ES2324508B1

ES2324508B1 - Mejora del contenido aromatico de vinos y otras bebidas alcoholicas mediante la utilizacion de microorganismos que, durante la fermentacion, producen monoterpeno sintasas.

Info

Publication number: ES2324508B1
Application number: ES200603283A
Authority: ES
Inventors: Margarita Orejas Suarez; Oscar Herrero Madrid; Daniel Ramon Vidal
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2006-12-27
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2010-05-31
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: WO2008077986A1; ES2324508A1

Abstract

Mejora del contenido aromático de vinos y otras bebidas alcohólicas mediante la utilización de microorganismos que, durante la fermentación, producen monoterpeno sintasas.

La presente invención describe un nuevo procedimiento para elaborar bebidas alcohólicas con mayor y/o diferente contenido terpénico, mediante la utilización de microorganismos manipulados genéticamente para que expresen durante la fermentación genes que codifican monoterpeno sintasas (a veces llamadas monoterpeno ciclasas), lo que les capacita para producir de novo monoterpenos aromáticos a partir de cualquier material vegetal de partida. Los microorganismos son transformados con el gen Lis, que codifica una linalol sintasa, incrementándose la secreción de linalol, como ejemplo de una familia extensa de genes que codifican monoterpeno sintasas.

Aunque los microorganismos serán preferentemente levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, también sería aplicable a otros microorganismos de interés enológico tales como otras levaduras y ciertas bacterias. En particular, bebidas alcohólicas fermentadas tales como vinos, incluidos cava y champagne, cerveza, sidra, sake, etc. podrán tener un aroma más favorable o diferente.

Description

Sector de la técnica

Sector vitivinícola. Se trata de dar solución al problema de los vinos (y eventualmente otras bebidas alcohólicas obtenidas por fermentación) con bajo contenido terpénico.

Estado de la técnica

El aroma de los vinos es una de las características más importantes en la valoración de su calidad. Se puede dividir en tres grandes grupos: (i) los aromas procedentes de la variedad de la uva o aromas primarios, producidos por sustancias volátiles, transferidas por los granos de la uva al mosto, fundamentalmente monoterpenos, que se pierden en gran parte durante el proceso; (ii) los aromas producidos durante la fermentación o aromas secundarios, entre los que se incluyen dos tipos de compuestos aromáticos mayoritarios, alcoholes superiores y ésteres; y (iii) el "bouquet", también conocido como aroma terciario, producido por la transformación final de los anteriores durante el envejecimiento.

El papel que juegan los monoterpenos - grupo muy variado de compuestos volátiles de bajo peso molecular - en el aroma afrutado y floral está bien definido (Williams et al., 1980) y variaciones cualitativas y cuantitativas en los mismos son responsables de matices varietales característicos (Marais, 1983). Más recientemente se ha establecido que algunos monoterpenos pueden además ser considerados como nutracéuticos (Crowell, 1999; Wise y Croteau, 1999; Croteau et al., 2000), por lo que la presencia de éstos podría ocasionar no sólo mejoras en las características organolépticas de los vinos sino también en sus características funcionales.

Los monoterpenos más abundantes en algunas variedades de uvas, y que en gran medida contribuyen al carácter varietal de los vinos, son linalol, geraniol, nerol \alpha-terpineol y citronelol (Ribéreau-Gayon et al., 1975; Park et al., 1991). Éstos están presentes en dos fracciones distintas: una libre que contribuye al aroma, y otra ligada, formando diglicósidos no aromáticos, fundamentalmente 6-O-\alpha-L-arabinofuranosil-\beta-D-glucopiranósidos, 6-O-\alpha-L-arabinopiranosil-\beta-D-glucopiranósidos, 6-O-\alpha-L-ramnopiranosil-\beta-D-glucopiranósidos, 6-O-\beta-D-xilopiranosil-\beta-D-glucopiranósidos, 6-O-\alpha-L-apiofuranosil-\beta-D-glucopiranósidos y 6-O-\beta-D-glucopiranosil-\beta-D-glucopiranósidos, estando el aglicón siempre ligado a la \beta-D-glucopiranosa (revisado en Günata, 2003). Esta segunda fracción es cuantitativamente superior a la primera (Günata et al., 1985a; 1985b), y apenas sufre cambios durante el proceso de fermentación llevado a cabo por Saccharomyces cerevisiae; por tanto supone una fuente potencialmente aprovechable para incrementar el aroma de los vinos. Se ha demostrado que la hidrólisis enzimática de estos compuestos precursores ocurre en dos etapas, en la primera la unión entre azúcares se rompe por la acción de una exoglicosidasa: una arabinofuranosidasa, una ramnosidasa, una \beta-xilosidasa o una apiosidasa y posteriormente, mediante la acción de una \beta-glucosidasa se libera el aglicón (normalmente un monoterpeno o un alcohol superior en menor medida) con capacidad aromática (Günata et al., 1988; 1990). Más recientemente se ha mostrado que la acción única de una exoglucanasa, al actuar como una endoglicosidasa, es suficiente para la liberación del monoterpeno (Gil et al., 2005).

