CN117120908A

CN117120908A - 用于高分辨率地检查样本的方法和光学显微镜

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Publication number: CN117120908A
Application number: CN202280025154.9A
Authority: CN
Inventors: R·施密特; B·哈尔克; M·罗伊斯; L·卡斯特鲁普
Original assignee: Aberina Instrument Co ltd
Current assignee: Aberina Instrument Co ltd
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2023-11-24
Also published as: WO2022200549A1; EP4288821A1; DE102021107704A1; DE102021107704B4; US20240085680A1

Abstract

本发明涉及一种用于对样本(6)进行光学显微镜检查的方法，特别是借助于激光扫描显微术或MINFLUX显微术来进行光学显微镜检查的方法，其中检测样本(6)或样本(6)中的对象相对于光学显微镜(26)的漂移并在必要时进行校正。特别地，本发明涉及一种用于借助于激光扫描显微术或MINFLUX显微术检查样本(6)的相应方法。为此，在样本中存在参考标记物(8、13)，根据MINFLUX原理重复确定参考标记物的位置，以确定漂移。

Description

用于高分辨率地检查样本的方法和光学显微镜

发明的技术领域

本发明涉及用于对样本进行光学显微镜检查的方法，其中检测样本或样本中的对象相对于测量装置的漂移并在必要时进行校正。特别地，本发明涉及用于借助于激光扫描显微术(Mikroskopie)或MINFLUX显微术检查样本的相应方法以及实施该方法的光学显微镜。

在MINFLUX显微术中，通过用激发光的、具有局部强度最小值的光分布在多个位置处扫描粒子来确定单个粒子(主要是荧光染料的单个分子)的位置。根据单个粒子的位置，可以创建样本的高分辨率图像或粒子轨迹。由于MINLFUX显微术的空间分辨率可以实现直至个位数的纳米范围，因此MINLFUX显微术特别依赖于样本的稳定性或样本中被检查对象相对于显微镜的测量装置的稳定性。即使是最小的位移也会导致定位的不准确性，并导致根据粒子位置创建的图像出现运动模糊。

在仪器方面通过适当的机械设计并通过选择热膨胀系数小的材料，可以减少因热膨胀而导致的样本相对于显微镜的缓慢漂移。然而，这些措施需要大量的技术工作，并且不能完全防止样本的漂移，尤其是不能在较长的测量时间内完全防止样本的漂移。特别地，所提到的建设性措施不足以满足使用高分辨率显微镜方法时所需的几纳米范围内的稳定性要求。因此，为了能够校正漂移，特别是通过补偿或数据校正来校正漂移，人们对精确检测出现的漂移特别感兴趣。在此，漂移的检测应尽可能少地影响样本的实际检查。

现有技术

文献WO 2015/097000 A1和Balzarotti F、Eilers Y、Gwosch KC、AH、Westphal V、Stefani FD、Elf J、Hell SW等人的出版物“Nanometer resolution imagingand tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes,Science 2017Feb 10；355(6325):606-612.doi:10.1126/science.aak9913.Epub 2016 Dec 22.PMID：28008086”描述了一种用于定位空间上隔离的荧光分子的方法(现在被缩写为MINFLUX)，其中在不同扫描位置处用激发光的、具有强度最小值的强度分布照射每个单个分子。对于每个照射位置，记录由激发光激发的荧光发射，并且根据荧光强度沿着强度最小值的位置的路线来推断相应分子的位置。从本质上讲，这种位置确定会有误差，但可以通过迭代应用该方法来减少位置确定的误差。为此，在每个迭代步骤之前调整照射位置，即将照射位置布置得更接近分子的各个假定位置。同时，增加激发光的强度，使得强度梯度在强度最小值附近增加。可替代地，可以增加测量持续时间，这相当于从有效光量方面增加激发光的强度。使用调整后的参数，在每个调整后的照射位置处依次照射分子，并记录荧光发射的强度。现在，根据荧光信号对强度最小值的扫描位置的依赖性，可以以比先前更小的误差来确定分子的位置。可以重复这些方法步骤，直到位置确定收敛或者直到达到另一个中断标准，例如事先确定的最大可接受误差。根据现有技术的MINFLUX方法的可实现的定位精度约为1nm，是最精确的商用荧光分子定位方法。

文献WO 2015/097000 A1进一步公开了可以从单个分子的位置数据获得样本中分子分布的(高分辨率)图像(“MINFLUX成像”)。该方法对应于从STORM显微术和PALM显微术中已知的用于根据单个荧光分子的多个位置确定来生成高分辨率图像的方法，但在MINFLUX显微术的情况下，图像的空间分辨率进一步提高了5nm。

在DE 10 2017 104 736 B3中描述了一种MINFLUX方法的变型，其中孤立存在的荧光染料分子的扫描不是通过用激发光的、具有局部强度最小值的强度分布进行照射来进行的，而是用激发光和荧光阻抑光的两个基本上互补的强度分布进行照射来进行的。在此，激发光的强度分布具有局部强度最大值，而荧光阻抑光的强度分布在同一位置具有局部强度最小值。具体来说，荧光阻抑光可以是STED光，该STED光通过触发受激发射来防止被激发的荧光染料分子在激发光的强度分布的边缘区域中发出荧光光子。在该方法的实施方式中，激发光和荧光阻抑光以这样的强度分布叠加，在RESOLFT显微术和STED显微术中也是如此。在MINFLUX方法的变型中利用了以下事实：针对相应的荧光染料分子记录的荧光强度取决于该荧光染料分子与荧光阻抑光的局部强度最小值的距离，并且可以根据针对荧光阻抑光的强度最小值的多个位置记录的荧光强度，来高精度地确定该荧光染料分子的位置。同样，在MINFLUX方法的这种变型中，可以将局部强度最小值定位在样本中的几个位置处，并且可以根据如在MINFLUX显微术中相同的原理来对所记录的荧光强度进行评估。然而，不同之处在于，在MINFLUX显微术中，荧光标记物的荧光强度随着其位置与局部强度最小值的位置的距离的增加而增加，而在进一步的光是荧光阻抑光的方法的实施方式中，荧光强度随着距离的增加而减小。

从STORM显微术和PALM显微术中可以了解到，待成像的样本在数据采集过程中会相对于显微镜系统运动，这会影响定位精度。在图像重建过程中，这会导致运动模糊和模糊的(verwaschen)图像。与高定位精度相对应地，当根据MINFLUX方法定位分子时，这个问题会更加严重。在这里，样本和显微镜系统之间可接受的相对运动在1nm或更小的范围内。

现有技术中，特别是关于STORM显微术和PALM显微术的现有技术，已知各种样本稳定的方法，其中提出了在数据采集的持续时间期间重新调整样本位置或随后对图像数据进行校正。

从DE 199 59 228A1已知一种具有温度传感器的激光扫描显微镜，其中通过根据相应的当前温度的校准曲线所测定的校正值来跟踪焦点位置。然而，该方法仅限于轴向(即，聚焦)热漂移的校正。

在EP 1 548 485 A1中，提出了一种方法和一种执行该方法的显微镜，其中在不同时间点采集优选不运动的对象的图像，其中使用运动估计器来计算图像采集之间的漂移，其中通过对图像的相应块(以及必要时子块)的比较来进行漂移识别。然后，可以将为各个块测定的漂移计算成总漂移。实际的校正可以通过图像数据的后续处理或通过在图像采集期间跟踪光束位置或样本位置来进行。

