CN110023811A - 针对用于显微镜的探测光的光学组件、用于显微镜检查的方法和显微镜 - Google Patents

针对用于显微镜的探测光的光学组件、用于显微镜检查的方法和显微镜 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于显微镜的、尤其是共焦扫描显微镜的探测光的光学组件，其具有用于被待测量的探测光穿过的射入平面(10)和布置在射入平面下游的用于将探测光(11)引导到探测平面(67)中的探测光路，其中，探测光路具有至少一个第一射束路径(1)，其具有第一光学射束引导器件，尤其是第一透镜和/或反射镜(20、30、34、36、58、60、66)，用于将探测光传导到探测平面中。光学组件在第一射束路径中具有至少一个用于对待测量的探测光在空间上进行光谱分裂的色散装置(26)和用于对在空间上进行了光谱分裂的探测光进行操纵的操纵装置(49)。第一光学射束引导器件与色散装置和操纵装置一起被布置并设立成用于产生射入平面到探测平面中的光谱分离并衍射受限的成像。优选地，光学组件具有第二射束路径(2)，其具有光学射束引导器件和用于选出第一射束路径(1)或第二射束路径(2)的选出装置(22)。在另一方面中，本发明还涉及一种用于显微镜检查的方法以及显微镜。

Description

针对用于显微镜的探测光的光学组件、用于显微镜检查的方 法和显微镜
技术领域
本发明在第一观点中涉及一种根据权利要求1的前序部分的针对用于显微镜的、尤其是用于共焦扫描显微镜的探测光的光学组件。
在另外的方面中，本发明涉及一种尤其是在使用根据本发明的光学组件的情况下用于显微镜检查的方法，并且涉及一种显微镜、尤其是共焦扫描显微镜。
背景技术
激光扫描显微镜已成为生物医学研究中不可或缺的工具。然而，显微镜的技术的最新发展仍渴望更加敏感且不损伤样品的方法。在此，利用经聚焦的单个的激光射束进行的共焦显微镜检查与其他方法相比具有明显的缺点。出于该原因，导致图像采集的某种程度的并行化的所谓的多点方法变得越来越重要。然而，除了并行化，还能够使用空间激发图案，使得在样品的不同区域中存在有不同颜色激发。有利地，能够借助空间上的超扫描来探测被各个激光射束在样本中激发的信号。
除了逐点扫描的方法之外，最近还开发了用于高分辨率成像的显微镜(宽场显微镜)的另外的措施。因此，例如公知有SOFI(Superresolution Optical FluctuationImaging，超分辨率光学波动成像)方法。为了能够在现有的染料上广泛使用该方法，需要一种能够接收具有MHz范围内的帧频的数据的非常快速的传感器。这种传感器已经存在，但是其具有的缺点是，仅具有相对有限数量的像素。有利地，这些传感器能够与共焦显微镜组合使用。因此，由共焦成像产生的数据能够与SOFI成像的数据组合。
已知的共焦系统不是比较灵活。通常，只能测量唯一的共焦的体积。然而，也提供了能够以能切换的方式测量多点图案和线图案的系统。为此，将不同的掩膜移入到照明光路中和针孔平面中。
已知的旋转盘系统虽然使用了用于测量多个共焦的体积的信号的成像的传感器(通常是EMCCD)。但是，这些系统却具有非常有限的的灵活性。因此无法改变光点的距离。此外，在这样的系统中无法进行令人满意地变焦，并且在可用的物镜方面是非常有限的。此外，转换到具有多于三个光谱通道的频谱模式几乎是不可能的，这是因为这些系统是基于最终扫描光点图案的标准的相机。
最后还公知有一种“阵列扫描”系统，其中，扫描样品上的点图案。所产生的信号辐射的图案在此再次被“解扫(descanned)”。然后利用静止的射束进行光学操纵，使得所谓的“重新分配(Reassignment)”在分辨率等方面展现期望的效果。最后，再次经由传感器扫描如此生成的光场。因此，原则上也得到了高并行化的优点，例如高帧频和低的光子损失，以及光子重新分配的优点，如与针孔大小无关地，在激光扫描显微镜的分辨率极限下工作。然而，这些优点是通过具有在成本、透射损耗、仪器中的实用性的问题方面的常见的缺点的极其复杂的光学器件换来的。最后，在光谱灵活性方面又受到严格限制。
此外，为此能够在激光扫描显微镜(LSM)中使用机械扫描仪来补偿所提及的传感器的有限数量的像素，并且还马赛克式地扫描对象物以用于该成像。这尤其是重要的，这是因为迄今可用的传感器，例如所谓的单光子雪崩光电二极管阵列(SPAD阵列)，目前仍具有相对较少的像素。为此必须如下这样地设计共焦显微镜的光学系统，即，能够将样品的一定的视场转移到传感器。
用于探测光的按类属的光学组件在DE 10 2014 107 606 A1中描述，并且具有下列部件：用于被待测量的探测光穿过的射入平面和布置在射入平面下游的用于将探测光引导到探测平面中的探测光路。在此，探测光路具有至少一个第一射束路径，其具有第一光学射束引导器件，尤其是第一透镜和/或反射镜，用于将探测光引导到探测平面中。
在DE 10 2014 107 606 A1中通过切换射束路径能够仅用一个传感器实现不同的激发和探测模式。在此，功能集成的激光扫描显微镜能够在逐点式、多点式、线状的和宽场状的照明之间进行切换。
发明内容
本发明的任务可以在于：说明一种光学组件、一种用于显微镜检查的方法和一种显微镜，利用它们能够提升针对多点显微镜检查方法的功能。
该任务通过具有权利要求1的特征的光学组件、通过具有权利要求18的特征的方法、并通过具有权利要求28的特征的显微镜来解决。
上述类型的光学组件根据本发明通过如下方式被改进，即，在第一射束路径中存在有用于对待测量的探测光的进行空间光谱分裂的至少一个色散装置，在第一射束路径中存在有用于操纵经光谱空间分裂的探测光的操纵装置，并且第一光学射束引导器件与色散装置和操纵装置一起被布置并被设立成用于产生射入平面到探测平面中的光谱分离且衍射受限的成像。
在根据本发明的用于显微镜检查的方法中使用了根据本发明的光学组件，并且其执行以下步骤：在照明光路中以照明光照射显微镜、尤其是共焦激光扫描显微镜中的样品，将样品由于以照明光照射所射出的待测量的探测光、尤其是荧光聚光，将待测量的探测光传导通过光学组件的射入平面，尤其是射入孔板，并且利用至少一个布置在光学组件的探测平面中的探测器测量探测光。优选地，在此，射入平面位于相对于布置有样品的平面是光学共轭的平面中。
