JP6169506B2 - 試料ホルダ、観察システム、および画像生成方法 - Google Patents

Description

本発明は，試料の内部を観察することが可能な荷電粒子線装置及びその試料台に関する。

物体の微小な領域の内部構造を観察するために，走査型透過電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＳＴＥＭ）や透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）などが用いられる。（以下，これらを総称して（Ｓ）ＴＥＭと表記する。）これらの電子顕微鏡で試料内部を観察するための一般的な方法として，多数の空孔を備えたメッシュ状の試料台の上に荷電粒子線が透過できる程度に薄くスライスされた試料を配置し，試料面に対して電子源側とは反対側に配置された検出器で透過荷電粒子線画像を取得することが知られている。しかし，この方法は試料がメッシュの空孔部で浮いた構成となるため，目的とする観察対象がメッシュ空孔部に位置するように試料作製する作業は容易ではない。そこで，特許文献１では，電子顕微鏡での観察向けに試料を直接載置することが可能な電子検出器が提案されている。

物体の微小領域を観察する手段は荷電粒子線顕微鏡だけでなく，光学顕微鏡を用いることも可能である。光学顕微鏡を用いた場合，電子顕微鏡では原理的に取得できない試料の色情報を取得できる。光学顕微鏡は白色光または特定の光を照射して試料に吸収または試料から放出された色情報をもつ透過光を結像することによって得られる。これを応用することで，例えば，生体細胞試料内部に特定の染色材を導入することで細胞内の特定領域を染色できるので，その色情報を抽出することによって染色領域または非染色領域の分布状況を可視化できる。このような手法は，特に病理診断やライフサイエンスの分野で広く用いられている。

荷電粒子線顕微鏡では色情報を取得できないが，光学顕微鏡では難しい微小領域の高分解能観察が可能である。さらに，荷電粒子線顕微鏡では試料の密度差を反映した情報も得られる。

特開平１０−２８３９７８号公報

特許文献１の検出器兼試料台は，半導体や金属膜などと電気配線等で配線された電気系の上に直接試料を載置している。この検出器兼試料台には配線が接続されているため，同じ試料を他の装置で観察するには電気配線を外す必要がある。また，培養細胞を観察する場合は，予め顕微鏡観察用の試料台上で試料自体を培養する必要がある。しかし，この検出器兼試料台で試料を培養しようとすると，高電圧を印加するための電気配線が繋がった回路を培養液等の中に浸さなければならず，目的とする観察対象の検出器兼試料台への載置が困難となる場合がある。以上のように，従来技術では透過荷電粒子による観察において試料の設置や取り出しに手間がかかっていた。

本発明は，かかる問題に鑑みてなされたもので，透過荷電粒子による像観察を簡便に行うことができる荷電粒子線装置，試料観察方法，試料台，観察システム，および発光素子を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の試料ホルダは、設置される試料の内部を透過又は散乱した荷電粒子により発光する発光部材が載置される試料載置部と、発光部材の試料が載置される面と非平行な面から出射される光を検出器の方向へ伝達する光伝達経路を構成する光伝達部材と、を有することを特徴とする。または、試料ホルダは、設置される試料の内部を透過又は散乱した荷電粒子により発光する発光部材が載置される試料載置部と、発光部材からの光を検出器の方向へ集光する集光手段とを有する。

さらに、観察システムとして、荷電粒子線を発生する荷電粒子線源と、設置される試料の内部を透過又は散乱した荷電粒子により発光する発光部材と、発光部材の試料が設置される面と非平行な面から出射される光を検出する検出器と、検出器からの信号に基いて試料の像を生成する画像生成部とを有することを特徴とする。

さらに、画像生成方法として、荷電粒子により発光する発光部材に載置された試料に対し、荷電粒子線を照射する工程と、試料を透過又は散乱した荷電粒子により発光部材から生じた光を発光部材の試料が載置される面と非平行な面から出射する工程と、出射された光を検出器の方向へ伝達する工程と、伝達された光を検出器により検出する工程と、検出器からの信号に基いて、試料の像を生成する画像生成工程とを有することを特徴とする。

本発明によれば，試料が載置された発光素子を発光させて，その発光を光伝達手段により効果的に検出器に導くことにより，透過荷電粒子による像観察を簡便に行うことができる。上記以外の課題，構成及び効果は，以下の実施形態の説明により明らかにされる。