Hasta ahora el uso enzimas de maceración, que facilitan la liberación de los precursores glicosídicos, y de glicosidasas, que facilitan la liberación del aglicón, tanto adicionadas al vino como producidas por la propia levadura que lleva a cabo la fermentación (revisado por Günata, 2003; Manzanares y Orejas, 2005; Ramón et al., 2005; Schuller y Casal., 2005; Verstrepen et al., 2006; así como protegido por varias patentes: Günata et al., 1989; Ramón et al., 1994; Rosi y Paolo 1996; Fowler et al., 1999; Vilanova de la Torre et al., 2004) es una de las estrategias ya descritas para incrementar el aroma del vino. No obstante, con esta estrategia sólo sería posible aumentar los componentes aromáticos de aquellos vinos procedentes de variedades de uva que tienen un nivel elevado de terpenos glicosilados, por ejemplo Moscatel; sin embargo la mayor parte de las variedades que se usan en vinificación, por ejemplo Palomino, Xarel.lo, Bobal etc., tienen un perfil aromático más neutro debido a la escasez de terpenos tanto en forma libre como glicosilada (López-Tamames et al., 1997; Gil y Vallés 2001; Estévez et al., 2004).

En estos casos, una alternativa a la adición de enzimas o la utilización de levaduras recombinantes que expresan dichas actividades, sería que la propia levadura que lleva a cabo la fermentación fuese capaz de sintetizar de novo monoterpenos como consecuencia de su metabolismo. En este sentido, aunque S. cerevisae normalmente no produce monoterpenos de forma natural, en un intento de obtener levaduras que los produjeran, se aislaron (tras mutagénesis con luz UV de la cepa de laboratorio FL100) dos mutantes autotróficos para ergosterol, de genotipo complicado, bloqueados en la enzima farnesil difosfato sintetasa, codificada por ERG20, y que además llevan mutaciones adicionales en otros genes de la ruta (erg12-2 y/o erg9, codifican mevalonato kinasa y escualeno sintasa respectivamente) que les permitían reducir los niveles de geraniol para sobrevivir; el mutante VL134 era capaz de excretar farnesol (0.220 mg/L) y geraniol (0.450 mg/L), producidos desde sus formas fosforiladas posiblemente por fosfatasas inespecíficas (Chambon et al., 1990a; 1990b). La habilidad de producir terpenos fue introducida en la cepa vínica L116 (Fermivin) por cruzamientos, y los mutantes descendientes del cruce eran capaces de producir grandes cantidades de algunos terpenos, incluso superiores que la cepa parental (hasta 6 ppm). Sin embargo, la capacidad de consumir glucosa y producir etanol era menor en todos los descendientes aislados, lo que les hacía inviables para determinadas aplicaciones tecnológicas (Javelot et al., 1991). Al igual que en el caso anterior, este método ha sido protegido por varias patentes (Karst et al., 1989; 1992; 1994, y Watanabe et al., 2002 para su utilización en Sake).

Más recientemente, Carrau et al. (2005) han descrito que algunas cepas vínicas diferentes a L116 eran capaces de producir monoterpenos en mosto sintético; en concreto la cepa KU1 (Uruguay) producía \sim5 \mug/L de linalol (cantidad que roza el umbral de detección, que es 4-10 ppb) y cantidades no detectables de otros monoterpenos como, por ejemplo geraniol. Sin embargo, en el mismo estudio, en otras cepas vínicas utilizadas industrialmente, Montrachet 522 (Universidad de California, Davis), CIVC8130 (Francia) y dos cepas uruguayas, el linalol producido estaba por debajo del umbral de detección.

Por otro lado, en las plantas los monoterpenos están presentes en los aceites esenciales de flores y frutas y son producidos, de manera específica, por las monoterpeno sintasas, que utilizan como sustrato geranil difosfato (GPP) (Bohlmann et al., 1998). Este sustrato es un metabolito común en microorganismos y en organismos superiores, lo que abre la posibilidad de aplicar técnicas de ingeniería metabólica para proporcionar a un determinado microorganismo nuevos pasos en la ruta de isoprenoides, que incluyan los genes que le faltan para la fabricación de un determinado monoterpeno (Carter et al., 2003 y Reiling et al., 2004 en Escherichia coli; Oswald et al., 2006 en cepas de laboratorio de S. cerevisiae). En los últimos diez años, distintos laboratorios han empezado a caracterizar los genes y enzimas responsables de la producción de los componentes específicos del aroma y del sabor de flores, frutas y verduras. Así, entre los genes cuyos productos determinan el olor de las flores de la especie Clarkia breweri, se ha caracterizado el gen Lis (Dudareva et al., 1996; patentado por Pichersky, 1997) que codifica la enzima S-linalol sintasa (LIS) y que cataliza la producción del monoterpeno S-linalol, uno de los componentes importantes del aroma de los vinos, en una única reacción desde el GPP. Puesto que en levaduras el GPP es un intermediario de la síntesis de ergosterol, en la presente invención se ha dotado a la cepa vínica S. cerevisiae T_{73} (CECT 1894; Querol et al., 1992) con el gen Lis de C. breweri y se ha estudiado tanto su capacidad para producir linalol a lo largo de la vinificación como sus características fermentativas.