根据本发明的显微镜尤其是共焦扫描显微镜，并且具有以下部件：具有至少一个显微透镜的照明光路和根据本发明的光学组件和至少一个布置在光学组件的探测平面中的探测器。根据本发明的显微镜尤其适用于执行根据本发明的方法。优选地，在此，射入平面位于相对于布置有样品的平面是光学共轭的平面中。
根据本发明的光学组件的优选的设计方案、根据本发明的方法的和根据本发明的显微镜的有利的变型方案将在下面、尤其是参考从属权利要求和附图进行描述。
作为本发明的中心思路能够认为是，在探测光路中存在有用于待测量的探测光的第一射束路径，在其中，能够同时光谱分裂和操纵多个照明光点的探测光。由此能够实现光谱分辨的扫描的显微镜检查的显微镜检查方法。
对于本发明的变型方案重要的是，此外在探测光路中还能够为待测量的探测光选出第二射束路径。因此，借助该第二射束路径，利用一个并是原探测设备不仅能够实现经扫描的宽场显微镜检查，这将在下面更详细地解释，而且还能够实现高并行化的多光点共焦显微镜检查。
因此，本发明提供了一种高功能的探测设备，其能够用于多种显微镜检查方法。
射入平面优选如下这样地定位，即，使其处于相对于样品平面是光学共轭的平面中。在射入平面中能够优选定位有射入孔板，但射入孔板不是绝对必要的。射入孔板也能够被称为针孔或尤其是共焦针孔。术语探测光路被视为所有的使待测量的探测光从其进入穿过射入孔板直到在第一、第二或另外的探测器都进行影响的光学部件。术语第一和第二射束路径被视为两个不同的光学路径，光学路径能够使待测量的探测光从其进入穿过射入孔板直到在探测平面中的探测器中进行指示地被经过。在此，第一射束路径和第二或另外的射束路径，在部分路段上，尤其是在射入孔板的下游和/或在探测器之前是相同的，也就是重合。在本说明书的范围内，样品或探测器上的照明光斑也被称为光点或点。尤其地，这些光点或点能够是衍射受限的。
术语“光”，尤其是照明光或探测光，应被理解为典型地在显微镜中使用的或出现的电磁辐射。尤其是在红外的、可见的或紫外光谱范围内的照明光典型地由激光器提供。优选地，根据本发明的显微镜优选是激光扫描显微镜。术语扫描和扫描在本说明书中同义使用。
在空间上光谱分裂或意义相同的色散分裂在本说明书的范围内尤其被理解为如下状况，其中，射线束的不同光谱分量沿不同的空间方向传导，并且在该意义下被分裂。在此，在特定的并非微不足道的波长区间和空间方向区间中，波长向一个空间方向进行持续映射。这意味着，彼此接近的波长也沿彼此接近的空间方向传导。相应地，彼此远离的另外的波长沿彼此远离的空间方向传导。因此，在该意义下，色散分裂是指与能够利用多个电介质分束器的结构实现的那种分裂不同的分裂。
在本发明的范围中，特别优选地，针对色散分裂使用衍射用的或折射用的元件，典型的是棱镜或光栅。原则上，在根据本发明的结构中不需要滤波器。然而，可选地，能够在传感器前面或在光学装置前面使用所谓的发射滤波器。例如，能够由此进一步减少激发光的份额或各个探测通道的串扰。对于本发明重要的是，实际的分裂在没有滤波器的情况下进行，或者换句话说，缺少滤波器地进行。一方面，这具有以下优点：关于实际的射束引导详细地要比在使用分立的二向色分束器或其他滤波器的结构的情况下实现了更大的灵活性。此外，与利用所谓的光谱梯度滤波器相比，潜在地实现了更好的光谱边缘陡度和更稳定的实施方案。
与DE 10 2014 107 606 A1相比，在变换照明模式时，在本发明中不发生光瞳平面和图像平面的替换。
在根据本发明的光学组件的特别优选的变型方案中，探测光路具有第二射束路径，其具有第二光学射束引导器件，尤其是透镜和/或反射镜，其用于将探测光传导到探测平面中。第二光学射束引导器件被布置并设立成用于产生射入平面到探测平面中的衍射受限的成像，并且存在有选出装置用于为待测量的探测光选出第一射束路径或第二射束路径。
利用该设计方案，本发明因此提供了一种探测设备，其能够依赖于测量任务和相应的照明地在不同的探测模式下运行。尤其地，共焦多点显微镜检查和必要时的经扫描的、宽场测量的测量任务能够彼此组合。
因此，本发明尤其解决了提供一种探测设备的任务，该探测设备在唯一系统中可供使用不同的成像措施，而不必切换在针孔前面的探测光路。因此，与现有技术的共焦系统相比，在探测方面实现了更高的灵活性。尽管DE 10 2014 107 606 A1示出了如何仅利用唯一的传感器在激光扫描系统中实现不同的运行模式。但是缺点是必须替换光瞳平面和图像平面。
在探测平面中优选存在有用于测量探测光的至少一个位置分辨式、尤其是分段的、探测器。具有至少一个被定位在探测平面中的探测器的根据本发明的光学组件也能够被称为探测设备。
原则上，根据本发明的光学组件能够在射入平面中没有射入挡板的情况下使用。在光学组件用于共焦显微镜的情况下，能够在射入平面中布置有射入孔板、尤其是共焦针孔，用于使待测量的探测光进入。
本发明的显着优点还在于，能够实现如下模式，其允许比较高的并行化度。在此能够想到的是在大约100倍的范围内的并行化的值。利用这种方法，也能够长时间友好地检验活细胞，这是因为能够在给定的图像采集速度下不降低图像质量的情况下显着减少最大光功率。但是，最大功率对于大部分的光子损伤效应来说恰好却起决定性作用。总剂量明显具有较小的效果。
选出装置原则上还能够被设立成用于能够在第一射束路径、第二射束路径与至少一个另外的射束路径之间进行选出。
原则上，选出装置能够是适合于转换光路的任意类型的射束偏转装置。原则上，在此也能够使用电光部件。特别有利地，选出装置是能调节的反射镜，其尤其能够运动进入到探测光路中及从该探测光路运动出来。该变型方案在结构上是简单的并且工作可靠。例如，反射镜能够枢转和/或是能移动的。在另外的有利的变型方案中，在选出装置中也能够充分利用光的偏振。例如，能够使用二向色反射镜，其反射率和透射特性敏感地与光的波长和偏振有关。
优选地，能调节的反射镜能够运动进入到探测光路的经准直的部分中。由此实现的是，反射镜的定位本身不是关键的。
原则上，分段的或像素化的探测器可用作位置分辨式探测器。
在特别优选的实施例中，位置分辨式探测器和/或位置分辨式第二探测器尤其是能冷却的SPAD探测器(SPAD＝Single Photon Avalanche Photodiode Array，单光子雪崩光电二极管阵列)或者是在合适的配置中的多个这种探测器的结构。
