JP6118898B2 - 荷電粒子線装置、試料観察方法 - Google Patents
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Description
はじめに、本実施例で用いられる試料台の概要に関して説明する。以下で説明する三次元内部構造観察方法は従来の一般的な電子顕微鏡用試料台においても可能であるが、次に説明する試料台を用いることでさらに利便性が向上する。
本実施例における試料台の詳細の説明と原理説明をする。本実施例の試料台は荷電粒子線を光に変換する検出素子500で構成される。図2のように試料6は検出素子500上に直接搭載される。図中試料6は一つだけ搭載されているが、複数配置されていてもかまわない。または、後述するように膜などの部材を介して間接に搭載されても良い。試料台500の下に、無色透明または多少の色が混在されている土台501(図示せず)を配置してもかまわない。土台501としては、透明ガラス、透明プラスチック、透明の結晶体などである。蛍光顕微鏡などで観察したい場合は、蛍光が吸収されない方がよいのでプラスチックがよい。土台501は必ずしもなくともよい。
次に、図6を用いて、荷電粒子線を用いて試料の三次元内部構造観察を実施するための原理に関して説明する。図では試料6と荷電粒子線900が照射される際の相互関係を示す。試料6には密度が比較的小さい物質904の中に、密度が比較的大きい内部物質901と内部物質902と内部物質903を持つ。内部物質903は内部物質901、902に比べると大きさが小さいかつ密度が小さいとする。試料として例えば細胞試料などを考えると、物質904は細胞内部であり、内部物質901、902、903などは細胞核などの細胞小器官などに対応する。
ここで、図7に、本実施例の試料台を搭載して三次元内部構造観察が実施できる装置に関して説明する。荷電粒子顕微鏡は、主として、荷電粒子光学鏡筒2、荷電粒子光学鏡筒を装置設置面に対して支持する筐体7(以下、真空室と称することもある)およびこれらを制御する制御系によって構成される。荷電粒子顕微鏡の使用時には荷電粒子光学鏡筒2と筐体7の内部は真空ポンプ4により真空排気される。真空ポンプ4の起動および停止動作も制御系により制御される。図中、真空ポンプ4は一つのみ示されているが、二つ以上あってもよい。
図8に操作画面の一例を示す。三次元内部構造を観察するために設定するベクトルパラメータ設定部として、モニタ上には照射エネルギーE変更部45、照射角度変更部46、試料角度変更部47が表示される。照射エネルギーE変更部45に入力された数値に従い荷電粒子線の照射エネルギーが設定される。照射角度変更部46は荷電粒子線を光軸との角度を変更するため入力窓であって入力された数値に従い荷電粒子線の光軸に対する照射角度が設定される。試料角度変更部47は試料6を傾斜する角度を入力する入力窓であり、入力された数値に従い試料ステージが傾斜することにより試料が傾斜される。前述のようにベクトルパラメータ照射エネルギーEは観察可能な構造物の密度に対応し、照射角度または試料角度は観察する方向に対応しているので、操作画面上の入力窓はそれぞれ「密度」または「観察方向」等の表示項目であってもよい。照射角度変更部46と試料角度変更部47はどちらか一方だけでもかまわない。さらに、荷電粒子線の焦点を変更する焦点調整部48、画像の明るさ調整部49、画像コントラスト調整部50、照射開始ボタン51、照射停止ボタン52などからなる。
次に、図9を用いて、ユーザが三次元内部構造を観察する手順について記載する。
次に、図9のステップBにおける三次元内部構造観察のための一連動作及び画像保存を実施するための手順を自動的に実施するための構成について説明する。具体的には、ステップ61からステップ67までを自動化すれば実施が可能である。
また、金コロイド等の標識を付加した免疫染色を試料に実施してもよい。標識をつけることによって、試料内部の形態構造だけでなく検出したいたんぱく質等が試料内部のどこに局在しているかなどを観察することが可能となる。図11では試料に標識をつけて観察する場合を考える。この場合の試料は例えば培養細胞や生体から摘出された細胞である。金標識909が接合した抗体を付加した材料を細胞内に注入すると、細胞内部のたんぱく質等に特異的に反応して結合する(抗原抗体反応)。荷電粒子線900は金標識909によって大きく散乱をうけるので、投影画像(または検出画像)910は図のようになり、金標識909が集まって局在化した場所がわかる。この結果、検出したいたんぱく質等の場所が把握できることになる。
前述の通り、試料台上に観察したい試料を搭載し、同一試料台上の試料の光学顕微鏡観察と荷電粒子顕微鏡観察を実施できる。このとき、光学顕微鏡及び荷電粒子顕微鏡で同一部位を正確に観察できることが望ましい。そこで、光学顕微鏡と荷電粒子顕微鏡で同一部位を観察できる装置システムに関して図12を用いて説明する。光学顕微鏡602にはCCDカメラ603が具備される。ユーザはまず光学顕微鏡にて試料の画像を取得する。CCDカメラ603と上位制御部36は配線604で接続されている。これにより、光学顕微鏡のデジタル画像情報を図中点線矢印で示したように上位制御部36に送ることが可能となる。また荷電粒子顕微鏡で取得される画像情報も同様に上位制御部36に送られるので、同一部位の顕微鏡像の比較が同一モニタ35上で実施することが可能となる。ユーザはモニタ上で光学顕微鏡によって取得した画像を見ながら、荷電粒子顕微鏡で画像取得する試料位置を探す。これによって光学顕微鏡での観察結果に基づいて所望の試料位置を一次荷電粒子線の照射位置に配置することができる。また、画像マッチングや類似度計算などの演算処理によって光学顕微鏡画像と類似した形状の試料位置を探して、自動的に荷電粒子線の照射位置として設定してもよい。なお、図示しないが、光学顕微鏡と上位制御部との間は、別のコンピュータが介在してもよいし、インターネットなどの通信ラインを経由して画像情報を送信してもよい。
次に、図18を用いて、大気圧下で観察可能な荷電粒子線装置を用いた例を説明する。荷電粒子顕微鏡の基本構成は図7のものと同じなので、本実施例では主に大気圧観察用装置の特徴のみ説明する。
16:真空配管、18:支柱、19:蓋部材用支持部材、20:底板、
34:キーボードやマウスなどのユーザインターフェース、35:モニタ、
36:上位制御部、37:下位制御部、38:ステージ制御部、39:通信線、40:データ送受信部、41:データメモリ部、42:外部インターフェース、43:演算部、44:操作画面、45:照射エネルギー変更部、46:照射角度変更部、47:試料角度変更部、48:焦点調整部、49:明るさ調整部、