Recientemente, nuevos genes que codifican otras monoterpeno sintasas están siendo caracterizados. Estos genes y otros que se vayan descubriendo podrán también ser expresados en cepas adecuadas de levaduras vínicas, de manera similar al ejemplo que aquí se recoge. El gen GES, que en albahaca codifica la enzima geraniol sintasa (Iijima et al., 2004), el gen que en uva codifica \alpha-terpineol sintasa (Martin y Bohlmann, 2004) y el gen QH1 que en Artemisa codifica una 3R-linalol sintasa (Jia et al., 1999) son algunos ejemplos.

Probablemente S. cerevisiae es uno de los organismos vivos de los que se posee mayor conocimiento molecular. Desde hace casi treinta años es posible transformar genéticamente cepas de laboratorio de esta especie (Beggs 1978). A todo ello hay que sumar la disponibilidad de la secuencia nucleotídica completa del genoma de este organismo (Goffeau et al., 1997) y una plétora de técnicas moleculares que han permitido y permiten avanzar en su manipulación. En la actualidad se dispone de levaduras vínicas transgénicas (YMGs) que sirven para mejorar el propio proceso de vinificación (por ejemplo facilitando la filtrabilidad) y de YMGs que sirven para mejorar las características organolépticas y/o funcionales de los vinos (revisado por: Manzanares y Orejas, 2005; Ramón et al., 2005; Schuller y Casal., 2005; Verstrepen et al., 2006). Recientemente en Japón se ha aprobado la utilización de una levadura recombinante, que allí no necesita ser calificada como YMG, para la elaboración de Sake (Akada, 2002).

La invención que se propone consiste en la mejora del proceso de fermentación de bebidas alcohólicas, preferentemente vinos, por el uso de un microorganismo que, habiendo sido modificado para producir monoterpeno sintasas heterólogas, conduce a una mejora del contenido aromático de la bebida.

Descripción de la invención Descripción breve

El objeto de la presente invención lo constituye el uso de un microorganismo útil para la producción de bebidas alcohólicas elaboradas a partir de mostos o zumos de frutas, preferentemente vinos, extractos de cereales u otros productos alimenticios de origen vegetal, manipulado genéticamente, en adelante uso de la presente invención, que comprende secuencias de DNA que codifican enzimas con actividad monoterpeno sintasa que permiten la producción de monoterpenos durante la fermentación.

Un objeto particular de la presente invención es el uso de la invención donde la bebida alcohólica pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: vinos, (incluidos no espumosos, así como cava, champagne y otros espumosos), cerveza, sidra, sake, etc.

Una realización particular de la presente invención es el uso de la invención donde la bebida alcohólica es vino, preferentemente, vinos blancos, tintos o rosados a partir de mostos de uva de cualquier variedad.

Otro objeto de la presente invención es el uso de la invención donde las secuencias de DNA que codifican enzimas con actividad monoterpeno sintasa incluyen cualquier gen que codifique enzimas que catalicen la formación de monoterpenos: linalol sintasa, geraniol sintasa, \alpha-terpineol sintasa, etc; así como cualquier secuencia de nucleótidos análoga a éstas que cifre enzimas con dicha actividad, de forma aislada o en sus posibles combinaciones.

Otra realización particular de la presente invención es el uso de la invención donde una secuencia de DNA que codifica una enzima con actividad monoterpeno sintasa incluye la secuencia del gen Lis de C. breweri (SEQ ID NO1), que codifica una linalol sintasa. O, conforme anteriormente se ha explicado, la proteína que codifica, la enzima con actividad S-linalol sintasa (SEQ ID NO2), así como cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aas) análoga a éstas.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de la invención en el cual el microorganismo es de interés en enología: levaduras o bacterias.

Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de la invención donde el microorganismo es una levadura vínica de la especie S. cerevisiae, preferentemente la cepa S. cerevisiae YR64 (pG1-Lis-URA) (CECT 12032), que comprende la secuencia de DNA del gen que en C. breweri codifica S-linalol sintasa (SEQ ID NO1).

Una última realización particular de la presente invención es el uso de la presente invención en la elaboración de bebidas alcohólicas conjuntamente con otros microorganismos, recombinantes o no, para producir distintas combinaciones de monoterpenos aromáticos durante la fermentación.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención se describe un método totalmente diferente a los antes citados (ver estado de la técnica) para mantener, aumentar y/o modificar el contenido terpénico de una bebida alcohólica y conseguir así que ésta tenga un aroma más favorable y/o diferente. El método de mejora propuesto, se centra en la fermentación de mostos, preferentemente de uva, para la producción de vinos; siendo un método extensible a la producción de otras bebidas alcohólicas obtenidas por fermentación a partir de distintas materias primas vegetales, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, por ejemplo: zumos de frutas, extractos de cereales, etc.