R.McGorty、D.Kamiyama、B.Huang的“Active microscope stabilization inthree dimensions using image correlation”，Optical Nanooscopy 2(1),3(2013)公开了一种方法，其中通过跟踪压电驱动的样本台来补偿样本漂移，样本台在x和y方向上的漂移不超过10nm，在z方向上的漂移不超过20nm。在此，样本漂移是通过样本的透射光图像与参考透射光图像的互相关性(Kreuzkorrelation)来确定的，其中x和y方向上的漂移由互相关性的最大值的位置确定，以及z方向上的漂移由互相关性的振幅确定。为了采集透射光图像，用不会影响荧光成像的红外光来透射样本。

从J.Prescher的“Assembly and optimization of a super-resolution STORMmicroscope for nanoscopic imaging of biological structures”，Dissertation,München(2016)中，已知一种在PALM显微术/STORM显微术中进行横向漂移校正的方法，将荧光纳米粒子作为参考对象引入到样本中。为了确定样本在x和y方向上的漂移，在STORM数据采集过程中重复采集这些纳米粒子的落射荧光图像(Epifluoreszenzbilder)，并将其与最初采集的参考落射荧光图像进行关联。根据互相关性的最大值的位置，确定相应时间点的x和y方向上的漂移，并用于在定位荧光单分子时的位置校正。

从C.Geisler等人的“Drift estimation for single marker switching basedimaging schemes”，Optics Express 20,7274(2012)中，已知一种在STORM显微术/PALM显微术中进行漂移校正方法，该方法也是基于多个相机(原始)图像的相关性，但在这种方法中，样本漂移作为时间的函数是通过所有相机(原始)图像的成对相关性来确定的，而不仅仅是通过与单个参考图像的相关性来确定的。无需对漂移的原因或类型做出任何其他假设，或无需修改数据采集，就可以显著提高单分子定位的精度。

发明任务

本发明基于以下目的，即给出一种用于检查样本的方法和光学显微镜，其中在检查样本期间，检测样本或样本中的对象相对于测量装置的漂移并在必要时进行校正。在此，检测和校正也必须满足MINFLUX显微术的精度要求，并应尽可能少地影响对样本的检查。

解决方案

本发明的任务通过根据独立权利要求1的方法和根据独立权利要求33的光学显微镜来解决。从属权利要求2至31涉及该方法的优选实施方式，从属权利要求32涉及样本载体在根据本发明的方法中的应用，以及从属权利要求34涉及光学显微镜的优选实施方式。

发明描述

本发明涉及用于对样本进行光学显微镜检查的方法，其中在多个照射位置处用聚焦激光照射样本并且探测来自样本的光学信号。在此，使用聚焦激光对样本进行检查可以根据广泛的成像模式进行，例如使用共焦激光扫描显微术、STED显微术或根据MINFLUX方法定位样本中的单个粒子。其特征在于，用聚焦激光照射样本并且基于位置且必要时以高空间分辨率探测光信号，因此容易因样本漂移而导致伪造

因此，根据本发明，通过根据MINFLUX原理重复确定至少一个参考标记物的位置来检测样本的漂移，其中将对参考标记物的位置确定集成到对样本的检查的测量过程中并在连续照射位置处对样本进行照射之间重复地进行。特别地，该方法可以在长时间(例如，数小时或数天)内跟踪并补偿样本的漂移。原则上，该方法(与一些可替代方法不同)不限于二维的漂移检测，而是可以选择性地应用在一个、两个或三个空间方向上。

用于对至少一个参考标记物进行位置确定的MINFLUX方法的特征在于，在参考标记物的(假定)位置周围的多个扫描位置处用扫描光的、具有局部最小值的强度分布照射参考标记物，其中扫描光诱导或调制参考标记物的光发射。在此，扫描位置布置在(例如根据先前的测量)至少大致已知的参考标记物位置周围的近距离范围内(通常在一个艾里斑(Airy-Scheibe)内)。根据在不同扫描位置处记录的光发射，可以例如通过形成加权矢量和以提高的精度来确定参考粒子的位置。扫描位置可以由扫描光逐步照射，或者扫描位置可以位于一曲线上或者限定一路径区段，沿着该曲线或路径区段通过相对于样本连续移动激发光束来照射样本。在第二种情况下，可以限定在激发光束的连续移动期间的时间间隔(停留时间)，借助于该时间间隔，将探测器探测到的光子与特定的扫描位置相关联，这与例如共焦激光显微术中的连续线扫描类似。样本位置布置在参考标记物的假定位置周围，这意味着扫描位置位于围绕假定位置的圆形或球体(例如，上述近距离范围)内。当然，这也包括仅两个扫描位置，这两个扫描位置例如位于与假定位置相交的线的相对两侧。

MINFLUX方法的具体设计可以在许多方面有所变化，对此还可以参考MINFLUX显微术的现有技术，这里仅以以下公开物为例参考：K.C.Gwosch等人的(2019)“MINFLUXNanoscopy Delivers Multicolor Nanometer 3D-Resolution in(Living)Cells”，bioRxiv doi：10.1101/734251和M.Weber等人的(2020)“MINSTED fluorescencelocalization and nanoscopy”，bioRxiv doi：10.1101/2020.10.31.363424。因此，在本发明的当前说明书和专利权利要求的意义上，术语MINFLUX方法应被广义地解释并且应当包括至少具有上述(以及必要时其他的)特征的所有实施方式。

用于定位参考标记物的光发射类型可以有很大不同，特别地可以是荧光或磷光、瑞利散射光或拉曼散射光、CARS散射光(相干反斯托克斯拉曼散射)或者通过扫描光的倍频(二倍频、三倍频等)或通过与扫描光的混频产生的光发射。根据本发明，扫描光适于激发或诱导参考标记物的相应光发射类型或调制其强度，其中调制可以对光发射的强度产生放大或减弱的作用。如果扫描光具有调制作用并且其本身不激发或者诱导参考标记物的光发射，则需要另外用激发光照射参考标记物。例如，荧光参考标记物可以用激发荧光的扫描光来扫描。然而，扫描光也可能触发受激发射，从而抑制参考标记物的自发(荧光)发射；在这种情况下，必须用额外的激发光来激发参考标记物使其发出光发射。

特别地，参考标记物是光稳定的。这意味着在光学显微镜实验的期望时间段内，参考标记物的光发射基本保持不变。特别地，参考标记物在期望时间段内也不会漂白，并且参考标记物在期望时间段内也不会出现暗态。适当的时间段可以根据实验要求而有所不同。例如，对于长期测量来说，可能需要几小时到几天的时间段。然而，对于某些实验，小于一秒、一毫秒或甚至一微秒的时间段可能就足够了。

在根据本发明的方法的优选实施方式中，通过使用激光扫描方法(例如，借助于共焦显微术或STED显微术)采集样本的图像来对样本进行检查。在这些情况下，通常通过使用聚焦激发光逐行扫描样本来进行图像采集，在STED显微术的情况下，还要用叠加在聚焦激发光上的STED光的、具有局部最小值的强度分布来实现。在这种情况下，可以定期地中断扫描，例如在扫描了预定或可预定数量的扫描行之后，或者以固定的时间间隔中断扫描，以便根据MINFLUX方法对参考标记物进行位置确定并测定漂移。然后，考虑到所测定的漂移，通过对扫描的校正控制来继续样本的扫描。为了完全消除漂移对样本图像的影响，漂移校正的精度必须超过激光扫描方法的空间分辨能力，理想情况下是≥2倍。由于MINFLUX方法的分辨率本身就比激光扫描高得多，因此通常可以满足这一要求。

