった２倍の量だが連続発酵において増強された。Ｃａｓｃａｄｅホップを用いた発酵では、すべての発酵から酢酸エチルをあまり生じなかった。酢酸ヘキシルは、対照発酵と比較して、すべての連続発酵においてほんの少しだけ増強された。

プロピオン酸エチル及び吉草酸エチルは対照発酵においてほぼ完全に産生されないので、短鎖エチルエステルが最も衝撃的な結果をもたらした。しかしながら、高濃度は連続発酵において達成された（最大１ｐｐｍ）。酪酸エチルに関しては、連続発酵のためのＳａａｚ及びＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎホップの添加でしか効果が見られなかった。
ヘキサン酸エチル及びオクタン酸エチルの濃度は、Ｃａｓｃａｄｅホップの添加を伴う連続発酵においてのみ上昇した。しかしながら、デカン酸エチルに関して、Ｓａａｚ及びＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎホップの添加を伴う連続発酵において、濃度が非常に高かった。対照発酵と連続発酵の相違は１０倍超であった。
高級アルコールは、対照発酵と比較して、連続発酵において濃度が有意に上昇しなかった唯一の化合物である。

実施例２
特に風味に関して、醸造業向けにピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）を使用する可能性を調査するために、大規模な醸造試験を醸造所にて実施した。
材料と方法
発酵方法
対照ビール及びピキア属によるビールを、醸造所において１５ＨＬの規模で作った。麦汁は、ペールエールビールに典型的なモルト品種から成り、使用したホップ品種はＣａｓｃａｄｅであった。１５ｈｌの麦汁を、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１を植菌するのに使用した。植菌率は、１ｍｌあたり１００〜２００万細胞と算出された。毎日、細胞数の計測のためにサンプルを採取し、そして、風味分析を最終的なビールに対しておこなった（表３を参照のこと）。

表３．発酵の最初の３日間の間のピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１の細胞数

３日目に、通常のビール酵母を加えた（White Labs製のＬｏｎｄｏｎＡｌｅ酵母）。その酵母は、あるビールを作るのに既に使用されているので、そのため、この醸造酒（第二世代）にとって最適なはずである。醸造酒の中に空気を吹き込むのと同時に、酵母を加えた。そのため、ビール酵母を加えると同時に、醸造酒の香りに見当をつけることが可能であった。香りは（バナナ、パイナップルのように）非常にフルーティーであった。糖が酵母によって完全に同化されるまで、発酵を実施した。その後、グリーンビールを、少なくとも１週間、７〜８℃にて熟成させた。８日目に、発酵を終了し、そして、発酵温度を８℃に下げた。発酵後、まだ発酵槽内に存在している酵母によりビールを７日間熟成させた。１５日目に、酵母は取り除き、そして、温度を２℃まで下げた。更に３週間後に、ビールを濾過し、低温殺菌し、そして、ボトルに詰めた。

風味分析
炎イオン化検出（ＧＣ−ＦＩＤ）と組み合わせたヘッドスペースガスクロマトグラフィーを、発酵産物中のアセトアルデヒド、酢酸エステル、エチルエステル、及び高級アルコールの計測に使用した。発酵サンプルを遠心分離し、その後、２ｍｌをバイアル内に回収した。次に、サンプルを、ヘッドスペースサンプラーを備えた較正済みPerkin Elmer GC Systemで分析した。ＧＣは、ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲカラム（長さ、３０ｍ；内径、０．２５ｍｍ；層の厚さ、０．５μｍ；Agilent Technologies, Germany）を備えていた。分割／非分割インジェクターを使用し、且つ、１８０℃に維持した。サンプルを、注入前にヘッドスペース自動サンプラー内で７０℃にて３０分間加熱した（針温度：１１０℃）。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。６０℃にて開始した後、２分後にオーブン温度を４５℃／分にて６０℃から２３０℃まで上げ、それを最終的に２３０℃にて５分間維持した。ＧＣ−プログラム中、キャリアガス（Ｈｅ）の一定流速（１０ｍＬ／分）を維持した。ＦＩＤ温度はそれぞれ２２０℃にて一定に維持した。結果をＴｕｒｂｏｃｈｒｏｍソフトウェアで分析した。