Dicho método se basa en la manipulación genética de levaduras vínicas para que sean capaces de producir monoterpeno sintasas heterólogas y como consecuencia produzcan y excreten de novo monoterpenos durante la fermentación alcohólica. La presente invención se basa en la observación de que la expresión de un gen, que en plantas codifica una S-linalol sintasa, en una levadura vínica (derivada de la cepa industrial S. cerevisiae T_{73}, Lallemand), que de manera natural aparentemente no produce linalol (ver figuras 2 y 5), induce la concomitante presencia de este monoterpeno aromático en los vinos producidos con dicha levadura recombinante. Más concretamente, se parte de la secuencia del cDNA del gen Lis de C. breweri, que codifica una S-linalol sintasa. Este gen se clona entre el promotor del gen TDH3 y el terminador del gen PGK1 de S. cerevisiae, en un vector de expresión de levaduras. La transformación de dicha cepa vínica con el vector anterior rinde la correspondiente levadura vínica de características mejoradas.

La mejora del proceso de vinificación que aquí se propone ha sido realizada en un mutante generado a partir de la levadura vínica S. cerevisiae T_{73} (el mutante T_{73}-4, auxótrofo de uracilo; Puig et al., 1998) y el gen Lis, que en C. breweri codifica la enzima S-linalol sintasa (Ejemplo 1). Se ha comprobado que la cepa vínica transformada es capaz, sin más manipulaciones de la ruta y sin el aporte de precursores, de producir y excretar linalol libre a lo largo de la vinificación. Mientras que los vinos resultantes de la fermentación de mostos Parellada con las cepas T_{73} y T_{73}-4 transformada con un plásmido control que no lleva el cassette de expresión del gen Lis - el llamado pGl-URA - no tienen cantidades detectables de linalol, aquellos fermentados con las levaduras que llevan el plásmido pG1-Lis-URA presentan cantidades de linalol relevantes desde el punto de vista sensorial, ya que sobrepasan el umbral de detección del mismo (Burdock, 2002) (Ejemplo 2). Por lo tanto, en la presente invención se ha demostrado que, a diferencia de lo que ocurre con otras estrategias ya descritas (ver estado de la técnica), (i) la expresión de cDNAs que codifican monoterpeno sintasas en levaduras vínicas es suficiente para la producción de novo de monoterpenos, independientemente de la materia prima; (ii) que es posible cambiar rutas metabólicas en cepas vínicas de Saccharomyces, en concreto la ruta de isoprenoides, para la producción de linalol y eventualmente otros monoterpenos; y (iii) que es posible conseguir una producción continuada de linalol en levaduras sin que esa concentración sea tóxica.

Además, se ha constatado que tanto la producción de alcohol como la tasa fermentativa de estas levaduras recombinantes son comparables a las de una levadura comercial, resultado de suma importancia de cara a su aplicabilidad, indicando que la expresión del gen Lis en la levadura vínica modificada no cambia sus características fermentativas (Ejemplo 3).

Hay que destacar que con las mencionadas levaduras modificadas genéticamente tampoco se tienen los problemas técnicos, antes mencionados, que surgen cuando se vinifica con levaduras portadoras de mutaciones en los genes ERG. En cuanto a su comparación con las levaduras que de forma natural producen monoterpenos, no todas las levaduras vínicas son capaces de producirlos en cantidades detectables, y además con esta invención se consiguen mejores rendimientos y se abre las puertas a la modificación dirigida de la composición de volátiles.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención lo constituye el uso de un microorganismo útil para la producción de bebidas alcohólicas elaboradas a partir de mostos o zumos de frutas, preferentemente vinos, extractos de cereales u otros productos alimenticios de origen vegetal, manipulado genéticamente, en adelante uso de la presente invención, que comprende secuencias de DNA que codifican enzimas con actividad monoterpeno sintasa que permiten la producción de monoterpenos durante la fermentación.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "monoterpeno sintasa" se refiere tanto a la secuencia de nucleótidos del gen en cuestión, como a la proteína que codifica, una enzima con actividad monoterpeno sintasa, así como a cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aas) análoga a éstas de otras especies. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir también cualquier secuencia de nucleótidos o aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de nucleótidos o aas contempladas en la presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucelótidos o aas, conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos o aas, la adición de uno o más nucleótidos o aas en cualquier parte de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos o aas en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad similar a la secuencia de la invención, es decir, sea capaz de sintetizar monoterpenos.

En general, una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de nucleótidos o aas. en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.

Secuencias de nucleótidos codificantes de enzimas con actividad monoterpeno sintasa se conocen hoy en día con tal detalle, que pueden obtenerse por un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook y Russel, 2001). Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar en un fragmento lineal de DNA integradas en el genoma, o bien integradas en un vector que permita la expresión de las mismas, en condiciones adecuadas, en distintos microorganismos de tal forma que a la vez que realizan la fermentación alcohólica y otras fermentaciones relacionadas puedan producir linalol u otros monoterpenos a partir de cualquier mosto, zumo, o vino, de partida.