在根据本发明的方法的另一优选实施方式中，不仅对参考标记物进行位置确定，而且还使用MINFLUX方法对样本进行检查。为此，除了参考标记物之外，样本还包含可以使用MINFLUX方法定位的其他粒子，这些粒子也具有荧光特性或光散射特性，但可与参考标记物区分开。在许多应用中，这些粒子是荧光染料的单个分子，荧光染料用于标记样本中感兴趣的结构。在此，荧光染料适用于标记，荧光染料除了荧光状态外还具有非荧光状态，并且荧光状态的染料分子与非荧光状态的染料分子的比例可以调节，使得在任何时间点，每个衍射极限体积仅存在单个染料分子处于荧光状态，从而可以对单个分子进行独立定位。荧光染料分子和非荧光染料分子之间的比例可以通过调整介质的化学成分来调节，或者也可以通过光诱导来调节；为此，技术人员可以参考PALM/STORM显微术和MINFLUX显微术的现有技术。

在该实施方式中，在检查样本时首先收集被定位的粒子的坐标，然后可以根据这些坐标确定样本的高分辨率图像和/或单个粒子的轨迹。在此，一方面可以通过根据对参考标记物的位置确定测定的漂移的量对样本进行跟踪，来进行漂移校正。然而，也可以纯计算地通过漂移的量校正粒子坐标，因此就不必跟踪样本了。例如，在这种情况下，经漂移校正的图像已经可以在测量期间作为实时图像显示在显示单元上。

如果根据MINFLUX方法对样本进行检查，则漂移校正的精确度必须高于定位单个粒子的精确度，以对样本进行检查。为了完全消除漂移对定位的影响，应将精确度提高到≥2倍。由于样本的检查和样本的漂移确定都是使用MINFLUX方法进行的，因此二者与方法相关的空间分辨能力是相同的。然而，MINFLUX中相应的定位精度取决于多个采集参数，特别是定位迭代次数、扫描位置的相应排列以及扫描光的强度。由于参考标记物的光稳定性远高于单个染料分子，因此可以以更高分辨率对参考标记物进行定位。

当根据MINFLUX方法对样本进行检查时，在照射位置处用扫描光照射样本以定位荧光团之间(即，在MINFLUX定位序列期间)当然不必中断测量，但也可以在中断测量并对参考标记物进行位置确定之前，对荧光团进行整体定位或甚至对多个不同荧光团依次进行定位。

根据本发明的方法的特别有利的实施方式是，将用于检查样本的激光同时(即在同一测量中)用作用于确定参考标记物的位置的扫描光。如果出于借助于MINFLUX显微术或STED显微术检查样本的目的，无论如何会生成激发光或STED光的、具有局部强度最小值的强度分布，则激光的这种双重使用特别有用。在这些情况下，同一光束偏转装置(其被设置用于借助于MINFLUX显微术或STED显微术检查样本)也可以通过适当的控制用于将激光引导至样本中的参考标记物上，该参考标记物的位置根据MINFLUX原理来测定，并通过重复这样的位置确定来检测漂移。这种漂移检测(以及必要时的漂移校正)的实现可以轻松地集成到样本检查的序列中，并且不需要任何额外的光学或机械组件。因此，与需要附加光束路径、光源和/或探测设备的可替代解决方案相比，其结构更简单且经济上有优势。然而，一个更重要和基本的优势在于，该方法精确检测了参考标记物相对于用于检查样本的光学成像系统的漂移。这就是漂移检测与漂移检测的可替代方法的不同之处，在可替代方法中通常需要额外的光源、光学元件、单独的光束路径和探测器或其他传感器，并且在可替代方法中，要探测样本、样本载体或显微镜部件与用于漂移检测的附加元件之间的漂移。因此，以这种方式不能检测用于漂移检测的这些附加元件和用于检查样本的光学成像系统之间可能存在的漂移。

特别地，在上述扫描光的双重使用中，扫描光在焦点处具有与用于检查样本的激光相同的光分布(例如，环形光分布或局域空心状光分布)。在MINFLUX方法的变型中，其中用高斯激发光分布和具有局部最小值的荧光阻抑光分布之间的叠加来照射样本，荧光阻抑光特别是同时用于检查样本的扫描光。这样，在对参考标记物进行位置确定和对样本进行检查时，焦点处的光分布都是相同的。

使用激光作为扫描光来检查样本可以例如用光散射纳米粒子(例如，金珠)而被简单地实现，因为这些纳米粒子会散射宽波长范围的光，因此特别地也可以针对样本中的荧光团使用各种类型的激发激光器，以产生光散射信号。

在该方法的优选实施方式中，根据至少一个参考标记物的位置来计算参考标记物相对于显微镜的光学成像系统的漂移，并且通过光束偏转单元的位置校正或通过跟踪样本来补偿该漂移。例如，可以通过将偏置电压(Offsetspannung)加到控制光束偏转单元或样本定位台的位置的控制电压，或者通过将相应的偏置加到数字可用的位置值来实现。

如前所述，参考标记物的位置确定集成到检查样本的测量过程中，并且在连续照射位置处对样本进行照射之间重复进行。在此，可以以规则的时间间隔或者在固定数量的照射位置之后确定至少一个参考标记物的位置。然而，如有必要，也可以不以固定间隔或不完全以固定间隔进行位置确定，而是根据样本的相应漂移速度进行调整。在将样本放入显微镜中或在(手动)移动样本之后，这个过程尤其有用，因为最初会导致相对较快的样本漂移。在此阶段中，以较短的间隔确定参考标记物的位置，而在放好样本之后，漂移速度会降低，可以增加位置确定之间的时间间隔。为此，根据位置测定计算漂移曲线，并通过外推该漂移曲线来确定样本已经漂移了预定的最大可接受量的时间点。为此，例如可以通过指数衰减的指数函数来对漂移进行建模。

调整参考标记物的位置确定的时间间隔尤为重要，因为根据MINFLUX方法进行的位置确定具有有限的捕捉范围，即只有在扫描位置与参考标记物的实际位置的距离不太大的情况下，才有可能对参考标记物进行明确的位置确定。该捕捉范围通常在200nm左右，并且必须确保参考标记物在连续的位置确定之间不会离开捕捉范围。

然而，为了通过参考标记物的位置确定来重新确定漂移而中断样本检查的频率必须与为此所需的时间进行权衡。执行漂移确定的频率越高，与可用于实际检查样本成比例的测量时间就越少。特别是在动态变化的样本中，样本检查的频繁中断往往是不可接受的。因此优选地，漂移确定不超过总测量时间的5％的份额、优选2％的份额并且特别优选1％的份额。在特殊情况下，附加地使用另一种外部方法来进行漂移确定和/或漂移校正也是有利的；这种方法也可以基于位于样本中的参考标记物或其他调节变量。在此，如果用于漂移确定的外部方法本身不能实现长期稳定性，例如由于它本身的漂移速度相对于用于样本检查的光学系统要慢，这也是可接受的。在这种情况下，根据本发明的参考标记物的位置确定用于对用于漂移确定的外部方法进行零点校正，零点校正的时间间隔可以大于样本本身的漂移确定。

对于根据本发明的方法的可行性而言，关键是给定参考标记物的位置可以在较长的时间段内可靠地重复确定，即参考标记物仅经受非常小的退化或根本没有退化(例如，光漂白的形式)。对于较短的测量，如果参考标记物的位置确定可以重复100次或1000次就足够了，但对于几个小时甚至几天的长时间测量，需要多达10000次重复。

对参考标记物的另一要求是，参考标记物在每次位置确定时都处于发光状态，以便可以连续跟踪漂移。如果参考标记物暂时处于暗态(如有机荧光染料通常就是这种情况)，则在这些时间不可能进行位置确定。因此，可能会出现这样的情况：在参考标记物处于暗态的时间段期间，样本漂移太远以致于参考标记物离开捕捉范围。因此，理想情况是参考标记物没有暗态，但在测量期间处于不能诱导或激发出光发射的暗态的时间至少不超过10％，优选不超过5％。

