JP6262284B2 - Ａａｄ−１２イベント４１６、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびそのイベント特異的な同定 - Google Patents

Ａａｄ−１２イベント４１６、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびそのイベント特異的な同定 Download PDF

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Description

本発明は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントおよびそれに由来する後代に関する。
ａａｄ−１２遺伝子（元々はデルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由
来）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質を
コードする。この形質により、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に対する耐性、お
よびピリジルオキシ酢酸除草剤に対する耐性が付与される。ａａｄ−１２遺伝子自体は、
植物における除草剤耐性について、ＷＯ２００７／０５３４８２に最初に開示された。
植物における異種遺伝子または外来遺伝子の発現は、その外来遺伝子が染色体のどこに
挿入されたかに影響される。これは、例えば、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチ
ン）のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の
近傍にあるためである可能性がある（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻:421〜477頁、19
88年）。同じ種類のトランスジェニック植物（または他の生物体）における同じ遺伝子が
、異なるイベント間で発現レベルの広範な変動を示すことがある。発現の空間パターンま
たは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子
の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写調節エレメントから
予測されるパターンに対応しない可能性がある。
したがって、多くの場合、所与の目的ために申し分のないレベルまで対象の導入された
遺伝子を発現するイベントを特定するために、多数のイベントを創出し、スクリーニング
する。商業目的のために、何百から何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベント
を、導入遺伝子の所望の発現レベルおよび発現パターンを有する単一のイベントについて
スクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルおよび／また
はパターンを有するイベントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入
遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、
元の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生
長条件によく適合する多数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。
米国特許出願公開第２００９０１３００７１号は、ダイズイベントＭＯＮ８７７０１お
よび検出方法に関する。米国特許出願公開第２００９００３６３０８号および同第２００
８００５１２８８号は、ダイズイベント３５６０．４．３．５および検出方法に関する。
米国特許出願第２００８０３１２０８２号は、ダイズイベントＤＰ−３０５４２３−１お
よび検出方法に関する。米国特許出願第２００６０２８２９１５号は、ダイズイベントＭ
ＯＮ８９７８８および検出方法に関する。
本明細書に開示されている特定のイベントを有するＡＡＤ−１２ダイズは、これまでに
開示されていない。
本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ
ＴＣＣ、アメリカの微生物系統保存機関）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２で寄託されてい
る種子を有する、ＤＡＳ−６８４１６−４と称されるＡＡＤ−１２ダイズ（ダイズ（Ｇｌ
ｙｃｉｎｅ ｍａｘ））イベント、およびそれに由来する後代に関する。本発明の他の態
様は、後代植物、ダイズ、種子、および／またはダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
の植物および種子および後代の再生可能な部位、ならびにそのいずれかから製造された食
品または飼料製品を含む。本発明は、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉、ならびに栄
養細胞、花粉細胞、および卵細胞の核を含むが、これらに限定されない、ダイズイベント
ＤＡＳ−６８４１６−４の植物の部位も包含する。本発明は、さらに、フェノキシオーキ
シン除草剤および／またはアリールオキシアルカノエート除草剤に対する耐性を有する（
これらの除草剤を、ダイズ植物の上から施用するか、近接するまたは近くの土壌に施用す
るか、または近接するまたは近くの雑草に施用するかにかかわらず）ダイズ植物、ダイズ
イベントＤＡＳ−６８４１６−４の新規の遺伝組成、およびダイズイベントＤＡＳ−６８
４１６−４を含むダイズ植物の農業生産力の側面に関する。
本発明は、一部において、植物の育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、本明
細書に記載の通り、ダイズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されたポリヌクレオチド
配列を含むダイズ植物における新規のａａｄ−１２形質転換イベントを包含する。
一部の実施形態では、前記イベント／ポリヌクレオチド配列に、例えば、他の除草剤耐
性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質を含めた他の形質を「積み重ねる
」ことができる。しかし、本発明は、本明細書に記載の通り、単一のイベントを有する植
物を包含する。本発明の特定の実施形態では、種々の除草剤抵抗性の雑草（例えば、グリ
ホサート抵抗性の雑草）を制御するために、１つまたは複数の除草剤耐性形質をダイズイ
ベントＤＡＳ−６８４１６−４に積み重ねる。
さらに、本発明は、試料（例えば、ダイズの）中の本主題のイベントの存在を検出する
ためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構築物のＤＮ
Ａ配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。アッセイの実
施において有用なキットおよび条件も提供される。
したがって、本発明は、一部において、（トランスジェニックダイズ系統における）全ａａｄ−１２挿入断片、およびその境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関する。これらの配列は独特である。これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによってこれらのイベントを同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、本発明のイベントを含むダイズ系統を一意的に同定することができる。

本発明は、以下を提供する。
［１］配列番号１を含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物。
［２］Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されている代表的な種子に存在するＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含むゲノムを含むダイズ種子。
［３］配列番号１を含むゲノムを含むダイズ種子。
［４］配列番号１を含む、上記［２］に記載の種子を生長させることによって作出されるダイズ植物。
［５］ＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含む、上記［４］に記載のダイズ植物の後代植物。
［６］配列番号１を含む、上記［１］に記載のダイズ植物の除草剤耐性後代植物。
［７］配列番号２９および配列番号３０のＳＮＰマーカー間の第４染色体に位置するダイズ染色体標的部位に導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックダイズ植物であって、上記標的部位が異種核酸を含む、トランスジェニックダイズ植物。
［８］配列番号２９および配列番号３０のＳＮＰマーカー間の第４染色体上の位置において異種核酸を挿入するステップを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法であって、上記標的部位が異種核酸を含む方法。
［９］花粉、胚珠、花、莢、リント、苗条、根、および葉からなる群から選択され、配列番号１を含む、上記［４］に記載の植物の一部。
［１０］配列番号１の残基１〜２７３０および配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２からなる群から選択されるゲノム配列中に、またはそれに隣接して導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックダイズ植物。
［１１］少なくとも１５ヌクレオチドを含み、ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の残基１〜２７３０および配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２からなる群から選択される核酸配列とのハイブリダイゼーションを維持する、単離されたポリヌクレオチド分子。
［１２］配列番号２〜２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
［１３］ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１の残基２７２０〜２７４０、配列番号１の残基９１１２〜９１３２、およびその相補物からなる群から選択されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
［１４］ポリメラーゼ連鎖反応によって生成するアンプリコンである、上記［１３］に記載のポリヌクレオチド。
［１５］配列番号１を含む、ポリヌクレオチド。
［１６］上記［１５］に記載のポリヌクレオチドを作出する方法。
［１７］導入遺伝子をダイズゲノムのＤＮＡセグメントに挿入する方法であって、上記ＤＮＡセグメントが、配列番号１の残基１〜２７３０を含む５’末端および配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２を含む３’末端を含む方法。
［１８］ダイズ植物を育種する方法であって、配列番号１を含む第１のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑してゲノムを含む第３のダイズ植物を作出するステップと、上記第３のダイズ植物を、上記ゲノム内に配列番号１が存在することについてアッセイするステップとを含む方法。
［１９］除草剤耐性形質をダイズ植物に遺伝子移入する方法であって、配列番号１を含む第１のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑してゲノムを含む第３のダイズ植物を作出するステップと、上記第３のダイズ植物を、上記ゲノム内に配列番号１が存在することについてアッセイするステップとを含む方法。
［２０］雑草を制御する方法であって、上記［１］に記載の植物を含む圃場にアリールオキシアルカノエート除草剤を施用するステップを含む方法。
［２１］上記除草剤が、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；およびＭＣＰＢからなる群から選択される、上記［２０］に記載の方法。
［２２］上記圃場に第２の除草剤を施用するステップを含む、上記［２０］に記載の方法。
［２３］上記第２の除草剤が、グリホサートおよびジカンバからなる群から選択される、上記［２２］に記載の方法。
［２４］雑草を制御する方法であって、圃場にアリールオキシアルカノエート除草剤を施用するステップと、上記除草剤を施用してから１４日間以内に上記圃場に上記［３の種子を植え付けるステップとを含む方法。
［２５］ダイズＤＮＡを含む試料中のダイズイベントを検出する方法であって、上記試料を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されている代表的な種子に存在するＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６に特徴的な少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
［２６］上記試料を、
ａ．配列番号１の残基１〜２７３０、配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２、およびその相補物からなる群から選択される隣接配列に結合する第１のプライマー、および
ｂ．配列番号１の残基２７３１〜９１２１またはその相補物を含む挿入断片配列に結合する第２のプライマー
と接触させるステップと、
上記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、上記プライマーの間で生成されたアンプリコンについてアッセイするステップとを含む、上記［２５］に記載の方法。
［２７］上記プライマーが、配列番号２〜７からなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２８］上記ポリヌクレオチドが、少なくとも３０ヌクレオチドを含み、かつストリンジェントな条件下で配列番号１の残基２７２０〜２７４０、配列番号１の残基９１１２〜９１３２、およびその相補物からなる群から選択される配列とハイブリダイズし、上記方法が、上記試料および上記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと、上記試料を、上記ポリヌクレオチドの上記ＤＮＡへのハイブリダイゼーションについてアッセイするステップとをさらに含む、上記［２５］に記載の方法。
［２９］上記［２７］に記載の第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むＤＮＡ検出キット。
［３０］上記［２８］に記載の方法を実施するためのＤＮＡ検出キット。
［３１］少なくとも３０ヌクレオチドを含み、かつストリンジェントな条件下で配列番号１の残基２７２０〜２７４０、配列番号１の残基９１１２〜９１３２、およびその相補物からなる群から選択される配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ検出キット。
［３２］除草剤抵抗性の雑草を処理する、または防ぐために使用される、上記［２０］に記載の方法。
［３３］上記除草剤が、上記植物を植え付ける前に施用される、上記［２０］に記載の方法。
［３４］グリホサート耐性形質をさらに含む少なくとも１つの上記［１］に記載の植物を含む地域においてグリホサート抵抗性の雑草を制御する方法であって、アリールオキシアルカノエート除草剤を上記地域の少なくとも一部に施用するステップを含む方法。
［３５］上記除草剤がフェノキシオーキシンである、上記［３４］に記載の方法。
［３６］上記除草剤がグリホサートとのタンク混合物から施用される、上記［３４］に記載の方法。
［３７］上記雑草の少なくとも１種が、上記植物と異なる種のグリホサート抵抗性の自生植物である、上記［２０］に記載の方法。
ｐＤＡＢ４４６８のプラスミドマップを示す図である。 ダイズイベントのゲノムＤＮＡを示す図であり、ＤＡＳ−６８４１６−４をＥｃｏＲＶまたはＰｖｕＩＩを用いて消化し、それを使用して対応するＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーを作製し、これを、標的ＤＮＡ配列を増幅するために鋳型として使用した。 ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の全長配列を５’端から３’端まで確認するためのプライマーの位置を示す図である。 ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の全長配列を５’端から３’端まで確認するためのプライマーの位置を示す図である。 ＡＡＤ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入部位の配列を確認するためのプライマーの位置を示す図である。 植物の生活環を通した発現レベルを示す図である。
［表の簡単な説明］
表１は、イベントＤＡＳ−６８４１６−４についての挿入断片および隣接配列の配列番
号１に関する残基の番号付けを示す。
表２は、サザン分析において使用したプローブの位置および長さを示す。
表３は、サザンブロット分析において予測されたハイブリダイズ断片および観察された
ハイブリダイズ断片を示す。
表４は、隣接境界領域を増幅するためのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノ
ムウォーキングの条件を示す。
表５は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４における境界領域およびイベント特異
的な配列の標準のＰＣＲ増幅のための条件を示す。
表６は、Ｔ鎖挿入断片についてのアンプリコン１〜４に対するプライマーの説明を示す
。
表７は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４における境界領域およびイベント特異
的な配列の標準のＰＣＲ増幅のためのＰＣＲ混合物を示す。
表８は、２００８年中に米国およびカナダにおいて生産されたダイズイベントＤＡＳ−
６８４１６−４から収集した組織中のＡＡＤ−１２タンパク質レベルの概要を示す。
表９は、サザン分析において使用したプローブの位置および長さを示す。
表１０は、サザンブロット分析において予測されたハイブリダイズ断片および観察され
たハイブリダイズ断片を示す。
表１１は、実験１において評価した農業形質パラメータを示す。
表１２は、実験１からの農業特性の分析を示す。
表１３は、２００９年の農業試験および収量試験において収集されたデータを示す。
表１４は、２００９年の全ての地域にわたる農業特性の結果の概要を示す。
表１５は、実験１からの病害発生率および虫害についての分析を示す。
表１６は、ＤＡＳ−６８４１６−４および従来のダイズの試験において観察された病害
ストレス要因および昆虫ストレス要因を示す。
表１７は、温暖な条件下および寒冷な条件下でのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４種子の発芽を示す。
表１８は、ダイズの茎葉の一般成分（proximate）分析、繊維分析およびミネラル分析
の概要を示す。
表１９は、ダイズの粒一般成分分析および繊維分析の概要を示す。
表２０は、ダイズの粒のミネラル分析の概要を示す。
表２１は、ダイズの粒のアミノ酸分析の概要を示す。
表２２は、ダイズの粒の脂肪酸分析の概要を示す。
表２３は、ダイズの粒のビタミン分析の概要を示す。
表２４は、ダイズの粒のイソフラボン分析の概要を示す。
表２５は、ダイズの粒の抗栄養因子分析の概要を示す。
表２６は、２，４−Ｄ出芽前耐性試験についての現場および処理の情報を示す。
表２７は、２，４−Ｄの出芽前施用に対するＤＡＳ−６８４１６−４ダイズの耐性を例
示している。
［配列の簡単な説明］
配列番号１は、本主題のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についての挿入断片配
列および隣接配列を示す。
配列番号２〜２８は、本明細書に記載のプライマーである。
配列番号２９および３０は、本明細書に記載の隣接ＳＮＰマーカーであるＢＡＲＣ−０
１９０９３−０３２９９およびＢＡＲＣ−０４４６０７−０８７３６である。
本発明は、一部において、植物の育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、本明
細書に記載の通り、ダイズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入された、本主題のａａｄ
−１２ポリヌクレオチド配列を含むダイズ植物（ダイズ）の新規の形質転換イベントを包
含する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列に、他の形質を「積み重ねる」
ことができる（例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパ
ク質をコードする遺伝子（複数可）など）。しかし、本発明は、本明細書に記載の単一の
イベントを有する植物を包含する。
さらに、本発明は、試料中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供
する。本発明の態様は、本明細書において例証または提案される任意の診断用核酸分子、
特に、完全にまたは部分的に本主題の隣接配列に基づく診断用核酸分子を設計および／ま
たは作出する方法を包含する。
より詳細には、本発明は、一部において、トランスジェニックダイズイベントＤＡＳ−
６８４１６−４、これらのイベントを含む植物系統、ならびにこの挿入断片、および／ま
たはその境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関する。本発明の植物系統は
、本明細書において開示され、提案されている配列を使用して検出することができる。
一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性ダイズ系統、およびその同定に関する。本
発明は、一部において、有性交雑の後代が対象のイベントを含有するかどうかを決定する
ために本主題のイベントの存在を検出することに関する。さらに、イベントを検出するた
めの方法が包含され、それは、例えば、組換え作物に由来する食物の市販前承認および表
示を必要とする規制に合致するために役立つ。任意の周知の核酸検出方法、例えばポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸プローブを使用したＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ンなどによって本主題のイベントの存在を検出することが可能である。イベント特異的な
ＰＣＲアッセイは、例えば、Windelsら（Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:45946
2、1999年）によって考察されている。これは、グリホサート耐性のダイズイベント４０
−３−２を、挿入断片と隣接ＤＮＡとの間の接合部にわたるプライマーセットを使用した
ＰＣＲによって同定することに関する。より詳細には、１つのプライマーは挿入断片由来
の配列を含み、第２のプライマーは隣接ＤＮＡ由来の配列を含んだ。
デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）に由来する、アリールオキシア
ルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードするａａｄ−１２遺
伝子を挿入することによってダイズを改変した。この形質は、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸除草剤およびピリジルオキシ酢酸除草剤に対する耐性を付与し、植物を形質転換す
る間、および育種苗床において選抜マーカーとして使用することができる。
より詳細には、本明細書には、ＡＡＤ１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６、なら
びに、それを、代々、植物全体および分子レベルで安定性および発現について選抜し、特
徴付けすることが記載されている。
本発明に従って使用される対象の合成遺伝子（ａａｄ−１２）は、デルフチア・アシド
ボランス（Delftia acidovorans）に由来し、フェノキシオーキシン（例えば、２，４−
Ｄ、ＭＣＰＡ）、ならびにピリジルオキシオーキシン（例えば、フルロキシピル、トリク
ロピル）を含めたアリールオキシアルカノエート部分を持ついくつかの除草剤を不活性化
することができる酵素をコードする。ａｔＵｂｉ１０プロモーターに駆動されるａａｄ−
１２遺伝子を、ダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋに、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス（Agrobacterium tumefaciens）法によって導入した。トランスジェニックＴ０植
物を４〜６世代にわたって自家受粉させた。平行して、優良なダイズ品種にａａｄ−１２
遺伝子の遺伝子移入も行った。全てのトランスジェニックイベントを、封じ込められ、規
制された圃場苗床および研究室の環境において４〜５世代にわたって特徴付けた。
イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６挿入物の両末端について配列決定し、特徴付けた
。イベント特異的なアッセイを開発した。これは、ダイズゲノム（ダイズの第４染色体）
上にマッピングされた；隣接ＳＮＰマーカーは、本明細書に配列番号２９および３０とし
て記載されている。イベントを別の優良な系統に遺伝子移入する。イベントにより、２，
４−Ｄおよびグルホシネートに対する耐性がもたらされる。
ａｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆動し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）法によって１００を超えるＡＡＤ１２Ｔ１Ｍａｖｅｒｉ
ｃｋダイズイベントを生成した。イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を、５つの自家受
粉させた世代およびいくらかの戻し交雑した世代の単一系列選抜によって選抜した。これ
は形態学的に正常であり、全ての自家受粉した世代を通じて、Ｖ３における２２４０ｇ
ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ噴霧に対して耐性であった。イベントは、単一の優性遺伝子とし
て遺伝性であり、その上、自家受粉した世代および戻し交雑した世代において正常なメン
デル分離を有した。
イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６は、全長の植物転写単位（ＰＴＵ）を伴う単一の
組み込みを有することが見いだされた。ベクターの骨格からは抗生物質抵抗性遺伝子配列
は見いだされず、また、ａａｄ−１２遺伝子のホモ接合状態および半接合性状態において
、数世代を通して遺伝子サイレンシングは検出されなかった。ａａｄ−１２遺伝子は、２
，４−Ｄ耐性のレベルをもたらす予測レベルで発現された。イベントは、ａａｄ−１２遺
伝子を安定に、複数の世代にわたって、および所与の世代において同胞系列の間で発現し
た。
上の背景技術のセクションにおいて言及されている通り、導入遺伝子の植物ゲノムへの
導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを伴う（したがって発現される所
与の挿入物について「イベント」と称する）。すなわち、アグロバクテリウム（Agrobact
erium）形質転換、「遺伝子銃」、およびＷＨＩＳＫＥＲなどの多くの形質転換技法を用
いると、導入遺伝子がゲノム内のどこに挿入されるかは予測不可能である。したがって、
挿入断片の両側の隣接植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所与の挿入イベントを有する
植物を同定するために重要であり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合領域にわ
たってＰＣＲアンプリコンを生成するＰＣＲプライマーを設計することができる。このＰ
ＣＲアンプリコンを使用して、独特のまたは別個の種類の挿入イベントを同定することが
できる。
「イベント」は、元々ランダムなイベントであるので、本開示の一部として、イベント
を含む少なくとも２５００種子のダイズ系統がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕ
ｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ、２０１１０に寄託され、制限なく一般に公開され
ている（しかし、特許権に支配される）。この寄託物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０
４４２と称される。２５個のダイズ（Glycine max）種子（ＡＡＤ−１２イベントｐＤＡ
Ｂ４４６８−０４１６）のバイアルが、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ ｏ
ｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２２、２００９を代表して寄託された。この寄託物は２００９年１
１月２日に試験され、同日に種子は生育可能（viable）であった。この寄託物は、特許手
続のための種子寄託物に関するブタペスト条約の条項に従い、かつその下で作製されたも
のであり、また、それに従い、かつその下で維持される。寄託物は、公共の受託所である
ＡＴＣＣ受託所において、３０年間、または最新の要求後５年間、または特許の有効期間
のいずれかのより長い期間にわたって制限なく維持され、その期間中に生育不能になった
場合は交換される。
寄託された種子は本発明の一部である。明らかに、ダイズ植物をこれらの種子から生長
させることができ、そのような植物は本発明の一部である。本発明は、これらのダイズ植
物に含有される、これらの植物およびその後代を検出するために有用なＤＮＡ配列にも関
する。本発明の検出方法およびキットは、試験の最終目的に応じて、これらのイベントの
任意の１つ、２つ、またはさらには３つ全てを同定することを対象とすることができる。
本発明の説明に役立つように、また当業者が本発明を実施する指針となるために、本明
細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者による従
来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第１．８２２条に明記されているＤ
ＮＡ塩基の命名法を使用する。
本明細書で使用される場合、用語「後代」は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６
８４１６−４を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち、対象の導入遺
伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することに
よって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴
とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転
換体および異種ＤＮＡを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、ゲノム
ＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交雑によって
作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質転換された
親由来の挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ／導入遺伝
子ＤＮＡ）は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イベント」は
、元の形質転換体由来のＤＮＡ、および挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形
質転換体および自殖によって生じる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統との有性交雑
の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予
測され得る挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むその後代も指
す。
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接するダイズのネイティ
ブなゲノム由来のＤＮＡに連結している点にわたり、植物の遺伝物質中の一方または他方
の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である。本明細書に記載のダ
イズイベントにおける挿入物にわたるＤＮＡ配列および同様の長さの隣接ＤＮＡが包含さ
れる。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供されるが、挿入物の接
合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする他の配列も特徴的であ
り、本発明に従って使用することができる。
本発明は、そのような隣接配列、接合部配列、および挿入断片配列を特定することに関
する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンは、本発明に包含される。本発明に
従って、挿入ＤＮＡおよびその端までわたるアンプリコンを使用するＰＣＲ分析方法を使
用して、対象の登録商標を持つトランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたト
ランスジェニックダイズの品種または系統を検出または特定することができる。
挿入断片を植物細胞のゲノムに導入するプロセスの間、挿入断片および／またはゲノム
隣接配列のいくらかの欠失または他の変化が起こることは珍しくない。したがって、本明
細書において提供される関連性のあるプラスミド配列のセグメントは、いくらかの軽微な
変動を含む可能性がある。同じことが、本明細書において提供される隣接配列にも当ては
まる。したがって、本主題の隣接配列および／または挿入断片配列といくらかの範囲の同
一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、本発明の範囲内である。本発明の配列に対
する同一性は、本明細書で例示または記載されている配列に対して少なくとも６５％配列
同一性、より好ましくは少なくとも７０％配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％
配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％同一性、およびより好ましくは少なくとも
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であ
ってよい。本明細書において提供されるハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー
ション条件は、そのような植物および本発明のポリヌクレオチド配列を定義するためにも
使用することができる。隣接配列プラス挿入断片配列の配列は、寄託されている種子を照
会して確認することができる。
これらの挿入断片のそれぞれの全配列は、それぞれの隣接配列の部分と一緒に、本明細
書において配列番号１として提供される。配列番号１（全部で１０，２１２塩基対）に関
してこのイベントについての挿入断片および隣接配列の位置が下の表１に示されている。
これは、例えば、実施例３においてより詳細に考察されている。
これらの配列（特に隣接配列）は独特である。これらの挿入断片および境界の配列に基
づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント
特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって
、異なるダイズ遺伝子型においてこれらのダイズ系統を同定することができることが実証
された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、これらのダイズ系統を一
意的に同定することができる。本明細書において同定される配列は独特である。
本発明の検出技法は、植物育種と併せて、１つまたは複数の追加的な対象の形質を後代
に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交雑した後に
、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。これらのＰ
ＣＲ分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトランスジェニ
ックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のＰＣＲ検出キッ
トも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管理にも有益
である。
さらに、隣接ダイズ／ゲノム配列を使用して、それぞれの挿入断片の遺伝子位置を特異
的に同定することができる。この情報を使用して、それぞれのイベントに特異的な分子マ
ーカー系を作製することができる。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖
データを確立するために使用することができる。
さらに、隣接配列の情報を使用して、導入遺伝子の組み込みプロセス、ゲノムの組み込
み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに
遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、
およびＭＡＲＳ［マトリックス付着領域］などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連
する）を試験し、特徴付けることができる。
本開示全てに照らして、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で入手可
能な種子を包含することが明白でなければならない。本発明は、受託番号ＰＴＡ−１０４
４２の下でＡＴＣＣに寄託されている種子から生長させた除草剤耐性ダイズ植物も包含す
る。本発明は、さらに、前記植物の部位、例えば、葉、組織試料、前記植物によって生産
される種子、花粉などを包含する。
さらに、本発明は、寄託されている種子から生長させた植物の後裔植物および／または
後代植物、好ましくは除草剤耐性ダイズ植物であって、本明細書に記載の検出可能な野生
型ゲノムＤＮＡ／挿入ＤＮＡ接合部配列を含むゲノムを有する植物を包含する。本明細書
で使用される場合、用語「ダイズ」は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘを意味し、ダイズ植物を
用いて育種することができるその全品種を包含する。
本発明は、本発明の植物を少なくとも一方の親として使用して交雑を行うプロセスをさ
らに包含する。例えば、本発明は、本明細書において例示されている植物のいずれかを一
方の親または両親として有するＦ１ハイブリッド植物を包含する。また、本発明のそのよ
うなＦ１ハイブリッドによって生産される種子も本発明の範囲内である。本発明は、例示
した植物と、異なる（例えば、純系の親）植物を交雑し、得られたハイブリッド種子を収
穫することによってＦ１ハイブリッド種子を作出するための方法を包含する。本発明は、
雌親または雄親のいずれかである、例示した植物を包含する。得られる植物の特性は、親
植物を慎重に考察することによって改良することができる。
除草剤耐性ダイズ植物は、本明細書で言及されている系統の任意の１つの種子から生長
させたダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物と、第２の親ダイズ植物との有性交雑を最
初に行い、それによって複数の第１の後代植物を作出すること；次いで、除草剤に対して
抵抗性である（または、本発明のイベントの少なくとも１つを保有する）第１の後代植物
を選択すること；第１の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第２の後代植物を作
出すること；次いで、第２の後代植物から、除草剤に対して抵抗性である（または、本発
明のイベントの少なくとも１つを保有する）植物を選択することによって育種することが
できる。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を第２の親ダイズ植
物または第３の親ダイズ植物と戻し交雑することをさらに含んでよい。次いで本発明のダ
イズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を植え付けることができる。
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、それぞれ独立に分離して付加された
２つの外因性遺伝子を含有する子孫を作出することもできることがまた理解される。適切
な後代を自殖させることにより、付加された外因性遺伝子のどちらについてもホモ接合性
である植物を作出することができる。栄養繁殖のように、親植物との戻し交雑および非ト
ランスジェニック植物との異系交雑も意図されている。種々の形質および作物のために一
般に使用される他の育種方法は当技術分野で公知である。反復親である望ましいホモ接合
性の栽培品種または純系統に、単純に遺伝した、高度に遺伝性の形質の遺伝子を伝達する
ために戻し交雑育種が使用されてきた。伝達される形質の供給源は、供与親と称されてい
る。生じた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ま
しい形質を有することが予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型を保有する個体を
選択し、反復親と繰り返し交雑（戻し交雑）する。生じた親は、反復親（例えば、栽培品
種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。
本発明のＤＮＡ分子は、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして使
用することができる。本発明のＤＮＡ分子は、当技術分野で公知の通り、遺伝的に連鎖し
ている作物学的に有用な形質を特定する方法（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマー
カー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）において使用することができる。Ｍ
ＡＢ法を使用して、本発明のダイズ植物（またはその後代および任意の他のダイズの栽培
品種または品種）との交雑の後代において除草剤抵抗性形質を追跡することができる。Ｄ
ＮＡ分子はこの形質についてのマーカーであり、当技術分野で周知のＭＡＢ法を使用して
、本発明の少なくとも１つのダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ
植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡することができる。本発明の方法を使用
して、対象イベントを有する任意のダイズ品種を特定することができる。
本発明の方法は、本発明の植物を用いて育種するステップを含む、除草剤耐性ダイズ植
物を作出する方法を包含する。より詳細には、前記方法は、本発明の２つの植物、または
本発明の１つの植物と任意の他の植物とを交雑するステップを含んでよい。好ましい方法
は、前記交雑の後代を、本発明に従って検出可能なイベントについて前記後代を分析する
ことによって選択するステップをさらに含む。例えば、本発明を使用して、他の望ましい
形質、例えば、作物学的形質など、例えば、本明細書において、種々の実施例において試
験されるものなどを含む植物を用いた育種サイクルを通して対象イベントを追跡すること
ができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物を検出し、特定し、選択し、例えば
育種のさらなるラウンドに直ちに使用することができる。対象イベント／形質は、昆虫抵
抗性形質（複数可）および／または別の除草剤耐性形質と育種を通じて組み合わせ、本発
明に従って追跡することもできる。後者の好ましい一実施形態は、対象イベントを除草剤
であるジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせて含む植物である。
したがって、本発明は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物または細菌
のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（例えば、Ｐａｔ、ｂａｒ）、
アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤への抵抗性（例えば、イミダゾリノン［イマ
ゼタピルなど］、スルホニル尿素系、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジ
ニルチオベンゾエート系、および他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど］）、ブロモキ
シニル抵抗性（例えば、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル−ピルビン酸−
ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）
の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ｐｓｂＡ
）、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩ
Ｘ（ＰＰＯ）阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤
に対する抵抗性（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えば、ＵＳ２００３
０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他の
ものを、単独で、または多数の組合せで積み重ねて、雑草のシフト（weed shift）および
／または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を有効に制御する、または妨げる能
力をもたらすことができる。
追加的な除草剤に関して、いくつかの追加的な好ましいＡＬＳ（ＡＨＡＳとしても公知
である）阻害剤としては、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド系（例えば、クロラン
スラム−メチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、およびペ
ノキススラムなど）、ピリミジニルチオベンゾエート系（例えば、ビスピリバックおよび
ピリチオバックなど）、ならびにフルカルバゾンが挙げられる。いくつかの好ましいＨＰ
ＰＤ阻害剤としては、メソトリオン、イソキサフルトール、およびスルコトリオンが挙げ
られる。いくつかの好ましいＰＰＯ阻害剤としては、フルミクロラック、フルミオキサジ
ン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフェナシル、カルフェント
ラゾン、スルフェントラゾン、およびジフェニルエーテル系（例えば、アシフルオルフェ
ン、ホメサフェン、ラクトフェン、およびオキシフルオルフェンなど）が挙げられる。
さらに、ＡＡＤ−１２単独に、または１つもしくは複数の追加的なＨＴＣ形質を積み重
ねたＡＡＤ−１２に、１つまたは複数の追加的なインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、
真菌抵抗性、もしくはストレス耐性など）またはアウトプット形質（例えば、生産量の増
加、油プロファイルの改良、繊維品質の改良など）を積み重ねることができる。したがっ
て、本発明を使用して、任意の数の作物害虫を柔軟かつ費用効果的に制御する能力を伴う
改良された作物の品質の完全な作物パッケージをもたらすことができる。
対象のＡＡＤ−１２酵素は、トランスジェニック発現を可能にして、ほぼ全ての広葉雑
草およびイネ科雑草を制御し得る除草剤の組合せに対する耐性をもたらす。ＡＡＤ−１２
は、例えば、他のＨＴＣ形質（例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イ
ミダゾリノン抵抗性、ブロモキシニル抵抗性など）、および昆虫抵抗性形質（Ｃｒｙ１Ｆ
、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ ３４／４５など）を積み重ねるための優れた除草剤耐性作物（
ＨＴＣ）形質としての機能を果たし得る。さらに、ＡＡＤ−１２は、第２の遺伝子または
遺伝子群を用いて遺伝子操作した植物の一次形質転換体を選択するために役立つ選択マー
カーとしての機能を果たし得る。
本発明のＡＡＤ−１２遺伝子は、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば２，４−Ｄ
Ｂ、ＭＣＰＢなど）に変換される化合物に対する抵抗性ももたらす。２，４−ＤＢ除草剤
に存在する酪酸部分は、β酸化によって植物毒性２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に変換
される。同様に、ＭＣＰＢは、β酸化によって植物毒性ＭＣＰＡに変換される。ブタン酸
除草剤は、それ自体は非除草性である。ブタン酸除草剤は、感受性植物においてβ酸化に
よってそれらのそれぞれの酸に変換され、それは植物毒性である除草剤の酢酸の形態であ
る。急速なβ酸化ができない植物は、ブタン酸除草剤による害を受けない。しかし、急速
なβ酸化ができる植物およびブタン酸除草剤を酢酸形態に変換することができる植物は、
その後にＡＡＤ−１２によって保護される。
除草剤を施用する方法は当技術分野で公知である。そのような施用は、２種以上の除草
剤のタンク混合物を含んでよい。本発明に従って使用するためのいくつかの好ましい除草
剤としては、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；ＭＣＰＢなどのフェノキシオーキシ
ン除草剤が挙げられる。これらに、１種または複数種の追加的な除草剤耐性遺伝子（複数
可）および対応する除草剤（例えばグリホサートおよび／またはグルホシネート）を積み
重ねることができる。１種、２種、３種、またはそれ以上の除草剤を、本開示の利益を有
する当業者に明白になる有利な組合せで使用することができる。本主題の除草剤の１種ま
たは複数種を圃場／地域に、本発明の種子を植え付ける前に施用することができる。その
ような施用は、例えば、植え付けの１４日間以内であってよい。本主題の除草剤の１種ま
たは複数種は、植え付け時および／または植え付け後であるが出芽前に施用することもで
きる。本主題の除草剤の１種または複数種は、土に（雑草を制御するために）、または雑
草および／または本発明のトランスジェニック植物の上から施用することもできる。本主
題の除草剤は、例えば、ある除草剤には耐性であるが、別の除草剤には耐性でない可能性
がある雑草を制御する、または防ぐために、交替させること、または組み合わせて使用す
ることができる。本主題の３種類の除草剤について、種々の施用時間を当技術分野で公知
の種々の方法で用いることができる。本発明は、ＡＡＤ−１２自生植物を制御するための
方法ももたらす。発明の名称が「CONTROL OF AAD DICOT VOLUNTEERS IN MONOCOT CROPS」
である同時に出願されたＰＣＴ出願を参照されたい。
本発明のＨＴＣ形質は、他のＨＴＣ形質（これらに限定されないが、グリホサート耐性
を含む）との新規の組合せにおいて使用することができる。これらの形質の組合せにより
、除草剤（例えば、グリホサート）に対する新しく獲得した抵抗性または固有の耐性によ
って雑草（および同様のもの）種を制御する新規の方法が生じる。したがって、ＨＴＣ形
質に加えて、トランスジェニック作物において、前記酵素によって除草剤耐性を創出する
、除草剤を使用して雑草を制御するための新規の方法は、本発明の範囲内である。
さらに、世界中で栽培されているグリホサート耐性作物が一般的である。他のグリホサ
ート耐性作物との輪作において多くの場合、グリホサート抵抗性自生植物を制御すること
は、輪作作物においては難しい。したがって、作物に個々に積み重ねた、または作物を個
々に形質転換した対象のトランスジェニック形質の使用は、他のＨＴＣ自生作物を制御す
るためのツールを提供する。
本発明の好ましい植物または種子は、そのゲノム内に、本明細書において同定される挿
入断片配列と、本明細書において同定される、挿入断片の両側の少なくとも２０〜５００
以上の連続した隣接ヌクレオチドを一緒に含む。別段の指定のない限り、隣接配列に言及
する場合、それは配列番号１について特定されたものを指す（上の表１を参照されたい）
。さらに、配列番号１は、元の形質転換体に挿入された異種ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのす
ぐ近接する例示的な隣接ゲノム配列を含む。これらの隣接配列の全部または一部は、イベ
ントを含む親系統の有性交雑の結果として挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが
予測され得る。
本発明は、本発明の植物の再生可能な細胞の組織培養物を包含する。また、そのような
組織培養物から再生された植物も、特に前記植物が例示されている品種の形態学的性質お
よび生理的性質の全てを発現することができる場合、包含される。本発明の好ましい植物
は、寄託されている種子から生長させた植物の生理的特性および形態学的特性の全てを有
する。本発明は、そのような種子および対象の品質形質を保有する種子の後代をさらに含
む。
植物または種子、またはその部位を操作（例えば、突然変異、さらなるトランスフェク
ション、およびさらに育種）することにより、「従属（本質的に由来する）」品種と称す
ることができるものが創出され得る。植物新品種保護国際同盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅ
ｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）（ＵＰＯＶ）は、ある品種が、保護された品種に由来し
ているかどうかを決定するための以下のガイドラインを提供した：
［Ａ］以下の場合、品種は別の品種（「原品種」）に本質的に由来するとみなされるべ
きである
（ｉ）原品種に主として由来する、または、それ自体が原品種に主として由来する品種に
由来し、同時に原品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的な特性の発現
を保持する；
（ｉｉ）原品種と明確に区別可能である；および
（ｉｉｉ）引き出す行為に由来する差異以外は、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組合
せから生じる本質的な特性の発現において原品種と一致する。
ＵＰＯＶの国際機関の第６回会議、ジュネーブ、１９９２年１０月３０日；当該連合の
事務局により作成された文書。
本明細書で使用される場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について、個体間で遺
伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世
代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の
親から栄養繁殖させることによって創出することができる。
本明細書で使用される場合、用語「栽培品種」および「品種」は同義であり、商業生産
のために使用される系統を指す。
「安定性」または「安定な」は、所与の構成要素に関しては、構成要素が代々、好まし
くは、少なくとも３世代、実質的に同じレベルで、例えば、好ましくは±１５％、より好
ましくは±１０％、最も好ましくは±５％で維持されることを意味する。安定性は、温度
、位置、ストレスおよび植え付け時間に影響を受ける可能性がある。その後の世代を圃場
条件下で比較することにより、構成要素が同様にもたらされるべきである。
「商業的有用性」は、従来の農業設備を使用して農業者が作物を生産することができる
ように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子
から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義さ
れる。商業的に有用であるために、種子の重量、油の含有量、および１エーカー当たりの
生産された油の総計によって測定した生産量は、同じ地域で栽培される高価値の形質を有
さない、別の匹敵する市販のキャノーラ品種の平均生産量の１５％以内である。
「作物学的に優良」は、系統が対象イベント（複数可）に起因する昆虫抵抗性に加えて
、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有することを意味す
る。以下の実施例に記載の、本発明のイベントを含む植物に個々に、または任意の組合せ
で獲得される作物学的形質は、本発明の範囲内である。これらの作物学的特性およびデー
タポイントの全てを使用して、そのような植物を、そのような植物を定義するために使用
する特性の範囲内の一点として、または一端もしくは両端で特定することができる。
本開示に照らして当業者に理解されるように、検出キットの好ましい実施形態は、例え
ば、「接合部配列」または「移行部配列」（ダイズゲノムの隣接配列と挿入断片配列が接
する場所）を対象とし、かつ／またはそれを含むプローブおよび／またはプライマーを含
んでよい。これは、例えば、上記の表１に示されている一方のまたは両方の接合部配列（
挿入断片と隣接配列が接する場所）を同定するために設計されたポリヌクレオチドプロー
ブ、プライマー、および／またはアンプリコンを含む。１つの一般的な設計は、隣接領域
内でハイブリダイズする１つのプライマー、および挿入断片内でハイブリダイズする１つ
のプライマーを有する。そのようなプライマーは、多くの場合、およそ、それぞれの長さ
が少なくとも約１５残基である。この配置を用いて、プライマーを使用して、本発明のイ
ベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成／増幅することができる。これらのプ
ライマーを使用して、上に示されている接合部配列にわたる（およびそれを含む）アンプ
リコンを生成することができる。
隣接配列に「接している」プライマー（複数可）は、一般には、約２００塩基を越えて
、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型的
な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って２００塩基の範囲内のどちら
かの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号１の残基約
２５３０〜２７３０および／または約９１２２〜９３２２由来の（またはそれとハイブリ
ダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、本発明の範囲内である。挿入プラ
イマーは、挿入断片のどこにでも同様に設計することができるが、残基約２７３１〜２９
３１および約８９２１〜９１２１を、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排
他的に使用することができる。
当業者は、さまざまな標準のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の下
で、配列番号１（または相補物）のセグメント、およびその相補物とハイブリダイズする
ようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここでプライマーまたはプロー
ブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう。すなわち、ある程度の
ミスマッチが容認され得る。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、一
般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライマーの内部または末端にある場合、
１または２ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくてよい。種々の適切なハイブリダイゼ
ーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体は、プローブ
にも使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡプローブ
およびＲＮＡプローブも使用することができる。重要なのは、そのようなプローブおよび
プライマーが、本発明のイベントの存在に対して特徴的である（独自に特定し、区別する
ことができる）ことである。
ＰＣＲ増幅において、例えば、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが
起こり得ることに留意するべきである。すなわち、別段の指定のない限り、本明細書にお
いて列挙されている配列は、ダイズのゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを生成し、次い
でそのアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮ
Ａから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考
慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が
見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエ
ラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本発明の範囲内であることを認識
し、留意するべきである。
例えば、イベントを創出する間に配列を挿入する場合、いくらかのゲノム配列が欠失す
ることは珍しくないことにも留意すべきである。したがって、本主題の隣接配列と、例え