这些传感器目前处于共焦系统中商业可用性的阈限上。也称为SPAD传感器的SPAD探测器具有一系列优点。因此，能够在特定的波长下实现高达80％的量子效率。单个像素的高放大使得能够在单光子计数模式(photon counting mode)下运行这些传感器。此外，这些传感器具有必要的读出速度，以便因此在扫描显微镜中实现1MHz范围内的必要的读出速率。读出时间能够在约1000μs到10ns之间变化。当点扩展函数(PSF，Point SpreadFunction)的份额被分布在相应多的像素上时，则给定了必要的动态。例如，在死区时间为50ns的情况下，能够达到每个单一元素1到5MHz之间的计数率。如果将点扩展函数的光分布到多个(例如25个)像素上的话，则能够实现在100MHz范围内的计数率，这对于激光扫描显微镜中的实际应用是完全足够的。电子器件的进一步的开发未来将允许在显着减少死区时间的情况下实现传感器中的电子雪崩的主动“熄灭”，这将再次提高最大的计数率。此外，这些传感器具有必要数量的像素以能够实现所述模式。因此，已知具有大约100×100个像素和更多像素的传感器。因此，用于在此处理的测量任务的最合适的传感器实际上是所谓的SPAD阵列(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)。这种类型的传感器结合了所有必要的属性，尤其是用于对光分布进行位置分辨测量的像素结构，具有高灵敏度(高量子效率或光子探测效率)，并最后具有用于通过足够高的放大来计数各个光子(光子计数)的可能性。
但是，应该采取进一步的措施，以便在根据本发明的系统中能够使用该传感器。例如，与光电倍增管(PMT)相比，这种传感器具有明显更高的暗噪。为了对抗该效应，应采取两项措施。首先，众所周知的是，冷却会显着降低暗噪(通过将温度降低8K，能够使暗噪近似减半)。此外，传感器应该是自适应可切换的，以便仅实际运行也被用于各自的信号生成的像素。为此，需要关于单一像素的所谓的随机访问(单访问可能性)。依赖于照明的光分布和所选择的传感器模式地，因此在传感器上选出特定的探测图案。
除了SPAD阵列传感器(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)之外，还可以使用其他传感器。例如，位置分辨式探测器和/或位置分辨式第二探测器可以是半导体探测器，尤其是CCD或CMOS探测器。尤其能够使用快速相机。
特别优选地，位置分辨式探测器和/或位置分辨式第二探测器可以是具有前置的图像放大器的、尤其是前置的多通道板的相机。
当需要特别好的灵敏度时，例如用于查验非常弱光的对象物时，则位置分辨式探测器和/或位置分辨式第二探测器可以由多个光电倍增器形成。在此，探测光能够利用非成像的器件被重新分布。能够使用微通道板(Multichannelplate)来作为位置分辨式探测器，以其也能够对各个光子进行计数。
此外可能的是，通过如下方式使用具有传统的光电倍增管技术的光学结构，即，在光电倍增管前面使用非成像的光学元件。这些能够例如是光纤束(DE 10 2013 015 931A1)。
最后，也能够使用另外的固体传感器，如光电二极管，尤其是PIN二极管、或所谓的SiPM、SiPMT、MPPC等，用作探测器。
依赖于使用哪个探测器地，除了纯成像之外还能够使用另外的方法。因此，利用SPAD阵列(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)也能够测量和显示染料的寿命(Fluorescence Lifetime Imaging，荧光寿命成像)。同样，能够测量信号间的相互关系，并在荧光相关光谱学(Fluorescence Correlation Spectroscopy)的意义下进行评估。利用相应的激发图案能够以此实现多点FCS或多点FLIM测量。
当使用相机式的传感器，例如EMCCD、CMOS、sCMOS或CCD型的相机时，则这些传感器能够装备有快速图像放大器，例如所谓的微通道板。此外，利用所谓的混合探测器还能够在空间上分辨地进行探测。这些传感器由光电阴极和APD结构构成。通过光电效应从光电阴极中撞出的电子在此以高电压(约8kV)加速，并且然后撞击在敏感的表面上，其工作方式类似于APD。利用能够实现单个光子测量的那么高的放大(增益)能够实现冲击和雪崩效应。混合探测器也能够空间上分辨地使用。
此外，能够利用非成像元件如光纤或光纤束将光重新分布到其他探测器上。例如，这些能够是光电倍增管。有利地，这些能够配备具有GaAsP的光电阴极。在光学结构中允许如下变化，即，利用成像传感器探测所有光谱份额。
在根据本发明的探测器的另外优选的设计方案中，存在有至少一个、尤其是二维的多透镜结构，并且存在有调节装置，以便将多透镜结构运动进入到探测光路中及从探测光路中运动出来。该变型方案能够实现在多透镜结构引入到光路中的情况下通过多个射线束进而是多点共焦显微镜对射入孔板的充分利用。在此，在多透镜结构的情况下没有必要必须利用所有的透镜。例如，在二维的多透镜结构中，仅使用一列透镜。
具有至少一个多透镜结构的根据设备的设计方案能够以有利的方式实现根据本发明的方法的被称为光谱分辨的多点扫描显微镜检查的改进方案。在此，利用照明光的多个光点，尤其是用位于一条线中的光点同时对样品进行扫描，其中，在射入孔板下游的探测光路中定位有多透镜结构，并且多透镜结构的透镜的数量是至少与对样品进行扫描的照明光的光点的数量一样大，利用照明光对样品扫描。此外，利用选出装置为待测量的探测光选出第一射束路径，将源自照明光的各个光点的探测光射束在空间上进行光谱分裂，并将这样得到的射线束利用尤其是在光谱选出平面中的操纵装置进行操纵，并且探测被操纵的射线束。
在该方法变型方案中，能够有针对性地对各个源自照明光的各个光点的探测光射束进行操纵。
原则上，当形成选出装置的能调节的反射镜被移入到光路中时，能够运行该光谱分辨的多点扫描显微镜检查。也就是说，于是在第一射束路径中，探测光在反射镜上至少反射一次。然而，特别优选地，反射镜从射束路径移出或移除以用于选出第一射束路径。也就是说，在该变型方案中，经由第一射束路径到达探测平面中的光并不在反射镜上反射。
对光谱成分的操纵原则上能够包括任何变化。特别优选地，对源自照明光的各个光点的针对其中至少一个、尤其是所有的光点的射线束的操纵是对至少一个、尤其是其中唯一的光谱分量的选出。在与照明光的相应的光点的光谱激发相协调中，然后可以有针对性地例如选出特定的染料的发射波长或光谱发射波长带，或者可以有针对性地选出两个或更多个发射波长或光谱发射波长带。
