CN103105382B - 用于对样本中的点状目标进行三维定位的显微装置和方法 - Google Patents

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Abstract

用于对样本中点状目标实现三维定位的显微装置，包括探测光学系统，以三维聚焦光分布的形式将布置在物空间的点状目标成像至像空间；分色装置，将光分成至少两个独立的光束，其波长落入不同的波长区域；至少两个探测单元，布置在像空间中，其中的一个接收两个光束中的一个，而另一个接收两个光束中的另一个，每个探测单元都包括布置与各光束的入射方向垂直的探测表面，用于感测光斑；评价单元，通过评价在探测表面上感测的光斑，确定在相关点状目标的横向X‑Y位置，以及相关点状目标在垂直于清晰度平面的光轴方向上相对于清晰度平面的轴向Z位置；用于两个波长区域中的至少一个区域的至少一个Z位置校正值，存储在评价单元中，校正值表示了探测光学系统在该波长区域上的纵向色差；以及评价单元使用相关Z位置校正值来校正在各波长区域上确定的Z位置。

Description

用于对样本中的点状目标进行三维定位的显微装置和方法
背景技术
最近几年，基于对特别是荧光分子的独立标记进行连续、随机的定位，光显微方法得到了发展，其能够显示尺寸小于传统光显微镜的衍射限制的分辨率极限的样本结构。这种方法描述在下述文献中，例如WO2006/127692A2；DE102006021317B3；WO2007/128434A1,US2009/0134342A1；DE102008024568A1；WO2008/091296A2；"Sub-diffraction-limitimaging bystochastic optical reconstruction microscopy(STORM)",Nature Methods3,793-796(2006),M.J.Rust,M.Bates,X.Zhuang；"Resolution of Lambda/10 influorescence microscopy using fast single molecule photo-switching",GeislerC.等,Appl.Phys.A,88,223-226(2007)。显微术的这一新分支也被称为“定位显微术”。从现有文献中可获知应用的方法，例如，被命名为(F)PALM((荧光)光敏定位显微术)、PALMIRA(独立运行获取的PALM)、GSD(IM)(基态消耗(单分子返回)显微术)、或(F)STORM((荧光)随机光学重建显微术)。
通常，这种新的方法中，其共同之处在于待成像的样本结构制备有点状目标，被称为标记，其具有两个可区分的状态，即“明亮”状态和“黑暗”状态。例如，如果使用荧光染料作为标记，明亮状态就是可发出荧光的状态而黑暗状态是不能发出荧光的状态。
在优选实施例中，例如在WO2008/091296A2和WO2006/127692A2中，使用可光致转换或光敏的荧光分子。可选地，例如在DE102006 0213 17B3中，使用标准荧光分子的固有黑暗状态。
为了以高于成像光学系统的经典分辨率极限的分辨率对样本结构进行成像，需要将标记的一个小的子集反复地转换至明亮状态。组成这个激活子集的标记的密度被选择为在明亮状态中、也是在可被光显微术成像的状态中相邻标记间的平均间距大于成像光学系统的分辨率极限。组成该激活子集的标记被成像在空间分解光探测器上，例如CCD摄像机上，从而每一点状标记的光分布被以光斑的形式感测，其中光斑的尺寸由光学系统的分辨率极限决定。
采用这一方式感测多个独立的原始数据图像，在每一原始数据图像中，对不同的激活子集进行成像。在图像分析过程中，在每一独立原始数据图像中确定光分布的中心点位置，其表示明亮状态中的点状标记。从独立原始数据图像中确定的光分布的中心点被合并成所有图像数据组形式的整体绘图。由该整体绘图生成的高分辨率全图像反映了标记的分布。