ばＧＥＮＢＡＮＫに列挙されているゲノム配列との間にもいくらかの差異が出現する可能
性がある。
「挿入断片」の構成成分が図面に例示されており、以下の実施例においてより詳細に考
察されている。これらの構成要素のＤＮＡポリヌクレオチド配列、またはその断片を、本
発明の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用することができる。
本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物由来の植物および種子などにおける導入遺伝
子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書
において提供される本主題の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の接合部配列（配列番号１の
残基２７３０〜２７３１と残基９１２１〜９１２２の間）、そのセグメント、および例示
された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領
域の接合部配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、挿入部位に隣接しているダイズの
細胞由来のＤＮＡの接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントに対して特徴的
であり得る。
これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成す
ることができる。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用い
て生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型において
本発明のダイズ系統を同定することができることが実証された。これらおよび他の関連す
る手順を用いて、これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。したがって、そ
のようなプライマー対に由来するＰＣＲアンプリコンは独特であり、これらのダイズ系統
を同定するために使用することができる。
一部の実施形態では、新規の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の連続した断片を含むＤＮ
Ａ配列は本発明の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチド
および３つの上述のダイズ植物の１つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さ
のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列および／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複
数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である
配列が包含される。
関連する実施形態は、本明細書において特定されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号１お
よびそのセグメントなど）の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、または
その相補物、およびこれらの配列由来の同様の長さのダイズの隣接ＤＮＡ配列、またはそ
の相補物に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅方法において、ＤＮＡプライマーとし
て有用である。これらのプライマーを使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言
及されるダイズイベントのいずれかに対して特徴的である。したがって、本発明は、その
ようなＤＮＡプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも包含す
る。
本発明は、試料中の、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮＡの存在を
検出する方法も包含する。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのダイ
ズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき
、前記イベント（複数可）に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセッ
トと接触させるステップと；（ｂ）核酸の増幅反応を実施し、それによって、アンプリコ
ンを生成するステップと；（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含んでよい。
本発明の別の検出方法は、試料中の、前記イベントの少なくとも１つに対応するＤＮＡ
の存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下で前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡとハイブリ
ダイズさせ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物（対
象のイベントがないＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと；
（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するス
テップと；（ｃ）プローブのＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを
含む方法を包含する。
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のａａｄ−１２イベントを含むダイズ植物
を作出する方法であって、（ａ）第１の親ダイズ系統（前記系統の植物に前記除草剤抵抗
性形質を付与する本発明の発現カセットを含む）と第２の親ダイズ系統（この除草剤耐性
形質を欠く）を有性交雑し、それによって、複数の後代植物を作出するステップと；（ｂ
）分子マーカーを使用することによって後代植物を選択するステップとを含む方法を包含
する。そのような方法は、場合によって、後代植物を第２の親ダイズ系統と戻し交雑して
、前記昆虫耐性形質を含む真の育種（true-breeding）ダイズ植物を作出するさらなるス
テップを含んでよい。
本発明の別の態様によると、前記３種のイベントの任意の１つ（または複数）を用いて
交雑の後代の接合性を決定する方法が提供される。前記方法は、ダイズＤＮＡを含む試料
を本発明のプライマーセットと接触させるステップを含んでよい。前記プライマーは、前
記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において
使用したとき、前記ダイズイベントの少なくとも１つに対して特徴的である第１のアンプ
リコンを生成する。そのような方法は、核酸の増幅反応を実施し、それによって、第１の
アンプリコンを生成するステップと；第１のアンプリコンを検出するステップと；ダイズ
ＤＮＡを含む試料を、ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使
用したとき、ダイズのゲノム領域と相同なネイティブなダイズのゲノムＤＮＡを含む第２
のアンプリコンを生成する前記プライマーセットと接触させるステップと；核酸の増幅反
応を実施し、それによって、第２のアンプリコンを生成するステップとをさらに含む。こ
の方法は、第２のアンプリコンを検出するステップと、試料中の第１のアンプリコンと第
２のアンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンが存在することに
より、試料が、導入遺伝子挿入物についてヘテロ接合性であることが示されるステップと
をさらに含む。
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示されている組成物およびＤＮＡの検出の技術分野
で周知の方法を使用して開発することができる。このキットは、試料中の対象のダイズイ
ベントＤＮＡを特定するために有用であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種する
ための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアン
プリコンと相同または相補的であるＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝
エレメントに含有されるＤＮＡと相同または相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これら
のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡのハイブリダイゼーション方法
においてプローブとして、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために
必要な試薬および材料も含有することができる。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元
素、リガンド、化学発光剤、または酵素など）を付着させた単離された核酸分子である。
そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合では、ダイズ植物由来であるかイベ
ント由来のＤＮＡを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベントの１つ由来
のゲノムＤＮＡの鎖と相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸または
リボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検
出するために使用することができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖とアニ
ーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラ
ーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離され
た／合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれら
の使用を指す。
プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、
２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４
０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３
、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、
６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８
０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３
、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１
０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１
１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１
２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１
３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１
４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１
５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１
６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１
７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１
８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１
９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２
０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２
１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２
２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２
３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２
４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２
５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２
６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２
７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２
８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２
９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３
０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３
１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３
２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３
３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３
４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３
５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３
６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３
７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３
８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３
９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４
０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４
１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４
２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４
３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４
４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４
５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４
６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４
７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４
８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４
９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチドまたはそれ以上
の長さである。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリ
ダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明に
よるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列と
は異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを従来の方法によって
設計することができる。
プローブおよびプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laborato
ry Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。ＰＣＲのプライマー対
は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用すること
によって得ることができる。
本明細書に開示されている隣接ＤＮＡおよび挿入断片の配列に基づくプライマーおよび
プローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし
、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること（および、必要であれ
ば、補正すること）ができる。
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配
列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅の方法を
使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を特定することがで
きる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリ
ダイズすることができる。本明細書で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの分子が
、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハイブリダイ
ズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、そ
の「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一方のあらゆ
るヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと
言える。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いとア
ニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズ
することができる場合、「最小限相補的」であると言える。同様に、分子は、従来の「高
ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするた
めに十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言
える。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年に記載されている。したが
って、完全な相補性から逸脱することは、そのような逸脱により、二本鎖構造を形成する
分子の能力が完全に妨げられない限りは許容できる。核酸分子がプライマーまたはプロー
ブとしての機能を果たすためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構
造を形成できるために十分に配列内で相補的であることのみが必要である。
本明細書で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比
較されている核酸配列の相補物と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列である。用語「
ストリンジェントな条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55において考察されている
特定のハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブの標的核酸（すなわち、対象と
する特定の核酸配列）とのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambro
okら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。したがって、本発明のヌク
レオチド配列は、相補的なＤＮＡ断片のひと続きと２重鎖分子を選択的に形成するそれら
の能力に関して使用することができる。
構想される適用に応じて、プローブの標的配列に対する選択性のさまざまな程度を実現
するためにハイブリダイゼーションのさまざまな条件を使用することができる。高い選択
性を必要とする適用のために、一般には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリン
ジェントな条件を用いることがある、例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ
〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされるような比較的低塩かつ／または高温の条
件を選択することがある。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション
濾過器を高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃
）で少なくとも２回洗浄することを伴ってよい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進
する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエ
ン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することは、当業者に
公知である。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシーである５０
℃で約２．０×ＳＳＣから高ストリンジェンシーである５０℃で約０．２×ＳＳＣまでか
ら選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー
条件である室温、約２２℃から高ストリンジェンシー条件である約６５℃まで増加させる
ことができる。温度と塩との両方が変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれ
かは、他方の変数が変化する一方で一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、も
しあれば、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡ配列を検出することは当業者に周知であり、米国特許第４，
９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分
析の方法の例である。
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細
書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー（またはア
ンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と特異的にハイブリダイズする。本発明
の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、本明細書において例示された配列の１つに
記載されている核酸配列、またはその相補物および／もしくは断片を有する。
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と、８０％
から１００％の間または９０％から１００％の間の配列同一性を共有する。本発明の別の
態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と９５％から１００％の間の配
列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を特定するための植物育種方
法において、マーカーとして使用することができる。プローブの標的ＤＮＡ分子とのハイ
ブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によって検出することができ、そ
れらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよ
び化学発光タグを挙げることができる。
特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関
して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはそ
の相補物）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること
、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件であ
る。
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダ
イズすることを示す。
本明細書で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳
型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交雑によって生じたダ
イズ植物が、本発明のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有
するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを、挿入され
た異種ＤＮＡの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプライマー、お
よび挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を使用して、
イベントＤＮＡの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増幅方法に供
することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対して特徴的で
ある配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ足す１ヌク
レオチド塩基対、および／またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３
、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、
４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６
０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３
、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、
８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１
００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１
１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１
２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１
３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１
４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１
５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１
６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１
７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１
８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１
９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２
００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２
１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２
２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２
３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２
４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２
５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２
６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２
７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２
８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２
９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３
００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３
１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３
２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３
３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３
４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３
５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３
６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３
７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３
