JP6277450B2 - フィルトレーション装置 - Google Patents
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Description
外筒部とプランジャを備え、該外筒部の先端部に溶液の出入口となるヘッドを有するシリンジ構造のベッセルと、
培養液とともに細胞塊を通過させた際に該細胞塊を小細胞塊に破砕する機能を有するフィルターを内蔵した接続具と、
二つの前記ベッセルのヘッド同士を前記接続具で接続した状態で、それぞれのベッセルの前記外筒部を固定し、一方のベッセルのプランジャを前進させ且つ他方のベッセルのプランジャを後退させる機能を備えたベッセル間移送装置と、
からなるフィルトレーション装置。
前記ベッセルは、前記外筒部の先端側内面に円錐形凹部を有してなる、(1)記載のフィルトレーション装置。
前記ベッセルの円錐形凹部の傾斜角度αは、中心角で80°〜160°の範囲に設定してなる、(2)記載のフィルトレーション装置。
前記フィルターは、ろ過粒度40〜100μmのメッシュフィルターである、(1)〜(3)何れか1に記載のフィルトレーション装置。
前記ベッセルのプランジャの先端には前記外筒部内に摺動可能に弾性嵌合するガスケットを設け、該ガスケットの先端チップの形状を円錐形凸部としてなる、(2)〜(4)何れか1に記載のフィルトレーション装置。
前記シリンジのヘッドと前記接続具の接続構造は、ルアーロック構造である、(1)〜(5)何れか1に記載のフィルトレーション装置。
前記ベッセル間移送装置は、それぞれのベッセルに対して、固定部と可動部と駆動機構部とを備えた第1機構と、第2機構を有し、それぞれのベッセルの外筒部を固定する外筒部保持部を前記固定部に備えるとともに、プランジャの基端に設けたプランジャボタンを保持するプランジャ保持部を前記可動部に備え、前記駆動機構部は該可動部に保持した前記プランジャを前進、後退駆動する機構であり、一方のベッセルから他方のベッセルに内容物を移し替えることが可能である、(1)〜(6)何れか1に記載のフィルトレーション装置。
前記ベッセル間移送装置の第1機構と、第2機構を互いに同一鉛直方向に対向させて上下に設け、一方の前記シリンジの外筒部の円錐形凹部に集積した細胞塊を、前記接続具のフィルターを通して他方の前記シリンジに移し替える、(7)記載のフィルトレーション装置。
静置すると細胞塊が沈殿する性質の細胞と培養液の組み合わせを用い、該培養液に培養後の細胞塊が懸濁した細胞液が入った前記シリンジを、ヘッドが下向き姿勢の状態で前記ベッセル間移送装置の上側の第1機構に装着し、該シリンジの外筒部の円錐形凹部に沈殿した細胞塊を、第1機構の可動部を前進させるとともに、第2機構の可動部を後退させて、前記接続具のフィルターを通して第2機構に装着した他のシリンジに移し替える、(8)記載のフィルトレーション装置。
前記培養ベッセル2のフロントフランジ6とバックフランジ7の下部をそれぞれ一対のローラで回転可能に支持するが、本実施形態では一側を駆動ローラ112と従動ローラ113の対、他側を従動ローラ114,114の対で支持する。具体的には、基台115の上面の中央部に中央ブロック116を固定するとともに、側部に側部ブロック117を固定し、各ブロックの対向面側に設けた凹部118に前記培養ベッセル2のフロントフランジ6とバックフランジ7の下部を受け入れることができるようにしている。前記中央ブロック116には、本体を該中央ブロック116に固定した駆動モータ120も駆動軸121に直結した前記駆動ローラ112と、自由回転する従動ローラ113とを前記凹部118の底部に並設している。一方、前記側部ブロック117には、自由回転する従動ローラ114,114を前記凹部118の底部に並設している。
(1)球状スフェロイドの構築
253G1細胞は、マトリゲル(BD MatrigelTM, BD Biosciences)をコートした6cm又は10cm培養ディッシュを用いて、ヒトES/iPS細胞維持用培地mTeSR1(STEM CELL TECHNOLOGIES)またはStemFit AK02N(Ajinomoto)中で培養し、隔日培養液交換を行い、5mM EDTAを用いて継代維持した。3次元培養を行うため、播種に用いる253G1細胞を、5mM EDTAを用いておよそ20〜40細胞からなる小スフェロイド(直径およそ50μm〜200μmのルーズな細胞塊)に剥離した。5×105細胞の剥離した253G1細胞(小スフェロイド)を、シリンジ型10mlベッセル中、ROCK(ロック; Rho-associated kinase; Rho結合キナーゼ)インヒビターY27632(WAKO Pure Chemicals、10μM)含有mTeSR1培地(10ml)、またはROCKインヒビターY27632含有StemFit AK02N培地(10ml)に播種し、回転細胞培養装置を用いて37℃、6rpmで3日間回転培養した。培養後、培養液中に生成した球状スフェロイドの位相差像を倒立顕微鏡EVOS(ThermoFisher)を用いて撮影した(図30参照)。図30は、10mlベッセルを用いたiPS細胞(253G1細胞)の3日間の回転培養後のスフェロイドの位相差像であり、図30(a)はmTeSR1培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像、図30(b)はAK02N培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像である。図中の白いバーは200μmを示す。得られた球状スフェロイドは、約50個で主な大きさは直径200〜400μmであった。