对于待成像的样本结构的典型再现，需要探测足够大量的标记信号。但是，由于明亮状态中两个标记之间存在着最小平均间距，因而在每一激活子集中标记的数量是受限制的，因而为了对样本结构进行完全地成像必须感测非常多的独立原始数据图像。独立原始数据图像的数量典型地在10,000至100,000之间。
除了对物平面(下文中也称为X-Y平面)中标记的横向位置进行上述的确定，同样也确定轴向(下文中也称为Z方向)上的位置。轴向表示成像系统的光轴的方向，即光的主传播方向。
根据被称为“颗粒追踪”的实验可获知三维定位，例如在Kajo等,1994,Biophysical Journal,67,Holtzer et al.,2007,Applied Physics Letters,90,以及Toprak等,2007,Nano Letters,7(7)中所描述的。其已应用在基于上述独立分子的转换和定位的成像方法中。参见Huang等,2008,Science,319,以及Juette等,2008,NatureMethods。相关的现有技术还参见Bossi等,2008,Nano Letters,8(8),2463-2468以及Pavani等,2009,PNAS,106。
原则上，通过评价在摄像机的探测表面上感测的光斑的变化来完成点状目标在Z方向上的定位，当点状目标从清晰度平面(sharpness plane)或与探测表面光学共轭的焦平面中移开时，这种变化是可见的。下文中，点状目标被理解为尺寸小于成像系统的、特别是探测目镜的衍射限制的分辨率极限的目标。这种情况下，探测目镜以三维聚焦光分布的形式将这种目标成像在成像空间中。聚焦光分布在摄像机的探测表面上生成光斑，在文献中也被称为“点扩散函数”，缩写为PSF。如果点状目标随后在Z方向上、即垂直于清晰度平面的方向上被移动通过焦点，PSF的尺寸和形状会发生改变。通过在PSF的尺寸和形状方面分析相应于感测的光斑的探测信号，可推断出目标的实际Z位置。
然而在三维定位中，根本问题在于由点状目标得到的PSF是关于探测平面对称的。这意味着，虽然当点状目标从清晰度平面中移开时PSF发生了改变并因而可以确定出目标距清晰度平面的距离，但在清晰度平面两侧的PSF的改变是对称的，因此难以确定点状目标究竟位于清晰度平面的哪一侧。
当需要执行所谓多色彩测量时，点状目标的三维定位会变得更加困难，其中采用不同的染料来标记样本，且用于感测这些不同染料的探测信号必须被分开。多色彩测量是有益的，特别是在结构的共定位中，例如细胞中的蛋白质。如果能够分开不同染料的探测信号，可得到染料的各个分布，因而得到了不同结构的分布。
当进行多色彩测量时，高分辨率定位显微术中的根本问题是使用任何探测目镜都不同程度存在着的所谓纵向色差(也被称为轴向色差)。纵向色差可被理解为由于波长的作用、导致了发射不同颜色的光的目标成像在不同的成像平面上的像差。这在图1中示出，其中假设点状目标10发射出两个波长的光(在图1中分别由实线和虚线示出，被标记为12和14)。在由目镜16和镜筒透镜18构成的探测光学系统中产生的纵向色差导致了对于不同波长探测光学系统生成的聚焦光分布在Z方向上彼此偏离。附图1中，相互偏离的聚焦光分布的中心点被标记为20和22。
纵向色差产生的原因是透镜材料中存在着色散，即对不同波长的光，其具有不同的折射系数。通过巧妙地设计透镜可一定程度地减小纵向色差。例如，典型的高性能目镜的纵向色差在150-200nm之间，这意味着在相同清晰度平面中的蓝色染料和红色染料的成像在Z方向上彼此偏离150-200nm。
在传统显微术中，上述范围内的纵向色差是可以容忍的，因为不论怎样其在Z方向上所能达到的分辨率仅在600-1000nm的范围之间。然而另一方面，在基于探测独立分子的定位显微术中现已获得了好得多的分辨率值。例如，可以得到低于50nm的分辨率。对于这一分辨率，上述大小的纵向色差是不能容忍的。
发明内容
本发明的目的是基于多色彩测量、对点状目标实现高精度的三维定位，尤其是在Z方向上实现高精度的三维定位。