Asimismo, al hablar de "secuencias de DNA que codifican enzimas con actividad monoterpeno sintasa" se incluyen también las secuencias ya conocidas, y al alcance de un experto medio en la materia, de los genes que codifican geraniol sintasa, \alpha-terpineol sintasa, 3R-linalol sintasa (Iijima et al., 2004; Martin y Bohlmann, 2004; Jia et al., 1999), etc.; así como otras secuencias de monoterpeno sintasas que puedan llegar a aislarse, caracterizarse, darse a conocer y ser utilizadas con el mismo objetivo que la presente invención. O, conforme anteriormente se ha explicado, las proteínas que codifican, así como cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aas) análogas a éstas de otras especies. Éstas y otras secuencias pueden conseguirse en bases de datos de dominio público y pueden obtenerse por un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica.

Puesto que cada monoterpeno tiene un aroma peculiar y diferente umbral sensorial, estas realizaciones también podrían tener un gran impacto en las propiedades sensoriales de los vinos, lo que rendiría "starters" con distintas habilidades en cuanto a la composición de terpenos. En este sentido, como alternativa a las fermentaciones con uno o distintos microorganismos, también cabe la posibilidad de co-transformar el microorganismo para el uso de la presente invención con varios de los genes anteriores.

En esta definición de microorganismo se incluyen también otros microorganismos, distintos a S. cerevisiae, que si bien no son responsables del propio proceso de vinificación, intervienen en determinadas circunstancias en dicho proceso (p.e. otras especies levaduriformes y también bacterias).

Tal como se utiliza en la presente invención el término levaduras se refiere a levaduras pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, al siguiente grupo: Saccharomyces, Hanseniaspora (Kloeckera), Candida, Pichia, Metschnikowia, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, etc.

Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de la invención donde el microorganismo es una levadura vínica de la especie S. cerevisiae, preferentemente a cepa S. cerevisiae YR64 (pG1-Lis-URA) (CECT 12032), que comprende la secuencia de DNA del gen que en C. breweri codifica S-linalol sintasa (SEQ ID NO1).

Tal como se utiliza en la presente invención el término bacterias se refiere, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a bacterias pertenecientes al siguiente grupo: Lactobacillus, Pediococcus, Oenococcus, etc.

Por otro lado, el microorganismo uso de la presente invención puede ser utilizado en la elaboración de bebidas alcohólicas conjuntamente con otros microorganismos, recombinantes o no, para producir distintas combinaciones de monoterpenos aromáticos durante la fermentación alcohólica.

Descripción del contenido de las figuras

Figura 1. Diagrama del plásmido desarrollado en esta invención (Se indican las enzimas utilizadas para su construcción así como otras de corte único): pG1-Lis-URA (Figura lA) y su control pG1-URA (Figura 1B).

Figura 2. Evolución del crecimiento de los transformantes YR63 (pG1-Lis-URA), YR64 (pG1-Lis-URA; CECT 12032), e YR65 (pG1-URA) en medio YPD (Figura 2A) y su cinética de producción de linalol (Figura 2B).

Figura 3. Perfiles cromatográficos de los medios de cultivo de las cepas YR63 (pG1-Lis-URA) (3A), YR64 (pG1-Lis-URA; CECT 12032) (3B) e YR65 (pG1-URA) (3C), tras una incubación de 24 horas en medio YPD. La flecha indica el tiempo de elución del linalol establecido por comparación con un patrón comercial.

Figura 4. Comparación de los perfiles iónicos del monoterpeno producido por la cepa YR64 (pG1-Lis-URA) y del linalol obtenidos por GC-MS.

Figura 5. Microvinificaciones. Evolución del crecimiento (5A), consumo de azúcares (5B), producción de etanol (5C) y cinética de acumulación de linalol (5D) de las cepas YR64 (pG1-Lis-URA; CECT 12032) y los controles T_{73} e YR65 (pG1-URA). Los resultados son la media de tres experimentos independientes.

Ejemplos de realización Ejemplo 1 Construcción de una cepa de levadura vínica que sintetiza de novo linalol 1.1.- Clonación del gen Lis de Clarkia breweri en un vector de expresión de levaduras

La región codificante del gen Lis de C. breweri (Dudareva et al., 1996) (SEQ ID NO1) se clonó en el vector pG-1 (Schena et al., 1991) entre el promotor del gen TDH3 de S. cerevisiae (codifica gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, antes llamado GPD_{p}) y el terminador del gen PGK1 de S. cerevisiae (codifica 3-fosfoglicerato kinasa) a partir de dos fragmentos, uno de 650 pb y otro de 2080 pb. El primero de ellos se obtuvo en una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos LisBgl2 (SEQ ID NO3) y LisXba1 (SEQ ID NO4) y el plásmido pR65 (plásmido pBlueScript II SK+ que contiene el cDNA del gen Lis) como DNA molde. Para la reacción de PCR se usó la enzima Expand High Fidelity (Roche). La amplificación consistió en 10 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 52.5ºC y 45 segundos a 72ºC y a continuación de otros 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 52.5ºC y 45 segundos a 72ºC, con incrementos de 5 segundos en el tiempo de extensión por cada ciclo.