由于稳定性要求，有机荧光染料的单个分子(例如，经常用于根据MINFLUX方法采集高分辨率图像或轨迹的有机荧光染料的单个分子)通常不适合作为用于根据本发明的方法的参考标记物。相反，优选地将掺杂有高稳定性的荧光团的纳米粒子，特别是掺杂有稀土金属铈、镨、钕、钐、铕、铽、镝、铒、铥和镱的离子或复合化合物的纳米粒子，考虑作为荧光参考标记物。这种纳米粒子具有极强的光稳定性。可替代地，荧光(半导体)量子点或具有荧光缺陷的纳米金刚石也适合作为荧光参考标记物。

参考标记物不一定必须是荧光的，也可以通过扫描光的(弹性或非弹性)散射来引起光发射。在这方面，金属纳米粒子或纳米棒也是优选的参考标记物，特别是因为在这些金属粒子上的光散射不受暗态的影响，并且这些粒子还具有高化学和光物理/光化学稳定性。在此，可以通过选择性地仅以一种偏振(其与扫描光的偏振正交)探测由参考标记物发射的光发射，来提高光发射相对于环境光或相对于不期望的光反射的对比度，例如光反射可能出现在光束路径中的光学界面处，特别是盖玻片的界面处。在此，利用了以下事实：当光在纳米粒子上散射时，通常会出现扫描光的去偏振或偏振状态变化。因此，去偏振的或偏振状态变化的散射光可以通过分析仪来探测，分析仪阻挡扫描光的偏振，从而使在界面上反射的扫描光隐退。通过在扫描光的光束路径中或在用于光发射的散射光探测器前面布置交叉线性偏振器，就可以实现该变型的简单实施方式。可替代地，可以使用偏振分束器将线性偏振扫描光反射到显微镜光束路径中。由于被参考标记物散射并在显微镜光束路径中在与扫描光相反的方向上传播的去偏振散射光相对于扫描光具有旋转的偏振分量，因此散射光的这些分量可以通过偏振分束器，并且可以通过在传输方向上布置在偏振分束器下游的探测器(选择性地)检测到，而在光束路径中的光学界面处反射的扫描光具有与入射扫描光相同的偏振，并在反方向上再次被偏振分束器反射出去。

样本中的光散射纳米粒子有时也用于其他样本稳定方法，例如在文献WO 2020/201430A1中描述的方法。这可能会产生协同效应。

一般而言，根据本发明的方法要求必须首先在样本中识别或寻找参考标记物并且至少大致确定参考标记物的位置。为此，可以在检查开始之前对样本或样本的一部分进行成像，并且可以在该图像中识别一个或更多个参考标记物并大致确定参考标记物的位置。可替代地，还可以通过用扫描光扫描式地扫描样本直到基于光发射探测到参考标记物，作为首次位置确定的一部分寻找参考标记物。然后，上次扫描位置可以用作根据MINFLUX方法对参考标记物进行位置确定的起点。在根据本发明的方法的优选实施方式中，基于参考标记物的光发射的波长，在样本中寻找和/或识别参考标记物。为此，参考标记物的光发射的波长必须不同于样本的其他光信号。例如，如果用荧光染料对样本进行染色，则其荧光发射相对于激发光的波长会发生红移(斯托克斯位移)，即其波长大于激发光的波长。与此相反，在相同激发光在参考标记物处发生(弹性)散射的情况下，产生散射光光信号，其波长与激发光的波长一致，因此即使使用相同的激发光来激发荧光并在参考标记物处发生散射，也可以基于波长将参考标记物与来自样本的荧光区分开来。

同样，可以基于光发射的光子通量的统计特征将参考标记物的光发射与从样本探测到的其他信号区分开来。用作参考标记物的金属纳米粒子上的光散射是瞬时的，而用于对样本中的结构进行染色的荧光染料的荧光电子激发态则根据指数衰减分布进行荧光衰减，衰减时间通常为几纳秒。因此，如果将时间分辨探测方法(例如，时间相关的光子计数法)用于光探测，如在荧光光谱学和荧光寿命成像(FLIM)的现有技术中所广为人知的，则散射光和荧光的时间分离是可能的。荧光参考标记物的光发射也可以与来自样本的其他荧光信号在时间上区分开，前提是这两个信号的荧光寿命彼此相差很大。

除了激发态的寿命之外，光子通量的其他统计参数也可以用于分离。如上所示，例如几乎所有荧光团都具有瞬时暗态，荧光团可以暂时过渡到瞬时暗态中。因此，即使在持续激发的情况下，荧光发射的光子通量也会被不发生荧光发射的阶段反复中断。发生荧光发射的通态(Ein-Zustand)的持续时间、不发生荧光发射的断态(Aus-Zustand)的持续时间以及通态持续时间期间发射的荧光光子的平均数量在很大程度上取决于相应荧光团的类型，因此也适合作为区分不同荧光团的参数。相应地，也可以基于这些参数来识别样本中的参考标记物以及与样本中的其他光源进行区分。

为了寻找参考标记物，必要时还可以利用以下事实：参考标记物产生基本上连续的光发射并且是位置固定的；相比之下，来自样本的荧光可能会随着时间发生更大的变化。特别地，如果使用MINFLUX方法检查样本，则不同组的空间上独立的染料分子在不同时间点被激活来进行定位。因此，样本中的荧光波动很大。然而，由于暗态和/或由于用荧光标记进行标记的样本中的结构的运动，也可能发生荧光波动。在这些情况下，由于参考标记物的光发射会累加，而其他源的荧光强度会被平均，并且相对于参考标记物的信号会减弱，因此可以通过按时间顺序采集的样本的多个图像的相关性(Korrelation)来识别参考标记物。对于用像素索引为i和j的两个(灰度)图像f₁和f₂，可以根据以下公式计算相关性振幅r_ij：

在这里，和/>是图像f₁和f₂的平均灰度值，求和是在图像的所有像素上进行的。对于两个以上的图像也可以以类似的方式计算相关性。可以通过由相关性振幅r_ij形成阈值来识别参考标记物，必要时还可以通过例如诸如形状和/或尺寸的形态标准来识别参考标记物。

虽然根据本发明的方法可以仅使用单个参考标记物(其位置被重复确定)来执行，但在实践中在多个参考标记物处进行位置确定通常是有利的。如果并行且单独地检测多个参考标记物的漂移，则可以通过求平均值来提高漂移确定的精度。另外，该方法还具有更强的稳健性，即使一个或更多个参考标记物例如由于光漂白等原因而无法进一步进行位置确定，也可以继续样本的检查。通过比较对多个参考标记物的位置确定，还可以识别参考标记物何时脱离其结合位点并相对于样本和其他参考标记物运动。多个参考标记物的独立位置确定还允许通过内插来根据多个参考标记物的漂移确定样本中(任何)点的漂移。由此，不仅可以检测并校正整个样本或样本中对象的相关漂移运动，还可以检测并校正样本中对象的形态变形。

即使在多个参考标记物处并行进行漂移确定，也不必在每次样本检查中断时确定所有这些参考标记物的位置；也可以交替定位多个参考标记物。在此，可以利用已确定位置的参考标记物的位置确定推断出其他未定位的参考标记物的位置。通过这种方式，未定位的参考标记物就可以保留在MINFLUX定位的捕捉范围内，以供后续的位置确定。