８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３
９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４
００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４
１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４
２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４
３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４
４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４
５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４
６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４
７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４
８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４
９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、ま
たは５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれ
以上のヌクレオチド塩基対（上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは引く）にわ
たってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を含むアンプ
リコンが生成されるように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列に由来してもよい。植物のゲノ
ム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離に位置してよ
い。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対までにわたる
ことができる。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成される
可能性があるプライマー二量体を特に除外する。
核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で公知の種々の核
酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で
公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，
２０２号に記載されている。２２ｋｂに至るまでのゲノムＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ
増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野で公知の他の方
法を、本発明の実施において使用することができる。本明細書において提供される配列に
由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後ＰＣＲアン
プリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定を行うことにより、本
主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または隣接ゲノム配列
を検証すること（および必要であれば、補正すること）ができる。
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技法によって検出することが
できる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、ＤＮＡアンプリ
コンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノム
ＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチド
を設計する遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、
マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のＰＣＲ後（挿入配
列内の１つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の１つのプライマーを使用する
）、一本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したｄｄＮＴＰを使用する一塩
基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。読み取りは、蛍光またはＥＬＩＳＡに基づ
いてよい。信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長に起
因して、挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00巻:18〜24頁、2000年）に記載されてい
るようなパイロシークエンス技法である。この方法では近接するゲノムＤＮＡと挿入ＤＮ
Ａの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチ
ドを、対象の領域（挿入配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプラ
イマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ
、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸およびル
シフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個々に加え、それが取り込まれた
結果、測定される光信号がもたらされる。光信号により、増幅、ハイブリダイゼーション
、および単一塩基または多塩基の伸長が上首尾であり、したがって導入遺伝子挿入断片／
隣接配列が存在することが示される。
蛍光偏光は、本発明のアンプリコンを検出するために使用することができる別の方法で
ある。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡの接
合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿
入ＤＮＡ内の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）由来
の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄ
ｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰが取り込まれる
。取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化として測定することができる。偏光の変
化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長の成功によって、導入遺伝子挿
入断片／隣接配列が存在することを示す。
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べると
、ゲノムの隣接と挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチド
プローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１
つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼお
よびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。特異的な増幅の間に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼにより、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部分が離れて除かれ、放
出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接配
列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
配列の検出において使用するための分子ビーコンが記載されている。簡単に述べると、
隣接ゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチ
ドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの独特の構造により、蛍光部分およびクエンチ
ング部分が極めて近傍に保たれる二次構造が含有される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲ
プライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプラ
イマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＰＣＲ増
幅が上手くいった後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズすることにより、プ
ローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間的に分離される。
蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーション
の成功によって、隣接ゲノム配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
ダイズゲノム内の挿入するために優れた位置を開示し、本発明は、この遺伝子位置の概
ね近くに少なくとも１つの非ａａｄ１２挿入断片を含むダイズ種子および／またはダイズ
植物も含む。１つの選択肢は、本明細書において例示されているａａｄ−１２挿入断片を
異なる挿入断片で置換することである。これらの一般的な点については、例えば、本発明
に従って、標的化相同組換えを使用することができる。この種類の技術は、例えば、ＷＯ
０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開された米国特許出願（Ｕ．Ｓ．２００３／０
２３２４１０）の主題である。したがって、本発明は、本明細書において同定される隣接
配列の全てまたは認識できる部分（例えば、配列番号１の残基１〜２７３０および残基９
１２２〜１０，２１２）が隣接する異種挿入断片（多コピーのａａｄ−１２の代わりにま
たはそれと一緒に）を含む植物および植物細胞を包含する。ａａｄ−１２遺伝子の１つの
追加的なコピー（または複数の追加的なコピー）も、この／これらのように挿入の標的と
することができる。
植物細胞の特定の染色体上の部位内に、相同組換えによってポリヌクレオチド配列を組
み込むための方法は、当技術分野の範囲内で記載されている。例えば、米国特許出願公開
第２００９／０１１１１８８Ａ１号に記載の部位特異的な組み込みでは、ドナーポリヌク
レオチド配列の染色体上の標的への導入を媒介するためのリコンビナーゼまたはインテグ
ラーゼの使用が記載されている。さらに、国際的な特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０
７号には、１つまたは複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に組み
込むためのジンクフィンガー媒介相同組換えが記載されている。米国特許第６，７２０，
４７５号に記載のＦＬＰ／ＦＲＴまたは米国特許第５，６５８，７７２号に記載のＣＲＥ
／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用を利用して、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体
上の部位に組み込むことができる。最終的に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体上
の位置に標的化するためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻(1996年
)5055〜5060頁に記載されている。
植物細胞内に部位特異的に組み込むための他の種々の方法は、一般に、公知であり、適
用可能である（Kumarら、Trands in Plant Sci. 6巻(4号)(2001年) 155〜159頁）。さら
に、いくつかの原核生物および下等真核生物において同定された部位特異的な組換え系を
植物における使用に適用することができる。そのような系の例としては、これらに限定さ
れないが、酵母であるジゴサッカロマイセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）の
ｐＳＲ１プラスミド由来のＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら(1985年)J. Mol. Biol. 1
82巻：191〜203頁）、およびファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann(1
991年)Mol. Gen. Genet. 230巻：170〜176頁）が挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導
入遺伝子（複数可）を組み込む、または積み重ねることが望ましい場合がある。トランス
ジェニックイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現、ならびに
多数の環境区域における、およびそれ全てにわたる除草剤耐性および農業生産力を含めた
効力の優れた組合せなどの独特の特性に基づいて選抜された好ましいゲノム遺伝子座と考
えることができる。新しく組み込まれた導入遺伝子は、既存の形質転換体の導入遺伝子の
発現特性を維持すべきである。さらに、新しく組み込まれたイベントのゲノム隣接配列お
よび染色体上の位置はすでに同定されているので、新しく組み込まれたイベントを検出し
、確認するためのアッセイの開発は克服されるであろう。最終的に、既存の導入遺伝子に
連結された特定の染色体上の位置に新しい導入遺伝子を組み込むことにより、従来の育種
方法を使用した有性異系交雑による導入遺伝子の他の遺伝的背景への遺伝子移入が促進さ
れる。
本発明の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列
を削除することが望ましい場合がある。例えば、米国特許仮出願第６１／２９７，６２８
号に記載の導入遺伝子の削除では、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントか
ら、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を除去するためのジンクフィンガ
ーヌクレアーゼの使用が記載されている。除去されるポリヌクレオチド配列は、選抜マー
カーであってよい。ポリヌクレオチド配列を削除および除去したら、改変されたトランス
ジェニックイベントを、ポリヌクレオチド配列を挿入することによって再標的化すること
ができる。ポリヌクレオチド配列を削除し、その後、改変されたトランスジェニックイベ
ントを再標的化することにより、選抜マーカーの再使用、または特定の遺伝子が発現する
ことによって生じる、植物のトランスクリプトームに対する意図されたものではない変化
を克服する能力などの利点がもたらされる。
本発明は、本明細書において、異種核酸を挿入するために優れた、ダイズゲノム内の第
４染色体上の特定の部位を開示している。第４染色体上のターゲティング部位の位置を同
定することにおいて有用な５’分子マーカー、３’分子マーカー、５’隣接配列、および
３’隣接配列も開示されている。したがって、本発明は、対象の異種核酸をこの予め確立
した標的部位に、またはこの標的部位の付近に導入するための方法を提供する。本発明は
、開示されている標的部位またはそのような部位の概ね近くに挿入された任意の異種ヌク
レオチド配列を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も包含する。そのような標的化
組み込みを実現するための１つの選択肢は、本明細書において例示されているｐａｔ発現
カセットの代わりに異なる挿入断片を削除することおよび／または置換することである。
この一般的な点について、例えば、またこれらに限定することなく、本発明に従って標的
化相同組換えを使用することができる。
本明細書で使用される場合、遺伝子、イベントまたは形質を「積み重ねること（stacki
ng）」は、所望の形質を１つのトランスジェニック系統内に組み合わせることである。植
物育種家は、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑を行い、次にこれらの所望の形
質を両方とも有する子孫を同定することによってトランスジェニック形質を積み重ねる。
遺伝子を積み重ねるための別の方法は、形質転換の間に、２種以上の遺伝子を同時に植物
の細胞核に伝達することによる。遺伝子を積み重ねるための別の方法は、トランスジェニ
ック植物を、対象とする別の遺伝子を用いて再形質転換することによる。例えば、遺伝子
を積み重ねることを用いて、例えば、２種以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数
可）と病害抵抗性形質（複数可）、２種以上の除草剤への抵抗性形質、および／または昆
虫抵抗性形質（複数可）と除草剤抵抗性の形質（複数可）を含めた２種以上の異なる形質
を組み合わせることができる。対象の遺伝子に加えて選抜マーカーを使用することも、遺
伝子を積み重ねることと考えることができる。
「相同組換え」とは、２種のヌクレオチド配列が相互作用して（組み換えられて）新し
い組換えＤＮＡ配列を形成し得る類似したヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有
するヌクレオチド配列の任意の対の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は
、本明細書ではそれぞれが「相同配列」と称される。一般に、相同組換えの頻度は、相同
配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一には満たない
２つのヌクレオチド配列間で起こり得るが、組換え頻度（または効率）は、２つの配列間
の相違が増加するにつれて減退する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれの
１つの相同配列を使用して実現することができ、それによって「単一乗換え」組換え産物
を生成することができる。あるいは、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配
列のそれぞれに２つの相同配列を置くことができる。ドナー上の２つの相同配列と標的上
の２つの相同配列との間の組換えにより、「２重乗換え」組換え産物が生成する。ドナー
分子上の相同配列が、操作される配列（例えば、対象の配列）に隣接する場合、標的分子
との２重乗換え組換えにより、対象の配列が元々標的分子上の相同配列の間にあったＤＮ
Ａ配列と交換された組換え産物がもたらされる。２重乗換え組換えイベントによって標的
とドナーとの間でＤＮＡ配列を交換することは、「配列交換」と称される。
本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物
は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明
細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明を実施するための手順を例示するため、および本発明のある特
定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これらの実施例は、限定するものと解
釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示されている技法は、それを実施
するための好ましい方式を例示するために使用される特定の手法を表していることが理解
されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱す
ることなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これらの特定の実施形態において多
くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の指定のない限り、全ての百分率
は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の割合は体積による。
別段の指定のない限り、以下の略語が使用されている。
ＡＡＤ−１２ アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１
ｂｐ 塩基対
℃ 摂氏温度
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＩＧ ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ キロベース
μｇ マイクログラム
μＬ マイクロリットル
ｍＬ ミリリットル
Ｍ モル質量
ＯＬＰ オーバーラッププローブ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ 植物転写単位
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ 標準操作手順
ＳＳＣ 塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．
０
ＴＢＥ トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３
Ｖ ボルト
［実施例］
ａａｄ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の形質転換および選抜
トランスジェニックダイズ（Glycine max）イベントＤＡＳ−６８４１６−４を、ダイ
ズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。Ｔ鎖ＤＮＡ領域
内に選抜マーカー（ｐａｔ）および対象の遺伝子（ａａｄ−１２）と一緒にバイナリーベ
クターｐＤＡＢ４４６８（図１）を保有する武装解除したアグロバクテリウム株ＥＨＡ１
０１（Hoodら、2006年）を使用して形質転換を開始した。
Zengら（Zengら、2004年）の手順を改変して用いてアグロバクテリウム媒介形質転換を
行った。簡単に述べると、ダイズ種子（Ｍａｖｅｒｉｃｋ栽培品種）を基本培地上で発芽
させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。アグロバクテリウムを除去す
るために、苗条誘導（shoot initiation）培地、苗条伸長培地、および発根培地にセフォ
タキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネートによる選択を使
用して、形質転換されていない苗条の生長を阻害した。選択された苗条を、根を発生させ
るために発根培地に移し、次に、小植物を順化させるために土壌混合物に移した。
選択された小植物の頂小葉にグルホシネートを塗布して推定形質転換体についてスクリ
ーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して、気候順化させ、次に葉にグ
ルホシネートを塗布して耐性を再確認し、推定形質転換体であるとみなした。スクリーニ
ングされた植物の試料を採取し、選択マーカー遺伝子および／または対象の遺伝子を確認
するための分子解析を行った。Ｔ０植物を温室内で自家受精させてＴ１種子を生じさせた
。
Ｔ１植物を戻し交雑し、優良な生殖質（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）に遺伝子移入した。このイ
ベント、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、独立した形質転換分離株から生成し
た。イベントをその独特の特性、例えば、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安
定発現、ならびに広範な遺伝子型背景および多数の環境全ての区域にわたる除草剤耐性お
よび農業生産力を含めた効力の優れた組合せに基づいて選抜した。以下の実施例は、ダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を特徴付けるために使用したデータを含有する。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のサザンブロットによる特徴付け
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１８−４の組み込みパ
ターンを確立した。これらの実験により、ａａｄ−１２導入遺伝子のダイズゲノム内への
組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４
１８−４は、プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来のａａｄ−１２ＰＴＵの単一コピーを含有
する全長の、単純な組み込みイベントであると特徴付けられた。
サザンブロットのデータにより、ｐＤＡＢ４４６８Ｔ鎖断片がダイズイベントＤＡＳ−
６８４１８−４のゲノムに挿入されたことが示唆された。詳細なサザンブロット分析を、
ｐＤＡＢ４４６８のＴ鎖組み込み領域に含有されるａａｄ−１２遺伝子に特異的なプロー
ブ、およびプラスミド内に位置する切断部位を有し、プラスミドまたはプラスミドとダイ
ズのゲノムＤＮＡの接合部にわたる断片（境界断片）内にハイブリダイズ断片を生じる説
明的な制限酵素を使用して行った。サザンハイブリダイゼーションによって示された制限
酵素とプローブの組合せについての分子量は、このイベントに独特であり、その同定パタ
ーンを確立した。これらの分析により、ａａｄ−１２ＰＴＵの再配置を伴わずにプラスミ
ド断片がダイズのゲノムＤＮＡに挿入されたことも示された。
実施例２．１
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を含有する個々のダイズ植物から回収した葉組
織からゲノムＤＮＡを抽出した。さらに、ａａｄ−１２遺伝子が存在しない物質系統の代
表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるＭａｖｅｒｉｃｋからｇＤＮＡを
単離した。
標準のＣＴＡＢ法の後、凍結乾燥した葉組織から個々のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出
した後、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）を使用して分光蛍光分析によって定量した。次いで、ＤＮＡをアガロースゲル
上で可視化してＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ分析からの値を確認し、ＤＮＡの質を決定した。
実施例２．２
ＤＮＡの消化および分離
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４をサザンブロットによって分子キャラクタリゼ
ーションするために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消化した。ダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖ
ｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、各ＤＮＡ試料にＤＮＡ１μｇ当たりおよそ５ユニット
の選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えることによって消化した。各試料
を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。消化のために、制限酵素ＳｐｅＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、およびＰａｃＩを個々に使用した（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ、Ｉｐｓｗ
ｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡで
あるｐＤＡＢ４４６８を非トランスジェニックダイズ品種であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来の
ゲノムＤＮＡと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ反
応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。消化物を一晩イ
ンキュベートした後、ＮａＣｌを、最終濃度が０．１Ｍになるまで加え、消化されたＤＮ
Ａ試料を、イソプロパノールを用いて沈殿させた。沈殿したＤＮＡペレットを、１×ロー
ディング緩衝液（０．１％ブロモフェノールブルー、１００ｍＭのＥＤＴＡ、５０％グリ
セロール、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）２０μｌに再懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試
料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いた０．８５％アガロースゲルにより、３５
ボルトでおよそ１８〜２２時間、電気泳動して断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジ
ウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外線（Ｕ
Ｖ）の下で可視化した
実施例２．３
サザン転写およびメンブレン処理
サザンブロット分析をSeversonら（1997年）に記載されている通り実施した。ＤＮＡ断
片を電気泳動によって分離し、ＵＶ光の下で可視化した後、ゲルを変性溶液（１５０ｍＭ
のＮａＯＨ、３ｍＭのＥＤＴＡ）中におよそ２０分間浸し、次いで、中和溶液（１５０ｍ
ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．８）に移し少なくとも２０分間置いた。ナイロンメンブレン（
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ、ＩＮ）へのサザン転写を
、転写緩衝液（２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、ｐＨ１０）を伴うウィッキング系を用
いて一晩実施した。転写後、メンブレンを６５℃で約２時間、加熱乾燥することによって