El producto de PCR, tras ser purificado, se clonó en el vector pGEM-T® Easy (plásmido para la clonación de productos de PCR, Promega) para rendir el plásmido pGEM-Lis. La secuenciación del producto de PCR reveló la ausencia de errores de polimerización ocurridos durante la amplificación del mismo; si bien se identificaron dos cambios en dos aminoácidos, no ocurridos durante la reacción de polimerización, que difieren de la secuencia de la base de datos (NCBI AAC49395). Se trató este plásmido con las enzimas BglII y XbaI y se aisló el fragmento de 650 pb. El segundo fragmento (2080 pb), necesario para completar la ORF del gen Lis, se obtuvo por restricción del plásmido pR65 con las enzimas XbaI y SalI. Ambos fragmentos fueron ligados en el vector pG-1, previamente digerido con las enzimas BamHI y SalI, para construir el plásmido pGl-Lis, que lleva el cassette de expresión TDH3_{p}::Lis::PGK_{t} y el marcador de selección TRP1.

Para la construcción del plásmido pG1-Lis-URA (Figura 1A), que lleva además el marcador de selección URA3, en el sitio SmaI del plásmido pG1-Lis se subclonó un fragmento de aproximadamente 1500 pb que contiene el gen URA3 de S. cerevisiae generado por PCR usando como molde DNA genómico de la cepa T_{73} y los oligonucleótidos URA1 (SEQ ID NO5) y URA4 (SEQ ID NO6). Las condiciones de PCR sólo difirieron de las anteriores en la temperatura de anillamiento, que fue de 55ºC. El fragmento anterior fue digerido con la enzima HindIII y los extremos protuberantes se rellenaron con la enzima Klenow; el fragmento resultante se clonó en el sitio SmaI del plásmido pG1-Lis-URA.

De manera similar, a partir del plásmido PG-1 se construyó el vector control pG1-URA (Figura 1B).

1.2.- Construcción de una cepa de levadura vínica que sintetiza de novo linalol

A continuación, se transformó la cepa vínica S. cerevisiae T_{73}-4 (ura3::470/ura3::470) (Puig et al., 1998), derivada de la cepa industrial T_{73}, por el método del acetato de litio (Gietz et al., 1995) mejorado, (Puig et al., 1998) con el plásmido pG1-Lis-URA y los transformantes se seleccionaron en medio sin uracilo. Se analizaron varios transformantes distintos y todos se comportaron de manera similar en cuanto a la producción de linalol; los transformantes YR63 (pG1-Lis-URA) e YR64 (pG1-Lis-URA; CECT 12032) fueron aislados para posteriores estudios. Se transformó además la cepa T-_{13}-4 con el plásmido pGl-URA para obtener una cepa control de las levaduras recombinantes generadas, denominándola YR65.

La expresión del gen Lis se comprobó, indirectamente, por la detección de linalol mediante cromatografía de gases (GC) en los medios de cultivo (YPD: 2% glucosa; 2% peptona; 1% extracto de levadura) donde se crecieron los transformantes YR63, YR64 e YR65. Ver a continuación.

Ejemplo 2 Fisiología de las levaduras recombinantes. Análisis de metabolitos en las S. cerevisae que expresan Lis

Se llevó a cabo la detección del linalol producido por las cepas YR63 (pG1-Lis-URA), YR64 (pG1-Lis-URA; CECT 12032) e YR65 (pG1-URA) mediante la técnica de microextracción en fase sólida, en espacio de cabeza, acoplada a cromatografía de gases (HS-SPME-GC). La microextración en fase sólida se realizó con fibras de poli-dimetilsiloxano (PDMS). Se tomaron alicuotas de 3 mL que se introdujeron en viales de 9 mL que contenían una barra magnética de 8x3 mm y 0.6 gr de NaCl (para intensificar la respuesta en la extracción del analito) (Arthur et al., 1992). Asimismo, para su cuantificación posterior, a las muestras se les añadió una cantidad fija del patrón interno 2-octanol (15 \muL de una solución al 0.005% p/v en etanol). Los viales se cerraron herméticamente y se dejaron 2 horas, con agitación, a temperatura ambiente, para conseguir el equilibrio de fases (líquido-vapor). La fibra de PDMS se introdujo a través del septum de teflón de los tapones en el espacio de cabeza del tubo. Tras un período de adsorción de 30 minutos, la fibra se inyectó en el cromatógrafo de gases (HP 5890 series II), en el que se liberaron los analitos durante cuatro minutos.