当交替地对不同参考标记物进行位置确定时，可以按固定顺序或随机序列来定位这些参考标记物。然而，在该方法的特别有利的实施方式中，基于聚焦激光的上次照射位置根据情况选择待定位的参考标记物。在此，可以选择最接近的参考标记物或者距上次照射位置的距离不超过预定量的参考标记物，该预定量优选为30μm，进一步优选为20μm，特别优选为10μm。在该实施方式中，使光束偏转的摆幅(Ausschlag)最小化，使得导致聚焦激光在样本中的定位时间很短，并且用于参考标记物的位置确定所需的时间保持得较低。

可以通过多种方式和方法用参考标记物来标记样本。在根据本发明的方法的优选实施方式中，通过将参考标记物附着到样本载体(特别是载片或盖玻片)上或样本载体中来对样本进行标记。为此，在将制剂施加到载片或盖玻片上之前，将荧光或光散射的纳米粒子化学结合到载片或盖玻片的表面上或通过静电相互作用进行固定。尽管这种类型的样本标记在实验室实践中很常见，但是以这种方式制备的样本在纳米粒子与表面的附着力方面并不总能提供令人满意的结果。此外，也很难设定样本中纳米粒子的所需密度，特别是很难设定它们的再现性。

因此，在生产期间已经设置有参考标记物的载片或盖玻片特别适合应用在根据本发明的方法中。在此，纳米粒子可以牢固地与载体材料连接，甚至嵌入其中。然而，不仅纳米粒子可以用作参考标记物，原则上所有可以使用MINFLUX方法在至少一个空间方向上定位的标记都可以用作参考标记物，即除了点状标记之外，还可以使用线状标记甚至平面标记作为参考标记物。在此，点状标记允许在三个空间方向上进行位置确定，直线标记允许在垂直于线延伸的方向上确定两个位置，而平面标记还允许垂直于平面的位置确定。

借助于机械雕刻或激光标记在材料上或材料中产生的结构以及在照射时形成散射中心的结构也适合用作参考标记物。光散射参考标记物也可以通过光刻结构化玻璃表面来制造。以这种方式制备的样本载体的主要优点在于，参考标记物可以按规则的排列和限定的间隔以可再现的方式布置，从而确保在扫描区域内始终有一个位置可以确定的参考标记物。特别地，激光标记不仅可以在表面上产生结构，还可以在玻璃中产生结构，因此参考标记物的位置不一定限于平面(玻璃表面)。虽然如果所有参考标记物都位于同一平面内，则参考标记在z方向上(即，在光轴方向上)的位置确定仅限于MINFLUX定位的捕捉范围，但可以使用布置在不同深度的参考标记物来实现参考标记物在明显更大范围内的位置确定。

设有标记的样本载体已知可用于其他目的并且部分可商业获得。在这方面，本发明不仅包括描述的和以各种实施方式呈现的方法，还包括具有参考标记物的样本载体在根据本发明的方法中的应用。

作为将参考标记物附着在样本载体上或样本载体中的可替代方案，参考标记物还可以耦合到样本中的对象，例如细胞。那么相对于整个样本而言，参考标记物不再一定是位置固定的，而是相对于它们所耦合到的对象是位置固定的。在该实施方式中，参考标记物的位置确定不再仅检测整个样本的漂移，而是可替代地或附加地检测耦合到参考标记物的对象或者细胞的漂移或主动运动。在检查细胞内结构的许多应用中，这是该方法的优选实施方式，因为细胞的被动和主动运动与整个样本的漂移一样会对检查产生破坏性影响。此外，该方法的该实施方式不仅允许检测作为漂移的样本或细胞的协调运动，而且还允许检测在检查期间由于生长过程或细胞分裂过程而发生的形态变化(例如，拉伸或压缩)。为此，样本中任何位置处的漂移都可以通过内插，根据位于相应位置周围的多个参考标记物的漂移来确定。然后，参考标记物形成(随时间变化的)二维或三维网格(英文：Mesh)，在该网格上可以借助于Warping算法对网格点之间的点的坐标进行插值。

在特殊情况下，样本中的对象也可以具有适合作为参考标记物的固有粒子。对此的示例是疟疾病原体恶性疟原虫在血红蛋白降解过程中产生的血红素色素，这种色素存在于受感染的红细胞中。这些色素是双折射的，因此偏振对比度特别适于确定色素的位置。

除了在各个实施方式中描述的根据本发明的方法之外，本发明还包括光学显微镜，其具有物镜、扫描光的光源、用于在样本中形成扫描光的、具有局部强度最小值的强度分布的光束整形装置、用于将在样本中定位扫描光的扫描设备和用于检测样本中参考标记物的光发射的探测器。该光学显微镜的特征在于其具有控制单元，该控制单元被设置用于执行根据本发明的方法。为了校正在参考标记物处确定的样本的漂移，光学显微镜优选地具有带有驱动器的样本台，利用该驱动器可以通过跟踪来补偿样本漂移。

从专利权利要求书、说明书和附图以及对附图的相关阐述中得出本发明的有利的改进方案。本发明的特征和/或特征组合的所述优点仅是示例性的，并且可以具有可替代的或累积的效果。

原始申请文件及专利的公开内容(但不是保护范围)适用以下规定：进一步的特征可以在附图中找到，特别是示出的相关布置和有效连接。本发明不同实施方式的特征组合或不同专利权利要求的特征组合也可以偏离专利权利要求的所选引用关系，并特此提出。这也适用于那些在单独附图中示出的或在其描述中提到的特征。这些特征也可以与不同专利权利要求的特征组合起来。同样，在本发明的进一步实施方式中，也可以省略专利权利要求中列出的特征，但这不适用于已授权专利的独立专利权利要求。

专利权利要求中包含的参考标记并不构成对专利权利要求所保护对象范围的限制。它们仅用于使专利权利要求更容易理解。

附图简述

图1以流程图示出了根据本发明的方法的实施方式。

图2以流程图示出了根据本发明的方法的另一实施方式。

图3以流程图示出了根据本发明的方法的另一实施方式。

图4示出了根据本发明的方法的示意图。

图5示出了通过从多个参考标记物的位置进行内插来确定漂移。

图6示出了用于应用在根据本发明的方法中的样本载体。

图7示出了根据第一实施方式的根据本发明的光学显微镜。

图8示出了根据第二实施方式的根据本发明的光学显微镜。

附图描述

在图1中，示出了根据本发明的方法的实施方式的流程图1，其中通过激光扫描方法例如借助于共焦显微术或STED显微术来检查样本。为此目的，用荧光标记物对样本或样本中感兴趣的结构进行染色。在流程图1中，虚线表示数据流。

首先，在样本中识别参考标记物，在检查样本期间通过重复的位置确定来确定漂移。例如，可以基于特征形状或特定光发射在样本的概览图像中识别参考标记物，并且可以至少近似地确定参考标记物在样本中的位置。例如，金属纳米粒子可以基于其明亮的点状散射光信号而在样本的反射光图像(Auflichtbild)中被识别出来。

例如，这样的反射光图像可以与样本的栅格荧光图像叠加，使得根据叠加来显示出参考标记物相对于样本结构的位置。例如，用户可以从该图像中选择一个或更多个用于确定漂移的参考标记物。例如，可以通过在图形用户界面上标记区域，例如通过用鼠标或触摸屏交互来限定和移动框架，来进行这种选择。

当选择了参考标记物时，首先使用MINFLUX方法确定参考标记物的位置，以测定起始位置r₀2，该起始位置作为参考位置用于在后续的参考标记物的位置确定中进行漂移测定。在所示的实施方式中，随后对样本的检查是逐行进行的；开始时，在第一扫描行上设置行计数器i，并且逐点扫描该行，其中探测该行的每个像素的荧光，并将荧光强度存储在像素值存储器3中。在下一步骤中，检查是否扫描了所有扫描行，即样本的检查是否全部完成。在这种情况下，该方法结束，否则行计数器i递增。

