JP2011158273A - 色収差測定方法、色収差測定装置及び色収差測定プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、効率よく色収差を測定しうる。
【解決手段】本発明は、対物レンズ１２の焦点を光軸方向に移動させながら、蛍光サンプルＳＰＥと撮像素子３０との相対位置を、当該焦点の移動方向と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させ、その間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像を取得することにより、蛍光サンプル像には各波長の光の像が色収差の違いに応じた傾きで写るので、顕微鏡装置１は、この傾きに基づいて色収差を測定することができるので、従来と比して蛍光サンプル像の枚数を低減でき、撮像時間を短縮できるので、効率よく色収差を測定しうる。
【選択図】図１０

Description

本発明は色収差測定方法、色収差測定装置及び色収差測定プログラムに関し、例えば光学系を介してサンプルを観察する分野に適用して好適なものである。

近年、特定の蛋白質又は遺伝子間の距離により薬剤や阻害剤などの効果が大きく異なってしまう場合があることが発見されており、該蛋白質又は遺伝子間の距離を正確に測定することが求められている。

そこで、ターゲットとなる蛋白質又は遺伝子が蛍光マーカにより標識された生体サンプルがレンズにより拡大された画像を取得し、該画像をもとに該蛍光マーカ間の距離を測定することにより、該蛋白質又は遺伝子間の距離を測定する方法が考えられる。この方法において、異なる蛋白質又は遺伝子に対して異なる波長の光（色）を発する蛍光マーカを用いる際には、レンズ（光学系）の色収差を加味する必要がある。

このような実情等に鑑み、光学系の色収差を測定する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。この装置は、複数の色の点光源をサンプルとし、測定対象となる光学系の光軸方向に所定間隔ごとに焦点を移動させ、これら焦点でのサンプル像のそれぞれを画像データとして取得する。そしてこの装置は、取得した画像全体の中から各色の最大輝度の画素がある画像に対応した位置に基づいて光学系の色収差を測定するようになっている。

特開２００７−１６３４５５公報

ところで上述した装置では、光学系の色収差を測定する際に、所定間隔ごとに焦点を移動させて膨大な枚数のサンプル像を撮像しなければならないため、撮像時間が長くなってしまう。このため、光学系の色収差を測定する際の撮像時間を短縮することが望まれている。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、効率よく色収差を測定しうる色収差測定方法、色収差測定装置及び色収差測定プログラムを提案しようとするものである。

かかる課題を解決するため本発明の色収差測定方法においては、対物レンズを含む光学系の光軸と直交する面に配された複数の波長の光を発するサンプルが含まれる範囲を当該光軸方向に当該対物レンズの焦点を移動させながら、当該サンプルの像であるサンプル像が当該光学系を介して結像される撮像素子と当該サンプルとの相対位置を、当該光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる移動制御ステップと、当該移動制御ステップで移動させる間、当該撮像素子を露光させることにより当該サンプル像を取得するサンプル像取得ステップと、当該サンプル像に基づいて当該光学系における当該複数の波長の光の色収差を測定する色収差測定ステップとを設けるようにした。

また本発明の色収差測定装置においては、対物レンズを含む光学系と、当該光学系の光軸と直交する面に配された複数の波長の光を発するサンプルの像であるサンプル像が当該光学系を介して結像される撮像素子と、当該サンプルが含まれる範囲を当該光軸方向に当該対物レンズの焦点を移動させながら、当該撮像素子と当該サンプルとの相対位置を、当該光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる移動制御部と、当該移動制御部が移動させる間、当該撮像素子を露光させることにより当該サンプル像を取得するサンプル像取得部と、当該サンプル像に基づいて当該光学系における当該複数の波長の光の色収差を測定する色収差測定部とを設けるようにした。

さらに本発明の色収差測定プログラムにおいては、コンピュータに対して、対物レンズを含む光学系の光軸と直交する面に配された複数の波長の光を発するサンプルが含まれる範囲を当該光軸方向に当該対物レンズの焦点を移動させながら、当該サンプルの像であるサンプル像が当該光学系を介して結像される撮像素子と当該サンプルとの相対位置を、当該光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる移動制御ステップと、当該移動制御ステップで移動させる間、当該撮像素子を露光させることにより当該サンプル像を取得するサンプル像取得ステップと、当該サンプル像に基づいて当該光学系における当該複数の波長の光の色収差を測定する色収差測定ステップとを実行させるようにした。

このように本発明においては、サンプル像を撮像する際、焦点を移動させながら、サンプルと撮像素子との相対位置を、焦点の移動方向と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させるようにしたことにより、サンプル像には各波長の光の像が色収差に応じた傾きで写るので、この傾きに基づいて色収差を測定することができる。ゆえにこのサンプル像をもとに色収差を測定することができるので、従来と比してサンプル像の枚数を低減することができ、色収差を測定する際の撮像時間を短縮することができる。

以上のように本発明によれば、サンプル像を撮像する際、焦点を移動させながら、サンプルと撮像素子との相対位置を、焦点の移動方向と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させるようにしたことにより、サンプル像には各波長の光の像が色収差に応じた傾きで写るので、この傾きに基づいて色収差を測定することができる。ゆえにこのサンプル像をもとに色収差を測定することができるので、従来と比してサンプル像の枚数を低減することができ、色収差を測定する際の撮像時間を短縮することができる。かくして効率よく色収差を測定し得る色収差測定方法、色収差測定装置及び色収差測定プログラムを実現できる。

顕微鏡装置を示す略線図である。 厚さ方向の生体サンプルを示す略線図である。 データ処理部の構成を示す略線図である。 Ｚ軸方向の蛍光サンプルを示す略線図である。 色収差測定処理を実行するＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。 色収差測定処理における焦点面の移動の様子を示す略線図である。 蛍光ビーズ像の様子を示す略線図である。 蛍光サンプル像を示す図である。 蛍光サンプル像を示す図である。 第１の実施の形態における色収差測定処理手順の説明に供するフローチャートである。 蛍光マーカ間距離測定処理を実行するＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。 生体サンプルに対する領域ごとの画像の取得を示す略線図である。 蛍光マーカ間距離測定処理における焦点面の移動の様子を示す略線図である。 蛍光マーカ間距離測定処理手順の説明に供するフローチャートである。 波長による焦点深度の違いの様子の説明に供する略線図である。 各色の蛍光マーカ位置の様子の説明に供する略線図である。 第２の実施の形態における焦点面の移動、及びそのときの蛍光ビーズ像の様子を示す略線図である。 第２の実施の形態における円弧傾き角の算出の説明に供する略線図である。 第２の実施の形態における色収差測定処理手順の説明に供するフローチャートである。 他の実施の形態における蛍光サンプルを示す略線図である。

以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．第１の実施の形態
２．第２の実施の形態
３．他の実施の形態

＜１．実施の形態＞
［１−１．顕微鏡装置の構成］
図１において、本一実施の形態による顕微鏡装置１を示す。この顕微鏡装置１は、例えば、組織切片、細胞又は染色体等の生体高分子でなる生体サンプルＳＰＬ等を配置可能な面をもち、その面に対して平行方向及び直交方向（ＸＹＺ軸方向）に移動可能なステージ（以下、これを可動ステージとも呼ぶ）１１を有する。

生体サンプルＳＰＬは、図２に示すように、厚さ（深部）方向に約４〜８［μｍ］の厚さを有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれるようにして所定の固定手法により固定され、必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ(Fluorescence In-Situ Hybridization)や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。

可動ステージ１１の一方の面側には光学系１２が配され、該可動ステージ１１の他方の面側には照明灯１３が配される。照明灯１３の光は、サンプルステージ１１に対して穿設される開口から、該可動ステージ１１の一方の面に配される生体サンプルＳＰＬに対する照明光として到達する。

顕微鏡装置１は、この照明光で得られる生体サンプルＳＰＬにおける一部の像を、光学系１２の対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂによって所定の倍率に拡大する。そして顕微鏡装置１は、これら対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂにより拡大される像を、撮像素子３０の撮像面に結像するようになされている。顕微鏡装置１は、ダイクロイックミラー１６、エミッションフィルタ１７を光路からはずせば一般の明視野画像の顕微鏡としても使用が可能である。