チオール分析
チオール分析は、Hill Laboratories、Hamilton, New Zealandによって実施された。２種類の化合物：３−メルカプトヘキサン−１−オール（ルバーブ、エキゾチックな果物）及び酢酸３−メルカプトヘキシル（パッションフルーツ）、を計測した。

結果
完成製品の風味分析を、３つのサンプル：１）対照ビール＝Jubilaum、２）濾過ビール、及び３）非濾過ビール、に対しておこなった（図２７〜３８を参照のこと）。風味分析は、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）を用いて発酵させたビールが、高濃度の風味化合物を含んでいることをはっきりと示している。特に、エステルである酢酸イソアミル（図２９）、プロピオン酸エチル（図３０）、吉草酸エチル（図３２）、オクタン酸エチル（図３４）及びデカン酸エチル（図３５）は大量に増加している。これらのエステルは、ビールのフルーティーな風味に関与し、そのため、大いに重要である。これらの結果はまた、実験室規模からの規模の大きな増大である、大規模な生産規模（１５ＨＬ）におけるビール製造でもビールのフルーティーさの向上を確認したことも示している。それは、醸造所が生産規模の醸造においてピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）を使用でき、且つ、ビールに対する酵母の効果が確なままであることを意味している。

対照ビール及びピキア属を用いたビールはまた、チオール風味化合物についても分析した。２種類の化合物：３−メルカプトヘキサノール（ルバーブ、エキゾチックな果物）及び酢酸３−メルカプトヘキシル（パッションフルーツ）、を計測した（図３８を参照のこと）。ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）がビールの３−メルカプトヘキサノールを酢酸３−メルカプトヘキシルに変換できること、そして、これがかなりの程度のものであることを記録したのは、これが最初である。図３８から分かるように、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）は、酢酸３−メルカプトヘキシルを産生するのに３−メルカプトヘキサン−１−オールを使用し、そして、サッカロミセスビール酵母のみを使用したとき（対照ビール）に比べて、これがより大きな程度のものである。

寄託物
ＷＯ２００９／１１０８０７に記載のとおり、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１及びＰＫ−ＫＲ２株を、University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, New Zealandによって、National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Australiaにて２００６年８月２４日に寄託され、それぞれ受入番号Ｖ０６／０２２７１１及びＶ０６／０２２７１２が与えられた。