作为色散装置可以考虑任意的能够实现所期望的光谱空间分裂的装置。例如，可以使用诸如光栅的衍射用的部件。特别优选的是如下探测设备，在其中，色散装置是棱镜。由此能够实现紧凑和轻便高效的结构，其中，在第一射束路径中由操纵装置射回的探测光沿反向方向重新通过色散装置，尤其是以如下方式进行，即，使得射回的探测光在以相反的顺序穿过色散装置之后不具有明显的色差，并且能够实现针孔或点发射器在样品中的衍射受限的成像。
在相应的方法中，经操纵的射线束沿变向的方向重新通过在第一射束路径中的色散装置。
在根据本发明的探测设备的另外的优选的实施变型方案中，操纵装置具有光谱选出平面，在其中可以布置有尤其是能调节的射束偏转器件。通过使各个光谱份额偏转，使得这些分开可以有针对性地朝原探测器或某一探测器的方向继续传导，或从待探测用的光中移除。
特别优选地，光谱选出平面位于不同于探测平面的平面中，然而，该平面相对于探测平面是光学共轭的。
当在光谱选出平面下游布置有至少一个第二探测器用于指示穿过也就是发射过光谱选出平面的探测光时，则得到了另外的评估可能性。原则上，然后能够特别地针对各个照明光点来光谱分辨地评估探测光。
借助操纵装置进行的光谱筛选原则上可以以不同方式实现。重要的是，将所期望的光谱分量传导向探测器。操纵装置，尤其是光谱选出平面中的射束偏转器件能够由具有反射镜、尤其是能运动的反射镜或其他光变向的元件的光机械结构形成。例如，可以使用微镜阵列。使用所谓的SLM(Spatial Light Modulator，空间光调制器)也能够是有利的。利用它们可以以如下方式影响期望的光谱份额，即，使得它们被变向到成像传感器。此外，所谓的DMD(Digital Mirror Devices，数字微镜器件)或MEMS(MEMS＝Micro Electro-Mechanical Systems，微电子机械系统)能够与光导功能一起使用。
此外，本发明的重要观点是，操纵装置和探测平面彼此间在射束路径中是分开的。因此，操纵装置和探测平面在空间上和光学上彼此间是分开的。然而，它们能够优选地位于相互光学共轭的平面中。
尤其是将二维的多透镜结构定位在探测光路中还能够实现被称为高并行化的多点扫描显微镜检查的特别优选的方法变型方案。在此，用照明光的尤其是布置在二维的图案中的多个光点对样品进行同时扫描，其中，在射入平面下游的探测光路中布置有尤其是二维的至少一个多透镜结构，并且多透镜结构的透镜的数量至少与对样品进行扫描的照明光的光点的数量一样大。此外，利用选出装置为待测量的探测光选出第二射束路径，并且探测源自照明光的各个光点的探测光射束。该方法特别适用于快速褪色的敏感样品。
在现有技术DE 10 2014 107 606 A1中，尽管通过仅利用一个传感器切换射束路径就能够实现不同的激发和探测模式。然而，与本发明相比，却不可能进行具有不同并行化程度的多点照明/探测。
原则上，在与根据本发明的探测设备联接的显微镜中的照明必须与分别所使用的方法相匹配。在根据本发明的方法的优选的变型方案中，为了在照明光路的光瞳平面中进行照明而定位有衍射用的元件，尤其是SLM(空间光调制器)或达曼光栅。因此能够以非常明确的方式产生期望的照明图案，例如一维或二维的多点图案或照明线。
尤其是在光谱分辨的多点共焦显微镜的情况下使用尤其是冷却的SPAD探测器(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)用作位置分辨式探测器。在此，当在SPAD探测器(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)中仅运行那些用于分别生成所需信号的像素时，能够提升测量数据的信噪比。
最后，根据本发明的光学组件能够实现用于直接成像的能够被称为宽场显微镜检查或被扫描的宽场显微镜检查的另外的有利的方法变型方案。在此，将样品至少在视野范围内同时利用照明光照射，并且利用选出装置为待测量的探测光选出第二射束路径，其中，视野范围成像到位置分辨式探测器上，并且其中，探测光路没有多透镜结构和探测孔板。
该方法的先决条件还在于，光学系统能够传输用于视场的光。由于该可传输的视场对于共焦显微镜的合适的光学系统来说通常不是很大，所以此方法的改进方案是优选的，在其中，在样品上扫描视场范围。在该方面，也可以提到使共焦显微镜的光学传导率提高以匹配探测设备。于是，原则上，通过将在每个扫描仪定位处分别获得的单个图像合并，使得能够获得大样品范围的整个图像。
根据本发明的显微镜优选是共焦激光扫描显微镜。扫描系统在此能够是根据现有技术的共焦系统。原则上，也能够使用如下系统，其中例如使样品本身移动。
附图说明
下面参考附图描述本发明的另外的优点和特征。在附图中：
图1：示出根据本发明的探测设备的透视的和示意性的视图；
图2：示出图1的探测设备的俯视图；
图3：示出图1和2的探测设备的细节；
图4：示出在用于光谱分辨的多光点共焦显微镜检查的方法的变型方案的根据本发明的探测设备中的位置分辨式探测器的示意图；
图5：示出在用于高并行化的多光点共焦显微镜检查的方法变型方案的根据本发明的探测设备中的位置分辨式探测器的示意图；
图6：示出在用于经扫描的宽场显微镜检查的方法变型方案的根据本发明的探测设备中的位置分辨式探测器的示意图。
将参照图1至图3详细阐述用于激光扫描显微镜的根据本发明的探测设备100的实施例。相同和作用相同的部件在图中通常用相同的附图标记标注。
具体实施方式
在图1和2中示意性地示出的探测设备100包括作为主要的部件的射入平面10、位置分辨式分段探测器68和具有第一射束路径1和第二射束路径2的探测光路。在第一射束路径1存在有色散装置26，并且能调节的反射镜22被用作用于在第一射束路径1与第二射束路径2之间进行转换的选出装置。在射入平面10中能够针对特定的应用存在有也能够被称为射入针孔的射入孔板10。
射入孔板(图1和图2中未示出)可位于由附图标记10标注的地方处。在此存在有也能够被称为相对于物镜的焦平面是共轭的平面的射入平面10。待测量的探测光11的射线束从该射入平面10射出，并利用第一聚光透镜12来准直，并被引导到能调节的多透镜结构16上，该能调节的多透镜结构能够借助未示出的用于特定的用途的机械装置从光路移除(双箭头17)。从多透镜结构16射出的辐射18到达至第二聚光透镜20，被该第二聚光透镜20准直，并从那里到达能调节的反射镜22，该能调节的反射镜借助未示出的机械装置能够从光路运动离开(双箭头23)，例如拉出或者摆动出来。出于清楚的原因，能调节的反射镜22未在图1中示出。