一方、この顕微鏡装置１の所定位置には、光源１４及び励起フィルタ１５が設けられる。顕微鏡装置１は、光源１４から光が照射された場合、該光のうちの蛍光染色に対する励起波長のみを励起フィルタ１５で透過させた励起光を、対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂ間に設けられるダイクロイックミラー１６で反射させて対物レンズ１２Ａに導く。そして顕微鏡１０は、この励起光を、対物レンズ１２Ａによって可動ステージ１１に配される生体サンプルＳＰＬに集光する。

スライドガラスＳＧに固定される生体サンプルＳＰＬに対して蛍光染色が施されていた場合、励起光により蛍光色素が発光する。この発光によって得られる光（以下、これを発色光とも呼ぶ）は対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１６を透過する。そしてこの発色光は、ダイクロイックミラー１６及び結像レンズ１２Ｂ間に設けられるエミッションフィルタ１７を介して、該結像レンズ１２Ｂに到達する。

顕微鏡装置１は、発色光の像を対物レンズ１２Ａによって拡大し、該発色光以外の光（励起フィルタ１５を透過した光、および顕微鏡の外部より入射する光などの光、以下、これを外光とも呼ぶ）をエミッションフィルタ１７によって吸収する。そして顕微鏡装置１は、外光が喪失された発色光の像を、結像レンズ１２Ｂによって拡大し、撮像素子３０の撮像面に結像するようになされている。

一方データ処理部２０は、カラーフィルタが配された撮像素子３０を用いて、生体サンプルＳＰＬ全体の像（以下、これを生体サンプル像とも呼ぶ）を生成し、これを所定形式のデータ（以下、これをサンプルデータとも呼ぶ）として保存するようになされている。

このようにこの顕微鏡装置１は、スライドガラスＳＧに配される生体サンプルＳＰＬを、鏡検状態の画像として保存することができるようになされている。したがってこの顕微鏡装置１は、スライドガラスＳＧ自体を保存する場合に比して、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって生体サンプルＳＰＬを保存することが可能となる。

［１−２．データ処理部の構成］
次に、データ処理部２０の構成について説明する。このデータ処理部２０は、図３に示すように、制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)２１に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。

具体的にはＲＯＭ(Read Only Memory)２２、ＣＰＵ２１のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)２３、ユーザの操作に応じた命令を入力する操作入力部２４、インターフェイス２５、表示部２６及び記憶部２７がバス２８を介して接続される。

ＲＯＭ２２には、各種の処理を実行するためのプログラムが格納される。インターフェイス２５には、可動ステージ１１、光源１４及び撮像素子３０（図１）がそれぞれ接続される。

表示部２６には、液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro Luminescence）ディスプレイ又はプラズマディスプレイ等が適用される。また記憶部２７には、ＨＤ（Hard Disc）に代表される磁気ディスクもしくは半導体メモリ又は光ディスク等が適用される。

ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２に格納される複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、該展開したプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。

またＣＰＵ２１は、展開したプログラムにしたがって、インターフェイス２５を介して可動ステージ１１、光源１４及び撮像素子３０を適宜制御するようになされている。

［１−３．色収差測定処理］
ところで顕微鏡装置１では、可動ステージ１１に配されたサンプルの像が光学系１２を介して撮像素子３０に結像される際に、波長によって焦点位置が違うことにより発生する結像位置のずれ、すなわち色収差が発生してしまう場合がある。そこで、この顕微鏡装置１では、光学系１２における色収差を測定する色収差測定処理を実行するようになっている。

この色収差測定処理では、色収差を測定すべき波長の光（色）を発する複数の蛍光ビーズが同一平面上に配置されたサンプル（これを蛍光サンプルとも呼ぶ）を用いる。この蛍光サンプルが可動ステージ１１に配置されることにより、これら複数の色の蛍光ビーズはＺ軸方向（光軸方向）の位置が同一となるように配置される。

この蛍光サンプルＳＰＥは、図４に示すように、例えば、発色光が赤色（波長約６２５［μｍ］）である赤色蛍光ビーズＥＢｒ、発色光が緑色（波長約５３０［μｍ］）である緑色蛍光ビーズＥＢｇ、発色光が青色（波長約４６０［μｍ］）である青色蛍光ビーズＥＢｂが配置されたものであるとする。蛍光サンプルＳＰＥは、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれるようにして所定の固定手法により固定される。因みに、赤色蛍光ビーズＥＢｒと緑色蛍光ビーズＥＢｇと青色蛍光ビーズＥＢｂとを特に区別せずに説明する場合、単に蛍光ビーズＥＢとも呼ぶ。

ＣＰＵ２１は、色収差測定処理の実行命令を操作入力部２４から受けると、該命令に対応するプログラムに従って、図５に示すように、光源制御部４１、ステージ移動制御部４２、蛍光サンプル像取得部４３、色収差測定部４４、データ記録部４５として機能する。

光源制御部４１は、光源１４を駆動させて、光源１４から光を照射させる。

ステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１を対物レンズ１２Ａから遠ざかるようにＺ軸方向に等速で移動させる。

またステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１がＺ軸方向に移動される間にＸＹ平面において等速で円弧を描くように、可動ステージ１１をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させる。例えば、ステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１の位置を、Ｚ軸方向に次式

Ｚ＝Ｚ０＋（ＤＺ／ＺＴ）Ｔ……（１）

となるように移動させながら、ＸＹ平面上を次式

Ｘ＝Ｘ０＋Ｌ０ｓｉｎ（ωＴ），Ｙ＝Ｙ０＋Ｌ０ｃｏｓ（ωＴ）……（２）

となるように移動させる。式（１）において、ＺはＺ軸方向における可動ステージ１１の位置を示し、Ｚ０はＺ軸方向の可動ステージ１１の初期位置を示し、ＤＺは可動ステージ１１の総移動距離を示し、ＺＴは可動ステージ１１の総移動時間を示し、Ｔは時刻を示す。すなわち、（ＤＺ／ＺＴ）は、Ｚ軸方向における単位時間あたりの移動速度を示す。

また、式（２）において、ＸはＸ軸方向における可動ステージ１１の位置、ＹはＹ軸方向における可動ステージ１１の位置を示し、Ｌ０は円運動における半径を示し、ωは角速度を示し、Ｘ０は円運動の中心のＸ座標、Ｙ０は円運動の中心のＹ座標を示す。

尚、初期位置Ｚ０、総移動距離ＤＺ、総移動時間ＺＴ、中心座標（Ｘ０，Ｙ０）、半径Ｌ０、角速度ωは、適宜設定される。例えば、半径Ｌ０は、蛍光ビーズＥＢのビーズ径よりも十分に大きく設定される。

このとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図６に示すように、蛍光サンプルＳＰＥのスライドガラスＳＧ側からカバーガラスＣＧ側へＺ軸方向に等速で移動されると同時に、ＸＹ平面で円弧を描くように移動される。

蛍光サンプル像取得部４３は、このように可動ステージ１１が移動されている間、撮像素子３０を露光させて、蛍光ビーズＥＢが配された蛍光サンプルＳＰＥを撮像素子３０に撮像させ、蛍光サンプルＳＰＥの像（以下、蛍光サンプル像とも呼ぶ）を取得する。

具体的に、ステージ移動制御部４２により可動ステージ１１が移動されている間、各蛍光ビーズＥＢに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っていない状態から徐々に合い、その後また焦点が合わなくなる。

従って図７に示すように、蛍光サンプル像において、各蛍光ビーズＥＢから発光される発色光の像（以下、これを蛍光ビーズ像とも呼ぶ）ＥＰは、ぼやけた大きな状態から、はっきりとした小さな状態に変化していき、その後またぼやけた大きな状態に変化する。これと共に蛍光ビーズ像ＥＰは、可動ステージ１１のＸＹ平面における円運動に応じた円弧を描く。

蛍光サンプル像の一例を、図８（参考図１）に示す。この図８に示すように、各色の蛍光ビーズ像ＥＰ（赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ、緑色蛍光ビーズ像ＥＰｇ、青色蛍光ビーズ像ＥＰｂ）は、略円弧状の輝点群として写る。

そしてこの蛍光サンプル像において所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを抽出すると、図９（Ａ）乃至（Ｃ）に示すように、各色の蛍光ビーズ像ＥＰがさらに円弧に近い像として抽出される。なお、図９に示した画像は、図８に示した画像に対して、輝度値が高い画素ほど黒くなるよう所定の画像処理が施されたものである。