ＤＮＡをメンブレンに結合させた。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのため
のサザンブロットメンブレンの準備ができた。
実施例２．４
ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を検出した。こ
の実験のために使用したプローブは、プラスミドｐＤＡＢ４４６８の特定のヌクレオチド
領域に対するプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって生成した。増幅されたＰＣＲ断片
をアガロースゲルから単離し、精製し、ハイブリダイゼーションプローブのための鋳型と
して使用した。サザンブロットハイブリダイゼーションプローブを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ ＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ（商標）ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を製造者の説明書に従って使
用したランダムプライミングによってα３２Ｐに特異的なヌクレオチドで標識し、ＰＲＯ
ＢＥＱＵＡＮＴ（商標）Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）によって精製した。この実
験のために使用したプローブが記載された表は、表２に記載されている。プレハイブリダ
イゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉ、ＭＯ）を使用して６５℃で４時間行った。次いで、プレハイブリダイゼーショ
ン溶液をデカントし、水で５分間煮沸することによって予め変性させた所望の量の特異的
なプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液と交換した。ハイブリダイゼーション
／プローブ混合物をナイロンメンブレンと一緒に６５℃で一晩インキュベートした。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを６５ｏＣ、洗浄緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナ
トリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ
、リン酸を用いて調整ｐＨ７．８に調整した）で２０分間、３回洗浄した。洗浄したフィ
ルターをオートラジオグラフィーのためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンに曝
露させ、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを、プローブについて
実証した。さらに、サザンブロットにおいて分子量マーカーを使用してハイブリダイズ断
片サイズを決定した。
実施例２．５
サザンブロットの結果
ａａｄ−１２ＰＴＵの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブに関
して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表３に示されている。予測され
た断片サイズは、ｐＤＡＢ４４６８のプラスミドマップ（図１）に基づき、観察された断
片サイズは、これらの分析から概算したものであり、α３２Ｐで標識されたＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＩＩ断片の指示サイズに基づく。
これらの消化およびハイブリダイゼーションから２種類の断片を同定した：公知の酵素
部位がプローブ領域に隣接し、ａａｄ−１２ＰＴＵの挿入領域内に完全に含有されている
内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置し、第２の部位がダイズ
ゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、ＤＮＡ断片の組み込み部位はそ
れぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベントごとに変動する。境界
断片により、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位を位置づける手段およびＤＮＡ挿
入物の数を評価する手段がもたらされる。イベントＤＡＳ−６８４１６−４を含有するダ
イズの３世代に対して完了したサザンブロット分析により、プラスミドｐＤＡＢ４４６８
由来の低コピー、インタクトなａａｄ−１２ＰＴＵが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１
６−４のダイズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。
制限酵素ＳｐｅＩおよびＫｐｎＩは、プラスミドｐＤＡＢ４４６８に独特の制限部位を
含有する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるａ
ａｄ−１２遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。５，４３６ｂｐより大きいまた
は５，３８３ｂｐより大きい境界断片は、それぞれＳｐｅＩおよびＫｐｎＩで消化した後
、ａａｄ−１２遺伝子プローブとハイブリダイズすることが予測された（表３）。それぞ
れＳｐｅＩおよびＫｐｎＩを使用したとき、約１２，０００ｂｐおよび約１６，０００ｂ
ｐの単一のａａｄ−１２ハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサ
イズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
のダイズゲノム内にａａｄ−１２遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆さ
れる。制限酵素ＰａｃＩを、ａａｄ−１２植物転写単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子
／ターミネーター）を含有する２，９０４ｂｐの断片を放出させるために選択した（表３
）。予測された２，９０４ｂｐの断片は、ＰａｃＩ消化した後、ａａｄ−１２遺伝子プロ
ーブを用いて観察された。全３種の酵素を用いてＤＡＳ−６８４１６−４試料を消化し、
その後ａａｄ−１２遺伝子プローブとハイブリダイズさせることで得られた結果により、
プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来のインタクトなａａｄ−１２ＰＴＵの単一コピーがダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のダイズゲノムに挿入されたことが示された。
実施例２．６
骨格配列が存在しないこと
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子が存在する
こと、または存在しないことをモニターするために、多重ＰＣＲアッセイを実施した。実
験は、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子コード配列の５つの異なる領域および内部標準と
して内在性のダイズレクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ：Ｋ００８２１ Ｍ３
０８８４）配列内の４０７ｂｐ領域を検出するために設計した。さらに、以下の対照を含
めた：（ｉ）スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡを付加した形
質転換されていないダイズのゲノムＤＮＡを用いた陽性対照；（ｉｉ）形質転換されてい
ないダイズ、Ｍａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを用いた陰性対照；および（ｉｉｉ）
ゲノムＤＮＡを有さないブランク。
ダイズ由来のゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢ法を使用して単離し、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎを
使用して定量した。各試料のＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μｌに正規化した。ＰＣＲ反応を
、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子コード配列およびレクチン遺伝子配列に特異的なプラ
イマー配列を使用して実施した。この反応物を、試料当たりＰＣＲ産物２０μｌを２％Ｅ
ゲルにローディングすることによって分析した。
Ｅゲル上に多数のアンプリコンが存在すること（１００ｂｐ、１５０ｂｐ、および４０
７ｂｐのバンド）は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４がスペクチノマイシン抵抗
性遺伝子コード配列を含有することを示すことになる（スペクチノマイシン抵抗性遺伝子
コード配列について、１００ｂｐおよび１５０ｂｐの増幅されたバンドが予測される）。
内部標準であるレクチン遺伝子配列に対応する４０７ｂｐのアンプリコンのみが存在する
場合、そのことは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４がスペクチノマイシン抵抗性
コード配列を含有しないことを示す。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のＤＮＡ試料では、１００ｂｐまたは１５
０ｂｐの断片は増幅されなかった。４０７ｂｐ断片のみが増幅された。しかし、スペクチ
ノマイシン抵抗性遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡをダイズのゲノムＤＮＡに加えた陽
性対照には１００ｂｐ、１５０ｂｐ、および４０７ｂｐの増幅断片が存在した。形質転換
されていないダイズ由来のＤＮＡを含有する陰性対照では、単一の４０７ｂｐ断片が増幅
された。最終的に、いかなるゲノムＤＮＡも含有しない反応物からは、いかなる増幅断片
も産生されなかった。そのように、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４においてスペ
クチノマイシン抵抗性コード配列は検出されなかった。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および隣接境界領域におけるＤＮＡ
配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４のＴ鎖ＤＮＡ挿入断片および隣接ゲノムＤＮＡ境界領域の配列を決定した。２，７３０
ｂｐの５’隣接境界配列、１，０９１ｂｐの３’隣接境界配列、および６，３９１ｂｐの
Ｔ鎖挿入断片を含む、全部で１０，２１２ｂｐのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
ゲノム配列（配列番号１）を確認した。配列解析により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４
１６−４が、予測されたＴ鎖挿入断片から配列が変動することなく、ＭＡＲエレメント、
ａａｄ−１２発現カセット、およびｐａｔ発現カセットを含有するインタクトな導入遺伝
子の単一コピーを含有することが検証された。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および境界の配列に基づくＰＣＲ増
幅により、境界領域がダイズ起源であること、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４をイベント特異的に同定するために接合領域を使用することができることが検証され
た。隣接境界配列を含めた接合領域にわたる配列を分析することにより、Ｔ鎖の挿入によ
って生じるいかなる新規のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ＞＝１５０ コドン）
も同定されなかった。さらに、Ｔ鎖の挿入部位を、非トランスジェニックダイズのゲノム
から同定された隣接境界配列の領域に対応するゲノムの断片をクローニングすることによ
って特徴付けた。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を野生型ゲノム配列と比較する
ことにより、元の遺伝子座からの５５ｂｐの欠失およびイベントの３’組み込み接合部に
おける９ｂｐの挿入が明らかになった。全体的に、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４の挿入断片および境界配列を特徴付けることにより、Ｔ鎖の単一の、インタクトなコピ
ーがダイズゲノム内に存在することが示された。
実施例３．１
ゲノムＤＮＡの抽出および定量
凍結乾燥した葉組織または粉砕したての葉組織から、改変したＣＴＡＢ法を使用してゲ
ノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡ試料を１×ＴＥ（１０ｍＭの
トリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、
ＭＯ）に溶解させ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ法を製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の説明書に従って使用して定量した。ＰＣＲ分析のために、ＤＮ
Ａ試料を分子生物学グレードの水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で
希釈して、濃度を１０〜１００ｎｇ／μＬにした。
実施例３．２
ＰＣＲプライマー
表４には、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＤＮＡ挿入断片および隣接境界領
域をクローニングし、確認するために使用したプライマー配列が、図２で記した位置およ
び説明とともに列挙されている。全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された
。プライマーを、原液については水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）
に溶解させて濃度を１００μＭにし、検量線用溶液については１０μＭの濃度まで水で希
釈した。
実施例３．３
ゲノムウォーキング
ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を製造者の説
明書に従って使用して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についてｐＤＡＢ４４６
８Ｔ鎖挿入断片の５’隣接境界領域および３’隣接境界領域をクローニングした。ダイズ
イベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のゲノムＤＮＡおよそ２μｇをＥｃｏＲＶおよびＰ
ｖｕＩＩを用いて一晩消化した（図２）。ＤＮＡ消化物を、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−２５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、
ＣＡ）を使用して精製し、その後ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）アダプターとライゲ
ーションしてＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーを構築した。ＧＥＮＯＭＥ
ＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーのそれぞれを、アダプタープライマーＡＰ１（このキ
ットで提供される）および構築物特異的プライマーであるＥＳ＿ＬＥｎｄ０３またはＥＳ
＿ＰＡＴＥｎｄ０３（表４）を用いた一次ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡ鋳型として使用した
。次に、一次ＰＣＲ反応物１：２５希釈物１マイクロリットル（１μＬ）を、このキット
で提供されるネステッドアダプタープライマーＡＰ２およびネステッド構築物特異的プラ
イマーであるＥＳ＿ＬＥｎｄ０４またはＥＳ＿ＰＡＴＥｎｄ０４（表４、７および図２）
を用いた二次ＰＣＲ増幅ための鋳型として使用した。
実施例３．４
従来のＰＣＲ
標準のＰＣＲを使用してダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および境界
配列をクローニングし、確認した。従来のＰＣＲ増幅ために、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴＡ
Ｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）、ＨＯＴＳＴＡ
ＲＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、ＨＩ
ＧＨ ＦＩＤＥＬＩＴＹ（商標）ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉ
ｎｃ）、またはＥＡＳＹ−Ａ（商標）高忠実度ポリメラーゼキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を製造者の推奨手順に従って使用した。特定のＰＣＲ条件お
よびアンプリコンの説明が表５、６、および７に列挙されている。
実施例３．５
ＰＣＲ産物の検出、精製、ＰＣＲ産物のサブクローニング、および配列決定
ＰＣＲ産物を１．２％または２％Ｅ−ＧＥＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製品の説明書に従って使用して電気泳動によって検査した。Ｄ
ＮＡマーカーと比較することによって断片サイズを推定した。必要であれば、ＱＩＡｑｕ
ｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃ
Ａ）を使用して１％アガロースゲルから断片を切り取って１×ＴＢＥ（８９ｍＭのトリス
−ホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）に入れ、臭化エチジウムで染色することによ
ってＰＣＲ断片を精製した。
ＰＣＲ断片を、配列決定するためにＴＯＰＯ ＴＡ ＣＬＯＮＩＮＧ（登録商標）ＫＩ
Ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製品の説明書に従って使用して
ＰＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにサブクローニングした。詳細に
は、製造者の説明書に従って、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング反応物２〜５マイクロ
リットルをＯｎｅ Ｓｈｏｔ化学的コンピテントなＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換し
た。クローニングされた断片を、プラスミドＤＮＡをミニプレップした後に（ＱＩＡｐｒ
ｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＥｃｏＲＩで制限
消化することによって、またはＴ３プライマーおよびＴ７プライマーを使用したダイレク
トコロニーＰＣＲによって検証した。次に、選択されたコロニーのプラスミドＤＮＡまた
はグリセロールストックを配列決定するために外部委託した。
サブクローニングした後、予測されたＤＮＡ断片がクローニングされたことを確認する
ために、推定標的ＰＣＲ産物について最初に配列決定した。予測されたＤＮＡ断片を含有
するコロニーを選択して、プライマーウォーキングによる二本鎖の全長についての配列決
定を完了した。配列決定は全て、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって行
われた。
挿入断片および境界配列の最終的な組立てを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）ソフ
トウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ
）を使用して完了した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片およびその隣
接境界配列のアノテーションを、ベクターＮＴＩ（バージョン１０および１１、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して実施した。
ＧｅｎＢａｎｋの非冗長ヌクレオチドデータベースに対してＢＬＡＳＴプログラムを使
用して相同性検索を実施した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（バージョン１１、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を使用したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）解析を実施して、ダイズイ
ベントＤＡＳ−６８４１６−４の完全な挿入断片および隣接境界配列、ならびに野生型Ｍ
ａｖｅｒｉｃｋダイズ系統の元の遺伝子座におけるＯＲＦ（≧１５０コドン）を同定した
。
実施例３．６
５’末端境界配列
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラ
リーのそれぞれから、導入遺伝子の５’末端に対して特異的なネステッドプライマーセッ
トを使用してＤＮＡ断片を増幅した。ＥｃｏＲＶ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ラ
イブラリーから約１．８ｋｂの断片、およびＰｖｕＩＩ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商
標）ライブラリーから約３ｋｂの断片が観察された。これらの断片を、ＰＣＲ（登録商標
）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングした。ヌクレオチド配列のデータを
生成するために、末端配列決定用にそれぞれのライブラリーについて５つのコロニーを無
作為に選定した。プライマーウォーキングによって完全な配列を得るために、両方のＰＣ
Ｒプライマーの配列を含有するコロニーを選択した。配列解析により、ダイズイベントＤ
ＡＳ−６８４１６−４のＥｃｏＲＶ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーか
ら増幅されたクローンが１，７４４ｂｐのＤＮＡ断片を含有すること、およびダイズイベ
ントＤＡＳ−６８４１６−４のＰｖｕＩＩ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラ
リーから増幅されたクローンが３，０４７ｂｐのＤＮＡ断片を含有することが明らかにな
った。配列解析により、ＥｃｏＲＶ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーか
ら得られたＤＮＡ断片とＰｖｕＩＩ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーク
ローンから得られたＤＮＡ断片が、プライマーＥＳ＿ＬＥｎｄ０４とＥｃｏＲＶ部位との
間の領域においてオーバーラップしていることが明らかになった。これらのＤＮＡ断片は
全て、導入遺伝子内にＴ鎖境界Ｂの５’末端接合部を含有し、これは、それらが、ダイズ
イベントＤＡＳ−６８４１６−４の５’末端の導入遺伝子挿入断片およびその隣接境界の
同じ領域から増幅されたことを示している。得られた２，７３０ｂｐのダイズのゲノム配
列は、ＧｅｎＢａｎｋにある配列との有意な相同性を有さないことが見いだされた。
実施例３．７
３’末端境界配列
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＥｃｏＲＶ ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商
標）ライブラリーから、導入遺伝子の３’末端に対して特異的なネステッドプライマーセ
ットを使用して、サイズが約１．３ｋｂであるＤＮＡ断片を増幅した。次に、このＤＮＡ
断片をＰＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングした。末端
配列決定のために５つのコロニーを無作為に選定した。５つのクローンは全て、プライマ
ーＡＰ２およびプライマーＥＳ＿ＰＡＴＥｎｄ０４の両方の配列を含有した。これらのク
ローンについて完全に配列決定することにより、１，３５９ｂｐのコンセンサスＤＮＡ断
片が得られた。配列解析することにより、１，３５９ｂｐの断片が、Ｔ鎖境界Ａの３’末
端領域由来の２６８ｂｐの断片およびダイズのゲノムＤＮＡ由来の１，０９１ｂｐの断片
で構成されることが開示された。ＢＬＡＳＴ検索により、この１，０９１ｂｐのダイズＤ
ＮＡ配列とＧｅｎＢａｎｋにある配列との間に有意な相同性は同定されなかった。
実施例３．８
ＤＮＡ挿入断片および接合部配列
以前に記載されているようなＰＣＲに基づく方法を使用して、ダイズイベントＤＡＳ−
６８４１６−４からＤＮＡ挿入断片および隣接境界領域をクローニングした。５’隣接境
界および３’隣接境界配列および予測された導入遺伝子配列を使用して、表６に列挙され
ているＰＣＲプライマーを設計した。全部で、４つのオーバーラップＤＮＡ断片（９７８
ｂｐのアンプリコン１、２，４１４ｂｐのアンプリコン２、１，８３４ｂｐのアンプリコ
ン３、および１，７０５ｂｐのアンプリコン４）をクローニングし、配列決定した（図３
）。挿入断片および隣接境界配列の全体を、４つの断片の間のオーバーラップ配列に基づ
いてアセンブリした。最終的にアセンブリした配列を解析することにより、ｐＤＡＢ４４
６８の導入遺伝子に由来する６，３９１ｂｐの断片が存在することが確認され、また、プ
ラスミドｐＤＡＢ４４６８から予測された配列と比較して、挿入ＤＮＡ配列の塩基の変化
は見られなかった。
実施例３．９
ダイズのゲノム配列の確認
ダイズゲノム内のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４導入遺伝子の挿入部位を確認
するために、異なるプライマー対を用いてＰＣＲを行った（図４および表５）。ダイズイ
ベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のゲノムＤＮＡおよび他のトランスジェニックダイズ
系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。
したがって、得られた５’末端境界配列が正確であるかどうかを確認するために、ａａｄ
−１２遺伝子から５’末端境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するためにａａｄ−
１２特異的な２種のプライマー、例えば、ＡＩＩＬＥｎｄ０５およびＡＩＩＬＥｎｄ０６
、ならびに、１６ＬＥｎｄＧ０１および１６ＬＥｎｄＧ０２と称される５’末端境界配列
に従って設計した２種のプライマーを使用した。同様に、クローニングされた３’末端境
界配列を確認するために、ｐａｔ特異的なプライマー、例えばＰＡＴ−Ｅｎｄ０６、およ
び１６ＰＡＴＧ０１および１６ＰＡＴＧ０２と称される、３’末端境界配列に従って設計
した２種のプライマーを使用して、ｐａｔ遺伝子から３’末端境界配列にわたるＤＮＡセ
グメントを増幅した。予測されたサイズを有するＤＮＡ断片は、ダイズイベントＤＡＳ−
６８４１６−４の隣接境界に位置した１つのプライマー、導入遺伝子特異的な１つのプラ
イマーの各プライマー対を用いたダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノムＤＮＡ
からのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニック
対照由来のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた５’境界配
列および３’境界配列が、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるＴ鎖挿入断片
の隣接境界配列であることを示している。
ダイズゲノム内のＤＮＡ挿入物をさらに確認するために、２つのダイズ配列にわたるＰ
ＣＲ増幅を完了した。５’末端境界配列に従って設計した２種のプライマー、１６ＬＥｎ
ｄＧ０３および１６ＬＥｎｄＧ０４、ならびに３’末端境界配列に対する２種のプライマ
ー、１６ＰＡＴＧ０３および１６ＰＡＴＧ０４を使用して、導入遺伝子、５’末端境界配
列、および３’境界配列の全体を含有するＤＮＡセグメントを増幅した。予測通り、１６
ＬＥｎｄＧ０３および１６ＰＡＴＧ０３のプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により、ダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノムＤＮＡからおよそ９ｋｂのＤＮＡ断片、およ
び非トランスジェニックダイズ対照および他のダイズトランスジェニック系統から２．７
ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。同様に、１６ＬＥｎｄＧ０４および１６ＰＡＴＧ０４の
プライマー対を用いて完了したＰＣＲ反応により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４の試料からおよそ９ｋｂのＤＮＡ断片、および他のダイズ対照系統全てから、同様に、
２．８ｋｂのＤＮＡ断片がもたらされた。両方のプライマー対をＰＣＲに使用した場合、
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４以外の全てのダイズ試料において約６ｋｂのサイ
ズのかすかなバンドが目に見えたことが認められ、これは、このかすかなバンドが、この
プライマー対でのダイズゲノムの非特異的な増幅に起因することを示唆している。
実施例３．１０
ダイズのゲノム配列の確認
１６ＬＥｎｄＧ０３と１６ＰＡＴＧ０３のプライマー対と１６ＬＥｎｄＧ０４および１
６ＰＡＴＧ０４のプライマー対を使用して非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖ
ｅｒｉｃｋから増幅された２．７ｋｂのＤＮＡ断片および２．８ｋｂのＤＮＡ断片をクロ
ーニングし、配列決定した。それらの配列を互いに突き合せ、ダイズイベントＤＡＳ−６
８４１６−４からクローニングされた５’境界配列および３’境界配列とアラインメント
した。これにより、クローニングされたＤＮＡ配列が、ｐＤＡＢ４４６８のＴ鎖がダイズ
イベントＤＡＳ−６８４１６−４に組み込まれた遺伝子座を含有したことが実証された。
アラインメント解析により、元の遺伝子座からの５５ｂｐの欠失および３’組み込み接合
部における９ｂｐの挿入物も明らかになった（図５）。クローニングされた元の遺伝子座
のダイズのゲノム領域においてオープンリーディングフレーム（＞／＝４５０ｂｐ、１５
０アミノ酸）は同定されなかった。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の隣接ＳＮＰマーカーによるゲノムの特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、挿入断片の近傍に位置するマーカー配