409B2細胞は、マトリゲル(BD MatrigelTM, BD Biosciences)をコートした6cm又は10cm培養ディッシュを用いて、ヒトES/iPS細胞維持用培地mTeSR1(STEM CELL TECHNOLOGIES)またはStemFit AK02N(Ajinomoto)中で培養し、隔日培養液交換を行い、5mM EDTAを用いて継代維持した。3次元培養を行うため、播種に用いる409B2細胞を、5mM EDTAを用いておよそ20〜40細胞からなる小スフェロイド(直径およそ50μm〜200μmのルーズな細胞塊)に剥離した。5×105細胞の剥離した409B2細胞(小スフェロイド)を、シリンジ型10mlベッセル中、ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地(10ml)、またはROCKインヒビターY27632含有StemFit AK02N培地(10ml)に播種し、回転細胞培養装置を用いて37℃、6rpmで3日間回転培養した。培養後、培養液中に生成した球状スフェロイドの位相差像を倒立顕微鏡EVOS(ThermoFisher)を用いて撮影した(図31参照)。図31は、10mlベッセルを用いたiPS細胞(409B2細胞)の3日間の回転培養後のスフェロイドの位相差像であり、図31(a)はmTeSR1培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像、図31(b)はAK02N培地での回転培養後のスフェロイドの位相差像である。図中の白いバーは200μmを示す。得られた球状スフェロイドは、約50個で主な大きさは直径200〜400μmであった。
本実施例では連続継代培養試験を行った。その手順は模式的に図5〜図7に示した通りである。つまり、培養ベッセルに用いて回転培養し、継代間に前記ベッセル間細胞液移送装置Aを用いてフィルトレーションと同時に新しい培養ベッセルに小スフェロイドを移した。
実施例2に記載の方法に従い、5mM EDTAを用いて小スフェロイドに剥離した253G1細胞(5x105個)をシリンジ型10mlベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有StemFit AK02N培地中で回転培養装置を用いて3日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。続いて、回転培養で使用したシリンジ型10mlベッセルをフィルター内蔵接続部及び回収用シリンジ型10mlベッセルと接続し、ベッセル間細胞液移送装置を用いた。フィルターを通すことで球状スフェロイドを小スフェロイドに砕いた。得られた小スフェロイドへ、新しい培地を充填し、回転細胞培養装置を用いて37℃、6rpmで4日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。その後、フィルター内蔵接続部及びベッセル間細胞液移送装置を用いた破砕、培地の充填、4日日間の培養を10回繰り返した(連続継代培養)。各継代時の破砕した直後の小スフェロイドの位相差像を図32に示す。各培養期間において毎回球状スフェロイドを得ることができた。それらの主な直径は200〜400μmであり、最大では直径700μmを超すものもできた。各破砕時の小スフェロイドは、同じような棒状の形態をしていた。トータルの培養日数40日間で、コンタミネーションを起こすことはなかった。
B、B1,B2,B3 回転細胞培養装置、
C キャップ、
M 培養液、
S スフェロイド、
SM 細胞液、
1 シリンジ、 2 培養ベッセル、
3 濃縮ベッセル、 4 接続具、
5 外筒部、 6 フロントフランジ、
7 バックフランジ、 8 ヘッド、
9 プランジャ、 10 軸部、
10A 軸部、 10B 軸部、
10C メスネジ、 10D オスネジ、
10E ノッチ、 11 ガスケット、
12 プランジャボタン、 13 第1部材、
14 第2部材、 15 流路、
16 ハウジング部、 17 メスネジ部、
18 接続部、 19 流路、
20 オスネジ部、 21 接続部、
22 凹部、 23 フィルター、
24 パッキン、 25 スペーサー、
26 培養液供給管、 27 第1機構、
28 第2機構、 29 ベース部、
30 固定部、 31 可動部、
32 駆動機構部、 33 固定部、
34 可動部、 35 駆動機構部、
36 保護カバー類、 37 ベース板、
38 支持板、 39 補強板、
40 リニアガイド、 41 リニアアクチュエータ、
42 ガイドレール、 43 可動ブロック、
44 ステージ、 45 駆動モータ、
46 送りネジ機構、 46A ネジ軸、
46B ナット部材、 47 リニアガイド、