Para la cromatografía se utilizó una columna capilar HP innowax (Hewlett-Packard) de 15 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.25 micras de espesor de fase. La temperatura del inyector fue de 220ºC y la del detector de 280ºC. La temperatura del horno fue inicialmente de 60ºC durante 5 minutos y después se incrementó a razón de 5ºC/min hasta 190ºC, y a razón de 20ºC/min hasta 250ºC, temperatura a la que se mantuvo durante 2 minutos. La identificación de linalol y otros componentes volátiles se llevó a cabo mediante comparación de sus tiempos de retención con el del patrón comercial. Para obtener su concentración inicialmente se construyó una curva de calibración con distintas concentraciones de linalol (Fluka) y posteriormente se relacionó el área de los cromatogramas con aquella.

Las cepas YR63 (pG1-Lis-URA), YR64 (pG1-Lis-URA) e YR65 fueron crecidas durante 18 horas en medio SD selectivo (2% glucosa, 0.5% sulfato amónico, 0.143% YNB) y entonces en medio YPD (10^{6} células/mL en matraces de 0.5 L con 100 mL de medio) y a distintos tiempos, durante 97 horas a 30ºC con una agitación de 100 rpm, se tomaron muestras para hacer recuentos (Figura 2). No se observaron diferencias significativas en las cinéticas de crecimiento de las dos cepas que producen linalol, YR63 (pG1-Lis-URA) e YR64 (pG1-Lis-URA), y la levadura control, YR65 (Figura 2A). Tanto en la cepa T_{73}-4 sin transformar (datos no mostrados) como en los transformantes de ésta con el plásmido pG1-URA (YR65) no se detectó linalol; tan sólo las levaduras transformadas con pGl-Lis-URA, YR63 e YR64 produjeron linalol (Figura 2B). La producción máxima de linalol (80 \mug/L) se alcanza hacia la mitad de la fase exponencial de crecimiento.

No se observan diferencias, salvo el pico del linalol, entre los cromatogramas de las cepas YR63 (pG1-Lis-URA) (Figura 3A) e YR64 (pG1-Lis-URA) (Figura 3B) y la cepa control YR65 (Figura 3C), lo que sugiere la ausencia de bioconversiones a partir del linalol producido en las condiciones experimentales del estudio.

Además, se confirmó mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) que el volátil que se había identificado por el tiempo de retención en CG es linalol. Para ello las cepas YR63 e YR64 (pG1-Lis-URA) fueron crecidas en medio YPD y se recogieron muestras a las 20 horas (máximo de producción de linalol). Las muestras se analizaron mediante la técnica de microextración en fase sólida, en espacio de cabeza, acoplada a cromatografía de gases con detector de masas. La GC-MS fue llevada a cabo en un cromatógrafo Agilent 6890 acoplado a un espectrómetro de masas Agilent 5973N (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). El espectro de iones del compuesto que eluye en el tiempo esperado al linalol fue el mismo que el espectro del linalol (Figura 4). De este modo se comprobó inequívocamente que el volátil que producían las cepas recombinantes YR63 e YR64, (pG1-Lis-URA) era linalol.

Ejemplo 3 Ensayos de microvinificación con la cepa vínica recombinante YR64 (CECT 12032)

Para averiguar si las levaduras recombinantes antes construidas eran capaces de llevar a cabo la vinificación hasta el final, si los parámetros físico- químicos del vino son similares a los del vino realizado con una levadura de uso industrial y si las manipulaciones genéticas antes realizadas llevan consigo cambios en el perfil de volátiles que se pudieran detectar en catas, se llevaron a cabo microvinificaciones con la cepa YR64 (pG1-Lis-URA; CECT 12032) y los controles T_{73} e YR65 (PG1-URA). Se utilizó mosto Parellada de la cosecha del 2003 procedente de Villafranca del Penedés. El mosto se filtró a través de cartuchos Sartopure PP2 de 1.2 \mum de poro (Sartorius) y posteriormente se esterilizó añadiendo Velcorin (dimetil dicarbonato) al 0,2% v/v, y se incubó a temperatura ambiente toda la noche. Finalmente, fue suplementado con 0,3 g/L de activador de la fermentación (LALVIN NUTRIENT VIT, Lallemand). Las microvinificaciones se llevaron a cabo por triplicado, a 18ºC y en condiciones estándar (Querol et al., 1992).

Las tres cepas anteriores se crecieron durante 18 horas en medio selectivo SD (2% glucosa, 0.5% sulfato amónico, 0.143% YNB). Tras este crecimiento las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en mosto y se inocularon 10^{6} células/mL en botellas de 250 mL con 225 mL de mosto estéril cerradas con tapón de rosca. A lo largo del experimento se tomaron muestras a distintos tiempos y en cada una de ellas se determinó el número de células, el consumo de azúcares, y la producción de etanol y linalol. El seguimiento de la evolución de la fermentación se realizó midiendo la D.O. a 600 nm en un espectrofotómetro Ultrospecc 2000 (Pharmacia, Biotech, England). El consumo de azúcares se siguió midiendo los grados BRIX con un refractómetro (Carl Zeiss, Germany). En los últimos días de la vinificación se empleó el multianalizador automático ECHO/ENOSYS (Tecnova S.A.) con el fin de determinar el final de la fermentación, esto es, cuando el contenido de azúcares fue menor de 2 g/L. El etanol se midió empleando un espectrofotómetro de infrarrojo (Enfrascan, Alliance Instruments, France). En los vinos finales se llevó a cabo el estudio de volátiles utilizando la técnica antes descrita (ejemplo 2).