在一特别有利的实施例中，用于对样本中的点状目标进行三维定位的装置包括探测光学系统，以三维聚焦光分布的形式将布置在物空间的点状目标成像至像空间；分色装置，将用于对点状目标成像的探测光学系统产生的光分成至少两个独立的光束，其波长在不同波长区域内；至少两个探测单元，布置在像空间中，其中的一个探测单元接收两个光束中的一个，而另一探测单元接收两个光束中的另一个，每个探测单元都包括布置为与相应光束的入射方向垂直的探测表面，用于感测光斑，每个光斑表示穿过相关聚焦光分布的平面横截面；评价单元，通过评价在各探测表面上感测的各光斑，确定在与清晰度平面平行的物平面内的相关点状目标的横向X-Y位置，以及相关点状目标在垂直于清晰度平面的光轴方向上相对于清晰度平面的轴向Z位置，各清晰度平面是与像空间中布置有各探测表面的探测平面光学共轭的物空间中的平面；用于两个波长区域中的至少一个(优选为两者)的至少一个Z位置校正值，存储在评价单元中，校正值表示了探测光学系统在该波长区域上的纵向色差；以及评价单元使用相关Z位置校正值来校正在各波长区域上确定的各点状目标的Z位置。
在一个实施例中，评价单元基于属于该点状目标且被两个探测表面感测的光斑的亮度比率来确定各个成像的点状目标的颜色，并将确定的颜色指定为表示该颜色的纵向色差的相关Z位置校正值。
根据本发明的装置适于以高的空间分辨度，特别地包括Z方向，实施用于点状目标的三维定位的多色彩测量。为此，定位装置包括将样本发出的光分成至少两个波长区域的分色装置。如果多色彩测量中使用的是发射光谱仅轻微地重叠的染料，则分色装置可适当地选自装置的探测光路中的滤色器。这种情况下，独立的探测滤色器及独立的探测通道被分配至每一染料。由于染料的发射光谱应符合可见光的可用光谱窗口，且如果可能必须没有大部分的重叠，因此能够以这种方式分开的染料的数量受到了限制。
然而，仅使用两个探测通道也能实施有效的分色。这种情况下，分色装置包括诸如将用于对点状目标成像的探测光学系统产生的光分开的二向色分束器，不论待分开的染料的数目有多少，二向色分束器都将其分成入射至探测单元的两个独立光束。以这种方式，在两个探测单元的探测表面上感测在不同波长区域上的同一目标的图像。基于这两个光斑亮度的比率，可容易地确定出染料。此时需要注意，两个探测单元可合并为一个单元，例如摄像机中摄像机芯片的一部分用于一个探测通道，摄像机芯片的另一部分用于另一探测通道。
根据本发明，通过评价在各探测单元的探测表面上感测的光斑来确定特定点状目标的横向X-Y位置和Z位置。例如，评价包含对光斑产生的PSF的形状和尺寸进行分析，以确定点状目标相对于清晰度平面的Z位置。为此可以想象，例如基于一个合适的分配协议来进行分析，该分配协议将正确的Z位置分配至测量的PSF的特定形状。例如，可通过一校准测量来获得这种分配协议，在校准测量中，点状目标在Z方向上从清晰度平面的一侧移至另一侧，由已知的Z位置确定出PSF的形状。这得到了能够在连续测量中将正确的Z位置分配至测量的PSF形状的分配协议。
例如，可使用其中PSF在X和Y方向上的尺寸的差别与Z位置相关联的分配协议。
根据本发明，对于至少两个波长区域中的每一个，评价单元都包含有至少一个指示探测光学系统在各波长区域上的纵向色差的Z位置校正值。这使得能够使用基于波长的Z位置校正值来校正以上述方式确定的目标的Z位置，因而补偿了探测光学系统中产生的纵向色差。因此本发明也能够对不同染料进行Z方向上的高精度定位。
在特别优选的实施例中，提供一种装置，其能够影响各聚焦光分布从而使得当点状目标位于清晰度平面中时相关的光斑具有对称的形状；当点状目标位于清晰度平面背向探测光学系统的一侧时，该相关的光斑具有第一非对称形状；而当点状目标位于清晰度平面朝向探测光学系统的一侧时，该相关的光斑具有可区分于第一非对称形状的第二非对称形状。采用这一配置，以这种方式打破对称的结构从而使得在探测器表面感测的来自清晰度平面一侧的点状目标的光斑不同于来自清晰度平面另一侧的点状目标的光斑。本文中“对称”表示光斑关于X-Z平面和Y-Z平面镜面对称的状态，其中X-Z平面和Y-Z平面都布置为垂直于位于X-Y平面中的探测表面。
用于影响各聚焦光分布的装置优选地包含柱面透镜。这种柱面透镜产生的象散差导致了当点状目标从清晰度平面的一侧移至另一侧时PSF不对称的变化。然而如果目标位于清晰度平面中，PSF就是对称的(例如，略为十字形的)。基于由象散差引起的探测表面上也即横向方向上的PSF形状的不对称的变化，可容易地确定目标的Z位置。