列を決定した。多型的な一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーのパネルを使用して導入遺伝子の
位置を同定し、マッピングした。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４２は、第４染色
体上の１１９．６ｃＭに位置する。この位置は、２つの隣接ＳＮＰマーカー、ＢＡＲＣ−
０４４６０７−０８７３６とＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９の間である。より詳細
には、導入遺伝子の位置は、ＳＮＰマーカーＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９から１
．３ｃＭ（４８０ｋｂ）離れてマッピングされた。
実施例４．１
隣接境界領域の配列を用いたＢＬＡＳＴ
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の隣接境界領域の配列（配列番号１）を、ダイ
ズの全ゲノム配列のＢＬＡＳＴに使用した。ＢＬＡＳＴの結果により、ダイズイベントＤ
ＡＳ−６８４１６−４の境界配列の両方が、連鎖群Ｃ１である第４染色体（Ｇｍ０４）上
に位置したことが示された。
実施例４．２
ＳＮＰマッピングおよびＢＬＡＳＴの結果
境界配列を用いたＢＬＡＳＴおよびマッピングからの結果に基づいて、イベントは、第
４染色体に割り当てられた。そのように、１０種のＳＮＰマーカーをダイズ遺伝連鎖マッ
プから選択した。ＳＮＰ配列を、Ｄｒ．Ｃｒｅｇａｎ、Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、およびＵＳＤＡによって開発され
たＳＮＰマーカーから選択した。これらのＳＮＰマーカーは、第４染色体に対応する連鎖
群Ｃ１に関連づけられる。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についてＴ鎖挿入断片
の物理的な位置を決定するために、ダイズの全ゲノム配列のＢＬＡＳＴにＳＮＰ配列を使
用した。
実施例４．３
ＳＮＰマーカーの結果
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、第４染色体上の１１９．６ｃＭにマッピン
グされる。２つの隣接ＳＮＰマーカーは、ＢＡＲＣ−０４４６０７−０８７３６およびＢ
ＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９である。導入遺伝子は、ＳＮＰマーカーＢＡＲＣ−０
１９０９３−０３２９９から１．３ｃＭ（４８０ｋｂ）離れており、ＳＮＰマーカーＢＡ
ＲＣ−０４４６０７−０８７３６とＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９の間のおよそ１
１９．６ｃＭである。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるＡＡＤ−１２タンパク質の特徴付け
組換えトランスジェニックダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４に由来するＡＡＤ−
１２タンパク質の生化学的性質を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ク
ーマシーブルー（Coomassie blue）を用いて染色し、糖タンパク質を検出する方法）、お
よびウェスタンブロット法を使用してタンパク質の生化学的性質を特徴付け、ＡＡＤ−１
２タンパク質の発現を確認した。
実施例５．１
植物組織におけるＡＡＤ−１２タンパク質の発現
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるＡＡＤ−１２タンパク質のレベルを決
定した。可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１２タンパク質を、ダイズの葉における定量的酵素
結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。０．５％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有
するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＡＡＤ−１２タンパク質を
抽出した。植物組織を遠心分離し；水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈
し、ＡＡＤ−１２ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製
造者の推奨プロトコールに従って使用した。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において、検出解析を実施して、発現の安定性
および遺伝性を垂直方向（世代間）および水平方向（系列間）の両方で調査した。Ｔ５世
代ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において、発現は安定であり（分離性でない）
、系列全てにわたって一貫した（図６）。
種々の植物の段階における圃場発現レベル試験を、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４において、Ｖ３前、Ｖ３後、Ｒ２前、およびＲ２後で実施した。噴霧処理全てについ
て、ならびに２，４−Ｄ除草剤を噴霧した小区画および噴霧していない小区画について、
発現値は同様であった。２×噴霧率（２，２４０ｇｍ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ）を施用
し、試験のどのポイントにおいても植物に対する害は確認されなかった。植物のｖ３前の
段階における、系列全てにわたった平均の発現は３００μｇ／ｃｍ２であった。２，４−
Ｄを噴霧した後、発現は安定なままであり、系列にわたって平均４００μｇ／ｃｍ２であ
った。ダイズがＲ２前に到達した時には、平均の発現は、平均２００μｇ／ｃｍ２にわず
かに降下した。２，４−Ｄを噴霧した後、Ｒ２後の発現は以前の平均４００μｇ／ｃｍ２
に戻った。図６を参照されたい。
実施例５．２
植物組織におけるＡＡＤ−１２タンパク質の発現
２００８年中に米国およびカナダの６つの区域で追加的な圃場発現試験を行った。ダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の４つの処理（噴霧なし、２，４−Ｄを噴霧、グルホ
シネートを噴霧、または２，４−Ｄおよびグルホシネートの両方を噴霧）を試験した。試
料採取した植物組織は、葉、粒、根、および茎葉を含んだ。発生のＶ５段階およびＶ１０
段階において葉組織を収集し、Ｒ３段階において根および茎葉を収集した。発生のＲ８段
階において粒を収集した（Gaska、2006年）。可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１２タンパク
質を、実施例５．１において前記されている通り、検証された酵素結合免疫吸着検定法（
ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。全ての種類の組織について、ＡＡＤ−１２タンパ
ク質レベルをｎｇ／乾燥重量（ｍｇ）に基づいて算出した。
種々のダイズマトリックスにおけるＡＡＤ−１２タンパク質の濃度（部位にわたって平
均した）の概要が表８に示されている。平均の発現値は、Ｒ３段階の根における１５．５
ｎｇ／乾燥重量（ｍｇ）から、Ｖ５段階の葉組織における６６．１ｎｇ／ｍｇにわたった
。発現値は、噴霧処理全てについて、ならびに２，４−Ｄ除草剤およびグルホシネート除
草剤を噴霧した小区画および噴霧していない小区画について、同様であった。６つの区域
全てにわたって、対照組織においてＡＡＤ−１２タンパク質は検出されなかった。
実施例５．３
ＡＡＤ−１２タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
安定剤を加えたＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を伴うリン酸緩衝生
理食塩水）ベースの緩衝液中のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の凍結乾燥した葉
組織からＡＡＤ−１２タンパク質を抽出し、可溶性タンパク質を遠心分離によって収集し
た。上清を濾過し、可溶性タンパク質をフェニルセファロース（ＰＳ）ビーズ（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に結合させた。１時間インキュベー
トした後、ＰＳビーズをＰＢＳＴで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて結合したタンパク
質を溶出した。伝導率を増加させるために、塩化ナトリウムを加え、ＰＳ精製されたタン
パク質を、ＡＡＤ−１２特異的なポリクローナル抗体とコンジュゲートした抗ＡＡＤ−１
２免疫親和性カラムにローディングした。結合していないタンパク質をカラムから収集し
、カラムを予め冷却したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を用いて広範囲に
わたって洗浄した。結合したタンパク質を、３．５ＭのＮａＳＣＮ、５０ｍＭのトリス、
ｐＨ８．０である緩衝液を用いてカラムから溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタ
ンブロットによって検査した。同じプロトコールを使用して、対照ダイズ系統であるＭａ
ｖｅｒｉｃｋの葉組織からタンパク質を単離した。Ｍａｖｅｒｉｃｋは、ａａｄ−１２遺
伝子を含有しないが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物を表す遺伝的背景を有
する。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４およびＭａｖｅｒｉｃｋ由来の凍結乾燥した葉
組織を、約２．０％のプロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ
）を含有するＰＢＳＴ緩衝液と混合し、Ｇｅｎｏ−Ｇｒｉｎｄｅｒのボールベアリングを
用いて粉砕することによってタンパク質を抽出した。試料を遠心分離し、上清を、Ｌａｅ
ｍｍｌｉ試料緩衝液と混合し、加熱し、短時間遠心分離した。試料をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃ
ｒｉｔｅｒｉｏｎ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに直接ローディングした。陽性参照標準物質、
微生物由来のＡＡＤ−１２タンパク質も、試料緩衝液と混合し、ゲルにローディングした
。トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅ、ＣＡ）を用いて
電気泳動を行った。電気泳動した後、ゲルを半分に切り、一方の半分はＰｉｅｒｃｅ Ｇ
ｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅタンパク質染料で染料し、他方のゲルの半分は、ニトロセルロー
スメンブレンに電気ブロッティングした。次に、ＡＡＤ−１２特異的なポリクローナルウ
サギ抗体を用いてニトロセルロースメンブレンを探索した。化学発光基質を使用して、免
疫反応性のバンドを可視化した。微生物由来のＡＡＤ−１２では、クーマシー染色したＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて可視化された主要なタンパク質バンドは、およそ３２ｋＤａ
であった。予測通り、対応する植物由来のＡＡＤ−１２タンパク質は、微生物由来のタン
パク質とサイズが同一であった。予想通りに、植物の精製された画分は、ＡＡＤ−１２タ
ンパク質に加えて、少量の非免疫反応性不純物を含有した。共精製されたタンパク質は、
カラムマトリックスとの弱い相互作用によってカラム上に保持されたと思われる（Willia
mら、2006年、KennedyおよびBarne、1983年およびHolroydeら、1976年）。
微生物由来のＡＡＤ−１２およびＤＡＳ−６８４１６−４植物組織抽出物は、抗ＡＡＤ
−１２ポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロットにおいて予測されるサイズの陽
性シグナルを示した。ＡＡＤ−１２ウェスタンブロット分析では、対照であるＭａｖｅｒ
ｉｃｋの抽出物において免疫反応性タンパク質は観察されず、また、トランスジェニック
植物由来の試料において代替のサイズのタンパク質（凝集体または分解生成物）は見られ
なかった。モノクローナル抗体により、微生物由来のタンパク質において少量のＡＡＤ−
１２二量体が検出された。これらの結果により、ＡＡＤ−１２タンパク質がダイズにおい
て発現されているという証拠が追加される。
サザンブロットによるダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のメチル化検出解析
導入された導入遺伝子は、植物ゲノムに組み込まれた後にサイレンシングを受ける可能
性がある。導入遺伝子の発現は、転写レベルおよび／または転写後レベルで阻害される可
能性がある。転写レベルでの遺伝子サイレンシングは、導入遺伝子、そのプロモーターお
よび他の関連性のある配列のメチル化に関連することが報告されている（Stemら、1997年
）。特定の配列におけるメチル化を検出するために、ある方法では、メチル化感受性制限
酵素を利用してＤＮＡを消化し、その後ＤＮＡ産物をサザンブロット分析する。特定の制
限酵素部位がメチル化されていると、酵素はＤＮＡを切断しない。制限部位がメチル化さ
れていると、サザンブロットで検出可能な、分子量がより高いＤＮＡ断片がもたらされる
。サザンブロットに基づくメチル化解析を実施して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４についてＴ鎖挿入断片のメチル化の状態を決定した。このアッセイは、ａａｄ−１２
遺伝子に特異的なプローブおよびそのプロモーターおよび２つのメチル化感受性制限酵素
を使用して行った。ａａｄ−１２発現カセットのメチル化は検出されなかった。
６．１．ダイズの葉の試料収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ゲノムＤＮＡを、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニック
ダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋのそれぞれの植物の葉から調製した。伝統的なＣＴＡ
Ｂ法を使用して、凍結乾燥した葉の試料からゲノムＤＮＡを単離した。抽出後、ＤＮＡを
、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用
して定量した。
６．２．ＤＮＡの消化および分離
ＤＮＡの分子キャラクタリゼーションのために、１０マイクログラム（１０μｇ）のダ
イズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のゲノムＤＮＡおよび非トランスジェニックダ
イズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ１μｇ当たりおよそ５ユ
ニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を各ＤＮＡ試料に加えることによ
って消化した。各試料を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。制限酵素ＡｃｉＩお
よびＨｙｐ１８８ＩＩＩを使用して消化した（Ｎｅｗ ＥｎｇｌおよびＢｉｏＬａｂ、Ｉ
ｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。非トランスジェニックダイズであるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のＤＮ
Ａを、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化して陰性対照として機能させた。
消化されたＤＮＡ試料を、ＮａＣｌを０．１Ｍの最終濃度まで加えた後、イソプロパノー
ルを用いて沈殿させ、１×ローディング緩衝液（０．１％ブロモフェノールブルー、１０
０ｍＭのＥＤＴＡ、５０％グリセロール、１０ｍＭのトリス ｐＨ７．５）２０μｌに再
懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩衝液（
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を３５ボルトでお
よそ１８〜２２時間用いて０．８５％アガロースゲルによって電気泳動して断片の分離を
実現した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で
染色し、ＤＮＡを紫外線（ＵＶ）の下で可視化した。
６．３．サザン転写およびメンブレン処理
Seversonら、（1997年）に記載されている通りサザンブロット分析を実施した。簡単に
述べると、ＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、ＵＶ光の下で可視化した後、ゲルを変
性溶液（１５０ｍＭのＮａＯＨ、３ｍＭのＥＤＴＡ）におよそ２０分間曝露させ、その後
、中和溶液（１５０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．８）に少なくとも２０分間曝露させた。
転写緩衝液（２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、ｐＨ１０）を用いたウィッキング系を使
用して、一晩、ナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ
ａｐｏｌｉ、ＩＮ）にサザン転写を実施した。転写した後、メンブレンを６５℃で約２時
間加熱乾燥した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのためのサザンブロット
メンブレンの準備ができた。
６．４．ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
ナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を、標識したプローブを使用して検出した。
プローブは、プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来の特異的なプライマーを伴う増幅されたＰ
ＣＲ断片として生成した。これらのＰＣＲ増幅された断片をアガロースゲルから切り取り
、精製した。精製されたＤＮＡ断片を、ハイブリダイゼーションプローブを作製するため
の鋳型として使用した。ハイブリダイゼーションプローブを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ ＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ（商標）ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を製造者の説明書に従って使用した
ランダムプライミングによってα３２Ｐに特異的なヌクレオチドで標識し、ＰＲＯＢＥＱ
ＵＡＮＴ（商標）Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）によって精製した。この試験のた
めに使用したプローブの一覧は、表９に記載されている。
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、それぞれ、６５℃で４
時間および一晩、ハイブリダイゼーション緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）
を使用して行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを６５℃、洗浄緩衝液（１０
ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、
０．１％ＳＤ、リン酸を用いてｐＨ７．８に調整した）で２０分間、３回洗浄した。洗浄
したフィルターを、オートラジオグラフィーのためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスク
リーンに曝露させ、画像をスキャンした。
６．５ プローブの除去
サザンハイブリダイゼーションのデータを得た後、メンブレンブロットからＤＮＡプロ
ーブを除去し、メンブレンブロットは、異なるＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼー
ションに再利用することができた。簡単に述べると、曝露後、メンブレンブロットを室温
で１０分間、再生溶液１（３０ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）で洗浄し、６
５℃で３０分間、再生溶液２（５ｍＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１％
ＳＤＳ）で洗浄した。次いで、メンブレンブロットを２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、それで
別のＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションの準備ができた。メンブレンブロッ
トをオートラジオグラフィーのためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露さ
せて、次のハイブリダイゼーションに進む前にＤＮＡプローブの全てを確実に除去した。
６．６．サザンブロットの結果
この試験では、ａａｄ−１２遺伝子およびそのプロモーターであるＡｔＵｂｉ１０のメ
チル化の状態を決定するために、メチル化感受性制限酵素ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８Ｉ
ＩＩを使用した。ｐＤＡＢ４４６８のＴ鎖ＤＮＡの公知の制限酵素部位に基づいて予測さ
れた特定の消化物およびプローブの断片サイズが表１０で示されている。サザンブロット
において分子量がより高い断片が検出されることは、ＡｃｉＩ制限酵素部位およびＨｙｐ
１８８ＩＩＩ制限酵素部位の認識配列内のシトシンがメチル化されていることを示すと思
われる。そのように、メチル化により、制限酵素がゲノムＤＮＡを消化することができな
くなる。
制限酵素ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８ＩＩＩを使用してａａｄ−１２遺伝子のメチル化
の状態を検査した。ａａｄ−１２プローブを使用すると、予測されたサイズを有するハイ
ブリダイゼーションバンドが観察された。このデータは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４
１６−４において、ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８ＩＩＩの認識部位におけるメチル化が起
こっていないことを示唆している。同様に、Ｈｙｐ１８８ＩＩＩで消化されたダイズイベ
ントＤＡＳ−６８４１６−４ＤＮＡ試料において、ＡｔＵｂｉ１０プローブを使用すると
、予測された分子量のバンドが検出された。このデータは、ａａｄ−１２プロモーター配
列における認識部位がメチル化されていなかったことを示している。
農業形質データ
２００８年の米国およびカナダの６区域における組成研究の一部として、および２００
９年に米国およびカナダの８区域において行われた別々の試験においても、ダイズイベン
トＤＡＳ−６８４１６−４を用いた農業試験を行った。これらの試験では、イベントＤＡ
Ｓ−６８４１６−４ダイズ（２，４−Ｄ除草剤および／またはグルホシネート除草剤の施
用を伴う、または伴わない）と、その非トランスジェニック近同質遺伝子対照（Ｍａｖｅ
ｒｉｃｋ）を比較した。両方の試験の全てにわたる結果により、農業形質パラメータは、
従来のダイズ系統について得られる範囲内であることが示された。
実施例７．１．
２００８年の農業形質データの生成
２００８年に、アイオワ、イリノイ、インディアナ、ネブラスカおよびカナダのオンタ
リオ（２つの現場）に位置する６つの現場において、イベントＤＡＳ−６８４１６−４ダ
イズおよび非トランスジェニック対照（Ｍａｖｅｒｉｃｋ品種）を用いた農業研究を行っ
た。対照系統であるＭａｖｅｒｉｃｋと比較して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４（除草剤処理を伴う、および除草剤処理を伴わない）の同等性を調査するために、群生
／集団数、実生／植物生長力、植物の高さ、倒伏、病害発生率、虫害、および開花までの
日数を含めた農業形質決定因子を評価した。この試験は、実験１と称される。
試験ダイズ種子および対照ダイズ種子を、作条の間隔をおよそ３０インチ（７５ｃｍ）
として、２５ｆｔの作条当たりおよそ１１２種子の播種密度で植えた。それぞれの現場に
おいて、それぞれの処理について３回反復の小区画を確立し、それぞれの小区画は２〜２
５ｆｔの作条からなった。小区画を完全乱塊（randomized complete block）（ＲＣＢ）
計画に配置し、それぞれの現場において独特に無作為化した。それぞれのダイズの小区画
には、同様の成熟度の非トランスジェニックダイズの２つの作条が隣接していた。試験現
場全体を最低１０ｆｔの同様の相対的な成熟度の非トランスジェニックダイズで囲んだ。
除草剤処理については、１エーカー当たりおよそ２０ガロン（１８７Ｌ／ｈａ）の噴霧
体積を施用した。これらの施用は、商慣習の最大表示量を再現するように設計した。２，
４−Ｄを、季節の合計３ｌｂ ａｅ／Ａで、上からの施用で３回散布して施用した。出芽
前および生長段階のおよそＶ４およびＲ２において、それぞれ１．０ｌｂ ａｅ Ａ（１
，１２０ｇ／ｈａ）の施用を行った。グルホシネートを、季節の合計０．７４ｌｂ ａｉ
／Ａ（８２８ｇ ａｉ／ｈａ）、上からの施用で２回散布して施用した。生長段階のおよ
そＶ６およびＲ１において、それぞれ０．３３ｌｂ ａｉ／Ａおよび０．４１ｌｂ ａｉ
／Ａ（３７４ｇ ａｉ／ｈａおよび４５４ｇ ａｉ／ｈａ）の施用を行った。
圃場現場の全てにわたって、混合モデル（ＳＡＳ バージョン８；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ １９９９）を使用して農業形質データについて分散分析を行った。エントリー
を固定効果とみなし、区域、区域内のブロック、区域×エントリー、およびエントリー×
区域内のブロックを、変量効果として指定した。全体的な処理の効果の有意性を、Ｆ検定
を用いて推定した。対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（噴
霧なし）トランスジェニックエントリー、グルホシネートを噴霧したダイズイベントＤＡ
Ｓ−６８４１６−４（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート）トラン
スジェニックエントリー、２，４−Ｄを噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ）トランスジェニックエントリー
ならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄの両方を噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８
４１６−４（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方）トランスジェニックエント
リーの間で、ｔ検定を用いて対応のある対比を行った。多重性を制御するために、偽発見
率（False Discovery Rate）（ＦＤＲ）を使用して調整Ｐ値も算出した（Benjaminiおよ
びHochberg、1995年）。
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネー
ト、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤から収集した農業形質
データの分析を行った。群生数、初期集団、実生生長力、施用後の害、倒伏、最終的な群
生数または開花までの日数について、統計的有意差は観察されなかった（表１２）。高さ
については、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ噴霧との間に有
意な対応のあるｔ検定が観察された。しかし、有意な全体的な処理の効果は観察されず、
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理と対照との間の差異は非常に小さく、また、
差異は、異なるダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理間で共有されなかった。これ
らの結果に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、近同質遺伝子非トラン
スジェニック対照と農業的に同等であった。
実施例７．２．
２００９年の農業形質データの生成
２００９年に、アーカンソー、アイオワ、イリノイ、インディアナ、ミズーリ、および
ネブラスカに位置する８か所の現場においてダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４およ
び非トランスジェニック対照（Ｍａｖｅｒｉｃｋ品種）を用いた農業研究行った。ダイズ
イベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ（除草剤処理を伴う、および除草剤処理を伴わな
い）の対照との同等性を調査するために、群生／集団数、実生／植物生長力、植物の高さ
、病害発生率、虫害、および開花までの日数を含めた農業形質決定因子を評価した（表１
３）。
試験には完全乱塊（randomized-complete-block）計画を用いた。エントリーは、ダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照系統、および市販されている
非トランスジェニックダイズ系統であった。試験ダイズ種子、対照ダイズ種子および参照
ダイズ種子を、作条の間隔をおよそ３０インチ（７５ｃｍ）として、作条当たりおよそ１
１２種子の播種密度で植えた。それぞれの現場において、それぞれの処理について４回反
復の小区画を確立し、各小区画は２〜２５ｆｔの作条からなった。それぞれのダイズの小
区画には、非トランスジェニックダイズ（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）の２つの作条が隣接してい
た。試験現場全体を、最低４つの作条（または１０ｆｔ）の非トランスジェニックダイズ
（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）で囲んだ。適切な昆虫、雑草、および病害の制御慣習を施用して農
業的に許容できる作物を生産した。
商慣習の最大表示量（maximum label rate）を再現するように除草剤処理を適用した。
処理は、噴霧しない対照および特定の生長段階において２，４−Ｄ、グルホシネート、２
，４−Ｄ／グルホシネートを施用した除草剤施用からなった。２，４−Ｄ施用については
、Ｖ４生長段階およびＲ２生長段階において除草剤を１．０ｌｂ ａｅ／Ａ（１，１２０
ｇ ａｅ／ｈａ）の比率で施用した。グルホシネート処理については、Ｖ４生長段階およ