在下一步骤中，检查是否应当进行参考标记物的位置确定和漂移校正，为此需要确定自参考标记物的上次位置确定以来经过的时间。如果达到(预先确定的)漂移测量间隔，则根据MINFLUX方法再次确定参考标记物的位置。可替代地，也可以在扫描了预定数量的扫描行之后重复确定参考标记物的位置。

根据参考标记物的当前位置r 4与起始位置r₀2之间的差值计算漂移校正，通过该漂移校正来跟踪样本，从而修正漂移；然后通过扫描下一扫描行i来继续样本的检查。

在图2中，示出了根据本发明的方法的实施方式的流程图1，其中与上述实施方式不同，用MINFLUX方法进行样本的检查。为此，用荧光染料标记样本或样本中感兴趣的结构，该荧光染料可以以光诱导的方式在至少一个方向上在荧光状态和非荧光暗状态之间转换。

与先前一样，在检查开始时，在样本中识别参考标记物，通过重复的位置确定来确定漂移，并且使用MINFLUX方法首先确定参考标记物的位置，以便测定起始位置r₀2。将漂移校正Δr初始化为值0。

在下一步骤中，(只有)少量用于标记样本的荧光染料分子通过光活化转换为荧光状态。在此，调节荧光染料分子的密度，使得在衍射极限体积内分别最多仅有一个荧光染料分子。

在下一步骤中，根据MINFLUX方法对先前光活化的染料分子进行定位。在此，定位包括将染料分子的大致位置初步确定为位置起始值，该位置起始值可以通过对样本(或样本的一部分)的系统扫描或通过采集样本的落射荧光图像来确定。从染料分子相应的定位初始值开始，根据MINFLUX方法以越来越高的精度逐步定位染料分子的位置，为此，在多个扫描位置处用激发光的、具有局部最小值的强度分布对染料分子进行扫描，并根据在这些扫描位置处探测到的荧光强度确定染料分子的改进位置r。在根据本发明的方法的该实施方式中，随后通过漂移校正值Δr校正染料分子的位置，然后将该位置存储在坐标存储器51中。

如果达到足够数量的单分子定位，就可以在此时中断并结束测量。各种标准都可以用作中断标准；例如，如果出现预先确定或可确定数量的单分子定位或达到预定的信噪比，则可以结束测量。也可以由操作员通过交互方式结束测量。

如在先前描述的实施方式中，现在检查是否应当进行参考标记物的位置确定和漂移校正，为此，确定自参考标记物的上次位置确定以来经过的时间。如果达到了(预先确定的)漂移测量间隔，则根据MINFLUX方法再次确定参考标记物的位置。根据参考标记物的当前位置r4和起始位置r₀2之间的差值计算更新的漂移校正Δr。然后，通过再次光活化和定位少量染料分子来继续对样本进行检查。

在图3中，示出了根据本发明的方法的另一实施方式的流程图。如图1所示的实施方式，这里也使用激光扫描方法例如借助于共焦显微术或STED显微术来检查样本。这里所示的方法的实施方式适用于在数小时甚至数天的较长时间段内重复检查样本。在此，漂移确定又被集成到样本检查中，但是这里漂移确定不是在连续的图像行之间进行的，而是在连续采集样本的图像或图像堆栈之间的暂停期间进行的。为此，在每次图像采集之后都检查漂移测量间隔是否到期。如果是这种情况，如图1所示，在参考标记物处确定漂移并跟踪样本。漂移测量间隔可以是预先确定的或是可预先确定的或者根据先前确定的漂移值动态地确定。然后，执行等待循环5，直到图像采集间隔到期为止；然后开始新的图像采集。在等待循环的重复运行过程期间，进一步检查漂移测量间隔是否到期，并且必要时进行进一步的漂移确定和样本跟踪。

在图4中，示意性地示出了根据本发明的方法。样本6包含待检查的细胞7以及参考标记物8，在这里参考标记物是光散射金属纳米粒子9的形式。借助于共焦激光扫描显微术检查细胞7，即用聚焦激光对细胞7进行蜿蜒形状的逐行扫描。样本6被布置在具有驱动器12的样本台11上的起始位置10处，利用驱动器12可以使样本6在x和y方向上运动。如果要在三个空间方向上进行漂移校正，则还需要在垂直于绘图平面的z方向上设置额外的调整。

首先，在样本6中识别参考标记物8并选择这些参考标记物13之一来执行漂移确定。在此，优选地进行选择，使得参考标记物13位于待检查的样本6的区域附近，但不在该区域内。现在对参考标记物13进行第一MINFLUX定位，为此在标记物周围密集布置的多个扫描位置14(此处仅以两个为例)处用扫描光的、具有局部最小值的强度分布照射标记物，并且根据在这些扫描位置14处记录的散射光强度来对参考标记物13进行精确定位。该第一定位限定了参考标记物13的起始位置10，因此限定了样本6或样本6中细胞7的起始位置10。然后，借助于栅格扫描来采集细胞7的图像，为此，从第一扫描行15开始对样本6逐行(这里是蜿蜒状的)扫描。一旦自第一次或上一次位置确定以来过去的时间达到漂移测量间隔，栅格扫描就中断16，并对参考标记物13重新进行MINFLUX定位，这样提供了参考标记物13相对于起始位置10的漂移位置17。为了进行校正，现在借助样本台11的驱动器12，根据漂移位置17和起始位置10之间的差值来跟踪样本。随后，借助于栅格扫描继续采集图像。

在图5中，概略示出了如何能够通过从多个参考标记物8的位置进行内插来确定任何点18的漂移，该点18的位置本身不能通过MINFLUX定位来确定。为此，用多个参考标记物8来标记细胞7，在所示的示例中，这些参考标记物8沿着近似规则的栅格19布置。(为了清楚起见，图中仅以其中两个参考标记物为例设置了附图标记。)在检查开始时，即在时间点t＝0时，参考标记物8处于起始位置10，该起始位置通过在检查开始之前对所有参考标记物8进行第一MINFLUX定位来确定。相对于点18周围的参考标记物8的起始位置10，通过内插来确定样本中的点18的起始位置20(其漂移将在检查时间段内进行校正)。

在样本检查期间的后续时间点t>0，例如由于细胞7生长，细胞7发生了变形。因此，参考标记物8的位置21发生改变，其中位置的改变是不均匀的，而是可能因参考标记物8的不同而不同。现在，参考标记物8(或至少点18周围的参考标记物)的新的MINFLUX定位提供了一组位置，点18的改变的位置22可以根据这些位置被内插得到。

用于定位参考标记物所执行的MINFLUX方法可以包括(必要时在从概览图像(例如，显示参考标记物的粗略位置的入射光图像和用荧光标记物标记的样本结构的栅格荧光图像的叠加)中选择参考标记物之后)预定位步骤，其中测定参考标记物的初始位置估计。为此，例如，探测器针孔的投影可以在样本平面中圆形地移动，而激发光分布相对于样本保持静止(所谓的针孔轨道(Pinhole-Orbit))。通过这种方式，可以在横向方向上(即，在垂直于激发光束的光轴的样本平面中)确定参考标记物的初始位置估计。随后，可以执行所谓的2D MINFLUX方法来精确定位参考标记物。