当发挥用于针对待测量的探测光11选出第一射束路径1或第二射束路径2的选出装置作用的反射镜22位于光路中时，如图2所示，在反射镜22上所反射的探测光59、62、64经由透镜58、60、66进入探测平面67中并到达位置分辨式探测器68上。这相当于第二射束路径2。借助在显微镜方面位于显微物镜的中间图像平面中的位置分辨式探测器68指示了进入到射入平面10中的待测量的探测光11。
当能调节的反射镜22已借助未示出的机械装置从光路移除，例如被拉出或摆动出来(双箭头23)时，待测量的探测光24从透镜20到达到棱镜26，该棱镜发挥色散装置作用并且被用于对待测量的探测光24进行空间光谱分裂。其中将可变的反射镜22从光路拉出的方法变型方案尤其涉及用于光谱分辨的共焦多光点扫描显微镜检查的方法。在此，利用多个光斑同时对样品照明，并且同时探测从这些被照明的样品方位射出的辐射。探测光在此占据第一射束路径。
例如，在图2中所示的状况中，待测量的探测光14、18、24能够垂直于纸面，即沿y方向(参见图1中的坐标系5)被分裂成多个分别属于不同的被照明的样品方位的射线束。该沿垂直于纸面的方向被分裂的探测光24进入棱镜26中，并从该棱镜沿x方向(参见图1中的坐标系5)被分裂。在空间上被光谱分裂的探测光28、32经由透镜30、34和36成像到光谱选出平面48中。
在光谱选出平面48中存在有操纵装置49，其用于操纵在空间上被光谱分裂的探测光。下面将结合图3进一步阐述这种操纵装置49的示例。借助于操纵装置49，例如能够从经光谱分裂的子射束传导回和/或抑制单个的光谱分量42、44、46。因此，各个被选出的光谱分量被操纵装置49射回，并且然后回到原光学路径上，即经由透镜36、34、30返回到棱镜26。然后经由棱镜26，第一射束路径再次被引导经过固定的反射镜57，并从那经由透镜58、60、66进入探测平面67中并到达位置分辨式探测器68上。
在图1和2中所示的光学构造中，因此，来自针孔平面10的待测量的探测光11要么经由用于筛选光谱分量光学设备(操纵装置49)被传导到检测平面67中，要么直接进入探测平面67中并成像到位置分辨式探测器68上。在此能够利用在光谱选出平面48中的也能够被称为光谱筛选单元的操纵装置49选出光谱份额，并传导到位置分辨式探测器68上。
对于本发明特别重要的是，在这两种变型方案中，即无论探测光是否经由第一还是经由第二射束路径传导地，射入平面都衍射受限地成像到在探测平面中。
在探测光经由第一射束路径传导到探测平面67中的情况下，衍射受限的成像还发生光谱分辨，其中，光谱分辨以及光谱筛选通过光谱操纵模式的各自的调整来提供。
根据本发明，相应地，第一光学射束引导器件30、34、36、57连同色散装置26和操纵装置49一起被布置并设立成用于产生射入平面10到探测平面67中的光谱分离并衍射受限的成像。
在探测光经由第二射束路径进入探测平面中的情况下，第二光学射束引导器件20、22、58、60、66同样被布置并设立成用于产生射入平面10到探测平面67中的衍射受限的成像。
参照图3阐述操纵装置49的细节。在那里示意性地示出了操纵装置49，其在所示的示例中应当是指微镜阵列49。该微镜阵列49具有多个能分别单独调节的反射镜，示例性地示出了其中三个反射镜50、51、52。这些反射镜50、51、52位于光谱选出平面48中，光谱选出平面48其本身位于相对于显微镜物镜的对象物平面是共轭的平面中，换言之，位于中间图像平面中。实际上，微镜阵列49具有较大数量的微反射镜50、51、52。然而，这些反射镜也能够宏观可见地实现，并且能够以合适的方式在光谱选出平面中引入到光路中。
在图3中所示的实施例中，被棱镜26已经在空间上光谱分开的、但是原本上是从一个并且是同一被照明的样品方位射出的三个射束42、44、46撞击在微反射镜50、51或52上。射束42、44、46被反射成射束43、45或47。通过对反射镜50、51、52有针对性地选择的调整例如能够引起只有特定的期望的光谱分量(例如，所示的射束43、45，47)被射回第二射束路径上、到达探测平面67中并到达位置分辨式探测器68上并在那里被指示。原则上，也能够如下这样地调整微镜阵列49的微反射镜50、51、52，即，使落入的光被发送穿过微镜阵列49。然后因为它已经被在空间上光谱分解，所以能够在微镜阵列49的下游要么被光谱分辨地探测，要么在其光谱整体性方面被另外的在图中并未示出的探测器所指示。示意性地，该被发送穿过微镜阵列49的光在图3中由箭头53说明。
图4示出了针对光谱可选的共焦探测的显微镜检查方法的情况的在位置分辨式探测器68上的示例性的光分布。在此假设，在样品中在四个不同的方位处分别被光谱激发。随后，从这些被激发的方位射出的所有的发射射束穿过显微镜结构并穿过针孔平面10传播直到光谱选出单元，即操纵装置49。在那里，将感兴趣的光谱份额如所述(图3)被转向回到位置分辨式探测器68中的平面中并在那里被在空间上分辨地探测。
整个结构的光学品质因此好到使得在对象物平面中的发光的点以衍射受限的品质在像素化的传感器、也就是位置分辨式探测器68上产生点扩散函数，从而能够应用“光子重新分配”的方法。尤其地，为此必须适当地实施色彩校正。由于探测光在棱镜26上被光谱分裂，使得各个波长从棱镜26直到光谱选出平面48在不同的路径上行进通过光学器件。在光谱选出平面48中还反射了具有不同的有针对性地调整的角度的特定的光谱份额，从而使这些光谱份额随后在又不同的路径上行进返回通过光学器件，以便之后在棱镜26中被分别光谱进行合并。通过光学器件的不同路径要求对所提及的光学器件进行有针对性的色彩校正。因此，光学器件的纯粹的横向色差无关紧要，但与色彩有关的球差却非常关键。一般而言，构造需要对诸如聚焦、球差和像散的所有偶数像差有很好的色彩校正，而像畸变和彗形差象的奇数像差却起到次要作用并在两次穿过光学器件中被补偿。
附加地，因此还能够将信号展开。光谱分辨率仅受到光谱选出装置的部件(即操纵装置49)相对于色散元件(即在所示的实施例中的棱镜26)的色散强度的调节精度的限制。