蛍光ビーズＥＢに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っているとき、蛍光サンプル像には蛍光ビーズ像ＥＰの輝度値が最も高く写る。従って、蛍光ビーズ像ＥＰにおいて所定閾値以上の輝度値である画素のまとまりが形成する円弧の傾きは、蛍光ビーズＥＢに対してほぼ焦点が合っていたときの、可動ステージ１１のＸＹ平面の円運動における移動方向を示している。

また可動ステージ１１は、ＸＹ平面において等速で円運動すると共にＺ軸方向に等速で移動しているため、当該円運動における移動方向の変化は、可動ステージ１１のＺ軸方向の移動距離、すなわち焦点面ＦＰの移動距離を示している。

ゆえに、各色における円弧の傾きの違いは、各色の蛍光ビーズＥＢに対して焦点が合ったときにおける可動ステージ１１の位置の違い、すなわち各色の焦点位置の違いを示し、各色の色収差量を示している。

そこで色収差測定部４４は、各色の蛍光ビーズ像ＥＰごとに、所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを輝点群として抽出する。

色収差測定部４４は、抽出した輝点群の形状を円弧とみなし、円弧の中点Ｏａと円弧の両端を結ぶ直線の中点Ｏｂとを結ぶ直線（すなわち円弧の中心と円弧の中点Ｏａとを通る直線）Ｌ１を算出する。色収差測定部４４は、算出した直線Ｌ１とＸ軸とのなす角（これを円弧傾き角とも呼ぶ）を各色の蛍光ビーズ像ＥＰごとに算出する。

そして色収差測定部４４は、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び緑色蛍光ビーズＥＰｇの円弧傾き角の角度差を算出する。

可動ステージ１１がＸＹ平面上において角速度ωで移動すると共に、Ｚ軸方向に移動速度（ＤＺ／ＺＴ）で移動している場合、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離は（ＤＺ／ＺＴ）／ωとなる。

そこで色収差測定部４４は、算出した角度差と（ＤＺ／ＺＴ）／ωとを乗算することにより、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び緑色蛍光ビーズＥＢｇに対する焦点位置の違い、すなわち、赤色の光を基準とした緑色の光の色収差量を算出する。

同様に色収差測定部４４は、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び青色蛍光ビーズ像ＥＰｂの円弧傾き角の角度差を算出する。

そして色収差測定部４４は、算出した角度差と（ＤＺ／ＺＴ）／ωとを乗算することにより、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び青色蛍光ビーズＥＢｂに対する焦点位置の違い、赤色の光を基準とした青色の光の色収差量を算出する。

ここで具体例として、可動ステージ１１を、対物レンズ１２から遠ざかるようにＺ軸方向に０．２３［μｍ／ｓ］で移動させながら、ＸＹ軸平面に半径８［μｍ］、３６秒で１周する速度（毎秒１０［ｄｅｇ］の角速度）で円運動させた場合について説明する。この場合、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離は、０．０２３［μｍ／ｄｅｇ］である。また、各蛍光ビーズＥＢのビーズ径は０．３［μｍ］であり、撮像素子３０の露光時間は３０［ｓ］であるとする。

この具体例において、色収差測定部４４は、例えば、赤色蛍光ビーズＥＢｒの円弧傾き角が３．９０［ｄｅｇ］、緑色蛍光ビーズＥＢｇの円弧傾き角が０．８５８［ｄｅｇ］、青色蛍光ビーズＥＢｒの円弧傾き角が３０．３８［ｄｅｇ］であると算出する。

すると色収差測定部４４は、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び緑色蛍光ビーズＥＢｇの円弧傾き角の角度差が−３．０４２［ｄｅｇ］であると算出する。

色収差測定部４４は、算出した角度差−３．０４２［ｄｅｇ］に単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離０．０２３［μｍ／ｄｅｇ］を乗算することにより、赤色の光を基準とした緑色の光の色収差量を−０．０７［μｍ］であると算出する。

これは、赤色の光の焦点位置を基準とすると緑色の光の焦点位置は、対物レンズ１２から０．０７［μｍ］遠いことを示す。すなわち赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び緑色蛍光ビーズＥＢｇがＺ軸方向に同一の位置にあるにもかかわらず、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び緑色蛍光ビーズＥＢｇは０．０７［μｍ］異なった位置に見えるという色収差が発生していることを示す。

また色収差測定部４４は、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び青色蛍光ビーズＥＢｇの円弧傾き角の角度差が＋２６．４８［ｄｅｇ］であると算出する。

色収差測定部４４は、算出した角度差＋２６．４８［ｄｅｇ］に単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離０．０２３［μｍ／ｄｅｇ］を乗算することにより、赤色の光を基準とした青色の光の色収差量を０．６０９［μｍ］であると算出する。

これは、赤色の光の焦点位置を基準とすると青色の光の焦点位置は、対物レンズ１２から０．６０９［μｍ］近いことを示す。すなわち赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び青色蛍光ビーズＥＢｂがＺ軸方向に同一の位置にあるにもかかわらず、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び緑色蛍光ビーズＥＢｇは０．６０９［μｍ］異なった位置に見えるという色収差が発生していることを示す。

このようにして色収差測定部４４は、蛍光サンプル像取得部４３により取得された蛍光サンプル像に基づいて、光学系１２における色収差を測定する。

そしてデータ記録部４５は、色収差測定部４４による測定結果を、色収差測定データとして記憶部２７に記録する。

［１−４．色収差測定処理手順］
次に上述した色収差測定処理の手順について図１０に示すフローチャートを用いて説明する。

ＣＰＵ２１は、ルーチンＲＴ１の開始ステップから入って次のステップＳＰ１に移る。ステップＳＰ１においてＣＰＵ２１は、例えば、操作入力部２４の入力をもとに、可動ステージ１１の移動条件（角速度ω、移動速度（ＤＺ／ＺＴ）など）を設定する。

そしてＣＰＵ２１は、設定した移動条件をもとに、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離を算出して記憶部２７に記録し、次のステップＳＰ２に移る。

ステップＳＰ２においてＣＰＵ２１は、光源１４から光を照射させ、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共にＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像を取得し、次のステップＳＰ３に移る。

ステップＳＰ３においてＣＰＵ２１は、蛍光サンプル像において、蛍光ビーズ像ＥＰごとに所定閾値以上の輝度値である画素群を抽出して、次のステップＳＰ４に移る。

ステップＳＰ４においてＣＰＵ２１は、抽出した輝点群の形状を円弧とみなし、各色の蛍光ビーズ像ＥＰごとに円弧傾き角を算出して、次のステップＳＰ５に移る。

ステップＳＰ５においてＣＰＵ２１は、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び緑色蛍光ビーズ像ＥＰｇの円弧傾き角の角度差と、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び緑色蛍光ビーズ像ＥＰｇの円弧傾き角の角度差とを算出して、次のステップＳＰ６に移る。

ステップＳＰ６においてＣＰＵ２１は、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離を記憶部２７から読み出し、これとステップＳＰ５において算出した角度差とを乗算することにより、赤色の光を基準とした緑色及び青色の光の色収差量を算出する。そしてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ７に移る。

ステップＳＰ７においてＣＰＵ２１は、算出した色収差量を色収差測定データとして記憶部２７に記録させ、次のステップに移って、この色収差測定処理を終了する。

［１−５．蛍光マーカ間距離測定処理］
また顕微鏡装置１では、蛍光染色された生体サンプルＳＰＬの像を取得して当該生体サンプルＳＰＬにおける蛍光マーカ間の距離を測定する蛍光マーカ間距離測定処理を実行するようになっている。この蛍光マーカ間距離測定処理では、上述した色収差測定処理において測定した色収差を用いて、蛍光マーカ間の距離を補正するようになされている。

ここでは生体サンプルＳＰＬにおいて、例えば、発色光が赤色である赤色蛍光マーカＥＭｒ（図１３）と、発色光が青色である青色蛍光マーカＥＭｂ（図１３）とが、それぞれ特定の蛋白質又は遺伝子に結合した状態であるとする。また、蛍光マーカ間距離測定処理を実行する前に、当該生体サンプルＳＰＬが可動ステージ１１に配置される。因みに、赤色蛍光マーカＥＭｒと青色蛍光マーカＥＭｂを特に区別せずに説明する場合、単に蛍光マーカＥＭとも呼ぶ。

ＣＰＵ２１は、蛍光マーカ間距離測定処理の実行命令を操作入力部２４から受けると、該命令に対応するプログラムに従って、図１１に示すように、光源制御部５１、ステージ移動制御部５２、生体サンプル像取得部５３、データ記録部５４、距離測定部５５、色収差補正部５６として機能する。