光学顕微鏡観察と荷電粒子線顕微鏡観察の概略説明図。 検出素子を具備した試料台の詳細図。 生体試料の観察方法と３Ｄ観察方法の説明図 生体試料の観察方法と３Ｄ観察方法の説明図 生体試料の観察方法と３Ｄ観察方法の説明図 基本的な検出原理説明図 実施例１における荷電粒子顕微鏡観察を実施するための全体構成図 実施例２における集光レンズを用いた集光方法の構成図 実施例２における側面レンズを用いた集光方法の構成図 発光素子の試料台ユニットへの固定方法の詳細図 実施例２における発光素子側面から発光を集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子側面から発光を集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子側面から発光を集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子から発光をミラーとレンズを持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子から発光をミラーとレンズを持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子から発光をミラーとレンズを持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子から発光をミラーとレンズを持った試料台ユニットの構成図 楕円ミラーの特性の説明図 実施例２における発光素子からの発光を楕円ミラーで集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子からの発光を楕円ミラーで集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子からの発光を楕円ミラーで集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例２における発光素子からの発光を楕円ミラーで集光する手段を持った試料台ユニットの構成図 実施例３におけるサイドエントリー型の荷電粒子顕微鏡装置構成図 実施例３におけるサイドエントリー型の荷電粒子顕微鏡装置構成図 実施例３におけるサイドエントリー型の荷電粒子顕微鏡装置構成図 実施例３におけるサイドエントリー型の荷電粒子顕微鏡装置構成図 実施例３におけるサイドエントリー型の荷電粒子顕微鏡装置構成図 実施例３におけるサイドエントリー型向け試料ユニットの先端形状詳細図 実施例３におけるサイドエントリー型向け試料ユニットの構成図 実施例３におけるサイドエントリー型向け試料ユニットの構成図 実施例３におけるサイドエントリー型向け試料ユニットの構成図 生体試料の表面像及び透過像の観察写真

以下，図面を用いて各実施形態について説明する。

以下では，本発明における試料台ユニット２４の詳細及び当該試料台ユニットが適応される荷電粒子線装置３６について説明する。ただし，これは本発明の単なる一例であって，本発明は以下説明する実施の形態に限定されるものではない。本発明は，荷電粒子線３５を照射することによって試料を観察する装置，例えば走査電子顕微鏡，走査イオン顕微鏡，走査透過電子顕微鏡，これらと試料加工装置との複合装置，またはこれらを応用した解析・検査装置にも適用可能である。なお，本発明における試料台ユニット２４と当該試料台ユニット２４が載置される荷電粒子線装置３６とにより，透過荷電粒子線像の観察が可能な観察システムを構成する。

本明細書において「試料台」とは発光素子２３を固定するための部材であり，発光素子の下部，もしくは側面にある。「試料台ユニット」とは試料を載置した状態で荷電粒子線装置から試料とともに取り外しできるユニットのことを意味する。具体的には，以下で説明するように，当該「試料台ユニット」は発光素子２３と試料台２５，集光手段とによって構成されていてもよく，発光素子のみで構成されていてもよい。「試料ステージ」は試料台ユニットや光検出器等によって構成されていてもよく，発光素子のみで構成されていてもよく，荷電粒子線装置２の試料室内で観察視野の移動を可能とする構造体を指す。なお、試料９は例えば生体試料、高分子材料等の一次荷電粒子線を透過するものであれば何でも構わない。

はじめに，本実施例の概要に関して説明する。本実施例では，試料内部を透過または散乱した荷電粒子線を光に変換し，その光を検出することで透過荷電粒子線像を生成する荷電粒子顕微鏡，観察システムについて説明する。より具体的には，試料が載置される試料台の少なくとも一部は荷電粒子線の照射により発光する発光素子で形成され，当該発光素子上にある試料を透過または散乱した荷電粒子線が当該発光素子に照射されることで光が発生し，荷電粒子顕微鏡に備えられた検出器でこの光を検知することで，透過荷電粒子線像を生成する。つまり，本実施例では試料を透過した荷電粒子線を直接検出するのではなく，光に変換して検出する。以下に詳述するように，荷電粒子線を光に変換する発光素子は外部から接続される電源ケーブルや信号線等の配線が不要である。そのため，同じ試料台を用いて荷電粒子線顕微鏡とその他の装置で観察することができ，装置間の試料の移動に際し電気配線の着脱が不要となる。また，発光素子自体または発光素子を有する試料台を簡単に着脱できるので，どのような試料でも試料台上に載置出来る。このような構成は特に，顕微鏡観察用の試料台上で試料自体を培養させる必要がある培養細胞などを観察する場合に有効である。

図１に示すように，本実施例の試料台２５を用いた場合，荷電粒子線顕微鏡による観察と光学顕微鏡２９などの他の装置による観察を同じ試料台２５で行うことができる。図１には本実施例における荷電粒子線を光に変換または増幅して発光させることが可能な発光素子２３（検出素子ともいう）と発光素子２３を支持する支持部材２１を具備する試料台２５と，発光素子からの光を集光する集光手段５０と，光検出器４と，荷電粒子線顕微鏡２と，光学顕微鏡２９を示す。試料９は試料台２５の上に載置される。

本実施例において，この試料台２５に具備された発光素子２３は透明な部材で作られていることが望ましい。以下，本明細書において，「透明」とは，特定の波長領域の可視光もしくは紫外光もしくは赤外光が通過可能，またはすべての波長領域の可視光もしくは紫外光がもしくは赤外光通過可能ということとする。紫外光は波長がおおよそ１０〜４００ｎｍであり，可視光は波長がおおよそ３８０ｎｍから７５０ｎｍであり，赤外光とは波長がおおよそ７００ｎｍ〜１ｍｍ（＝１０００μｍ）程度の波長の領域のことを言う。例えば，多少の色が混在していても透けて見えれば特定の波長領域の可視光が通過可能ということであり，無色透明であればすべての波長領域の可視光が通過可能という意味である。ここで「通過可能」とは少なくとも当該波長領域の光によって光学顕微鏡２９による観察が可能な光量の光が通過することを指す。典型的には透過率５０％以上であることが望ましい。