びＶ６〜Ｒ２生長段階にある植物に施用を行った。両方の施用については、Ｖ４施用およ
びＶ６〜Ｒ２施用について、それぞれグルホシネートを０．３３ｌｂ ａｉ／Ａ（３７４
ｇ ａｉ／ｈａ）および０．４１ｌｂ ａｉ／Ａ（４５４ ｇ ａｉ／ｈａ）の比率で施
用した。両方の除草剤を施用するエントリーは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
および非トランスジェニックＭａｖｅｒｉｃｋを含めた対照であった。Ｍａｖｅｒｉｃｋ
小区画は、除草剤を施用した後に枯死することが予測された。
圃場現場全てにわたって、混合モデル（ＳＡＳバージョン８；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ １９９９年）を用いて農業形質データについて分散分析を行った。エントリーを固
定効果とみなし、区域、区域内のブロック、区域×エントリー、およびエントリー×区域
内のブロックを、変量効果として指定した。個々の区域において、類似の様式で、エント
リーを固定効果とし、ブロックおよびエントリー×ブロックを変量効果として分析を行っ
た。データは統計分析には回さなかった。９５％信頼水準において有意差が宣言され、Ｆ
検定を用いて全体的な処理の効果の有意性を推定した。噴霧していないＡＡＤ−１２（噴
霧なし）トランスジェニックエントリー、グルホシネートを噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡ
Ｄ−１２＋グルホシネート）トランスジェニックエントリー、２，４−Ｄを噴霧したＡＡ
Ｄ−１２（ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ）トランスジェニックエントリーならびにグルホシ
ネートおよび２，４−Ｄの両方を噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グ
ルホシネート）トランスジェニックエントリーと対照エントリーとの間で、ｔ検定を用い
て対応のある対比を行った。
この試験では多数の対比を行ったので、多重性が問題であった。予想外の効果を探すた
めに単一の試験において多数の比較を行う場合、多重性が問題である。これらの条件下で
、比較に関するｐ値に基づいて誤って差異が宣言される確率は非常に高い（１−０．９５
比較の数）。この試験では分析物当たり４つの比較があり（１６種の農業形質についての
分析所見）、農業形質について６４の比較が生じる。したがって、調整していないｐ値に
基づいて１つまたは複数の誤った差異が宣言される確率は、農業形質について９９％であ
った（１−０．９５６４）。
対照エントリー、ＡＡＤ−１２噴霧なしエントリー、ＡＡＤ−１２＋グルホシネートエ
ントリー、ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄエントリー、およびＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グ
ルホシネートエントリーから収集した農業形質データの分析を行った。現場全てにわたる
分析について（表１４）、実生生長力、最終集団、植物生長力／害（Ｖ４、Ｒ１）、倒伏
、病害発生率、虫害、開花までの日数、成熟までの日数、莢の数、種子の数、生産量、お
よび植物の高さについて統計的有意差は観察されなかった。群生数および初期集団につい
ては、対照とＡＡＤ−１２＋グルホシネートエントリーとの間に有意な対応のあるｔ検定
が観察されが、有意な全体的な処理の効果またはＦＤＲ調整Ｐ値を伴わなかった。植物生
長力／害（Ｒ２）については、対照とＡＡＤ−１２＋グルホシネートエントリーおよびＡ
ＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネートエントリーのどちらとの間にも有意な対応のあ
るｔ検定および有意な全体的な処理の効果が観察されたが、有意なＦＤＲ調整Ｐ値を伴わ
なかった。これらの変数全てについて平均した結果も、この試験において試験された参照
系統について見いだされた範囲内であった。
実施例７．３．
生態学的評価
ダイズ栽培の実践に詳しい人（育種家、圃場の管理者、圃場の農学者、圃場の従業員）
がダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の圃場試験をモニターし、観察した。圃場試験
を行った人員は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物に対する植物病害および害
虫の発生率を、同じ試験において従来のダイズ品種と比較して視覚的にモニターした。実
施例７．１に記載の実験１の一部として、病害および虫害を、０％が病害発生率または昆
虫抵抗性に起因する害を表す０〜１００％の数値的な尺度で評価した。表１５に、実験１
に記載の６か所の現場全てにわたる結果が示されている。
病害発生率については、統計的有意差は観察されなかった。虫害については、対照とダ
イズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間に有意な対応のあるｔ検定が
観察された。しかし有意な全体的な処理の効果は観察されず、ダイズイベントＤＡＳ−６
８４１６−４処理と対照との間の差異は小さく、また、差異は、異なるダイズイベントＤ
ＡＳ−６８４１６−４処理間で共有されなかった。
２００６年〜２００８年に行われた全てのＵＳＤＡ ＡＰＨＩＳに届け出た圃場試験か
らの生態学的な観察も行った。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物の試験におけ
る病害の発生率および昆虫の存在を記録し、従来の対照と比較したダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４植物の発生率または反応の差異を検査した。全ての場合において、ダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物のいずれの試験でも従来の対照と比較して差異は
見られなかった。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および従来のダイズの試験にお
いて観察された病害ストレス要因および昆虫ストレス要因は、表１６に記載されている。
これらの観察は、生態学的なストレス要因に対するダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４の反応は、従来のダイズの反応と異ならないという結論を裏付ける。
実施例７．４．
発芽（Ｇｅｒｍａｎｃｙ）および休眠の評価
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４種子の発芽について、温暖な条件下および寒冷
な条件下で近同質遺伝子型の比較器と比較して調べることによって種子の休眠特性の変化
を評価した。
温暖発芽試験については、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および対照ダイズの
種子を、水を染み込ませた発芽用パッドを含有するペトリ皿に、プレート当たり２５個置
き、過剰な水を流し出した。プレートを２５℃に置き、これらの条件下で５日間保持した
。系統当たり１６プレート（４００種子）を調製した。５日後、発芽しなかった種子の数
を記録した。
寒冷発芽試験については、鉢植え用土を満たした平箱半分当たり種子１００個の種子を
植えた。平箱に多少水をまき、１０℃で７日間保持し、その後２５℃に５日間曝露し、そ
の後、発芽しなかった種子の数を記録した。
それぞれの試験からのデータを、反復当たり種子１００個の４回の反復を伴う完全無作
為計画を使用した分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。統計分析のために、発芽し
た種子の数を１００で割った値の平方根のアークサインを使用してデータを変換した。発
芽率（パーセント）が、表１７に要約されている。
温暖発芽実験または寒冷発芽実験のいずれにおいても、ダイズイベントＤＡＳ−６８４
１６−４の種子の発芽と対照ダイズの種子の発芽との間に有意差はなかった（それぞれＰ
ｒ＞Ｆ＝１．０および０．１３）。これらの結果は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４において種子の休眠特性が変化してないことを示している。
実施例７．５．
農業特性、病害特性、害虫特性、および発芽特性の概要
生育期全体を通して植物の生長特性を評価する農業形質データにより、ダイズイベント
ＤＡＳ−６８４１６−４の従来の非トランスジェニックダイズとの同等性が実証されてい
る。植物の生長および表現型の特性、病害および昆虫の圧力に対する感受性によって示さ
れる生態学的ストレス要因に対する反応、ならびに発芽および休眠の特性は、多様な環境
にわたって、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物と従来のダイズとの間で変化し
なかった。したがって、これらのデータにより、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
の農業特性、病害特性、および害虫特性は、従来のダイズの農業特性、病害特性、および
害虫特性と有意に異ならず、また、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズが植物
害虫リスクの増加を示す徴候はないという結論が裏付けられる。Benjamini、Y.、Hochber
g、Y.（1995年）Controling the false discovery rate：A practical and powerful app
roach to multiple testing. J. Royal Statistical Soc. B、57巻:289〜300頁。
粒および茎葉の組成
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（２，４−Ｄを噴霧、グルホシネートを噴霧、
２，４−Ｄ＋グルホシネートを噴霧、または２，４−Ｄまたはグルホシネートを噴霧して
いない）と従来のダイズとの間の同等性を調査するために、ダイズの茎葉および粒につい
て組成分析を実施した。米国およびカナダの主要なダイズ生産地域内に位置する６か所の
試験場において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を伴う種子系統およびダイズイ
ベントＤＡＳ−６８４１６−４を伴わない種子系統を使用して試験を行った。試験場は、
多様な農業習慣および環境条件の地域を代表し、タンパク質の発現解析および実施例７．
１に記載の農業実験１のために使用したのと同じ現場であった。試験はアイオワ、イリノ
イ、インディアナ、ネブラスカ、およびカナダのオンタリオ（２現場）に位置した。
ダイズの茎葉および粒の試料を、種々の試験を用いて栄養素量について分析した。茎葉
について行った分析は、タンパク質、脂肪、灰分、水分、炭水化物、酸性デタージェント
繊維（ＡＤＦ）、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、カルシウムおよびリンを含んだ。
粒について行った分析は、一般成分（灰分、全脂肪、水分、タンパク質、コレステロール
、炭水化物）、繊維、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、抗栄養因子を含んだ。
ダイズの茎葉および粒についての栄養分析の結果を文献において報告されている値と比
較した。圃場現場の全てにわたって、混合モデルを使用して分散分析も行った。エントリ
ーを固定効果とみなし、区域、区域内のブロック、および区域×エントリーを、変量効果
として指定した。全体的な処理の効果の有意性を、Ｆ検定を用いて推定した。ダイズイベ
ントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（噴霧していないＡＡＤ−１
２；２，４−Ｄまたはグルホシネートを噴霧していない）、グルホシネートを噴霧したダ
イズイベントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（ダイズイベントＤ
ＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート）、２，４−Ｄを噴霧したダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４＋２，４−Ｄ）、ならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄの両方を噴霧したダイズイ
ベントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（ダイズイベントＤＡＳ−
６８４１６−４＋両方）と、対照エントリーとの間でｔ検定を用いて対応のある対比を行
った。
この試験では多数の対比を行ったので、多重性が問題であった。予想外の効果を探すた
めに単一の試験において多数の比較を行う場合、多重性が問題である。これらの条件下で
、比較に関するｐ値に基づいて誤って差異が宣言される確率は非常に高い（１−０．９５
比較の数）。この試験では分析物当たり４つの比較があり（７５の定量化された分析物）
、現場の組成分析全てにわたって３００の比較が行われた。したがって、調整していない
ｐ値に基づいて１つまたは複数の誤った差異が宣言される確率は９９．９９％より高かっ
た。
多重性を説明するための１つの方法は、ｐ値を調整して実験に関する誤差率（宣言され
た差異が全て有意である確率）を制御することであるが、試験において多くの比較を行う
場合、特異的な効果を検出するための検定力は有意に低下する可能性がある。検定力がは
るかに大きい代替法は、ｐ値を調整してそれぞれの宣言された差異が有意である確率を制
御することである。これは、偽発見率（ＦＤＲ）手順（BenjaminiおよびHochberg、1995
年）を用いて実現することができる。したがって、変量効果の処理間の真の差異の識別（
偽陽性）を改善するために、ＦＤＲを用いてｐ値を調整した。
実施例８．１．
ダイズの茎葉の組成分析
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの茎葉試料
中のタンパク質、脂肪、灰分、水分、炭水化物、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）、中
性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、カルシウムおよびリンの分析を実施した。全ての区域
にわたる結果の概要が表１８に示されている。
タンパク質、脂肪、灰分、水分、炭水化物、ＡＤＦ、ＮＤＦ、カルシウムまたはリンに
ついて、現場全てにわたる分析において、対照エントリーとトランスジェニックエントリ
ーとの間に統計学的差異は観察されなかった。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋
グルホシネートおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤についての
現場全てにわたる平均灰分値は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネー
トおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤについてのＮＤＦ値と同様
に、文献範囲の外側であった。非トランスジェニック対照を含めた全ての処理についての
ＡＤＦ値も、文献値の外側であった。茎葉におけるいかなる一般成分、繊維の種類、また
はミネラルについても、平均値は、非トランスジェニック対照とトランスジェニックエン
トリーのいずれとの間でも有意に異ならなかった。これらの組成成分に基づいて、ダイズ
イベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ由来の茎葉は、近同質遺伝子非トランスジェニッ
ク対照の茎葉と実質的に同等であった。
実施例８．２．
ダイズの粒の組成分析
実施例８．２．１
一般成分および繊維
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
のタンパク質、脂肪、灰分、水分、コレステロール、炭水化物、ＡＤＦ、ＮＤＦおよび総
食物繊維の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表１９に示されている。
脂肪、ＡＤＦまたは総食物繊維に関しては、現場全てにわたる分析において、対照エン
トリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。しか
し、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエントリーについては、ＡＤＦ
が文献範囲よりもわずかに高かった。
タンパク質レベルは、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、ダイズイベントＤＡ
Ｓ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方
の除草剤について、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なった。しか
し、ＦＤＲを調整した後、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄについて
のｐ値のみが有意であり、また、全ての処理についての全体の平均のタンパク質の値は報
告された文献値の範囲内であり、これは、差異が生物学的には意味がないことを示してい
る。
灰分の現場全てにわたる分析において、対照と２，４−Ｄを噴霧したダイズイベントＤ
ＡＳ−６８４１６−４処理との間に有意な調整していないＰ値が観察されたが、全体的な
処理の効果または調整したＰ値は観察されなかった。灰分値も、報告された文献値の範囲
内であり、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。
水分レベルは、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６
８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草
剤について、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なった。しかし、水
分についての全体的な処理の効果は有意でなく、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
＋２，４−Ｄ処理のみが有意なＦＤＲ調整したＰ値を有し、また、全ての処理について平
均水分レベルは文献範囲内であった。このことにより、差異は生物学的には意味がないこ
とが示された。
コレステロール値は、全て定量限界未満（＜ＬＯＱ）であり、また、報告された文献値
はない。
炭水化物レベルは、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２
，４−Ｄについて、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なった。しか
し、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ処理のみが、ＦＤＲ調整したＰ
値に基づいて対照と有意に異なり、全ての処理の平均は報告された文献値の範囲内であり
、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
ＮＤＦレベルは、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４＋グルホシネートについて、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異
なっが、これは、有意な調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わなかった。現場全
てにわたるＮＤＦの値は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートおよ
びダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエントリーについて報告された文
献値よりもわずかに高かったが、差異は、非トランスジェニック近同質遺伝子対照と比較
して９％未満であった。
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非
トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
実施例８．２．２
ミネラル
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
のカルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、
カリウム、セレン、ナトリウムおよび亜鉛の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の
概要が表２０に示されている。
クロム、銅、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、リン、セレンおよびナトリウム（検
出されなかった）については、現場全てにわたる分析において、調整していないＰ値に基
づいて、対照エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察さ
れなかった。
カルシウムは、現場全てにわたる分析におい て、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４＋２，４−Ｄについて、調整していないＰ値に基づいて有意差を有したが、これは、
有意なＦＤＲ調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わず、全ての処理の平均は文献
範囲内に入り、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。
マグネシウムレベルは、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８
４１６−４＋両方の除草剤およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネー
トについて、それぞれ、調整していないｐ値および調製したｐ値に基づいて対照と比較し
て有意に異なったが、全体的な処理の効果は有意でなかった。マグネシウムの現場全てに
わたる平均値は、報告された文献値よりもわずかに低かったが、対照と比較して差異は小
さく（＜３％）、全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、対照と比
較して、より文献値に近かった。
全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、現場全てにわたる分析に
おいて、対照と比較して有意に高いカリウムの値を有した。しかし、対照と比較して差異
は小さく（＜５％）、全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、対照
と比較して、より文献範囲に近かった。
亜鉛レベルの差異は、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４
１６−４＋両方の除草剤について、調整していないＰ値に基づいて有意であったが、これ
は、有意なＦＤＲ調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わず、また、差異は小さか
った（＜４％）。
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非
トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
実施例８．２．３
アミノ酸
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
の以下のアミノ酸の分析を実施した：アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、シスチン
、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン
、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およ
びバリン。全ての区域にわたる結果の概要が表２１に示されている。
システイン、メチオニン、プロリン、チロシンまたはトリプトファンについては、対照
エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄについてのイソロイシンレベルは、
調整していないＰ値に基づいて対照と有意に異なったが、これは、有意なＦＤＲ調整した
Ｐ値または有意な全体的な処理の効果を伴わなかった。残りの１２種のアミノ酸のレベル
は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーのうちの２つ以上について、対照
と比較してわずかに低かったが（＜７％）、全てが非トランスジェニックダイズについて
の文献範囲内に入った。全てのエントリーについて、全てのアミノ酸が文献範囲内であり
、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。これらの組成成分に基づい
て、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非トランスジェニックダイズの
粒と実質的に同等であった。
実施例８．２．４
脂肪酸
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
の２２種の脂肪酸の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２２に示されて
いる。
脂肪酸の１０：０カプリン酸、１５：０ペンタデカン酸、１５：１ペンタデセン酸、２
０：３エイコサトリエン酸、２０：４アラキドン酸、８：０カプリル酸、１２：０ラウリ
ン酸、１４：０ミリスチン酸、１４：１ミリストレイン酸、１７：１ヘプタデセン酸、１
８：３ガンマリノレン酸、および２０：２エイコサジエン酸を分析し、結果はＬＯＱ未満
であった。脂肪酸の１６：０パルミチン酸、１７：０ヘプタデカン酸、および２０：１エ
イコセン酸は、対照とＡＡＤ−１２エントリーとの間で有意に異ならなかったが、２０：
１エイコセン酸値は、ＡＡＤ−１２＋グルホシネートおよびＡＡＤ−１２＋両方の除草剤
について、報告された文献値よりも低かった。しかし、対照と比較して差異は小さかった
（＜５％）。
１６：１パルミトレイン酸のレベルは、対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイ
ベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、
噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーのみが、１６：１パル
ミトレイン酸について有意なＦＤＲ調整したＰ値を有した。この処理についての１６：１
パルミトレイン酸の現場全てにわたる値は報告された文献値と比較して低かったが、近同
質遺伝子対照と比較して差異は小さかった（＜１３％）。
１８：０ステアリン酸のレベルは、対照と、噴霧なしおよびダイズイベントＤＡＳ−６
８４１６−４＋グルホシネートとの間で、調整していないＰ値に基づいて有意に異なった
。しかし、調整したｐ値または全体的な処理の効果に基づいて有意差は確認されず、また
、全てのエントリーは報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニック
ダイズとの同等性を示している。
１８：１オレイン酸のレベルは、対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８
４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベント
ＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋
両方の除草剤との間で有意に異なった。しかし、１８：１オレイン酸レベルは、全ての処
理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの
同等性を示している。
１８：２リノール酸のレベルは、対照と、噴霧なしおよびダイズイベントＤＡＳ−６８
４１６−４＋２，４−Ｄとの間で、調整していないＰ値に基づいて有意に異なった。しか
し、調整したｐ値または全体的な処理の効果に有意差は確認されず、また、１８：２リノ
ール酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トラン
スジェニックダイズとの同等性を示している。
１８：３リノレン酸のレベルは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーの
それぞれと、対照との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なり、また、調整し
たｐ値も、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４およびダイズイベント
ＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤処理の間で対照と比較して有意であった。１８：
３リノレン酸について入手可能な文献値はないが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−
４と対照処理との間の差異は小さかった（＜６％）。
２０：０アラキジン酸のレベルは、対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６
８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベン
トＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４
＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なり、まら、２０：０
アラキジン酸は、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、およびダイズイベントＤＡ
Ｓ−６８４１６−４＋グルホシネート処理について、調整したＰ値にも有意差を有した。
しかし、２０：０アラキジン酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内で
あり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
２２：０ベヘン酸のレベルは、対照と、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダ
イズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値に基
づいて有意に異なり、また、２２：０ベヘン酸のレベルは、現場全てにわたる分析におい
て、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートについて、調整したＰ値に
も有意差を有した。しかし、有意な全体的な処理の効果はなく、また、２２：０ベヘン酸
レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェ
ニックダイズとの同等性を示している。