参考文献

Claims

ａ）麦汁を供する工程、
ｂ）少なくとも１つのホップ品種を加えて、ホップ添加（hopped）麦汁を得る工程、
ｃ）ピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株である第一の酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させる工程、及び
ｄ）サッカロミセス属（Saccharomyces）又はブレタノミセス属（Brettanomyces）に属する第二の酵母株によりホップ添加麦汁を発酵させて、ビールを得る工程、
を含み、当該ピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri）が、University of Auckland, School of Biological Sciences、Auckland 1142, New Zealandによって、National Measurement Institute、541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Australiaにて２００６年８月２４日に寄託され、それぞれ受入番号Ｖ０６／０２２７１１及びＶ０６／０２２７１２であるピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１及びピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ２から成る群から選択される、ビール醸造方法。
前記工程ｃ）と工程ｄ）とが連続して実施される、請求項１に記載の方法。
前記工程ｃ）における発酵が、工程ｄ）における発酵の開始前に、少なくとも１２時間継続される、請求項２に記載の方法。
前記工程ｃ）と工程ｄ）とが、工程ｃ）の第一の酵母株と工程ｄ）の第二の酵母株の同時植菌によって同時に実施される、請求項１に記載の方法。
前記工程ｄ）が、少なくとも２４時間継続される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つのホップ品種が、Ｓａａｚ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、Ｃａｓｃａｄｅ及びＡｍａｒｉｌｌｏから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記工程ｃ）における発酵が、約１２℃〜２８℃にて実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記工程ｃ）における発酵が、約２０℃〜２２℃にて実施される、請求項７に記載の方法。
前記第二の酵母株が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、及びブレタノミセス・ブルクセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ビールが、低アルコールビール、減アルコールビール又はノンアルコールビールである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記工程ｃ）におけるピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株の使用が、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、吉草酸エチル、オクタン酸エチル、及びデカン酸エチルから成る群から選択される少なくとも１つの風味化合物の含有量を少なくとも５０％増大させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記工程ｃ）におけるピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株の使用が、チオールである酢酸３−メルカプトヘキシルの含有量を少なくとも１０％増大する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、工程ｂ）における少なくとも１つのホップ品種が、以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ、Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅ、から成る群から選択されるいずれかの品種である場合の、工程ｃ）におけるピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株の使用が、工程ｂ）におけるホップ品種が以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ、Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅ、から成る群から選択される任意の他の品種である場合の、工程ｃ）におけるピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株の使用に由来する風味化合物である、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、及び吉草酸エチルのレベルに関する風味プロフィールとは異なる風味プロフィールを生じる、方法。
ビールにおいて、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、吉草酸エチル、オクタン酸エチル、デカン酸エチル及びチオールである酢酸３−メルカプトヘキシルから成る群から選択される少なくとも１つの風味化合物の含有量を増加させるためのピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）酵母株の使用であって、当該ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）株が、University of Auckland, School of Biological Sciences、Auckland 1142, New Zealandによって、National Measurement Institute、541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Australiaにて２００６年８月２４日に寄託され、それぞれ受入番号Ｖ０６／０２２７１１及びＶ０６／０２２７１２であるピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ１及びピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＰＫ−ＫＲ２から成る群から選択される、使用。
少なくとも１つのホップ品種が、ビール醸造中に添加される、請求項１４に記載の使用。
前記少なくとも１つのホップ品種が、Ｓａａｚ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、Ｃａｓｃａｄｅ及びＡｍａｒｉｌｌｏから成る群から選択される、請求項１５に記載の使用。
前記ビールが、低アルコールビール、減アルコールビール又はノンアルコールビールである、請求項１４又は１５に記載の使用。
前記ピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株が、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチル、吉草酸エチル、オクタン酸エチル、及びデカン酸エチルから成る群から選択される少なくとも１つの風味化合物の含有量を少なくとも５０％増大させる、請求項１４又は１５に記載の使用。
前記ピキア・クルイベリ菌種（Pichia kluyveri spp.）酵母株が、チオールである酢酸３−メルカプトヘキシルの含有量を少なくとも１０％増大させる、請求項１４又は１５に記載の使用。
前記少なくとも１つのホップ品種が、以下の：Ａｈｔａｎｕｍ、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、ＭｏｕｎｔＨｏｏｄ、ＭｏｕｎｔＲａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＧｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、ＦｉｒｓｔＧｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、ＷｈｉｔｂｒｅａｄＧｏｌｄｉｎｇＶａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ−ＣｏｅｕｒＦｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、ＧｒｅｅｎＢｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、ＮｅｌｓｏｎＳａｕｖｉｎ、ＰａｃｉｆｉｃＧｅｍ、ＰａｃｉｆｉｃＪａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、ＰｒｉｄｅｏｆＲｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＣｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、ＰｏｌｎｉｓｃｈｅｒＬｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、ＳｔｙｒｉａｎＧｏｌｄｉｎｇｓ、ＴａｒｄｉｆｄｅＢｏｕｒｇｏｇｎｅ、Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、ＥｌＤｏｒａｄｏ、ＳａｎＪｕａｎＲｕｂｙＲｅｄ、Ｓａｔｕｓ、ＳｏｎｎｅｔＧｏｌｄｉｎｇ、ＳｕｐｅｒＧａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、ＢｒａｍｌｉｎｇＣｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ．ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＨｅｒｋｕｌｅｓ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＭａｇｎｕｍ、ＨａｌｌｅｒｔａｕｅｒＴａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、ＨａｌｌｅｒａｔａｕＡｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、ＳｕｍｍｅｒＳａａｚ、ＳｕｐｅｒＡｌｐｈａ、ＳｕｐｅｒＰｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ−ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＡｔｌａｓ、ＳｔｙｒｉａｎＡｕｒｏｒａ、ＳｔｙｒｉａｎＢｏｂｅｋ、ＳｔｙｒｉａｎＣｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ及びＳｏｒａｃｈｉＡｃｅから成る群から選択されるいずれかの品種である、請求項１５に記載の使用。