48 リニアアクチュエータ、 49 ガイドレール、
50 可動ブロック、 51 ステージ、
52 駆動モータ、 53 送りネジ機構、
53A ネジ軸、 53B ナット部材、
54 固定ステージ、 55 可動ステージ、
56 間隔調整具、 57 プランジャ保持部、
58 調整板、 59 ピン、
60 スリット溝、 61 長孔、
62 締付ネジ、 63 ハンドル、
64 係合凹部、 65 プランジャ保持部、
66 調整板、 67 ピン、
68 スリット溝、 69 長孔、
70 締付ネジ、 71 ハンドル、
72 係合凹部、 73 外筒部保持部、
74 U字状凹部、 75 フランジ嵌合溝、
76 保持部材、 77 フック、
78 外筒部保持部、 79 U字状凹部、
80 フランジ嵌合溝、 81 保持部材、
82 フック、 83 接地パッド、
84 接地パッド、 85 駆動ローラ、
86 従動ローラ、 87 規制ローラ(規制部)、
88 基台、 89 駆動機構、
90 中央ブロック、 91 側部ブロック、
92 回転軸、 93 回動軸、
94 突出部、 95 回転軸、
96 プーリ、 97 タイミングベルト、
98 プーリ、 99 駆動モータ、
100 駆動軸、 101 プーリ、
102 タイミングベルト、 103 回転数調整つまみ、
104 ネジ、 105 第1部材、
106 第2部材、 107 支持面、
108 支持面、 109 フランジ部、
110 フランジ部、 111 凹部、
112 駆動ローラ、 113 従動ローラ、
114 従動ローラ、 115 基台、
116 中央ブロック、 117 側部ブロック、
118 凹部、 120 駆動モータ、
121 駆動軸、 122 ボールプランジャ(規制部)、
123 固定脚、 124 アジャスター、
125 水準器、 126 基台、
127 アジャスター、 128 基台、
129 駆動側ブロック、 130 対向ブロック、
131 駆動ローラ、 131 駆動ローラ、
132 従動ローラ、 132 従動ローラ、
133 従動ローラ、 134 従動ローラ、
135 凹部、 136 ボールプランジャ(規制部)、
137 ボックス、 138 駆動モータ、
139 駆動軸、 140 プーリ、
141 回転軸、 142 プーリ、
143 タイミングベルト、 144 アジャスター、
α 傾斜角度。
Claims (9)
- 外筒部とプランジャを備え、該外筒部の先端部に溶液の出入口となるヘッドを有するシリンジ構造のベッセルと、
培養液とともに細胞塊を通過させた際に該細胞塊を小細胞塊に破砕する機能を有するフィルターを内蔵した接続具と、
二つの前記ベッセルのヘッド同士を前記接続具で接続した状態で、それぞれのベッセルの前記外筒部を固定し、一方のベッセルのプランジャを前進させ且つ他方のベッセルのプランジャを後退させる機能を備えたベッセル間移送装置と、
からなるフィルトレーション装置。 - 前記ベッセルは、前記外筒部の先端側内面に円錐形凹部を有してなる請求項1記載のフィルトレーション装置。
- 前記ベッセルの円錐形凹部の傾斜角度αは、中心角で80°〜160°の範囲に設定してなる請求項2記載のフィルトレーション装置。
- 前記フィルターは、ろ過粒度40〜100μmのメッシュフィルターである請求項1〜3何れか1項に記載のフィルトレーション装置。
- 前記ベッセルのプランジャの先端には前記外筒部内に摺動可能に弾性嵌合するガスケットを設け、該ガスケットの先端チップの形状を円錐形凸部としてなる請求項2〜4何れか1項に記載のフィルトレーション装置。
- 前記シリンジのヘッドと前記接続具の接続構造は、ルアーロック構造である請求項1〜5何れか1項に記載のフィルトレーション装置。
- 前記ベッセル間移送装置は、それぞれのベッセルに対して、固定部と可動部と駆動機構部とを備えた第1機構と、第2機構を有し、それぞれのベッセルの外筒部を固定する外筒部保持部を前記固定部に備えるとともに、プランジャの基端に設けたプランジャボタンを保持するプランジャ保持部を前記可動部に備え、前記駆動機構部は該可動部に保持した前記プランジャを前進、後退駆動する機構であり、一方のベッセルから他方のベッセルに内容物を移し替えることが可能である請求項1〜6何れか1項に記載のフィルトレーション装置。
- 前記ベッセル間移送装置の第1機構と、第2機構を互いに同一鉛直方向に対向させて上下に設け、一方の前記シリンジの外筒部の円錐形凹部に集積した細胞塊を、前記接続具のフィルターを通して他方の前記シリンジに移し替える請求項7記載のフィルトレーション装置。
- 静置すると細胞塊が沈殿する性質の細胞と培養液の組み合わせを用い、該培養液に培養後の細胞塊が懸濁した細胞液が入った前記シリンジを、ヘッドが下向き姿勢の状態で前記ベッセル間移送装置の上側の第1機構に装着し、該シリンジの外筒部の円錐形凹部に沈殿した細胞塊を、第1機構の可動部を前進させるとともに、第2機構の可動部を後退させて、前記接続具のフィルターを通して第2機構に装着した他のシリンジに移し替える請求項8記載のフィルトレーション装置。
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