Como se observa en la Figura 5A, la evolución del crecimiento de las tres cepas fue similar, aunque la portadora del plásmido pG1-Lis-URA, YR64 (CECT 12032), tiene una cinética de crecimiento ligeramente desplazada con respecto a la cepa comercial. El consumo de azúcares (Figura 5B) fue también similar en todas las cepas, llegando en todos los casos a un nivel inferior a los 2 g/L tras 6 días de fermentación. Del mismo modo, la cinética de producción de etanol (Figura 5C) fue similar en las tres vinificaciones alcanzando en todas ellas un grado alcohólico próximo al 8%. Este valor es ligeramente inferior al de los vinos comerciales a causa de la baja concentración de azúcares de partida del mosto, que no superaba los 130 g/L. Estos resultados indicaron que la expresión del gen Lis en la levadura vínica modificada aparentemente no modificaba sus características fermentativas.

En cuanto a la cinética de acumulación de linalol (Figura 5D), se observó que la cepa YR64 (CECT 12032), portadora del plásmido PG1-Lis-URA, era capaz de producir este monoterpeno durante la vinificación. Las otras dos cepas control no acumularon linalol durante el ensayo. La máxima concentración de linalol se alcanzó en el segundo día de fermentación (26,01 \mug/L), punto a partir del cual fue bajando paulatinamente (hasta 18,60 \mug/L en el vino acabado). Puesto que el umbral de detección olfativa de este compuesto se ha fijado en 4-10 \mug/L, estos resultados validan la invención propuesta.

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<110> Consejo superior de Investigaciones Científicas

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Orejas, Margarita

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Ramón, Daniel

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Herrero, Oscar

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<120> Microorganismo productor de monoterpenos, procedimiento de obtención y sus aplicaciones en la fermentación de bebidas alcohólicas

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<130> S-linalol sintasa

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<160> 6

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 2725

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<212> DNA

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<213> Clarkia breweri

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(6)

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (641)..(648)

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (2719)..(2725)

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 870

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<212> PRT

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<213> Clarkia breweri

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<220>

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<221> VARIANT

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<222> (129)..(129)

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<220>

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<221> VARIANT

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<222> (233)..(233)

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<400> 2

3

4

5

6

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<210> 3

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<223> LisBg12

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<400> 3

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cggaagatct ggtaccacct taaacaagac

\hfill

30

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<210> 4

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> LisXba1

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<400> 4

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aggcaatgct tctagaaata g

\hfill

21

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<210> 5

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> URA1

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<400> 5

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aatgtggctg tggtttcagg g

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21

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<210> 6

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> URA4

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgaggtat tggatagttc c

\hfill

21

Claims

1. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas caracterizado por la utilización de microorganismos modificados para que expresen genes exógenos que codifican monoterpeno sintasas, preferentemente linalol sintasa, lo que les capacita para la producción de novo de monoterpenos.

2. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 1 caracterizado por que el microorganismo es una levadura de interés en enología.

3. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que la levadura pertenece preferentemente al siguiente grupo: Saccharomyces, Hanseniaspora (Kloeckera), Candida, Pichia, Metschnikowia, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces.

4. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones de la 1 a la 3 caracterizado por que la levadura es la especie Saccharomyces cerevisiae.

5. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 1 y 4 caracterizado por que el miroorganismo es S. cerevisiae YR64 transformado con la secuencia SEQ ID NO1(CECT 12032).

6. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 1 caracterizado por que el microorganismo es una bacteria de interés en enología.

7. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 1 y 6 caracterizado por que la bacteria pertenece preferentemente al siguiente grupo: Lactobacillus, Pediococcus, Oenococcus.

8. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el microorganismo incluye secuencias nucleotídicas que codifican una o varias monoterpeno sintasas, preferentemente linalol sintasas, geraniol sintasas, \alpha-terpineol sintasas.

9. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 8 caracterizado por que el microorganismo incluye preferentemente la secuencia del gen Lis de C. breweri (SEQ ID NO1), que codifica una linafol sintasa o cualquier secuencia de nucleótidos análoga a ésta y que se expresa de manera funcional.

10. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 8 y 9 caracterizado por que las actividades monoterpeno sintasa están codificadas en uno o varios microorganismos, utilizados conjuntamente o de manera aislada.

11. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que la bebida fermentada pertenece preferentemente al siguiente grupo: vinos (incluidos tanto no espumosos como cava, champagne y otros espumosos), cerveza, sidra, sake.

12. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 11, caracterizado por que la bebida fermentada es vino: vino blanco, tinto o rosado obtenido a partir de mostos de uva de cualquier variedad.