光源制御部５１は、光源１４を駆動させて、光源１４から光を照射させる。

ステージ移動制御部５２は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべき部位（以下、これをサンプル部位とも呼ぶ）が撮像範囲ＡＲに位置するように、可動ステージ１１を順次移動させる。ステージ移動制御部５２は、例えば図１２に示すように、該撮像範囲ＡＲに対して生体サンプルＳＰＬを割り当てる。この図１２では、撮像範囲ＡＲに割り当てるべき生体サンプルＳＰＬの領域が重ならない態様となっているが、隣接する領域の一部が重なる態様であってもよい。

そしてステージ移動制御部５２は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共にＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させる。

このとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図１３に示すように、生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へＺ軸方向に等速で移動されると同時に、ＸＹ平面で円弧を描くように移動される。

また生体サンプル像取得部５３は、ステージ移動制御部５２により可動ステージ１１が移動されている間、撮像素子３０を露光させ、対象とすべきサンプル部位を撮像素子３０に撮像させ、この結果得られる各サンプル部位の像を取得する。生体サンプル像取得部５３は、各撮像範囲ＡＲに割り当てられる各サンプル部位の像を順次取得して連結することによって生体サンプル像を生成する。

データ記録部５４は、生体サンプル像が生成されると、該生体サンプル像の全部又は生体サンプル像の復元可能な一部を示す画素情報を含むサンプルデータを生成する。

そしてデータ記録部５４は、このサンプルデータに対して、生体サンプル像に関する識別情報を示すデータを付加し、該データが付加されたサンプルデータを記憶部２７に記録する。

この識別情報は、例えば、生体サンプルＳＰＬの採取者名、採取者性別、採取者年齢及び採取日付等といった情報である。データ記録部５４は、この識別情報を入力すべきことを、生体サンプルＳＰＬのデータ保存命令が与えられたタイミングや、スライドガラスＳＧをセットすべきタイミング等といった所定のタイミングで通知するようになされている。

因みにデータ記録部５４は、サンプルデータが生成されたときに識別情報が得られていない場合には、該識別情報を入力すべきことを警告するようになされている。ちなみに、識別情報を入力すべきことの通知又は警告は、例えば音声や、ＧＵＩ（Graphical User Interface）画面等により実行される。

また距離測定部５５は、生体サンプル像取得部５３により生成された生体サンプル像をもとに、生体サンプルＳＰＬにおける蛍光マーカＥＭ間の距離を測定する。

具体的に、生体サンプル像には、各蛍光マーカＥＭから発光される発色光の像（以下、これを蛍光マーカ像とも呼ぶ）が、図７に示した蛍光ビーズ像ＥＰと同様に、可動ステージ１１のＸＹ平面における円運動に応じた略円弧状の輝点群として写る。

蛍光マーカＥＭに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っているとき、生体サンプル像には蛍光マーカ像の輝度値が最も高く写る。従って、蛍光マーカ像において所定閾値以上の輝度値である画素のまとまりが形成する円弧の傾きは、蛍光マーカＥＭに対してほぼ焦点が合っていたときの、可動ステージ１１のＸＹ平面の円運動における移動方向を示している。

また可動ステージ１１は、ＸＹ平面において等速で円運動すると共にＺ軸方向に等速で移動しているため、当該円運動における移動方向の変化は、可動ステージ１１のＺ軸方向の移動距離、すなわち焦点面ＦＰの移動距離を示している。

ゆえに、蛍光マーカＥＭ間での当該円弧の傾きの違いは、各蛍光マーカＥＭに対して焦点が合ったときにおける可動ステージ１１の位置の違い、すなわち、蛍光マーカＥＭ間のＺ軸方向の距離を示していると考えられる。

そこで距離測定部５５は、生体サンプル像から、各蛍光マーカＥＭの色ごとに所定閾値以上の輝度値である画素群を抽出して抽出した輝点群の形状を円弧とみなし、上述した色収差測定処理と同様にして円弧傾き角を蛍光マーカＥＭごとに算出する。

そして距離測定部５５は、距離を測定する対象となる蛍光マーカＥＭ同士（例えば赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ）の円弧傾き角の角度差を算出する。

距離測定部５５は、算出した角度差と単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離とを乗算することにより、赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ間のＺ軸方向の距離を算出する。

しかしながら上述した色収差測定処理で測定したように、光学系１２において、赤色及び青色の光では、色収差が発生していた。例えば、赤色蛍光マーカＥＭｒと青色蛍光マーカＥＭｂとがＺ軸方向において同一の位置にある場合にも、赤色蛍光ビーズＥＢｒ及び青色蛍光ビーズＥＢｂの位置が０．６０９［μｍ］異なった位置に見えるという色収差が発生していた。

そこで色収差補正部５６は、距離測定部５５により算出した赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ間のＺ軸方向の距離から、色収差測定処理で測定した赤色の光を基準とした青色の光の色収差量を減算する。これにより色収差補正部５６は、赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ間のＺ軸方向の距離から色収差の影響を取り除くように、当該距離を補正する。

そしてデータ記録部５４は、この補正された赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ間のＺ軸方向の距離を、距離測定データとして記憶部２７に記録する。

［１−６．蛍光マーカ間距離測定処理手順］
次に上述した蛍光マーカ間距離測定処理の手順について図１４に示すフローチャートを用いて説明する。

ＣＰＵ２１は、ルーチンＲＴ２の開始ステップから入って次のステップＳＰ１１に移る。ステップＳＰ１１においてＣＰＵ２１は、例えば、操作入力部２４の入力をもとに、可動ステージ１１の移動条件を設定する。

そしてＣＰＵ２１は、設定した移動条件をもとに、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離を算出して記憶部２７に記録し、次のステップＳＰ１２に移る。

ステップＳＰ１２においてＣＰＵ２１は、光源１４から光を照射させ、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共にＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて各サンプル部位の像を取得し、取得した各サンプル部位の像を連結して生体サンプル像を生成し、次のステップＳＰ１３に移る。

ステップＳＰ１３においてＣＰＵ２１は、生体サンプル像から蛍光マーカＥＭの色ごとに所定閾値以上の輝度値である画素群を抽出して、次のステップＳＰ１４に移る。

ステップＳＰ１４においてＣＰＵ２１は、抽出した輝点群の形状を円弧とみなし、各色の蛍光マーカＥＭごとに円弧傾き角を算出して、次のステップＳＰ１５に移る。

ステップＳＰ１５においてＣＰＵ２１は、距離を測定する対象となる赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂの円弧傾き角の角度差を算出して、次のステップＳＰ１６に移る。

ステップＳＰ１６においてＣＰＵ２１は、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離を記憶部２７から読み出し、これとステップＳＰ１５において算出した角度差とを乗算する。これによりＣＰＵ２１は、赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ間のＺ軸方向の距離を算出して、次のステップＳＰ１７に移る。

ステップＳＰ１７においてＣＰＵ２１は、記憶部２７から色収差測定データを読み出し、当該データをもとに、赤色蛍光マーカＥＭｒ及び青色蛍光マーカＥＭｂ間のＺ軸方向の距離から色収差の影響を取り除いた値を算出し、次のステップＳＰ１８に移る。

ステップＳＰ１８においてＣＰＵ２１は、算出した値を距離測定データとして記憶部２７に記録させ、次のステップに移って、この蛍光マーカ間距離測定処理を終了する。

［１−７．動作及び効果］
以上の構成において顕微鏡装置１は、複数の色の蛍光ビーズＥＢが配された蛍光サンプルＳＰＥが含まれる範囲をＺ軸方向（光軸方向）に対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを移動させながら、ＸＹ平面（光軸と直交する面）において円運動させる。

顕微鏡装置１は、このように焦点面ＦＰを移動させている間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像を取得する。この結果、顕微鏡装置１は、各色の蛍光ビーズ（各波長の光）の像が円弧状に写ると共に、当該蛍光ビーズの像における円弧が各色の色収差に応じた傾きで写った蛍光サンプル像を取得する。

顕微鏡装置１は、この蛍光サンプル像における各波長の光の像の傾き（円弧傾き角）に基づいて光学系１２における色収差を測定する。

このように顕微鏡装置１は、１枚の蛍光サンプル像をもとに色収差を測定することにより、所定間隔ごとに焦点を移動させて取得した蛍光サンプル像に基づいて色収差を測定する従来の方法と比べて、蛍光サンプル像の枚数を大幅に低減することができる。ゆえに顕微鏡装置１は、色収差を測定する際の撮像時間を短縮することができるので、効率よく色収差を測定することができる。