当使用柱面透镜时，分配至两个探测表面的清晰度平面在物空间中是一致的。然而，分配至两个探测表面的清晰度平面也能够在物空间中彼此偏离，以用于打破为确定Z位置提供的PSF的对称结构。在该实施例中，如果待定位的目标位于一个探测通道的清晰度平面中，则其在该通道清晰地成像，而在另一探测通道中非清晰地成像。如果目标布置在两个清晰度平面之间，其在两个探测通道上都非清晰地成像，但在聚集位置距其更近的通道上更加清晰一些。由于哪一探测通道占用哪一聚焦位置是已知的，因而基于测量也能够确定点状目标所处的Z位置。根据校准测量可得到合适的分配协议。例如，一个可能的分配协议是一个探测通道中感测的光斑的直径与另一探测通道中感测的光斑的直径的差。
根据本发明，可采用其它的方式来打破PSF的对称结构，例如根据Pavani等,2009,PNAS,106中描述的所谓双螺旋方法。
优选地，提供沿光轴移动样本载体和/或探测光学系统、特别是探测目镜的定位装置。这样能够在Z方向上即光轴方向上相对探测光学系统的清晰度平面移动样本，也即待定位的点状目标，从而确定分配至各目标的PSF形状的(非对称)变化，并因而确定该目标的Z位置。
根据本发明，定位装置优选地具有用于将激发光发射至样本的光源和位于该光源之后、用于改变发射至样本上的激发光的光谱的装置。改变入射在样本上的激发光的光谱成分使得能够使用例如反射校准元件来精确地确定探测光学系统在这些波长上的纵向色差，并保存Z位置校正值并将在待定位染料随后的测量中引入该值。
根据本发明，在一有利地改进的方法中，使用不同校准波长的光照射一包含有至少一个反射或散射点状校准目标的校准样本；对每一校准波长，确定点状校准目标的Z位置；确定对各个校准波长确定的校准目标的Z位置之间的偏差；基于这些偏差确定出基于波长的Z位置校正值。该有利的实施例包含使用一校准样本来执行校准以确定出指示纵向色差的Z位置校正值，校准样本例如为玻璃基板，在样本中或样本上设置有诸如金的微球体或金属纳米点的反射或散射校准目标。为了确定纵向色差，可使用与随后待定位的染料发射的相同的光分布来照射该校准目标。因此，以与随后待定位的染料相同的波长照亮该校准目标。然后可连续地使用期望的波长来照射该校准目标。则对每一波长，确定出该校准目标的Z位置。这种情况下，对每一单个校准波长，可实施用于校准样本的不同Z位置的多校准测量。相似地，可经过校准样本的特定Z位置以设定该Z位置处的各校准波长。不论采用哪一方式，都能获得必要的校准信息，例如用于不同染料的校准曲线。
上述方法具有这样的优点，无需不同染料的组合在场以作为参考样本，替代的是仅需一个校准样本。所需要的仅是生成待定位的每一染料的相应的激发光分布。例如，可使用布置在发射激发光的光源之后的合适的滤波器来实现。这种情况下，每一染料类型被分配至产生的光谱相应于该染料的发射光谱的滤波器。
优选地，采用不同激发波长的光照射包含有多个不同荧光染料的校准样本，其中每一激发波长分别激发被分配至其的荧光染料以发射荧光，该荧光的荧光波长不同于其它荧光染料发射的荧光的荧光波长，对定义校准波长的每一荧光波长，确定点状校准目标的Z位置，确定对各个校准波长确定的校准目标的Z位置之间的偏差，以及基于这些偏差确定出基于波长的Z位置校正值。
优选地，通过对确定的Z位置校正值进行插值法来确定用于处于两个校准波长之间的波长的Z位置校正值。附加地或可选地，通过对确定的Z位置校正值进行外推法来确定用于比最长的校准波长还长或比最短的校准波长还短的波长的Z位置校正值。这些有利的改进使得即使对校准测量中未实施的波长区域，也能确定纵向色差。
附图说明
参考下述附图，下文中进一步地解释了本发明：
图1是图解在探测光学系统中发生的纵向色差的示意图；
图2示出了图解柱面透镜如何打破探测表面上感测的PSF的对称结构的示意图；
图3示出了将探测表面上感测的PSF的形状关联至点状目标相对于清晰度平面的Z位置的分配协议；
图4示意性地绘出了根据本发明的定位装置；
图5示出了图解不同染料的光谱分离的的示意图；以及
图6是示出用于评价探测表面上感测的PSFs的可选实施例的示意图。
具体实施方式