如果需要参考标记物的3D定位(如果样本中用荧光染料标记的结构也需要进行三维成像，则通常是这种情况)，则可能必须使用另外的预定位方法，因为针孔轨道方法不提供任何有关参考标记物的轴向位置的信息。例如，基于激发光分布的初始位置的位置估计的收敛可以用于3D预定位，特别是光散射参考标记物的3D预定位。为此，例如可以对从概览图像估计的参考标记物的位置周围的点云执行多个迭代MINFLUX定位序列。在定位序列中，首先将激发光分布的中心最小值依次放置在照射模式的点处，这些点布置在点云的随机点周围，并确定每个点的光子数。由此计算出新的位置估计，并且在下一步骤中将照射模式布置在新的位置估计周围。对每个点执行该序列，直到位置估计发散(如果起始点在参考标记物的捕获范围之外，则为此情况)或收敛(如果起始点在捕捉范围内)。起始点的位置越接近参考标记物的实际位置，该位置估计收敛得就越快。根据定位序列的路线，可以使用3D照射模式和横向以及轴向的起始点的三维点云来预定位参考标记物。随后，可以应用3DMINFLUX方法，以高分辨率确定参考标记物的位置。

特别是由于较低的有效性，所描述的预定位方法需要比MINFLUX方法更多的定位步骤来定位样本结构。在此，由于参考标记物的光稳定性高，因此可以承受较强的曝光。由于需要额外的时间，3D预定位方法特别地仅用于参考标记物的初始位置确定，而对于漂移测定中的进一步的位置确定，特别地不使用预定位，而是直接使用3D MINFLUX方法。对于后续测量中的3D MINFLUX方法，特别地可以将分别在先前步骤中确定的参考标记物的位置用作起始值，而不使用预定位。

特别地，与传统的MINFLUX方法相比，所述的根据位置估计的收敛进行预定位不需要有关背景信号的先验信息。然而，为了提高稳健性和收敛的速度，所使用的照射模式可以特别地包括与先前位置估计精确对应的中心位置，其中通过在该中心位置处探测到的光子数(特别是用因数缩放)来估计背景信号。

图6示出了由玻璃制成的样本载体23，该样本载体23具有制备区域24，在该制备区域24内，样本载体23具有适用在根据本发明的方法中使用的参考标记物8。这种参考标记物8可以是例如光散射的固定金属纳米粒子9；然而，例如也可以通过在表面或玻璃体积中以点状散射光中心的形式进行激光雕刻来产生参考标记物。在所示的示例中，样本载体在制备区域中具有规则的六边形排列的参考标记物8。样本载体23可以具有其他特征，例如标记区域25。

在制备区域24中，可以将待检查的样本施加到样本载体23上。优选地，将样本固定在样本载体23的表面上，以确保与参考标记物8的固定位置关系。例如，可以在样本载体23的表面上培养细胞，或者可以将细胞化学固定在玻璃表面上。

图7示意性地示出了用于执行根据本发明的方法的光学显微镜26的结构。光源27提供扫描光28，扫描光28一方面对位于样本6中的荧光粒子进行荧光激发，另一方面被位于样本6中的光散射参考粒子散射。

扫描光28的光束29穿过串联连接的两个光束偏转装置30(在这里被设计为电光偏转器(EOD)31)，该光束偏转装置用于在水平方向或者竖直方向上偏转光束29。扫描光28的一部分在部分透明的反射镜44处被反射出光束路径；该部分光束在光束阱49中被捕获。在部分透明的反射镜44处透射的部分扫描光28的波前由液晶调制器(空间光调制器，SLM)32整形，使得在随后通过物镜33聚焦时，在样本6中产生扫描光28的、具有局部强度最小值的强度分布。由液晶调制器32反射的光束通过光束耦合器34耦合到光学显微镜26的主光束路径35中。扫描光28经由扫描仪36并通过扫描透镜37被偏转到物镜33的后孔径中，物镜33将扫描光28聚焦到样本6中，样本6被保持在具有驱动器12的样本台11上。具有驱动器12的样本台11构成样本定位单元50。

在所示的配置中，基于电流计(Galvanometer)的扫描仪36用于在样本6中对聚焦的扫描光28进行相对缓慢但可以在较大图像场内实现的粗定位，而EOD 31则用于对扫描参考标记物的强度最小值的快速定位。在此，EOD 31允许高速定位，但定位范围仅限于几微米。物镜33从样本6接收到的荧光粒子的荧光38和参考粒子的散射光39沿着主光束路径35在与扫描光28相反的方向上传播。相对于扫描光28波长偏移的荧光38通过光束耦合器34，用滤波器40净化、用透镜41聚焦穿过共焦针孔42，并用布置在针孔42后面的荧光探测器43探测。与此相反，由物镜33从样本6接收到的参考粒子的散射光39具有与扫描光28相同的波长，因此被光束耦合器34反射出主光束路径35。它继续在与扫描光28相反的方向上移动，并通过部分透明的反射镜44被偏转到散射光探测器45上。

根据本发明，光学显微镜26具有控制单元46，控制单元46生成用于控制扫描仪36、EOD 31和驱动器12的控制信号47，以及接收荧光探测器43和散射光探测器45的探测器信号48。控制装置46被设置成通过扫描仪36将扫描光28定位在单个荧光粒子上，并通过用扫描光28在近距离范围内重复扫描样本6中的单个粒子以及根据用荧光探测器43在扫描位置处探测到的荧光38的光量确定单个粒子的位置，来定位样本6中的单个粒子。在此，控制单元46周期性地中断单个荧光粒子的定位，以便根据MINFLUX方法确定至少一个参考标记物的位置。为此，用扫描光在近距离范围内的多个扫描位置处扫描参考标记物，并且根据用散射光探测器45在扫描位置处探测到的散射光39的光量来计算参考标记物的位置。通过控制样本台11的驱动器12沿相反方向跟踪样本6来补偿根据与参考标记物的初始位置的差值计算的漂移。

图8中所示的光学显微镜26的实施方式与图7所示的光学显微镜26的不同之处在于散射光探测器45在光束路径中的位置，特别是散射光39的耦合出去的方式。根据图8，分束器52布置在光束耦合器34和扫描仪36之间的主光束路径35中，分束器52具有反射表面，反射表面的表面法线与主光束路径35中的光束传播方向成一个小角度(即，特别是10°或更小，优选为5°或更小，进一步优选为1°或更小)。为了更加清晰，图8中示出的该角度大于光学显微镜26的典型实施的角度。散射光39的一小部分(例如，约5％)被分束器52从主光束路径耦合出去并偏转到散射光探测器45上，散射光探测器45特别地被设计为光电倍增器。由于分束器52位于光束耦合器34的物镜侧，并且分束器52特别地反射与波长无关的光，因此特别地一部分荧光也被耦合出去。然而，由于分束器52与主光束路径35的角度较小，因此这部分光也很小。

分束器52特别地被设计为所谓的光束取样器。在此，这是一种由折射率比空气高的材料(例如，玻璃)制成的组件，其具有平坦的反射表面(特别地，其反射与波长和偏振无关)。特别地，与反射表面相对的第二表面设置有抗反射涂层，以避免光束倍增。另外，第二表面可以被布置成与反射表面成一个小角度，从而避免组件内部的干扰。作为光束取样器的替代方案，任何反射表面(例如，已存在于光束路径中的组件的反射表面)，例如窗户等，可用于将散射光耦合出去。

将分束器52部置在物镜33附近是有利的，因为探测到的散射光39的波前被光束路径中的光学元件(例如，液晶调制器32)扭曲的程度越小越好，这改善了对参考标记物的位置确定。

为了获得特别节省空间且低成本的布置，可以使用已存在于主光束路径35中的透镜(图8中未示出)来将散射光39聚焦到散射光探测器45上。也就是说，分束器52没有布置在准直的光束路径中。例如，这样的透镜可以是将液晶调制器32的有源表面镜像到物镜33的光瞳中的光学中继器或望远镜的一部分。