在图4中所示的示例中示意性地示出了具有多个像素69的位置分辨式探测器68。例如，其是冷却的SPAD阵列(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)。为了使噪声最小化，在此有利地仅使用在被指明的光分布71至78周围的区域中的像素。在没有预期的探测光的中央的区域70中，没有施加偏置电压，或在任何情况下电压都低于击穿阈限，因此，整个区域70并不助于信号也不助于噪声。因此能够改善信噪比。具体地，点71和75属于第一样品点的不同光谱分量。相应地，点72和76属于被照明的第二样品点，点73和77属于被照明的第三样品点，并且最后的点74和78属于被照明的第四样品点。示意性地示出了像素69。实际上，像素能够更小，从而使光点71至78与更多数量的像素重叠，例如9个像素。因为在光谱选出平面48中借助操纵装置49，尤其是微镜阵列能够针对每个单个的被照明的扫描点单独地调整各个光谱分量的射回，所以光在点71至78的其中每个内能够具有不同的波长或不同的光谱范围，其中，光谱范围通过其光谱边界来限定，并且因此限定了其在光谱中的地位和其光谱宽度。这种情况在图4中通过点71至78的分别不同的阴影来示意性地示出。
事实上，利用单点激发能够实现的是，利用根据本发明的探测设备探测多达三个几乎能任意地选出的光谱通道，其中，其中两个通道能被在空间上分辨地探测到(所谓的光子重新分配的可能性)。
空间上的分辨率在此并不被理解为样品的空间上的分辨率。相反地，应该总是在空间上超扫描位于相同的部位上的PSF，即点扩展函数。因此，在该意义下，PSF在探测器空间中被空间上分辨地测量。
在用N个光谱激光点来激发样品时，能够进行对3×N个能调整的光谱通道的探测，其中，从而能够在空间上分辨地探测2×N个通道。还可能实现的是，用线传感器直接接收N个光谱。
活细胞相对于强烈的光入射具有特别高的敏感性。一方面，在此荧光染料被破坏。在此这称为照片漂白。另一方面，可能发生对细胞的直接损伤，例如，受到通过多光子过程引起的对DNA的破坏。这些过程通常较少地依赖于光剂量而更多地依赖于光学的最大功率或等效地依赖于强度。换句话说，光子通量或光子密度对于这些过程是至关重要的。有意义的信噪比(SNR)在生物成像中具有下限。另一方面，通常，图像采集速率应达到一定的值。因此，为了在给定的样品和给定的图像采集速率下达到特定的信噪比，通常提高了激发辐射的激光功率。出于所述的样品损坏的原因，这在活细胞中可能是有问题的。在这些情况下，应当能够实现的是，将显微镜切换到对样品特别友好的模式。如果不想在此放弃激光扫描显微镜的在高分辨率成像中存在有光学切片(光学“切片”)的可能性的优势，则唯一的可行方案是尽可能强烈地并行化采集。本发明实现了这一点。
因此，在探测设备中的切换元件，即能调节的反射镜22再次被调整到第二射束路径2上，即运动进入到光路中(双箭头23)。此外，在光路中导入微透镜阵列16(双箭头17)。在此，针对使用了经由光谱选出平面48的第一射束路径1的光谱分辨的共焦多点显微镜，使用到同一多透镜结构16，就像针对现在所述的高并行化的扫描显微镜那样。重要的只是，多透镜结构16的微透镜的数量相应于待测量的焦点(测量光点)的最大数量。此外，多透镜结构16确定了焦点的间距，也称为“节距(pitch)”。这被与多射束照明相协调地进行。
图5中示意性地示出了针对高并行化的多点扫描显微镜的探测情况。在此，多个光斑点79落在位置分辨式探测器68上，这些光斑点分别属于样品中的不同的被照明的方位。与使用到经由光谱选出平面48的第二射束路径的光谱分辨的多点扫描显微镜相比，光斑点59通常不具有被有针对性地调整的光谱型廓。相反地，光斑点49的光谱组成是由分别被照明的样品点对入射光的各自的光谱响应所得到的。在此，还示意性地示出了像素69，并且实际上像素能够更小，从而使光点79与更多数量的像素重叠，例如9个像素。
当然，对于每个应用情况必要的是，将具有相应的几何形状的激发场射入到样品中。例如，在高并行化的多点扫描显微镜的情况下，必须将具有各个焦点的正确间距的合适的照明图案射入到样品上。这能够以原则上不同的方式来实现。一方面，能够用多点图案进行显微镜的直接照明。此外也能够实现的是，在能够在激光扫描显微镜中例如位于主分色器与扫描物镜之间的静止的光瞳中，利用空间光调制器(SLM)来切换相应的图案。例如，也能够使用所谓的达曼光栅。
附加地，也能够在高并行化的多共焦激光扫描显微镜中的分别不同的区域中激发不同的波长并且探测分别在这些区域中被激发的放射。
除了线性荧光激发之外，在迄今所述的方法变型方案中，荧光的多光子激发也是可能的。
最后，根据本发明的设备100也可用于直接成像。这将结合图6进行阐述。在那里示意性地示出了细胞组合80到位置分辨式探测器68的像素69上的成像。在此，所有传感器像素69都是有效的。为了扩大观察区域，能够使用显微镜的机械扫描仪显示样品的其他的区域。为了直接成像，微透镜结构16必须在射入平面10中的针孔之前和之后移出光路(双箭头17)，并且针孔本身必须被张开到直接成像的场的大小。可变的反射镜22在此被如下这样地调整(双箭头23)，即，使光不经由光谱选出平面48引导，而是经由第二射束路径2引导到位置分辨式探测器68上。在此，该结构的固有对称性被充分利用，该对称性在于，可变的反射镜22针对一方面从在光谱选出平面48中的操纵装置49回来的光和针对另一方面等效地来自针孔平面10的光的定位。以如下方式将可变的反射镜22导入到光路中，即，使光不经由光谱选出平面48引导，而是来自针孔平面10地直接转向到位置分辨式探测器68上，这导致针孔平面10在位置分辨式探测器68上成像。然而，由于针孔10本身在相对于样品的共轭的平面中，所以提供了对样品的直接成像。这现在能够实现的是，利用根据本发明的探测设备灵巧地实现了所有可能的宽场探测方法。图6在此示出了强度分布的简单图示。在这种情况下，样品当然必须用相应的较大的场来照明，这能够用常规的宽场照明来实现。然而，更好的是如下的照明分布，其尽可能刚好相应于所成像的场并且相应地在样品上扫描。为此，原则上只需相应的光场经由主分色器和扫描仪射入到样品上，并且在其上进行扫描或扫描。
因此，对样品的照明必须与分别使用的显微镜检查方法相匹配。因此，针对共焦的运行模式，将激光射束聚焦到样品中，并且使该聚点在样品上扫描。针对宽场探测，必须在样品中的小场上进行相应的激发。被照明的场应在此相应于成像到传感器上的面积的大小。为了扫描更大的图像，必须利用机械扫描仪将小视场在样品上运动。为此，必须如下这样地设计激光扫描系统的光学器件，即，使它能够运输/传播一定的视场。这在光学上意味着系统必须具有一定的光导率。