また顕微鏡装置１は、このように従来の方法と比べて蛍光サンプル像の枚数を大幅に低減できるので、蛍光サンプル像を一時記憶しておくためのワークメモリの容量や蛍光サンプル像に対する画像処理等の処理負荷も減らすことができる。

ここで、本発明と異なり、所定間隔ごとに焦点を移動させて蛍光サンプル像を取得して、各色において最大輝度の画素がある蛍光サンプル像が取得されたときの可動ステージの位置をもとに、各色の焦点位置の違い、すなわち色収差を測定する方法について考える。

実際上、図１５に示すように、波長（色）によって、焦点位置Ｆが異なるだけでなく、焦点深度（焦点位置を中心とする焦点が合う範囲の長さ）Ｄも異なっている。ゆえにこの方法において蛍光サンプル像を取得した位置や焦点の移動間隔によっては、最大輝度の画素がある蛍光サンプル像が必ずしも焦点位置に対応していない場合がある。この場合、各焦点位置の違いを正確に検出できず、色収差を精度よく測定できないことがある。

これに対して本発明の顕微鏡装置１は、蛍光サンプルＳＰＥが含まれる範囲をＺ軸方向に焦点面ＦＰを移動させながら、ＸＹ平面において円運動させ、その間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像を取得する。この結果、当該蛍光サンプル像には、各色の蛍光ビーズ像ＥＰが焦点位置に応じた傾きで写るので、顕微鏡装置１は、この傾きに基づいて色収差を精度よく測定することができる。

また顕微鏡装置１は、異なる蛋白質又は遺伝子がそれぞれ異なる波長の光を発する蛍光マーカＥＭにより標識された生体サンプルＳＰＥを撮像する際、焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させながら、ＸＹ平面において円運動させる。

顕微鏡装置１は、このように焦点面ＦＰを移動させている間、撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。この結果、顕微鏡装置１は、各蛍光マーカＥＭの像がＺ軸方向の位置に応じた傾きで写った生体サンプル像を取得する。

顕微鏡装置１は、この生体サンプル像における各蛍光マーカＥＭの像の傾き（円弧傾き角）の違いに基づいて各蛍光マーカＥＭ間の距離を測定する。

そして顕微鏡装置１は、予め測定された色収差に基づいて、測定した各蛍光マーカＥＭ間の距離を、色収差の影響を取り除くように補正する。

これにより顕微鏡装置１は、色が異なる蛍光マーカＥＭ同士であっても当該蛍光マーカＥＭ間の距離を精度よく測定することができる。

ここで、本発明とは異なり、所定間隔ごとに焦点を移動させて生体サンプル像を取得し、取得した生体サンプル像における各色の蛍光マーカ像のぼけ具合を比較し、各色の蛍光マーカのＺ軸方向の位置を検出し、蛍光マーカ間の距離を測定する方法について考える。尚、以下説明する図１６では、説明の便宜上、光学系の色収差は補正されているものとする。

この方法では、例えば、図１６（Ａ）に示すように、赤色蛍光マーカＥＭｒ、緑色蛍光マーカＥＭｇ、青色蛍光マーカＥＭｂの全てに対して焦点が合った生体サンプル像が取得された場合、これら蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置が同一であると検出する。

しかしながら、上述したように波長によって焦点深度Ｄが異なるため、例えば図１６（Ｂ）に示すように、赤色蛍光マーカＥＭｒ、緑色蛍光マーカＥＭｇ、青色蛍光マーカＥＭｂの全てに対して焦点が合った生体サンプル像が取得されても、各蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置が異なる場合がある。この場合、この方法では、各蛍光マーカのＺ軸方向の位置が同一であると誤検出してしまう。

また波長によって焦点深度Ｄが異なるために、図１６（Ｃ）に示すように、赤色蛍光マーカＥＭｒ、緑色蛍光マーカＥＭｇ、青色蛍光マーカＥＭｂのＺ軸方向の位置が同一であっても、赤色蛍光マーカＥＭｒ、緑色蛍光マーカＥＭｇにのみ焦点が合い、青色蛍光マーカＥＭｂからは焦点が外れた生体サンプル像が取得される場合がある。この場合、この方法では、赤色蛍光マーカＥＭｒ及び緑色蛍光マーカＥＭｇと、青色蛍光マーカＥＭｂとのＺ軸方向の位置が異なると誤検出してしまう。

このようにこの方法では、蛍光マーカＥＭ間のＺ軸方向の距離を精度よく測定することができない場合がある。

これに対して本願発明の顕微鏡装置１は、焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させながら、ＸＹ平面において円運動させ、その間に撮像素子３０を露光させ、生体サンプル像を取得する。この結果、当該生体サンプル像には、各色の蛍光マーカ像がＺ軸方向の位置に応じた傾きで写るので、顕微鏡装置１は、この傾きに基づいて各蛍光マーカＥＭ間の距離を精度よく測定することができる。

以上の構成によれば顕微鏡装置１は、蛍光サンプルＳＰＥが含まれる範囲を光軸方向に焦点を移動させながら、蛍光サンプルＳＰＥと撮像素子３０との相対位置を、当該焦点の移動方向と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させるようにした。これにより、蛍光サンプル像には各波長の光の像が色収差に応じた傾きで写るので、顕微鏡装置１は、この傾きに基づいて色収差を測定することができる。ゆえに顕微鏡装置１は、この蛍光サンプル像をもとに色収差を測定することができるので、従来の方法と比較して蛍光サンプル像の枚数を低減することができ、色収差を測定する際の撮像時間を短縮することができ、かくして効率よく色収差を測定することができる。

＜２．第２の実施の形態＞
第２の実施の形態においては、第１の実施の形態と異なり、色収差測定処理において、蛍光サンプル像を２回撮影するようになっている。なお、蛍光マーカ間距離測定処理及び顕微鏡装置１の構成については、第１の実施の形態と同様であるためその説明を省略する。

［２−１．色収差測定処理］
第２の実施の形態における色収差測定処理では、第１の実施の形態と同様に、図４に示したような色収差を測定すべき波長の光を発する複数の蛍光ビーズＥＢを同一平面上に配置した蛍光サンプルＳＰＥを可動ステージ１１に配置しておく。

ＣＰＵ２１は、第１の実施の形態と同様に、色収差測定処理の実行命令を操作入力部２４から受けた場合、光源制御部４１、ステージ移動制御部４２、蛍光サンプル像取得部４３、色収差測定部４４、データ記録部４５として機能する。

光源制御部４１は、光源１４を駆動させて、光源１４から光を照射させる。

ステージ移動制御部４２は、１回目の撮影において、可動ステージ１１をＺ軸方向にだけ等速で移動させる。例えば、ステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１の位置を、Ｚ軸方向に次式

Ｚ＝Ｚ１＋αＴ……（３）

となるように移動させる。因みに、Ｚ１は可動ステージ１１のＺ軸方向の初期位置を示し、αは可動ステージ１１の移動速度を示す。

このときステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１をＸＹ平面上では移動させない。例えば、ステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させている間、可動ステージ１１のＸＹ平面上の位置を次式

Ｘ＝Ｘ１，Ｙ＝Ｙ１……（４）

となるように固定させる。因みに、Ｘ１はＸ軸上の位置、Ｙ１はＹ軸上の位置を示す。

したがってこのとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図１７（Ａ）に示すように、ＸＹ平面上では固定されたまま、蛍光サンプルＳＰＥのスライドガラスＳＧ側からカバーガラスＣＧ側へＺ軸方向に等速で移動される。

蛍光サンプル像取得部４３は、このように可動ステージ１１が移動されている間、撮像素子３０を露光させて、蛍光サンプルＳＰＥを撮像素子３０に撮像させ、蛍光サンプル像ＩＭ１（図１８）を取得する。

この蛍光サンプル像ＩＭ１において、蛍光ビーズ像ＥＰは、図１７（Ｂ）に示すように、ぼやけた大きな状態から、はっきりとした小さな状態に変化していき、その後またぼやけた大きな状態に変化する。そのため、蛍光サンプル像において、所定閾値以上の輝度値である画素を抽出すると、図１７（Ｃ）に示すように、当該画素のまとまりは略円形を形成する。