調査した２２種の脂肪酸のうち、２１種の脂肪酸について、４つのダイズイベントＤＡ
Ｓ−６８４１６−４エントリーの全てが、対照と統計学的に区別できなかったか、または
、文献値の範囲内であった。１つの場合（噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４
１６−４；１６：１パルミトレイン酸）で、値は最小の文献値をわずかに下回り、対照と
統計学的に異なった（＜１３％低かった）が、３種の噴霧処理の全ては、文献範囲内であ
った。これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６由来の粒は、非
トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
実施例８．２．５
ビタミン
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
のビタミンの分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２３に示されている。
ダイズの粒中のベータ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェ
ロール、ビタミンＡ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタ
ミンＤおよびナイアシンについての文献値は見つからなかった。ベータトコフェロール、
ビタミンＡ、ビタミンＢ１２およびビタミンＤは全てＬＯＱ未満であった。ビタミンＢ１
、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥまたはナイアシンについて、対
照、噴霧していないＡＡＤ−１２および処理したＡＡＤ−１２の間に差異は観察されなか
った。入手可能な文献範囲を有するこれらのビタミンの中で、近同質遺伝子対照を含めた
全ての処理について値がその範囲を超えたビタミンＢ２を例外として、全ての処理がこれ
らの範囲内に入った。
デルタ−トコフェロールレベルは、対照と、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋
グルホシネートエントリーおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエ
ントリーとの間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、これは、有
意な調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わなかった。ガンマトコフェロールは、
対照と、噴霧なしエントリーおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ
エントリーとの間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異なった
。しかし、ガンマトコフェロールは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理につい
て、近同質遺伝子対照と比較して１１％未満高かった。
ビタミンＢ５レベルは、対照と、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネ
ートエントリーとの間で、調整したＰ値に基づいて有意に異なった。しかし、これは、有
意な全体的な処理の効果を伴わなかった。
葉酸は、対照と、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄおよ
びダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤について、調整していないｐ値
に基づいて有意に異なった。葉酸については、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エ
ントリーの２種について、対照と比較して調整したｐ値にも有意差があった。しかし、葉
酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４エントリーは、近同質遺伝子対照との差異が＜９％であり、これは、非
トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非
トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
実施例８．２．５
イソフラボン
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
のイソフラボンの分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２４に示されてい
る。
ゲニステインおよびグリシテインの結果は、処理した試料について、ＬＯＱを下回った
。ダイジンレベルは、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤エン
トリーとの間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異なった。し
かし、全体的な処理の効果は有意でなかった。報告された文献値はないが、ダイズイベン
トＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤処理は、近同質遺伝子対照との差異が＜９％で
あった。ゲニスチンレベルは、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除
草剤エントリーとの間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異な
った。しかし、全体的な処理の効果は有意でなかった。ゲニスチン値は、全ての処理につ
いて、報告された文献値よりも高かったが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理
は、近同質遺伝子対照と比較して差異が９％未満であった。グリシチンの値は対照とダイ
ズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値および
調整したｐ値に基づいて有意に異なった。グリシチンについて報告された文献値はなかっ
たが、全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、近同質遺伝子エント
リーと比較して、差異が１３％未満であった。
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ由来の粒
は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
実施例８．２．５
抗栄養因子
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−
ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中
の抗栄養因子の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２５に示されている
。
レクチン、フィチン酸、またはトリプシン阻害物質について、対照エントリーとトラン
スジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。これらの３種の抗栄
養因子は全て文献範囲内でもあり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示
している。
ラフィノースは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート処理につい
て、対照と比較して調整していないｐ値に基づいて有意に低かった（＜１０％）。ラフィ
ノースは、現場全てにわたる分析において、調整したＰ値または全体的な処理の効果に基
づいて有意に異ならなかった。ラフィノースレベルは、全ての処理について報告された文
献値の範囲内でもあり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
スタキオースは、対照およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート
エントリーとの間で、調整していないＰ値に基づいて有意に異なった。スタキオースレベ
ルは、現場全てにわたる分析において、調整したＰ値または全体的な処理の効果に基づい
て有意に異ならなかった。スタキオースレベルは、全ての処理について報告された文献値
の範囲内でもあり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
レクチン、フィチン酸、ラフィノース、スタキオースおよびトリプシン阻害物質につい
ての抗栄養因子分析は、全て報告された文献値の範囲内であり、調整していないｐ値に基
づく２つの有意差は、抗栄養因子のレベルがダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理
について対照と比較して低かった。
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ由来の粒
は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
実施例８．３
粒および茎葉の組成の概要
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の組成物は、近同質遺伝子系統と統計学的に区
別できなかったか、または近同質遺伝子系統との差異が１３％未満であったか、または非
トランスジェニックダイズについての文献範囲内であった。したがって、ダイズイベント
ＤＡＳ−６８４１６−４は、非トランスジェニックダイズと実質的に同等であることが見
いだされた。組成の結果のプロットは、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１
６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡ
Ｓ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方ダ
イズと対照ダイズ系統との間に、生物学的に意味のある、処理に関連するいかなる組成上
の差異も示していない。結論として、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６
−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ
−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の組
成の結果により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４と従来のダイズの同等性が確認
される。
植え付け前の、一掃するための施用および出芽前試験
この実施例では、本発明によって可能になる、ダイズ作物の植え付けおよび除草剤の使
用の新しい方法を記載している。
植え付け前の、一掃するための除草剤の施用は、所与の作物を植え付ける前に、冬また
は初春の間に現れた雑草を枯らすことを意図している。一般には、これらの施用は、植え
付け前に雑草の物理的な除去が完了していない不耕起または低耕起の管理体制において適
用する。したがって、不耕起または低耕起のダイズと併せて使用する除草剤計画によって
、植え付け前に存在する非常に広範な広葉雑草およびイネ科雑草を制御しなければならな
い。
グリホサート、グラモキソン、およびグルホシネートは、植え付け前の、一掃するため
の除草剤の施用のために広範に使用される非選択的な残留しない除草剤の例である。しか
し、一部の雑草は、以下の因子の１つまたは複数に起因して、そのような除草剤で制御す
ることが難しい：除草剤に対する雑草種または生物型の固有の非感受性、比較的大きなサ
イズの越冬一年生雑草、および除草剤の取り込みおよび活性を制限する寒冷な気候条件。
非選択的な除草剤が不十分である場合に、これらの除草剤とタンク混合して雑草に対する
スペクトルおよび活性を増加させるために、いくつかの除草剤の選択肢が利用可能である
。１つの例は、ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）（horseweed）を制御するために
役立つ２，４−Ｄ＋グリホサートのタンク混合の施用を用いることである。グリホサート
は、存在する雑草の大部分を植え付け前に一掃制御するために４２０〜１６８０ｇ ａｅ
／ｈａ、より一般には、５６０〜８４０ｇ ａｅ／ｈａで使用することができるが、多く
の広葉雑草種（例えば、ヒメムカシヨモギ（horseweed））を制御することに役立つよう
に、２８０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄをに施用することができる。
２，４−Ｄは、非常に広範囲の広葉雑草（比較的低温においてさえも）に対して有効で
あり、かつ非常に安価であるので、一般的に好まれる植え付け前の除草剤である。しかし
、一掃するための施用の後に植える作物が２，４−Ｄに対して感受性が高い場合（例えば
、大部分の双子葉作物）、土壌に２，４−Ｄが残留すること（短期であっても）により、
作物が害される恐れがある。ダイズに使用するために、多くの２，４−Ｄエステル除草剤
の表示では、１ｌｂ ａｉ／エーカーの一掃するための施用の少なくとも１５日後までは
新しい作物の植え付けが制限されている。２，４−Ｄの低揮発性エステル製剤の場合では
、一掃するための最大０．５ｌｂ ａｉ／エーカーまでの比率では、一般には、施用後７
日を過ぎてから植え付けることが必要とされ、１．０ｌｂ ａｉ／エーカーの比率では、
一般には、施用後３０日を過ぎてから植え付けることが必要とされる。水溶性である２，
４−Ｄのアミン製品の場合のさらなる懸念は、除草剤が種子の帯域に浸出する恐れがある
ことである。しかし、ａａｄ−１２遺伝子を含有する作物は、２，４−Ｄに対して耐性で
あり、土壌中に２，４−Ｄが残留することによって負の影響を受けない。この耐性に起因
して、ａａｄ−１２遺伝子を含有する植物は、ａａｄ−１２遺伝子を含有しない植物より
も害を持続することなく、一掃後すぐに植えることができる。さらに、タンク混合（また
は市販のプレミックス）パートナーと用いる２，４−Ｄ除草剤の柔軟性が増し、費用が縮
小することにより、雑草制御の選択肢が改善され、重要な不耕起および低耕の状況におけ
る一掃するための施用の頑強性が増す。
２，４−Ｄアミンの出芽前施用を、植え付けの７日前、１５日前または３０日前に、１
１２０ｇ ａｅ／ｈａ、２２４０ｇ ａｅ／ｈａ、４４８０ｇ ａｅ／ｈａの比率で、ａ
ａｄ−１２遺伝子を含有するダイズ（イベントＤＡＳ−６８４１６−４）および対照ダイ
ズに適用する。出芽前施用を、当技術分野において認められている手順で、地理的に異な
る地方に位置する圃場の小区画に適用する。出芽および早期生長の正確な評価をもたらす
ために、除草剤処理した小区画は、処理していない小区画と対になっている。植え付け後
、および植え付けの７日前、１５日前または３０日前の２，４−Ｄの施用後；ａａｄ−１
２遺伝子を含有するダイズ（イベントＤＡＳ−６８４１６−４）および対照ダイズの害を
測定する。圃場試験の結果は、ａａｄ−１２遺伝子を含有するダイズ（イベントＤＡＳ−
６８４１６−４）により、植え付けの７日前、１５日前、または３０日前の２，４−Ｄ除
草剤の出芽前処理に頑強な耐性がもたらされることを示している。
これらの実施例は、利用可能な多くの選択肢のうちのいくつかである。雑草制御の当業
者は、例として、連邦の除草剤表示（CPR、2003年）に記載の製品およびAgriliance Crop
Protection Guide（2003年）に記載の用法を利用することによって、これらに限定され
ないが、グラモキソン＋２，４−Ｄまたはグルホシネート＋２，４−Ｄを含めた種々の他
の施用に注目されよう。上記の例を、安定に形質転換されていれば、ＡＡＤ−１２遺伝子
によって保護される、２，４−Ｄ（または他のフェノキシオーキシン除草剤）に対する感
受性が高い任意の作物に施用することができることも、当業者には認識されよう。
ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズは、２，４−Ｄに対して耐性である除草剤である。この
実施例では、圃場条件下での、ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズの除草剤耐性の特徴付けに
ついて報告している。ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズを、除草剤である２，４−Ｄに対す
る耐性について、米国で行った圃場試験において評価した。ＤＡＳ−６８４１６−４ダイ
ズについて、提唱された最大の施用率は、２，４−Ｄについては１１２０ｇ ａｅ／ｈａ
である。以下に考察するデータは、ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズにより、これらの提唱
された最大使用率の少なくとも４倍の比率において、許容できる耐性がもたらされること
を示している。
２，４−Ｄの解毒、およびこの化合物によって後に引き起こされる害からの保護に対す
るＤＡＳ−６８４１６−４ダイズの効力を、圃場研究において特徴付けた。２，４−Ｄに
対する出芽前の耐性を評価するために試験を設計した。出芽前試験を完全乱塊計画として
行った。実験単位は、出芽前試験のための、長さおよそ３ｍの、作条が２つある小区画か
らなり、全ての試験は３回の反復を含有した。除草剤の施用は全て、噴霧体積およそ１４
０〜１９０ｌ／ｈａを送達する、ガスで加圧された小さな小区画噴霧装置を用いて行った
。使用した２，４−Ｄの製剤は、４５６ｇ ａｅ／リットルのジメチルアンモニウム塩で
あった。作物が出芽したおよそ７日後に、視覚的な害の評点を取得した。評点は、小区画
内の植物全てにわたって観察された全ての害の症状の視覚的合成を反映する０〜１００の
尺度で取得し、０＝処理していない小区画と比較して害なし、１００＝全ての植物が枯死
とした。
出芽前試験は、植え付け後だが、作物が出芽する前の、１１２０ｇ ａｅ／ｈａ、２２
４０ｇ ａｅ／ｈａ、および４４８０ｇ ａｅ／ｈａの施用からなった。出芽前試験に関
する情報は、表２６に提示されている。
要約すると、２，４−Ｄ耐性の圃場評価を行った。ミシシッピ、インディアナ、および
ミネソタの区域において、ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズおよび形質転換されていないＭ
ａｖｅｒｉｃｋダイズの、出芽前の２，４−Ｄアミンの施用に対する反応を検査する試験
を行った。この３区域全てにわたって平均すると、２，４−ＤアミンをＤＡＳ−６８４１
６−４に出芽前に施用することにより、施用率に関係なく、２％以下の害が生じた（表２
７）。形質転換されていないＭａｖｅｒｉｃｋでは、同じ処理によって３４〜６０％の害
が引き起こされた。２，４−Ｄを出芽前施用したものの害は、群生の減少および生長の低
下からなった。
グリホサート耐性遺伝子＋ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の組合せを使用して
グリホサート抵抗性の雑草を制御する方法
グリホサートは、非常に広範な広葉およびイネ科雑草種を制御するので、広範囲にわた
って使用されている。しかし、ＧＴＣにおいて、および非作物施用においてグリホサート
の使用を繰り返すことにより、雑草のシフトが自然により耐性の種またはグリホサート抵
抗性の生物型に選択されてきており、またこれからもそれが続くであろう。大部分の除草
剤抵抗性管理戦略では、抵抗性の雑草の出現を遅延させる方法として、同じ種の制御をも
たらすが異なる作用様式を有する、効果的な比率で使用されるタンク混合の除草剤パート
ナーが処方される。４１６ＡＡＤ−１２イベントにグリホサート耐性形質（および／また
は他の除草剤耐性形質）を積み重ねることにより、グリホサート、フェノキシオーキシン
（複数可）（例えば、２，４−Ｄ）およびピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば
、トリクロピル）を同じ作物において選択的に使用することが可能になり、それによって
ＧＴＣにおいてグリホサート抵抗性の双子葉雑草種を制御することが可能になる機構をも
たらすことができた。これらの除草剤は、異なる作用様式の２つ以上の除草剤を含むタン
ク混合物中で同時に施用することができ；植え付け前、出芽前、または出芽後および分裂
時のおよそ２時間からおよそ３カ月までにわたる施用のタイミングで、単一の除草剤の組
成をそれぞれ逐次的に施用することができる；あるいは、それぞれの化学的クラスを代表
する任意の数の除草剤の任意の組合せを、作物の植え付けの約７カ月以内、作物を収穫す
るまで（または、個々の除草剤について、いずれか最も短い収穫前の間隔）の任意のタイ
ミングで施用することができる。
広範なスペクトルのイネ科雑草および広葉雑草を制御することにおいて、施用のタイミ
ング、個々の除草剤の比率、および厄介なまたは抵抗性の雑草を制御する能力の点で柔軟
性を有することが重要である。グリホサート抵抗性遺伝子／ＡＡＤ−１２ ４１６イベン
トの積み重ねを有する作物におけるグリホサートの施用は、約２５０〜２５００ｇ ａｅ
／ｈａにわたってよく；（１種または複数種の）フェノキシオーキシン除草剤は、約２５
〜４０００ｇ ａｅ／ｈａ施用してよく；（１種または複数種の）ピリジルオキシ酢酸オ
ーキシン除草剤は、２５〜２０００ｇ ａｅ／ｈａ施用してよい。これらの施用（複数可
）の最適な組合せ（複数可）およびタイミングは、特定の状況、種、および環境に左右さ
れ、雑草制御の当業者および本開示の利益を受ける当業者が決定することが最善である。
北アメリカにおいて植えられている綿、キャノーラ、トウモロコシ、およびダイズの畑
地の大部分は、グリホサート耐性（ＧＴ）形質を含有し、また、ＧＴトウモロコシの採用
は増えている。追加的なＧＴ作物（例えば、コムギ、イネ、サトウダイコン、および芝生
）が開発中であるが、これまで発売されていない。多くの他のグリホサート抵抗性種は、
開発段階への実験中である（例えば、アルファルファ、サトウキビ、サンフラワー、ビー
ト、エンドウ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ
；ポプラおよびモミジバフウのような森林種；ならびにマリーゴールド、ペチュニア、お
よびベゴニアのような園芸種；World Wide Web、isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm、2
005年）。ＧＴＣは、このシステムによって提供される、雑草完全な広がりを制御するた
めの価値があるツールであり、利便性および費用の有効性である。しかし、現在標準の基
剤処理としてのグリホサートの有用性は、グリホサート抵抗性の雑草について選択されて
いる。さらに、グリホサートのみの化学的プログラムが実施されている圃場において、グ
リホサートが本質的にあまり効果的でない雑草が優勢な種にシフトしている。ＡＡＤ−１
２イベント４１６にＧＴ形質を積み重ねることにより、従来の育種によってまたは新規の
形質転換イベントと共同で、雑草を制御する効力、柔軟性、および雑草のシフトを管理す
る能力および除草剤抵抗性の発生を改良することができる。作物をＡＡＤ−１２イベント
４１６で形質転換することにより、単子葉作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジル
オキシオーキシンの安全性により高い余地を有することになり、双子葉作物にフェノキシ
オーキシンを選択的に施用することができる。ＡＡＤ−１２イベント４１６およびＧＴ形
質を任意の単子葉作物種または双子葉作物種に積み重ねた場合、改良された雑草制御の選
択肢のためのいくつかのシナリオを構想することができる：
ａ）大部分のイネ科植物および広葉雑草種を制御するために、グリホサートを標準の出
芽後の施用率（４２０〜２１６０ｇ ａｅ／ｈａ、５６０〜８４０ｇ ａｅ／ｈａが好ま
しい）で施用することができる。ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）などのグリホ
サート抵抗性の広葉雑草またはグリホサートを用いて制御することが本質的に厄介な雑草
（例えば、ツユクサ（Commelina）種、サツマイモ（Ipomoea）種など）を制御するために
、２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａ（５６０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａが好ましい）の２
，４−Ｄを、グリホサートと、逐次的に、タンク混合して、またはプレミックスとして施
用して有効な制御をもたらすことができる。トリクロピルについては、施用率は一般には
７０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａ、より一般には１４０〜４２０ｇ ａｅ／ｈａの範囲にな
る。フルロキシピルについては、施用率は、一般には３５〜５６０ｇ ａｅ／ｈａ、より
一般には７０〜２８０ ａｅ／ｈａの範囲になる。
ｂ）現在、ＧＴＣにおいて施用されるグリホサートの比率は、一般に、施用のタイミン
グ当たり５６０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの範囲である。グリホサートは、広葉雑草種よ
りもイネ科植物種に対してはるかに効果的である。ＡＡＤ−１２イベント４１６＋ＧＴを
積み重ねた形質により、イネ科植物に有効な比率のグリホサート（１０５−８４０ｇ ａ
ｅ／ｈａ、より好ましくは２１０−４２０ｇ ａｅ／ｈａ）が可能になる。それから、２
，４−Ｄ（２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａ、より好ましくは５６０〜１１２０ｇ ａｅ
／ｈａ）を、イネ科植物に有効な比率のグリホサートと、逐次的に、タンク混合して、ま
たはプレミックスとして施用して必要な広葉雑草の制御をもたらすことができる。上記の
比率のトリクロピルおよびフルロキシピルは、処理レジメンにおいて許容できる構成成分
になる。低率のグリホサートにより、広葉雑草の制御にもいくらかの利益がもたらされる
；しかし、主要な制御は、２，４−Ｄ、トリクロピル、またはフルロキシピルによるもの
である。
作物をＡＡＤ−１２イベント４１６で形質転換することにより、１つまたは複数の商業
的なアリールオキシオーキシン除草剤を単独で、または組み合わせて（逐次的にまたはそ
れぞれ独立に）使用することが可能になることが、雑草制御の当業者には認識されよう。
これらの化学物質を代表する特定の比率の他の除草剤は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍または同様の編集物によって編集された除草剤の
表示、オンライン（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）で編集された表示、またはＡｇ
ｒｉｌｉａｎｃｅからのCrop Protection Guide（2005年）などの任意の商業的なまたは
学術的な作物保護の手引きによって決定することができる。ＡＡＤ−１２イベント４１６
によってＨＴＣにおいて使用することが可能になったそれぞれの代替の除草剤は、単独で
使用されようが、タンク混合して使用されようが、または逐次的に使用されようが、本発
明の範囲内であるとみなされる。
（参考文献）

Claims (19)

  1. 配列番号１を含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物であって、前記トランスジェニックダイズ植物が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されているダイズ種子に由来する、トランスジェニックダイズ植物。
  2. Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されているダイズ種子。
  3. 配列番号１を含む、請求項２に記載の種子を生長させることによって作出されるダイズ植物。
  4. ＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含む、請求項３に記載のダイズ植物の後代植物。
  5. 配列番号１の残基１−２７３０および配列番号１の残基９１２２−１０２１２の宿主植物の配列間に挿入された配列番号１の残基２７３１−９１２１を含む、請求項１に記載のダイズ植物の除草剤耐性後代植物。
  6. 花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、配列番号１を含む、請求項３に記載の植物の一部。
  7. ダイズ植物を育種する方法であって、配列番号１を含む第１のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑してゲノムを含む第３のダイズ植物を作出するステップと、前記第３のダイズ植物を、前記ゲノム内に配列番号１が存在することについてアッセイするステップとを含み、前記第１のダイズ植物が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されているダイズ種子に由来する、方法。
  8. 除草剤耐性形質をダイズ植物に遺伝子移入する方法であって、配列番号１を含む第１のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑してゲノムを含む第３のダイズ植物を作出するステップと、前記第３のダイズ植物を、前記ゲノム内に配列番号１が存在することについてアッセイするステップとを含み、前記第１のダイズ植物が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されているダイズ種子に由来する、方法。
  9. 雑草を制御する方法であって、請求項１の植物を含む圃場にアリールオキシアルカノエート除草剤を施用するステップを含む方法。
  10. 前記除草剤が、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；およびＭＣＰＢからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記圃場に第２の除草剤を施用するステップを含む、請求項９に記載の方法。
  12. 前記第２の除草剤が、グリホサートおよびジカンバからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 雑草を制御する方法であって、圃場にアリールオキシアルカノエート除草剤を施用するステップと、前記除草剤を施用してから１４日間以内に前記圃場に請求項２の種子を植え付けるステップとを含む方法。
  14. 除草剤抵抗性の雑草を処理する、または防ぐために使用される、請求項９に記載の方法。
  15. 前記除草剤が、前記植物を植え付ける前に施用される、請求項９に記載の方法。
  16. グリホサート耐性形質をさらに含む少なくとも１つの請求項１に記載の植物を含む地域においてグリホサート抵抗性の雑草を制御する方法であって、アリールオキシアルカノエート除草剤を前記地域の少なくとも一部に施用するステップを含む方法。
  17. 前記除草剤がフェノキシオーキシンである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記除草剤がグリホサートとのタンク混合物から施用される、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記雑草の少なくとも１種が、前記植物と異なる種のグリホサート抵抗性の自生植物である、請求項９に記載の方法。

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