参考图2，首先解释了本发明中如何通过评价探测表面上感测的PSF来确定点状目标的Z位置。为便于解释，在图2示出的例子中首先仅考虑单色光。
图2在a)部分示出了一个传统的布置，其中点状目标30被由目镜透镜32和镜筒透镜34构成的探测光学系统36成像在探测表面38上。假定目标30位于与探测表面38光学共轭的清晰度平面40中。
探测光学系统36将发自目标30的光成形为入射在探测表面38上的三维聚焦光分布。因而探测表面38感测表示垂直于Z方向且穿过该聚焦光分布的平面横截面的光斑42。为便于更好地解释，图2中以探测表面38上的平面图的形式示出光斑42，即在X-Y平面上示出。在图2的a)部分中示出的例子中，点状目标30位于清晰度平面40上，探测表面38上的光斑42为圆形，即关于X-Z和Y-Z平面镜面对称的形状。
图2在b)部分示出一改进实施例，其中除目镜透镜32和镜筒透镜34外还提供一柱面透镜44。柱面透镜44在X-Y方向上具有不同的折射率。探测表面38上的光斑42相应地在X和Y方向上的变成十字形。由于在b)部分示出的例子中，点状目标30仍处在清晰度平面40中，因此十字形光斑42仍保留了上述意义上的对称性。
图2在c)部分示出一个例子，其中点状目标30被布置在清晰度平面40的上方。关于清晰度平面40的这种偏离导致探测平面38上的光斑42不对称地变成椭圆形。目标30距清晰度平面越远，光斑42的椭圆形状就越显著。
图2在d)部分示出一个例子，其中点状目标30位于清晰度平面40的下方。同样，探测表面38上的光斑42变成椭圆形，但椭圆的取向不同与c)部分中光斑42的取向。因而基于光斑42的形状，相应地能够探测点状目标究竟是布置在清晰度平面40的上方还是下方。
从图2可明显地看出，基于探测表面38上光斑42的形状和尺寸可确定点状目标30相对于清晰度平面40的Z位置。在该典型实施例中，这是基于图3示例性地示出的分配协议来实现的。借由校准测量获得该分配协议，在校准测量中沿Z方向移动点状目标30并分别确定出对于各个Z位置的光斑42的形状也即PSF的形状。图3示出的分配协议中，使用两个相互垂直的椭圆轴的长PSFx和PSFy的差作为PSF形状的参数，并与Z位置相比较。从图3中可明显地看出，每一个Z位置被明确地分配一个PSFx-PSFy的差值。如果上述差的值为零，则可推断出该点状目标30恰位于清晰度平面40中。
严格来说，图3示出的分配协议仅对于单个预确定的波长是有效的。如果所考虑的不仅是单个波长，而是多个不同波长或波长区域，则相较于图3示出的分配协议，其结果是偏移的、也可能是变形的多个分配协议，这是由纵向色差造成的。纵向色差本质上产生图3中示出的零交点的偏移。根据本发明，在校准测量中对每一感兴趣的波长都确定出图3中示出的这种分配协议。根据由此获得的校准曲线的零交点的上述偏移，可得到表示探测光学系统在各个波长上的纵向色差的Z位置校正值，并在确定点状目标的Z位置时予以考虑。
图4示出表示本发明的典型实施例的显微装置100。
装置100具有激发光源102，其将激发光发射至改变激发光的光谱的装置104上。例如，装置104包括可选择地插入激发光的光路中的多个光学滤波器的布置。
装置104发出的激发光入射在二向色分束器106上，分束器106被具体设置为朝着目镜108反射激发光。目镜108将激发光传送至布置在可移动的样本支架110上的样本112，样本包括多个待定位的点状目标。图4中仅示意性地绘出这些目标中的一个目标，标记为114。这里假定点状目标114的尺寸小于目镜108的衍射限制的分辨率极限。样本支架110被耦合至定位装置116，其沿光轴O移动样本支架110。
点状目标114发出的光被引导穿过目镜108并入射在分束器106上。分束器106被具体设置为将目标114发出的光透射至探测滤波器118。光随后穿过镜筒透镜120并入射在反射镜122上。反射镜122反射的光随后穿过柱面透镜124，且柱面透镜124以图2示出的方式影响了该光。