またステージ移動制御部４２は、２回目の撮影において、第１の実施の形態と同様に、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら、ＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させる。このときステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１を、１回目の撮影における可動ステージ１１のＸＹ平面の位置（式（４））を基準位置とし、当該基準位置を中心として円運動させる。

すなわち、ステージ移動制御部４２は、可動ステージ１１の位置を、Ｚ軸方向に次式

Ｚ＝Ｚ１＋βＴ……（５）

となるように移動させながら、ＸＹ平面上を次式

Ｘ＝Ｘ１＋Ｌ０ｓｉｎ（ωＴ），Ｙ＝Ｙ１＋Ｌ０ｃｏｓ（ωＴ）……（６）

となるように移動させる。式（５）において、βは、Ｚ軸方向における単位時間あたりの移動速度を示す。また１回目の撮影時の移動速度α、２回目の撮影時の移動速度β、基準位置座標（Ｘ１，Ｙ１）なども、適宜設定される。例えば、移動速度α及び移動速度βを同一の値とすると、１回目の撮影時（Ｚ軸方向にのみ移動させた撮影）に取得した蛍光サンプル像において蛍光ビーズ像が明るくなりすぎ、後述する円弧の中心位置を正確に検出できない場合がある。従ってこの場合には、移動速度αを移動速度βよりも早くするなど、１回目及び２回目の両方において適切な蛍光サンプル像が取得されるように移動速度α及び移動速度βの値が設定される。

蛍光サンプル像取得部４３は、このように可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて、蛍光サンプルＳＰＥを撮像素子３０に撮像させ、蛍光サンプル像ＩＭ２（図１８）を取得する。

この蛍光サンプル像ＩＭ２には、図８に示したように各色の蛍光ビーズ像ＥＰ（赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ、緑色蛍光ビーズ像ＥＰｇ、青色蛍光ビーズ像ＥＰｂ）が、略円弧状の輝点群として写る。

ここで、図１８に一例として示す蛍光サンプル像ＩＭ１及びＩＭ２では、それぞれ色ごとに所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりが抽出されており、蛍光ビーズ像ＥＰ１は略円形状の像、蛍光ビーズ像ＥＰ２は略円弧状の像として写っている。この蛍光ビーズ像ＥＰ１と蛍光ビーズ像ＥＰ２とは、同一の蛍光ビーズＥＢの像である。

上述したように蛍光ビーズＥＢに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っているとき、蛍光サンプル像には蛍光ビーズ像ＥＰの輝度値が最も高く写る。従って、蛍光ビーズ像ＥＰ２において各色における円弧の傾きの違いは、各色の色収差量を示していると考えられる。

また蛍光サンプル像ＩＭ２を取得する際、可動ステージ１１が蛍光サンプル像ＩＭ１を取得した際のＸＹ平面の位置を中心としてＸＹ平面を円運動する。ゆえに、蛍光サンプル像ＩＭ２における蛍光ビーズ像ＥＰ２の中心（円弧の中心）は、蛍光ビーズ像ＥＰ１の中心（すなわち最も輝度値の高い位置）と同一位置となっている。

そこで色収差測定部４４は、蛍光サンプル像ＩＭ１において、蛍光ビーズ像ＥＰ１の最も輝度値の高い位置（蛍光サンプル像ＩＭ１における座標）を算出する。そして色収差測定部４４は、蛍光サンプル像ＩＭ１において算出した位置に対応する蛍光サンプル像ＩＭ２の位置（同一座標）を、蛍光ビーズ像ＥＰ２の円弧の中心Ｏｐとして設定する。

色収差測定部４４は、蛍光ビーズ像ＥＰ２の輝度値が最も高い位置（座標）Ｂｐを算出し、当該位置Ｂｐと設定した円弧の中心Ｏｐとを結ぶ直線Ｌ２とＸ軸とのなす角を、円弧傾き角として各色の蛍光ビーズ像ＥＰ２ごとに算出する。

そして色収差測定部４４は、上述した第１の実施の形態と同様に、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び緑色蛍光ビーズＥＰｇの円弧傾き角の角度差を算出して、当該角度差に基づいて赤色の光を基準とした緑色の光の色収差量を算出する。また色収差測定部４４は、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び青色蛍光ビーズＥＰｂの円弧傾き角の角度差を算出して、当該角度差に基づいて赤色の光を基準とした青色の光の色収差量を算出する。

このように第２の実施の形態における顕微鏡装置１は、蛍光サンプル像ＩＭ１及びＩＭ２に基づいて、光学系１２における色収差を測定するようになっている。

［２−２．色収差測定処理手順］
次に上述した色収差測定処理の手順について図１９に示すフローチャートを用いて説明する。

ＣＰＵ２１は、ルーチンＲＴ３の開始ステップから入って次のステップＳＰ２１に移る。ステップＳＰ２１においてＣＰＵ２１は、例えば、操作入力部２４の入力をもとに、１回目及び２回目の撮影における可動ステージ１１の移動条件を設定する。

ＣＰＵ２１は、設定した移動条件をもとに、２回目の撮影時における単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離を算出して記憶部２７に記録し、次のステップＳＰ２２に移る。

ステップＳＰ２２においてＣＰＵ２１は、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向にのみ等速で移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像ＩＭ１を取得し、次のステップＳＰ２３に移る。

ステップＳＰ２３においてＣＰＵ２１は、各色の蛍光ビーズ像ＥＰ１ごとに、最も輝度値の高い位置を検出し、例えばＲＡＭ２３に一時記憶させ、次のステップＳＰ２４に移る。

ステップＳＰ２４においてＣＰＵ２１は、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共にＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像ＩＭ２を取得し、次のステップＳＰ２５に移る。

ステップＳＰ２５においてＣＰＵ２１は、各色の蛍光ビーズ像ＥＰ２ごとに、最も輝度値の高い位置を算出して、次のステップＳＰ２６に移る。

ステップＳＰ２６においてＣＰＵ２１は、蛍光ビーズ像ＥＰ１の輝度値が最も高い位置に対応する蛍光サンプル像ＩＭ２の位置（円弧の中心）Ｏｐと蛍光ビーズ像ＥＰ１の輝度値が最も高い位置Ｂｐとを結ぶ直線Ｌ２を算出する。そしてＣＰＵ２１は、当該直線Ｌ２とＸ軸とのなす角を、円弧傾き角として各色の蛍光ビーズ像ＥＰ２ごとに算出して、次のステップＳＰ２７に移る。

ステップＳＰ２７においてＣＰＵ２１は、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び緑色蛍光ビーズ像ＥＰｇの円弧傾き角の角度差と、赤色蛍光ビーズ像ＥＰｒ及び緑色蛍光ビーズ像ＥＰｇの円弧傾き角の角度差とを算出して、次のステップＳＰ２８に移る。

ステップＳＰ２８においてＣＰＵ２１は、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離を記憶部２７から読み出し、これとステップＳＰ２７において算出した角度差とを乗算することにより、赤色の光を基準とした緑色及び青色の光の色収差量を算出する。そしてＣＰＵ２１は、ステップＳＰ２９に移る。

ステップＳＰ２９においてＣＰＵ２１は、算出した色収差量を色収差測定データとして記憶部２７に記録させ、次のステップに移って、この色収差測定処理を終了する。

［２−３．動作及び効果］
以上の構成において顕微鏡装置１は、蛍光サンプルＳＰＥの１回目の撮影の際、蛍光サンプルＳＰＥが含まれる範囲をＺ軸方向（光軸方向）にのみ対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを移動させながら、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像ＩＭ１を取得する。

そして顕微鏡装置１は、蛍光サンプルＳＰＥの２回目の撮影の際、蛍光サンプルＳＰＥが含まれる範囲をＺ軸方向（光軸方向）に焦点面ＦＰを移動させながら、ＸＹ平面（光軸と直交する面）において１回目の撮影における位置を中心として円運動させる。顕微鏡装置１は、このように焦点面ＦＰを移動させている間、撮像素子３０を露光させて蛍光サンプル像ＩＭ２を取得する。

この結果、蛍光サンプル像ＩＭ２には、各色の蛍光ビーズ（各波長の光）の像が円弧状で各色の色収差に応じた傾きで写ると共に、蛍光サンプル像ＩＭ１には、蛍光サンプル像ＩＭ２における各波長の光の像（円弧）の中心が写る。

