JP6244087B2 - 試料における点状対象の三次元位置決め用の顕微鏡装置および方法 - Google Patents
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Description
12 波長
14 波長
16 対物レンズ
18 チューブレンズ
20 焦点配光の中心点
22 焦点配光の中心点
30 点状対象
32 対物レンズ
34 チューブレンズ
36 検出光学系
38 検出面
40 鮮鋭面
42 光点
44 円柱レンズ
100 顕微鏡装置
102 励起光源
104 装置
106 二色ビームスプリッタ
108 対物レンズ
110 可動試料ホルダ
112 試料
114 点状対象
116 位置調整装置
118 検出フィルタ
120 チューブレンズ
122 偏向ミラー
124 円柱レンズ
126 色分離装置
128 二色ビームスプリッタ
130 偏向ミラー
132 偏向ミラー
134 偏向ミラー
136 偏向ミラー
138 カメラ
140 偏向ミラー
142 偏向ミラー
144 偏向ミラー
146 検出ユニット
148 検出ユニット
150 検出面
152 検出面
154 コントローラ
160 透過特性曲線
170 対物レンズ
172 チューブレンズ
174 チューブレンズ
180 点状対象
182 ビームスプリッタ
184 偏向ミラー
186 偏向ミラー
187 偏向ミラー
188 第1の画像面
190 第1の鮮鋭面
192 第2の画像面
194 第2の鮮鋭面
198 光点
200 光点
Claims (16)
- 試料(112)における点状対象(30、180)の三次元位置決め用の顕微鏡装置(100)であって、
対象空間に配置された点状対象(30、180)を、それぞれ三次元焦点配光の形態で画像空間に結像する検出光学系(36)と、
前記検出光学系(36)によって生成された光から分割された2つの別個の光束のそれぞれ1つを受信する、前記画像空間に配置された2つの検出ユニット(146、148)であって、関連焦点配光を通る平面セクションをそれぞれ表す光点(42)を感知するために、前記それぞれの光束の入射方向に垂直に配置された検出面(38)を含み、これら2つの検出面に割り当てられたそれぞれの鮮鋭面(40、190、194)が、前記対象空間において互いにオフセットされた、検出ユニット(146、148)と、
前記検出面(38)上で感知された前記光点(42)を評価することによって、鮮鋭面(40)と平行な対象面内の関連点状対象(30、180)の横方向X−Y位置、および前記鮮鋭面(40)に垂直に位置する光学軸(O)の方向における、前記鮮鋭面(40)に対する前記関連点状対象(30、180)の軸方向Z位置を確認する評価ユニット(154)であって、前記鮮鋭面(40)は、前記対象空間に位置する平面であって、前記画像空間に位置し、かつ前記検出面(38)が配置された検出平面と光学的に共役な平面である、評価ユニット(154)と、
を含む顕微鏡装置(100)にして、
前記検出ユニット(146、148)によって検出できる異なる波長領域用のそれぞれ1つのZ位置補正値が、その波長領域における前記検出光学系(36)の縦の色収差を示すものであり、前記評価ユニット(154)に記憶されること、および
関連Z位置補正値を用いて、前記それぞれの点状対象(30、180)の、前記それぞれの波長領域で確認された前記Z位置を補正する前記評価ユニット(154)を更に含む、
顕微鏡装置(100)。 - 光源によって放射され、前記検出ユニット(146、148)によって受信された前記光束から励起光をフィルタリングするように具体化されたフィルタを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡装置(100)。
- 前記点状対象(30、180)を結像するために、前記検出光学系(36)によって生成された光を、異なる波長領域に光波長がある2つの別個の光束に分割する二色ビームスプリッタ(182)を特徴とする、請求項1または2に記載の顕微鏡装置(100)。
- 前記点状対象(30、180)が前記鮮鋭面(40)に位置する場合に、関連光点(42)が対称的な形状を有するように、かつ前記点状対象(30、180)が前記検出光学系(36)に背を向けた前記鮮鋭面(40)の側に位置する場合に、前記関連光点(42)が、第1の非対称的な形状を有するように、かつ前記点状対象(30、180)が前記検出光学系(36)に面している前記鮮鋭面(40)の側に位置する場合に、前記関連光点(42)が、前記第1の対称的な形状と見分けることができる第2の非対称的な形状を有するように、前記それぞれの焦点配光に影響を及ぼすための装置(44、124)を特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の顕微鏡装置(100)。
- 前記それぞれの非対称的な形状が、少なくともほぼ楕円を構成し、前記評価ユニット(154)が、前記2つの相互に垂直な楕円軸の長さにおける差に基づいて、前記それぞれの点状対象(30、180)の軸方向Z位置を確認する、請求項4に記載の顕微鏡装置(100)。