在穿过柱面透镜124以后，光抵达分色装置126。分色装置126包括二向色分束器128，下面将参考图5的a)部分来详细地解释分束器128的作用。二向色分束器128允许第一波长区域内的部分荧光透过，并反射第二波长区域内的剩余的荧光(参见图5的a)部分)。允许透过的该部分荧光被反射镜130,132,134和136引导至摄像机138。在分束器128上反射的另一部分荧光被引导至不同的光路，其通过反射镜140,142和144的布置也抵达摄像机138。摄像机138包括两个独立的探测单元146和148，每一个分别具有探测表面150和152。分束器128允许通过的部分荧光入射至探测表面150上，而分束器128反射的另一部分荧光入射至探测表面152上。从而，分色装置借由二向色分束器128将探测光路分成了两个独立的探测通道，其中一个通向探测表面150，另一个通向探测表面152。
装置100进一步包括控制器154，其对装置100的个别组件施加控制并根据本发明评价由摄像机138生成的信号以对点状目标114进行定位。
分色装置126实现了对包含在样本112中的不同染料的光谱分离，下文中将参考附图5解释该光谱分离。
图5在a)部分示出三个不同染料A,B和C的荧光发射，以及被标记为160的二向色分束器128的透射特征曲线。如前所述，二向色分束器128将探测光路分成了通向两个独立的探测表面150和152的两个独立的探测通道。由于分配至两个探测表面150和152的清晰度平面在物空间是一致的，因而探测表面150和152感测样本112上相同的区域。然而，进入两个探测通道的波长区域是不同的。例如，染料A的发射区域几乎全部落入一个探测通道内，而染料C的发射区域几乎全部落入另一探测通道内。但染料B的发射区域大体上位于两个探测通道的中间。
当接收单个染料发出的荧光时，荧光以图5的a)部分示出的方式分布在两个探测通道上。图5在b)部分示出源自三个染料A,B和C并被探测表面150和152感测的光斑的示例。从图中可看出，染料A在一个探测通道上留下的光斑具有相对较高的信号级，而在另一探测通道上生成的光斑具有相对较低的信号级。由染料C生成的光斑则完全相反。但另一方面，源自染料B的光斑在两个探测通道上具有大约相同的信号级。
对每一单分子信号，能够测量其在两个探测通道上的亮度分布也即光子分布，在图5的c)部分中以图示出。图中，每一测量的单分子信号生成由极坐标r和φ定义的测量点。这里，角度φ提供了染料颜色的信息，而距坐标系原点的距离r表示亮度。测量来自三个染料A,B和C的大量信号，即得到c)部分中示出的分布，值得注意的就是彼此分离的三个“染料云”。这些染料云的空间范围由各探测通道上光子分布的统计波动定义，由于单分子信号都具有不同的亮度，因此每个信号中光子的总数目也是随机的。当此时测量其光子分布落入这些染料云中的一个区域的信号时，就能明确地确定该分子是染料类型A,B和C中的哪一个。
因此可彼此分开的染料的数目远大于所需要的探测通道的数目。另外，还能够分离发射光谱大体上彼此重叠的染料。这是非常有利的，鉴于是以相同的激发光照射所有的染料。还需要提及的是，结合上述参考图5的光谱信号分离和三维定位，还能得到可用于确定纵向色差的其它有用的信息。例如，信号被分离至两个光谱不同的探测通道，则在每个探测通道上所引起的纵向色差具有不同的效果。因此，用于同一单分子的信号在两个探测通道上看起来是不一样的。如果对两个信号都使用相同的由PSF的形状推出Z位置所基于的分配协议，则对两个探测通道获得用于Z位置的不同的值。根据这两个值可推出染料光谱的分布和绝对纵向色差。
参考图5所描述的光谱信号分离具有进一步的优点。特别地，如果测量图5的c)部分中所示出的染料云，通常各染料云的宽度明显地大于根据纯粹的统计考虑所期望的宽度。这是因为染料微环境的改变会导致其发射光谱的改变。基于染料的即时环境的性质，因此染料分子在样本中某一位置处的光谱不同于在另一位置处的光谱。光谱信号分离提供了这样的优点，即对每一单个染料分子可以分别地测量光谱偏移，因此也可对每一单个分子相应地校正纵向色差。
上述实施例应被理解为仅仅是示例性的。图6中示出可能的变型例中的一个。