ゆえに顕微鏡装置１は、蛍光サンプル像ＩＭ１に基づいて蛍光サンプル像ＩＭ２において各波長の光の像における円弧の中心位置を検出し、当該中心位置に基づいて各波長の光の像の傾き（円弧傾き角）を算出する。

そして顕微鏡装置１は、この蛍光サンプル像における各波長の光の像の傾き（円弧傾き角）に基づいて光学系１２における色収差を測定する。

このように顕微鏡装置１は、蛍光サンプル像ＩＭ１及びＩＭ２（２枚の蛍光サンプル像）をもとに色収差を測定することにより、所定間隔ごとに焦点を移動させて蛍光サンプル像を取得して色収差を測定する方法と比べて蛍光サンプル像の枚数を大幅に低減できる。ゆえに顕微鏡装置１は、色収差を測定する際の撮像時間を短縮することができるので、効率よく色収差を測定することができる。

また顕微鏡装置１は、焦点面ＦＰをＺ軸方向にのみ移動させながら撮像された蛍光サンプル像ＩＭ１をもとに、蛍光ビーズ像ＥＰ２の円弧の中心位置を検出し、当該中心位置をもとに各波長の光の像の傾き（円弧傾き角）を算出するようにした。

これにより顕微鏡装置１は、焦点面ＦＰをＺ軸方向にのみ移動させながら撮像された蛍光サンプル像ＩＭ１を用いない場合と比して、より正確に円弧傾き角を算出できるので、より精度よく色収差を測定することができる。

＜３．他の実施の形態＞
なお上述した第１及び第２の実施の形態においては、色収差測定処理において赤色蛍光ビーズＥＢｒ、緑色蛍光ビーズＥＢｇ、青色蛍光ビーズＥＢｂが配された蛍光サンプルＳＰＥを用いるようにした。本発明はこれに限らず、この他種々の波長の光を発光する蛍光ビーズＥＢが配された蛍光サンプルＳＰＥを用いるようにしてもよい。

また、色収差を測定すべき色数に対応した数の蛍光ビーズＥＢが配された蛍光サンプルＳＰＥに限らず、複数波長もしくはワイドバンドの光（例えば白色光）を発する１つの蛍光ビーズＥＢが配された蛍光サンプルＳＰＥを用いるようにしてもよい。

この場合、図２０に示すように、例えば白色光を発する白色蛍光ビーズＥＢｗが配された蛍光サンプルＳＰＥｘが可動ステージ１１に配される。ＣＰＵ２１は、上述と同様に、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させると共にＸＹ平面において円運動させながら撮像素子３０を露光させることにより、当該白色蛍光ビーズＥＢｗが配された蛍光サンプルＳＰＥｘの蛍光サンプル像を取得する。

光学系１２に色収差がある場合、各波長の光（色）の像が形成する円弧の傾きが色収差に応じて異なるため、蛍光サンプル像には、白色蛍光ビーズＥＢｗが形成する円弧の像が波長（色）ごとに分かれて写る。

ＣＰＵ２１は、この蛍光サンプル像に対して色分解処理を行うことにより、各色の円弧の像を抽出し、上述した第１の実施の形態と同様に各色の円弧傾き角を算出して当該円弧傾き角に基づいて色収差を測定する。

複数の蛍光ビーズＥＢを用いて精度良く色収差を測定するには、各蛍光ビーズＥＢのＺ軸方向の位置を同一にするために、蛍光ビーズＥＢが配されるスライドガラスＳＧが平坦であることが求められる。これに対してここまで述べたように１つの蛍光ビーズＥＢを用いて色収差を測定する場合、蛍光ビーズＥＢを配するスライドガラスＳＧの平面性が優れていない場合であっても、精度よく色収差を測定することができる。

また本発明は、蛍光ビーズに限らず、例えばピンホールを背面から照明することにより所定の波長の光を発するようにしたサンプルなど、色収差を測定すべき波長の光を発するサンプルであれば、この他種々のサンプルを用いるようにしてもよい。

また上述した第１及び第２の実施の形態においては、Ｚ軸方向に可動ステージ１１を動かすことによって焦点面ＦＰを蛍光サンプルＳＰＥ及び生体サンプルＳＰＬに対してＺ軸方向に移動させるようにした。本発明はこれに限らず、例えば対物レンズ１２ＡをＺ軸方向に可動させ得る移動機構を設け、該対物レンズ１２ＡをＺ軸方向に移動させることによって焦点面ＦＰを蛍光サンプルＳＰＥ又は生体サンプルＳＰＬに対してＺ軸方向に移動させるようにしてもよい。

さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、ＸＹ平面における面方向に可動ステージ１１を動かすことによって焦点面ＦＰを面方向に動かすようにした。本発明はこれに限らず、例えば撮像素子３０をＸＹ平面の面方向に可動させ得るステージを設け、該ステージを介して撮像素子３０を面方向に移動させることによって蛍光サンプルＳＰＥ又は生体サンプルＳＰＬと撮像素子３０との相対位置を面方向に移動させるようにしてもよい。

さらに上述した第１の実施の形態においては、赤色蛍光ビーズＥＢｒ、緑色蛍光ビーズＥＢｇ、青色蛍光ビーズＥＢｂが配された蛍光サンプルＳＰＥの像に基づいて、赤色を基準とした緑色及び青色の色収差量を測定するようにしたが、本発明はこれに限らない。

例えば、赤色蛍光ビーズＥＢｒ、緑色蛍光ビーズＥＢｇ、青色蛍光ビーズＥＢｂを用いて赤色、緑色、青色の色収差量を測定するだけでなく、例えば、オレンジ色や紫色などこの他の色（波長）の色収差量を測定してもよい。この場合ＣＰＵ２１は、例えば、測定した赤色、緑色、青色の色収差量に基づいて、波長と色収差量の関係を示す式を作成し、当該式を用いて種々の波長の色収差量を算出する。

さらに上述した第１の実施の形態においては、蛍光サンプルＳＰＥを撮像する際、焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させると共にＸＹ平面において円運動させるようにした。本発明はこれに限らず、蛍光サンプルＳＰＥを撮像する際、焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させる間にＸＹ平面において移動方向を変化させるようにすればよく、例えば焦点面ＦＰをＸＹ平面においてサインカーブを描くように移動させてもよい。この場合ＣＰＵ２１は、例えば、蛍光ビーズ像ＥＰの傾きの違いと色収差量とが対応付けられたテーブルを記憶部２７に保持し、該テーブルを参照することにより、色収差量を求めるようにすればよい。

さらに上述した第２の実施の形態においては、１回目の撮影として焦点面ＦＰをＺ軸方向にのみ移動させながら蛍光サンプル像ＩＭ１を撮像した。そして２回目の撮影として焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させると共にＸＹ平面で円運動させながら蛍光サンプル像ＩＭ２を撮像した。本発明はこれに限らず、先に焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させると共にＸＹ平面で円運動させながら蛍光サンプル像ＩＭ２を撮像し、後に焦点面ＦＰをＺ軸方向にのみ移動させながら蛍光サンプル像ＩＭ１を撮像するようにしてもよい。

さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、蛍光ビーズ像ＥＰが形成する円弧の傾き（円弧傾き角）を算出し、各色の円弧傾き角の角度差に基づいて光学系１２における色収差を測定するようにした。本願発明は、これに限らない。

例えば、蛍光サンプル像において所定の閾値よりも高い輝度値の画素を抽出すると、各色の蛍光ビーズ像ＥＰが、色収差の違いに応じた傾きの略楕円形を形成する場合がある。この場合、ＣＰＵ２１は、例えば各色の蛍光ビーズ像ＥＰが形成する楕円の長軸とＸ軸とのなす角を算出し、当該なす角の角度差に基づいて光学系１２における色収差を測定するようにしてもよい。

さらに上述した第１の実施の形態においては、蛍光マーカ間距離測定処理において、焦点面ＦＰをＺ軸方向に移動させると共にＸＹ平面において円運動させながら撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得するようにした。そして当該生体サンプル像に写った各蛍光マーカ像の円弧傾き角の角度差に基づいて、各蛍光マーカＥＭ間の距離を測定するようにした。本発明はこれに限らない。