50:コントラスト調整部、51:照射開始ボタン、52:照射停止ボタン、53:プリアンプ、54:プリアンプ、55:画面、56:画面、57:画像保存ボタン、58:画像読み出しボタン、59:照射エネルギー制御部、61、62、63、64、65、66、67:ステップ、70:操作画面、71:初期試料角度θ設定部、72:最終試料角度θ設定部、73:変更角度Δθ設定部、74:垂直設定バー、75:水平設定バー、76:画面、77:自動画像取得基準点、78:自動取得開始ボタン、
102:連結部、103:ガスボンベ、107:支持板、119:ハーメチックシール、120:ハーメチックシール、122:蓋部材、123,124,125,126,128,129:真空封止部材、155:隔膜保持部材、
200:荷電粒子顕微鏡の光軸、201:光学顕微鏡の光軸、202:光学顕微鏡、250:光学顕微鏡、269:柱、270:土台、271:筐体、272:ガスノズル、
500:試料台または検出素子、501:土台、502:薄い膜、503:光検出器、505:プリアンプ基板、506:固定部材、507:配線、508:密度が高い部分、509:密度が低い部分、510:一次荷電粒子線、511:一次荷電粒子線、512:上層部、513:下層部、514:電子正孔対、515:抵抗、516:配線、517:増幅器、518:検出素子、
601:荷電粒子線顕微鏡、602:光学顕微鏡、603:CCDカメラ、604:配線、
702:薄い膜、703:置換物質、
800:光検出器、801:光伝達路、
900:荷電粒子線、901:内部構造、902:内部構造、903:内部構造、903a:投影された内部構造903、904:物質、905:光軸、906:投影画像(また
は検出画像)、907:投影画像(または検出画像)、908:投影画像(または検出画
像)、909:金標識、910:投影画像(または検出画像)、911:金標識、912
:投影画像(または検出画像)、913:マーキング
Claims (14)
- 一次荷電粒子線を試料に照射する荷電粒子光学鏡筒と、
前記試料を保持する試料台を着脱可能に配置する試料ステージと、
前記一次荷電粒子線と前記試料との相互関係を決定するベクトルパラメータを制御する制御部と、を有し、
前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出器を含んで構成され、
複数の異なるベクトルパラメータでの一次荷電粒子線の照射によって、各ベクトルパラメータに対応する前記試料の透過荷電粒子画像を取得することを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記ベクトルパラメータは前記一次荷電粒子線の入射方向と前記試料との相対角度を含むものであって、
前記一次荷電粒子線の光軸に対して前記試料を傾斜することが可能な試料ステージ駆動機構を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記ベクトルパラメータは前記一次荷電粒子線の入射エネルギーを含むものであって、
前記一次荷電粒子線の入射エネルギーを可変とする荷電粒子線源、前記一次荷電粒子線を加速もしくは減速させる電圧が印加される光学レンズ、または前記試料ステージに電圧を印加する電源の少なくともいずれかを備えることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記ベクトルパラメータは前記一次荷電粒子線の入射方向と前記試料との相対角度を含むものであって、
前記一次荷電粒子線を当該一次荷電粒子線の光軸に対して傾斜させて前記試料に入射する光学レンズを備えることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記ベクトルパラメータは前記一次荷電粒子線の前記試料に入射される電流量を含むものであって、
前記一次荷電粒子線の照射電流量を変化させることが可能な光学レンズまたは電流制御部を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記各ベクトルパラメータに対応する複数の透過荷電粒子画像を並列して表示するモニタを有することを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記各ベクトルパラメータに対応する複数の透過荷電粒子画像を、前記ベクトルパラメータの大小の順に、任意の時間ごとに切替えて表示するモニタを有することを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
予め特定の試料位置を選択する入力画面を表示するモニタと、
前記ベクトルパラメータの変更前後で、前記透過荷電粒子画像における前記特定の試料位置が変わらないように、前記試料ステージを移動する駆動機構を有することを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
予め特定の試料位置を選択する入力画面を表示するモニタと、
前記ベクトルパラメータの変更前後で、前記透過荷電粒子画像における前記特定の試料位置の焦点および明るさが変わらないように、焦点および明るさを調整する演算部を有することを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記検出器は前記試料の内部を透過または散乱してきた荷電粒子によって発光する発光部材であることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記試料台は光学顕微鏡装置と荷電粒子顕微鏡装置の共用試料台であることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項10に記載の荷電粒子線装置において、
前記発光部材は特定のまたは全ての波長領域の可視光もしくは紫外光もしくは赤外光が通過可能であることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記検出器は半導体検出素子であることを特徴とする荷電粒子線装置。 - 請求項1に記載の荷電粒子線装置において、
前記一次荷電粒子線を透過または通過させる着脱可能な隔膜を有し、当該隔膜により前記荷電粒子光学鏡筒の内部空間と前記試料が載置された空間とが隔離されていることを特徴とする荷電粒子線装置。
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