图6中示出的布置具有两个独立的探测通道，其中一个基本上由目镜170和镜筒透镜172定义，另一个由目镜170和镜筒透镜174定义。点状目标180发出的光被分束器182和反射镜184,186和187等分地引导至两个探测通道。这两个探测通道在聚焦位置上略微不同。这意味着，一个探测通道具有第一成像面188，其与第一清晰度平面190是光学共轭的，而另一探测通道具有在Z向上偏离于第一成像面188的第二成像面192，其与在Z向上偏离于第一清晰度平面190的第二清晰度平面194是光学共轭的。如果待定位的目标180位于一个探测通道的清晰度平面中，则其在该通道中清晰地成像，而在另一探测通道中非清晰地成像。如果其位于两个清晰度平面190和194之间，则在两个探测通道上都非清晰地成像。如果目标180被布置在焦平面190和194的上方，则在两个探测通道上都非清晰地成像，但其在清晰度平面更接近于目标180的探测通道中的成像要更清晰一些。
由于探测通道的聚焦位置是已知的，因而能够基于测量确定目标180的位置。根据校准测量可得到合适的分配协议。例如，一个可能的分配协议可以是在一个探测通道中感测的光斑198的直径和在另一探测通道中感测的光斑200的直径的差。这种分配协议相似于图3中示出的分配协议。

Claims (16)

1.一种用于对样本(112)中的点状目标(30,114)实现三维定位的显微装置(100)，包括：
探测光学系统(36,108)，以三维聚焦光分布的形式将布置在物空间的点状目标(30,114)成像至像空间；
影响各聚焦光分布的装置(44,124)，使得当点状目标(30,114)位于清晰度平面(40)中时，其相关的光斑(42)具有对称的形状；当点状目标(30,114)位于清晰度平面(40)背向探测光学系统(36,108)的一侧时，其相关的光斑(42)具有第一非对称形状；而当点状目标(30,114)位于清晰度平面(40)朝向探测光学系统(36,108)的一侧时，其相关的光斑(42)具有可区分于第一非对称形状的第二非对称形状；
分色装置(126)，将用于对点状目标(30,114)成像的探测光学系统(36,108)产生的光分成至少两个独立的光束，其波长位于不同的波长区域；
至少两个探测单元(146,148)，它们布置在像空间中，其中的一个探测单元接收两个光束中的一个，而另一探测单元接收两个光束中的另一个，每个探测单元(146,148)都包括布置为与相应的光束的入射方向垂直的探测表面(38,150,152)，用于感测光斑(42)，每个光斑表示穿过相关聚焦光分布的平面横截面；
评价单元(154)，通过评价在探测表面(38,150,152)上感测的光斑(42)，确定在与清晰度平面(40)平行的物平面内的相关点状目标(30,114)的横向X-Y位置，以及相关点状目标(30,114)在垂直于清晰度平面(40)的光轴(O)方向上相对于清晰度平面(40)的轴向Z位置，清晰度平面(40)是与像空间中布置有探测表面(38,150,152)的探测平面光学共轭的物空间中的平面；
用于可被探测单元(146,148)探测的不同波长区域的各个Z位置校正值，存储在评价单元(154)中，Z位置校正值表示探测光学系统(36,108)在相应波长区域上的纵向色差；以及
评价单元(154)使用相关Z位置校正值来校正在各波长区域上确定的各点状目标(30,114)的Z位置。
2.根据权利要求1的显微装置(100)，其特征在于滤波器，其设置为从探测单元(146,148)接收的光束中滤除由光源发射的激发光。
3.根据权利要求1的显微装置(100)，其中各非对称的形状至少大约构成椭圆形，评价单元(154)基于两个相互垂直的椭圆轴的长度差来确定各点状目标(30,114)的轴向Z位置。
4.根据权利要求1或3的显微装置(100)，其中影响各聚焦光分布的装置包含柱面透镜(44,124)。
5.根据权利要求1至3之一的显微装置(100)，其中分配至两个探测表面(150,152)的清晰度平面在物空间是一致的。
6.根据权利要求1的显微装置(100)，其中分配至两个探测表面的清晰度平面在物空间是彼此偏离的。
7.根据权利要求6的显微装置(100)，其中两个探测表面感测属于一个相同的点状目标的光斑，且评价单元基于光斑的尺寸比率来确定该点状目标(30,114)的轴向Z位置。