例えば、蛍光マーカ間距離測定処理において、ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１をＺ軸方向にのみ移動させながら撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。次にＣＰＵ２１は、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させると共にＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させながら撮像素子３０を露光させて生体サンプル像を取得する。このときＣＰＵ２１は、可動ステージ１１をＺ軸方向にのみ移動させた際の可動ステージ１１のＸＹ平面の位置を基準位置とし、当該基準位置を中心として可動ステージ１１を円運動させるようにする。

これにより、可動ステージ１１を円運動させた際の生体サンプル像における蛍光マーカ像の中心（円弧の中心）位置は、可動ステージ１１をＺ軸方向にのみ移動させた際の生体サンプル像における蛍光マーカ像の位置と同一位置となる。

そこでＣＰＵ２１は、可動ステージ１１をＺ軸方向にのみ移動させた際の蛍光マーカ像の位置を、可動ステージ１１を円運動させた際の蛍光マーカ像の円弧の中心位置として設定する。ＣＰＵ２１は、この円弧の中心位置及び当該円弧における最も輝度値が高い位置を結ぶ直線とＸ軸とのなす角を円弧傾き角として蛍光マーカごとに算出し、上述と同様に各蛍光マーカの円弧傾き角の角度差に基づいて各蛍光マーカ間の距離を算出する。

さらに上述した第１の実施の形態においては、色収差測定処理により測定した色収差に基づいて、異なる色の蛍光マーカ間の距離から色収差の影響を取り除くようにした。本発明はこれに限らず、例えば、任意の蛍光マーカにおいて、所定の基準位置からのＺ軸方向の位置を検出する際に、色収差測定処理により測定した色収差に基づいて当該位置を補正するようにしてもよい。

この場合、例えば赤色蛍光マーカＥＭｒにおいて予め円弧傾き角とＺ軸方向の位置とが対応づけられたテーブルを記憶部２７に保持しておく。そしてＣＰＵ２１は、例えば青色蛍光マーカＥＭｂのＺ軸方向の位置を検出する際、青色蛍光マーカＥＭｂの円弧傾き角から当該テーブルを参照して位置を算出したのち、赤色及び青色の色収差を用いて算出した位置を補正する。

さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂが設けられている場合について述べた。本発明はこれに限らず、対物レンズが１つであってもよい。また対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂをレボルバー等を適用して他の対物レンズおよび他の結像レンズと交換を可能とし倍率が可変できるようにしてもよい。

さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、色収差測定処理及び蛍光マーカ間距離測定処理により得られた測定データは記憶部２７に保存された。記憶部２７は、データ処理部２０内に設ける場合に限定されるものではなく、該データ処理部２０の外部としてもよい。また記憶部２７に対するデータの通信媒体はバス２８に限定されるものではなく、例えば、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体としてもよい。

さらに上述した第１及び第２の実施の形態においては、色収差測定装置としての顕微鏡装置１に、対物レンズとして対物レンズ１２Ａ、光学系として光学系１２、撮像素子として撮像素子３０が設けられるようにした。また顕微鏡装置１に、移動制御部としてステージ移動制御部４２、サンプル像取得部として蛍光サンプル像取得部４３、色収差測定部としての色収差測定部４４が設けられるようにした場合について述べた。しかしながら本発明は、その他種々の構成でなる対物レンズ、撮像素子、移動制御部、サンプル像取得部及び色収差測定部を設けるようにしても良い。また本発明は、顕微鏡以外の光学系の色収差を測定する場合も適用することができる。

本発明は、遺伝子実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用することができる。

１……顕微鏡装置、１１……可動ステージ、１２……光学系、１２Ａ……対物レンズ、１２Ｂ……結像レンズ、１３……照明灯、１４……光源、１５……励起フィルタ、１６……ダイクロイックミラー、１７……エミッションフィルタ、２０……データ処理部、２１……ＣＰＵ、２２……ＲＯＭ、２３……ＲＡＭ、２４……操作入力部、２５……インターフェイス、２６……表示部、２７……記憶部、３０……撮像素子、４１、５１……光源制御部、４２、５２……ステージ移動制御部、４３……蛍光サンプル像取得部、４４……色収差測定部、４５、５４……データ記録部、５３……生体サンプル像取得部、５５……距離測定部、５６……色収差補正部、ＣＧ……カバーガラス、ＳＧ……スライドガラス、ＳＰＥ……蛍光サンプル、ＳＰＬ……生体サンプル、ＥＢ……蛍光ビーズ、ＥＭ……蛍光マーカ。

Claims (7)

1. 対物レンズを含む光学系の光軸と直交する面に配された複数の波長の光を発するサンプルが含まれる範囲を当該光軸方向に当該対物レンズの焦点を移動させながら、当該サンプルの像であるサンプル像が当該光学系を介して結像される撮像素子と当該サンプルとの相対位置を、当該光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる移動制御ステップと、
   上記移動制御ステップで移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記サンプル像を取得するサンプル像取得ステップと、
   上記サンプル像に基づいて上記光学系における上記複数の波長の光の色収差を測定する色収差測定ステップと
   を有する色収差測定方法。
2. 上記移動制御ステップでは、
   上記光軸方向に上記対物レンズの焦点を移動させる間に、上記撮像素子と上記サンプルとの相対位置を上記光軸と直交する面方向に円運動させる
   請求項１に記載の色収差測定方法。
3. 上記光軸方向にだけ上記対物レンズの焦点を移動させる焦点移動制御ステップと、
   上記焦点移動制御ステップで移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記サンプル像を取得する焦点移動サンプル像取得ステップと、
   をさらに有し、
   上記移動制御ステップでは、
   上記光軸方向に上記対物レンズの焦点を移動させる間に、上記撮像素子と上記サンプルとの相対位置を、上記光軸と直交する面方向に、上記焦点移動制御ステップにより移動させた際の位置を中心として円運動させ、
   上記色収差測定ステップでは、
   上記焦点移動サンプル像取得ステップにより取得したサンプル像と、上記サンプル像取得ステップにより取得したサンプル像とに基づいて、当該サンプル像における各波長の光の像の傾きを算出し、当該傾きに基づいて上記色収差を測定する
   請求項２に記載の色収差測定方法。
4. 上記色収差測定ステップでは、
   上記サンプル像における各波長の光の像の傾きを算出し、当該傾きに基づいて上記色収差を測定する
   請求項１に記載の色収差測定方法。
5. 上記光軸と直交する面に配され、ターゲットに標識される蛍光マーカが染色された生体サンプルに対して、当該蛍光マーカを励起する光を光源により照射する照射ステップと、
   上記光軸方向に上記対物レンズの焦点を移動させながら、上記撮像素子と上記生体サンプルとの相対位置を、上記光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる生体サンプル移動制御ステップと、
   上記生体サンプル移動制御ステップで移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記生体サンプルの像である生体サンプル像を取得する生体サンプル像取得ステップと、
   上記生体サンプル像における、上記蛍光マーカが発する蛍光の像の傾きに基づいて上記蛍光マーカ間の距離を測定する距離測定ステップと、
   上記距離測定ステップにより測定した上記蛍光マーカ間の距離を、上記色収差測定ステップにより測定した色収差に基づいて補正する色収差補正ステップと
   をさらに有する請求項１に記載の色収差測定方法。
6. 対物レンズを含む光学系と、
   上記光学系の光軸と直交する面に配された複数の波長の光を発するサンプルの像であるサンプル像が上記光学系を介して結像される撮像素子と、
   上記サンプルが含まれる範囲を上記光軸方向に上記対物レンズの焦点を移動させながら、上記撮像素子と上記サンプルとの相対位置を、上記光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる移動制御部と、
   上記移動制御部が移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記サンプル像を取得するサンプル像取得部と、
   上記サンプル像に基づいて上記光学系における上記複数の波長の光の色収差を測定する色収差測定部と
   を具える色収差測定装置。
7. コンピュータに対して、
   対物レンズを含む光学系の光軸と直交する面に配された複数の波長の光を発するサンプルが含まれる範囲を当該光軸方向に当該対物レンズの焦点を移動させながら、当該サンプルの像であるサンプル像が当該光学系を介して結像される撮像素子と当該サンプルとの相対位置を、当該光軸と直交する面方向に移動方向が変化するように移動させる移動制御ステップと、
   上記移動制御ステップで移動させる間、上記撮像素子を露光させることにより上記サンプル像を取得するサンプル像取得ステップと、
   上記サンプル像に基づいて上記光学系における上記複数の波長の光の色収差を測定する色収差測定ステップと
   を実行させる色収差測定プログラム。