- 前記それぞれの焦点配光に影響を及ぼすための前記装置が、円柱レンズ(44、124)を含む、請求項4または5に記載の顕微鏡装置(100)。
- 前記2つの検出面が、同じ点状対象に属する光点を感知し、前記評価ユニットが、前記光点のサイズ比に基づいて、その点状対象(30、180)の軸方向Z位置を確認する、請求項1に記載の顕微鏡装置(100)。
- 前記評価ユニット(154)が、それぞれ結像された点状対象(30、180)の色を、前記2つの検出面(150、152)によって感知されかつその点状対象(30、180)に属する光点の輝度比に基づいて確認し、前記確認された色を、その色用の縦の色収差を示す関連Z位置補正値に、割り当てる、請求項3〜7のいずれか一項に記載の顕微鏡装置(100)。
- 試料取付台(110)および/または前記検出光学系(36)を前記光学軸(O)に沿って移動させるための位置調整装置(116)を特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の顕微鏡装置(100)。
- 励起光を前記試料(112)上に放射するための光源(102)、および前記試料(112)上に放射された前記励起光のスペクトル変化のために前記光源の後に配置された装置(104)を特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の顕微鏡装置(100)。
- 試料(112)における点状対象(30、180)の三次元位置決め用の方法であって、
対象空間に配置された点状対象(30、180)を、それぞれ三次元焦点配光の形態で、検出光学系(36)によって画像空間に結像するステップと、
前記画像空間に配置され、かつ関連焦点配光を通る平面セクションをそれぞれ表す光点(42)を感知するため、それぞれの光束の入射方向に垂直に配置され、割り当てられたそれぞれの鮮鋭面(40、190、194)が前記対象空間において互いにオフセットされた検出面(38)を備えて成る、2つの検出ユニット(146、148)を用いて、前記検出光学系(36)によって生成された光から分割された2つの別個の光束のそれぞれ1つを受信するステップと、
前記対象空間に位置する平面であって、前記画像空間に位置し、かつ前記検出面(38)を配置した検出平面と光学的に共役な平面である鮮鋭面(40)と平行な対象面内のそれぞれの点状対象(30、180)の横方向X−Y位置、および前記鮮鋭面(40)に垂直に位置する光学軸(O)の方向における、前記鮮鋭面(40)に対する前記それぞれの点状対象(30、180)の軸方向Z位置を、前記検出面(38)上で感知された関連光点(42)を評価することによって確認するステップと、
前記検出ユニット(146、148)によって検出できる異なる波長領域用のそれぞれ1つのZ位置補正値であって、関連波長領域における前記検出光学系(36)の縦の色収差をそれぞれ示すZ位置補正値を利用可能にするステップと、
関連Z位置補正値を用いて、前記それぞれの点状対象(30、180)の、前記それぞれの波長領域で確認されたZ位置を補正するステップと、
を有する、方法。 - 光源によって放射された励起光が、前記検出ユニット(146、148)によって受信された前記光束から、フィルタによってフィルタリングされることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記点状対象(30、180)を結像するために前記検出光学系(36)によって生成された光を、異なる波長領域に光波長がある2つの別個の光束へ分割することを特徴とする、請求項11または12に記載の方法。
- 少なくとも1つの反射または散乱点状較正対象を含む較正試料が、異なる較正波長の光で照明され、
前記点状較正対象のZ位置が、各較正波長用に確認され、
様々な較正波長用に確認された前記較正対象のZ位置間の偏差が決定され、
これらの偏差に基づいて、波長依存Z位置補正値が識別される、
請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の異なる蛍光染料を含む較正試料が、異なる励起波長の光で照明され、各励起波長が、蛍光を放射するために、各励起波長に割り当てられた1つの蛍光染料をそれぞれ励起し、前記蛍光の蛍光波長が、他の蛍光染料によって放射された前記蛍光の蛍光波長と異なることと、
前記点状較正対象のZ位置が、較正波長を定義する各蛍光波長用に確認されることと、
様々な較正波長用に確認された前記較正対象のZ位置間の偏差を決定することと、
これらの偏差に基づいて、波長依存Z位置補正値が識別されることと、
を特徴とする、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 各2つの各較正波長間に位置する波長用のZ位置補正値が、識別されたZ位置補正値の補間によって確認され、および/または最長較正波長より長いか、最短較正波長より短い波長用のZ位置補正値が、識別されたZ位置補正値の外挿によって確認される、請求項15に記載の方法。
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