8.根据权利要求1至3之一的显微装置(100)，其中该分色装置(126)包括二向色分束器(128)。
9.根据权利要求1至3之一的显微装置(100)，其中评价单元基于属于该点状目标(30,114)且被两个探测表面(150,152)感测的光斑的亮度比率来确定各个成像的点状目标(30,114)的颜色，并将确定的颜色指定为表示该颜色的纵向色差的相关Z位置校正值。
10.根据权利要求1至3之一的显微装置(100)，其特征在于沿光轴(O)移动样本载体(110)和/或探测光学系统(36,108)的定位装置(116)。
11.根据权利要求1至3之一的显微装置(100)，其特征在于用于将激发光发射至样本(112)上的光源(102)，以及布置在该光源之后、用于改变发射至样本(112)上的激发光的光谱的装置(104)。
12.一种用于对样本(112)中的点状目标(30,114)实现三维定位的方法，包括：
借由探测光学系统(36,108)，以三维聚焦光分布的形式将布置在物空间的点状目标(30,114)成像至像空间；
提供影响各聚焦光分布的装置(44,124)，使得当点状目标(30,114)位于清晰度平面(40)中时，其相关的光斑(42)具有对称的形状；当点状目标(30,114)位于清晰度平面(40)背向探测光学系统(36,108)的一侧时，其相关的光斑(42)具有第一非对称形状；而当点状目标(30,114)位于清晰度平面(40)朝向探测光学系统(36,108)的一侧时，其相关的光斑(42)具有可区分于第一非对称形状的第二非对称形状；将用于对点状目标(30,114)成像的探测光学系统(108)产生的光分成至少两个独立的光束，其波长位于不同的波长区域；
借由布置在像空间中的一个探测单元(146)接收两个光束中的一个，借由布置在像空间中的另一探测单元(148)接收两个光束中的另一个，每个探测单元(146,148)都包括布置为与相应的光束的入射方向垂直的探测表面(38,150,152)，用于感测光斑(42)，每个光斑表示穿过相关聚焦光分布的平面横截面；
通过评价在探测表面(38,150,152)上感测的相关光斑(42)，确定在与清晰度平面(40)平行的物平面内的各个点状目标(30,114)的横向X-Y位置，以及各个点状目标(30,114)在垂直于清晰度平面(40)的光轴(O)方向上相对于清晰度平面(40)的轴向Z位置，清晰度平面(40)是与像空间中布置有探测表面(38,150,152)的探测平面光学共轭的物空间中的平面；
对可被探测单元(146,148)探测的不同波长区域分别确定可用的一个Z位置校正值，各个Z位置校正值表示探测光学系统(108)在相关波长区域上的纵向色差；以及
使用相关的Z位置校正值来校正在各波长区域上确定的各点状目标(30,114)的Z位置。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于借由滤波器从探测单元(146,148)接收的光束中滤除由光源发射的激发光。
14.根据权利要求12或13的方法，其中
使用不同校准波长的光照射包含有至少一个反射或散射点状校准目标的校准样本；
对每一校准波长，确定点状校准目标的Z位置；
确定对各个校准波长确定的校准目标的Z位置之间的偏差；
基于这些偏差确定出基于波长的Z位置校正值。
15.根据权利要求12或13的方法，其特征在于
采用不同激发波长的光照射包含有多个不同荧光染料的校准样本，其中每一激发波长分别激发被分配至其的荧光染料以发射荧光，该荧光的荧光波长不同于其它荧光染料发射的荧光的荧光波长，
对定义校准波长的每一荧光波长，确定点状校准目标的Z位置，
确定对各个校准波长确定的校准目标的Z位置之间的偏差，以及
基于这些偏差确定出基于波长的Z位置校正值。
16.根据权利要求15的方法，其中通过对确定的Z位置校正值进行插值法来确定用于处于两个校准波长之间的波长的Z位置校正值，和/或通过对确定的Z位置校正值进行外推法来确定用于比最长的校准波长还长或比最短的校准波长还短的波长的Z位置校正值。
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