除了强度的简单图示之外，还能够实现利用基于结构化照明(SIM，StructuredIllumination Microscopy，结构化照明显微镜)的另外的方法。在探测侧，这完全如上面参考图6所述的那样工作。区别仅在于不同的照明。在直接成像的情况下，除了示出了位置分辨的强度之外，还能够测量另外的参数。例如，能够利用SPAD阵列传感器(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)，由于非常高的读出速度，也能够测量荧光寿命。因此，实现了作为FLIM(Fluorescence lifetime imaging microscopy，荧光寿命成像显微镜)所公知的显微镜检查方法的速度的显着提高。此外，例如能够使用分子发射的相互关系用于提高光学分辨率。这例如通过所谓的SOFI方法完成。
因此，本发明提供了一种可用于多种微观方法的新型的光学组件。与根据现有技术的共焦显微镜相比，现在也能够采集一定的视场。在此，探测设备既能够用于借助有利的空间超扫描来进行的共焦显微镜检查的标准方法的探测，而且另一方面能够用于宽场式的探测。由此能够实现的是，采集到具有多个光谱通道的共焦图像。在另外的应用中，也能够进行对多点场的高并行化的采集，以便对活体样品进行特别温和的显微镜检查。最后，能够通过如下方式充分利用传感器的二维表征，即，采集在样品上扫描到的小的宽场图像。在此，结合照明，可执行不同的宽场式的方法。
因此，本发明提出了一种光学结构，其以这样的方式能够实现对射束路径的简单转换，即，能够在具有能调整的光谱特征的中等并行化的多焦点运行方式与具有相对高的并行化度的多焦点的运行方式之间转换到仅一个传感器上。此外，通过从检测光路移出，也就是移除分段的光学器件(多透镜或微透镜结构)，也能够进行宽场探测。在探测光路中，仅最多两个选出元件，优选是在探测单元中的反射镜以及必要时的多透镜或微透镜结构，被切换向针孔平面以用于在这两个模式之间切换。
为了将中等并行化的光谱分辨的多共焦显微镜转换成高并行化的显微镜，在简单的情况下只需要切换一个反射镜。
因此，根据本发明的探测设备允许在具有或没有光子重新分配、高并行化的多点扫描和直接成像的情况下进行共焦的多点扫描。
附图标记列表
1 第一射束路径
2 第二射束路径
5 坐标系
10 孔板平面(针孔平面)、射入孔板
12 第一聚光透镜
14 第一聚光透镜后的探测射线束
16 能调节的多透镜结构
17 双箭头：能调节的多透镜结构的运动
18 多透镜阵列后的探测射线束
20 第二聚光透镜
22 能调节的反射镜
23 双箭头：能调节的反射镜的运动
24 第二聚光透镜后的探测射线束
26 棱镜
28 棱镜后的探测射线束
30 第三聚光透镜
32 第三聚光透镜后的探测射线束
34 第一发散透镜
36 第四聚光透镜
42、44、46 第四聚光透镜后的光谱分裂的子射束
43、45、47 由微镜阵列49反射的子射束42、44、46
48 光谱选出平面
49 光谱选出平面中的微镜阵列
50、51、52 微镜阵列49的微反射镜
53 箭头：穿过光谱选出平面的探测光
54 从光谱选出平面射回的探测光
56 重新穿过棱镜后的探测光
57 反射镜(固定设定)
58 第五聚光透镜
59 第五聚光镜头后的探测光
60 第二发散透镜
62、64 第二发散透镜后的探测光
66 第六聚光透镜
67 探测平面
68 位置分辨式探测器
69 位置分辨式探测器的像素
70 位置分辨式探测器的被动设定的区域
71～78 探测子射束的光谱分裂的光斑
79 高并行化的共焦运行下的光斑
80 宽场图像
100 根据本发明的探测设备

Claims (28)

1.用于显微镜的、尤其是共焦扫描显微镜的探测光的光学组件，所述光学组件具有：
用于被待测量的探测光(11)穿过的射入平面(10)以及
布置在所述射入平面下游的用于将所述探测光(11)引导到探测平面(67)中的探测光路，
其中，所述探测光路具有至少一个第一射束路径(1)，所述第一射束路径具有第一光学射束引导器件，尤其是第一透镜和/或反射镜(20、30、34、36、58、60、66)，用于将所述探测光(11)传导到所述探测平面(67)中，
其特征在于，
在所述第一射束路径(1)中存在有用于对所述待测量的探测光(24)在空间上进行光谱分裂的至少一个色散装置(26)，
在所述第一射束路径中存在有用于对在空间上进行了光谱分裂的探测光(42、44、46)进行操纵的操纵装置(49)，并且
所述第一光学射束引导器件(20、30、34、36、58、60、66)与所述色散装置(26)和所述操纵装置(49)一起被布置并设立成用于产生所述射入平面(10)到所述探测平面(67)中的光谱分离且衍射受限的成像。
2.根据权利要求1所述的光学组件，
其特征在于，
所述探测光路具有第二射束路径(2)，所述第二射束路径具有第二光学射束引导器件，尤其是透镜和/或反射镜(56、66)，用于将所述探测光(11)传导到所述探测平面(67)中，
所述第二光学射束引导器件(20、22、58、60、66)被布置并设立成用于产生所述射入平面(10)到所述探测平面(67)中的衍射受限的成像，并且
存在有用于为所述待测量的探测光选出所述第一射束路径(1)或所述第二射束路径(2)的选出装置(22)。
3.根据权利要求1或2所述的光学组件，
其特征在于，
在所述探测平面(67)中存在有至少一个位置分辨式探测器(68)、尤其是分段的探测器，用以测量所述探测光(11)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
在所述射入平面(10)中布置有射入孔板、尤其是共焦针孔，用于使待测量的探测光(11)进入。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
所述选出装置(22)是能调节的反射镜，尤其是，所述能调节的反射镜尤其能运动进入到所述探测光路中并能从所述探测光路运动出来(23)。
6.根据权利要求5所述的光学组件，
其特征在于，
所述能调节的反射镜(22)能运动进入到所述探测光路的经准直的部分中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
所述操纵装置(49)具有光谱选出平面(48)，在所述光谱选出平面中布置有尤其是能调节的射束偏转器件(50、51、52)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