附图标记列表

1 流程图

2 起始位置

3 像素值存储器

4 位置

5 等待循环

6 样本

7 细胞

8 参考标记物

9 纳米粒子

10 起始位置

11 样本台

12 驱动器

13 参考标记物

14 扫描位置

15 扫描行

16 中断

17 漂移位置

18 点

19 栅格

20 起始位置

21 位置

22 位置

23 样本载体

24 制备区

25 标记区域

26 光学显微镜

27 光源

28 扫描光

29 光束

30 光束偏转装置

31 电光偏转器(EOD)

32 液晶调制器

33 物镜

34 光束耦合器

35 主光束路径

36 扫描仪

37 扫描透镜

38 荧光

39 散射光

40 滤波器

41 透镜

42 针孔

43 荧光探测器

44 部分透明的反射镜

45 散射光探测器

46 控制单元

47 控制信号

48 探测器信号

49 光束阱

50 样本定位单元

51 坐标存储器

52 分束器。

Claims

1.一种用于对用参考标记物(8、13)标记的样本(6)进行光学显微镜检查的方法，所述参考标记物特别是光稳定的，其中所述检查包括在多个照射位置处用聚焦激光顺序地照射所述样本(6)，

其特征在于，

在所述照射位置处进行照射之间重复地中断对所述样本(6)的检查，并且根据MINFLUX方法确定至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述参考标记物(13)周围的近距离范围内布置的多个扫描位置(14)处用扫描光(28)的、具有局部最小值的强度分布照射所述至少一个参考标记物(13)以进行位置确定，所述扫描光(28)诱导或调制所述参考标记物(13)的光发射，并且根据针对所述扫描光(28)的所述多个扫描位置(14)探测到的所述参考标记物(13)的光发射计算出所述至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述参考标记物(13)的光发射是荧光或磷光、瑞利散射光或拉曼散射光、CARS散射光(相干反斯托克斯拉曼散射)或者通过所述扫描光(28)的倍频或通过与所述扫描光(28)的混频产生的光发射。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，从所述参考标记物(13)的光发射中选择性地探测与所述扫描光(28)的偏振正交的偏振。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，用于检查所述样本的激光同时是用于确定所述至少一个参考标记物(8、13)的位置(21、22)的扫描光(28)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，根据所述至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)计算所述参考标记物(8、13)相对于所述光学显微镜(26)的光学成像系统的漂移，并且通过光束偏转单元的位置校正或通过使用样本定位单元(50)跟踪所述样本(6)来补偿所述漂移。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，以规则的时间间隔确定所述至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，如果通过根据所述参考标记物(13)的先前位置确定创建的漂移曲线的时间外推确定的所述参考标记物(13)的位置(21、22)发生了预定量或可预定量的变化，则重新确定所述至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，用于所述至少一个参考标记物(8、13)的位置确定的测量持续时间不超过用于检查所述样本(6)的总测量持续时间的5％的份额、优选2％的份额并且特别优选1％的份额。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在特别是由于所述参考标记物(13)的退化而不再能够进行进一步的位置确定之前，能够多次、优选100次、进一步优选1000次、特别优选10000次确定所述至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，在所述样本(6)的检查期间，所述参考标记物(8、13)处于不能够被诱导或激发出光发射的暗态的时间不超过10％、优选地不超过5％、特别优选地任何时间都不处于暗态。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考标记物(8、13)是光散射纳米粒子、特别是金属纳米粒子，荧光纳米粒子、特别是掺杂有稀土金属的离子或复合化合物的纳米粒子，荧光量子点或具有荧光缺陷的纳米金刚石。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，基于所述参考标记物(8、13)的光发射的波长，所述参考标记物(8、13)在所述样本(6)中被找到和/或被识别为参考标记物(8、13)。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，基于所述参考标记物(8、13)的光发射的光子通量的统计特征，所述参考标记物(8、13)在所述样本中被找到和/或被识别为参考标记物(8、13)。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，基于所述参考标记物(8、13)的光发射的寿命，所述参考标记物(8、13)在所述样本(6)中被找到和/或被识别为参考标记物(8、13)。

16.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，通过所述样本(6)的多个图像的相关性，所述参考标记物(8、13)在所述样本(6)中被找到和/或被识别为参考标记物(8、13)。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，交替地或者在同一定位步骤中在不同的参考标记物(8、13)处进行位置确定。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，为了对参考标记物(8、13)进行位置确定，在每种情况下都在所述样本(6)中选择一参考标记物(13)，所述参考标记物(8、13)与聚焦激光的上次照射位置的距离不超过30μm，优选地不超过20μm，特别优选地不超过10μm。

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，通过根据多个参考标记物(8、13)的漂移进行内插来确定所述样本(6)中的点(18)的漂移。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其特征在于，通过使用激光扫描方法采集所述样本(6)的图像来对所述样本(6)进行检查。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，以至少对应于所述激光扫描方法的空间分辨能力的精度，优选地以超过所述激光扫描方法的空间分辨能力的、为所述激光扫描方法的空间分辨能力的至少2倍的精度，确定所述至少一个参考标记物(8、13)的位置。

22.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其特征在于，对所述样本(6)的检查包括使用MINFLUX方法确定所述样本(6)中的空间上彼此分离的单个粒子的位置。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，以至少对应于粒子的位置确定精度的精度，优选地以超过粒子的位置确定精度的、为粒子的位置确定精度的至少2倍的精度，确定所述至少一个参考标记物(8、13)的位置(21、22)。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于，对所述样本(6)的检查包括根据单个粒子的位置计算所述样本(6)的高分辨率图像和/或单个粒子的轨迹。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其特征在于，根据所述至少一个参考标记物(13)的位置(21、22)计算所述参考标记物(8、13)相对于所述光学显微镜(26)的光学成像系统的漂移，并且根据MINFLUX方法确定的单个粒子的位置(21、22)通过所述漂移的量进行校正。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考标记物(8、13)相对于样本载体(23)是位置固定的或与样本载体(23)结合在一起或嵌入到样本载体(23)中。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，将所述参考标记物(8、13)设计为在所述样本载体(23)上或所述样本载体(23)中的雕刻物、特别是机械雕刻物或激光标记。

28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述参考标记物(8、13)是通过所述样本载体(23)的表面结构化、特别是光刻表面结构化形成的。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其特征在于，所述参考标记物(8、13)相对于所述样本(6)中的对象或结构是位置固定的，或者与所述样本(6)中的对象或结构结合在一起。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述参考标记物(8、13)是所述对象的固有成分，特别是有色色素。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过对所述至少一个参考标记物(8、13)的位置确定所测定的漂移用于漂移确定补充方法的零点校正。

32.一种样本载体(23)在根据权利要求1至28中任一项所述的方法中的应用，所述样本载体(23)上雕刻、嵌入或结合有参考标记物(8、13)。

33.一种光学显微镜(26)，包括：

物镜(33)，

扫描光的光源(27)，

光束整形装置，其用于在样本(6)中形成所述扫描光(28)的、具有局部强度最小值的强度分布，

扫描设备，其用于在所述样本(6)中定位所述扫描光(28)，

探测器，其用于检测所述样本(6)中参考标记物(8,13)的光发射，

控制单元(46)，其用于控制所述扫描设备并处理由所述探测器输出的探测器信号(48)，

其特征在于，

所述控制单元(46)被设置用于执行根据权利要求1至31中任一项所述的方法。

34.根据权利要求33所述的光学显微镜(26)，其特征在于，所述光学显微镜(26)包括具有驱动器(12)的样本台(11)，并且所述控制单元(46)控制所述驱动器(12)，从而补偿通过对至少一个参考标记物(8、13)的位置确定而确定的漂移。