所述光谱选出平面(48)处于不同于所述探测平面但与所述探测平面(67)光学共轭的平面中。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
所述操纵装置(49)、尤其是光谱选出平面(48)中的射束偏转器件(50、51、52)通过微镜阵列、SLM(空间光调制器)、DMD(DMD＝数字微镜器件)和/或MEMS(MEMS＝微电子机械系统)形成，或者就是微镜阵列、SLM(空间光调制器)、DMD(DMD＝数字微镜器件)和/或MEMS(MEMS＝微电子机械系统)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
在所述光谱选出平面(48)下游布置有至少一个第二探测器，用于指示穿过所述光谱选出平面(48)的探测光。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
所述色散装置(26)是棱镜。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
从所述操纵装置(49)射回的探测光(43、45、47)在所述第一射束路径(1)中沿相反的方向重新穿过所述色散装置(26)，尤其是使得射回的探测光在以相反的顺序穿过所述色散装置之后不具有明显的色差，并且使得针孔或点发射器在样品中的衍射受限的成像成为可能。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
位置分辨式探测器(68)和/或位置分辨式第二探测器尤其是能冷却的SPAD探测器(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
位置分辨式探测器(68)和/或位置分辨式第二探测器由多个光电倍增器形成，所述探测光尤其是经由光纤束被输送给所述多个光电倍增器。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
位置分辨式探测器(68)和/或位置分辨式第二探测器是半导体探测器、尤其是CCD或CMOS探测器。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
位置分辨式探测器(68)和/或位置分辨式第二探测器是具有前置的图像放大器的、尤其是前置的多通道板的相机。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的光学组件，
其特征在于，
存在有至少一个、尤其是二维的多透镜结构(16)，并且
存在有调节装置(17)，以便将所述多透镜结构(16)运动进入所述探测光路中及从所述探测光路中运动出来。
18.用于在使用根据权利要求1至17中任一项所述的光学组件的情况下进行显微镜检查的方法，在所述方法中执行以下步骤：
在照明光路中以照明光照射显微镜、尤其是共焦激光扫描显微镜中的样品，
将样品由于以照明光照射而射出的待测量的探测光(11)、尤其是荧光聚光，
将所述待测量的探测光(11)传导穿过所述光学组件(100)的射入平面(10)、尤其是射入孔板，并且
利用至少一个布置在所述光学组件(100)的探测平面(67)中的探测器(68)来测量所述探测光(11)。
19.根据权利要求18所述的方法，
其特征在于，
为了光谱分辨的多点扫描显微镜检查，利用所述照明光的多个光点、尤其是利用位于一条线中的光点同时对所述样品进行扫描，
其中，在探测光路中在所述射入平面(10)下游定位有多透镜结构(16)，并且所述多透镜结构(16)的透镜的数量至少与所述照明光的用来对所述样品进行扫描的光点的数量一样多，
利用选出装置(22)为所述待测量的探测光(11)选出第一射束路径(1)，
将所述探测光的源自所述照明光的各个光点的光束在空间上进行光谱分裂，并将这样得到的射线束(42、44、46)利用尤其是在光谱选出平面中的操纵装置(49)来操纵，并且
探测被操纵的射线束。
20.根据权利要求19所述的方法，
其特征在于，
对源自所述照明光的各个光点的射线束的针对所述光点中的至少一个光点、尤其是所有光点的操纵是对至少一个、尤其是唯一的光谱分量的选出。
21.根据权利要求19或20所述的方法，
其特征在于，
被操纵的射线束(43、45、47)沿相反的方向再次穿过第一射束路径(1)中的色散装置(26)。
22.根据权利要求18所述的方法，
其特征在于，
为了直接成像(宽场显微镜检查)，将样品至少在视野范围内同时以照明光照射，
利用选出装置(22)为所述待测量的探测光(11)选出第二射束路径(2)，其中，将视野范围成像到位置分辨式探测器(68)上，并且其中，所述探测光路没有多透镜结构(16)。
23.根据权利要求22所述的方法，
其特征在于，
在所述样品上对所述视野范围进行扫描。
24.根据权利要求18所述的方法，
其特征在于，
为了高并行化的多点扫描显微镜检查，以所述照明光的尤其是布置在二维图案中的多个光点同时对所述样品进行扫描，
其中，在所述探测光路中在所述射入平面(10)下游定位有尤其是二维的多透镜结构(16)，并且所述多透镜结构(16)的透镜的数量至少与所述照明光的用来对所述样品进行扫描的光点的数量一样多，
利用选出装置(22)为所述待测量的探测光(11)选出第二射束路径(2)，
对所述探测光(79)的源自所述照明光的各个光点的光束进行探测。
25.根据权利要求24所述的方法，
其特征在于，
为了在所述照明光路的光瞳平面中进行照明而定位有衍射用的元件，尤其是SLM(空间光调制器)或达曼光栅。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，
其特征在于，
其中，使用尤其是受冷却的SPAD探测器(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)来作为位置分辨式探测器(68)。
27.根据权利要求26所述的方法，
其特征在于，
在SPAD阵列(68)(SPAD＝单光子雪崩光电二极管阵列)中，仅运行那些被用于分别所需的信号生成的像素。
28.显微镜、尤其是共焦扫描显微镜，所述显微镜具有照明光路，具有至少一个显微物镜、根据权利要求1至17中任一项所述的光学组件以及至少一个布置在光学组件(100)的探测平面(67)中的探测器(68)。
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