また，ここで特定の波長領域とは少なくとも光学顕微鏡２９の観察に用いる波長領域を含む波長領域である。そのため，本実施例の試料台２５の一面側からの光が試料９を透過することによって得られる「光透過信号」を試料台２５のもう一面側から検出することが可能な一般的な光学顕微鏡２９（典型的には透過型光学顕微鏡２９）に用いることが可能である。光学顕微鏡２９としては，生物顕微鏡，実体顕微鏡，倒立型顕微鏡，金属顕微鏡，蛍光顕微鏡，レーザ顕微鏡等，像観察に光を利用する顕微鏡ならばどんなものでもかまわない。また，ここでは説明のために「光学顕微鏡」と記載するが，本発明は画像の拡大率に関らず，試料９に光を照射することで情報を取得する装置一般に適用可能である。

本実施例では，荷電粒子線顕微鏡２内で発生された荷電粒子線が試料に照射された後に試料９の内部を透過または散乱した「透過荷電粒子信号」を，試料台２５に具備された発光素子２３にて光に変換して検出することにより，透過荷電粒子顕微鏡画像として取得できる。

また，荷電粒子線顕微鏡２と光学顕微鏡２９では得られる情報が異なるため，近年は荷電粒子線顕微鏡２光学顕微鏡２９の両方で同一試料９を同一視野で観察したい要求が増えている。しかしながら，例えば特許文献１の検出器兼試料台は光が透過できず，実質的に光学顕微鏡２９では観察が困難なため，専ら荷電粒子線顕微鏡向けの試料台であった。このため，荷電粒子線顕微鏡向けの試料９と光学顕微鏡２９向けの試料９を別々に作製する必要があり，試料作製に手間がかかる等の課題があった。

以下で，試料台ユニット，試料搭載方法，画像取得原理，装置構成等の詳細に関して説明する。

図２を用いて，本実施例における試料台２５の詳細について説明する。本実施例の試料台２５は荷電粒子線を光に変換する発光素子２３とそれを支持する支持部材２１（透明である場合には透明部材ともいう）から構成される。光学顕微鏡２９での観察と荷電粒子顕微鏡での観察を同じ試料台で行う場合には，発光素子２３と支持部材２１を含む試料台２５は透明であることが望ましい。試料は発光素子２３上に直接載置される。または，後述するように膜などの部材を介して間接的に載置されても良い。支持部材２１は無色透明であることが望ましいが，多少の色が混入していてもかまわない。例えば，支持部材２１の材料として，透明ガラス，透明プラスチック，透明の結晶体などがある。蛍光顕微鏡などで観察する場合は蛍光が吸収されない方が望ましいため，透明プラスチックが好ましい。本実施例の試料台２５では，少なくとも，試料９が配置される箇所と試料台２５において試料９が配置される箇所と対向する面との間にある発光素子２３と支持部材２１とが「透明」であれば光学的な顕微鏡観察が可能である。なお，後述するように支持部材２１は必須の構成ではない。

発光素子２３は，例えば数ｋｅＶから数１００ｋｅＶぐらいまでのエネルギーで飛来する一次荷電粒子線を検知し，一次荷電粒子線が照射されると可視光や紫外光や赤外光などの光を発光する素子である。本実施例の試料台２５に用いられる場合，当該発光素子２３は試料台２５に載置された試料９の内部を透過または散乱した荷電粒子を光に変換する。発光素子２３としては例えばシンチレータ，ルミネッセンス発光材，ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）素子やＹＡＰ（イットリウム・アルミニウム・ペロブスカイト）素子などである。発光波長は，可視光，紫外光，赤外光のうち特定のまたは任意のいずれかの波長領域であればよい。シンチレータの例としてはＳｉＮなど無機材でできた無機シンチレータや，ポリエチレンテレフタレートなど発光することが可能な材料が含有するプラスチックシンチレータあるいは有機シンチレータや，アントラセンなどが含有した液体シンチレータが塗布された材料などである。荷電粒子線を光に変換可能な素子であれば発光素子２３はどのような材料であってもかまわない。

なお，発光素子２３は着脱可能な固体に限らず，荷電粒子線が照射されることによって蛍光を発生する蛍光剤がコーティングされた薄膜やサンプル内に吸収し，荷電粒子線の照射により発光する微粒子でもよい。本実施例では，これらも含め，荷電粒子を受けることにより光を発生する部材を総称して発光素子２３と称する。荷電粒子線の固体内平均自由行程は荷電粒子線の加速電圧（照射エネルギー）に依存し，数十ｎｍから数十μｍである。このため，発光素子２３内の発光領域は，試料９を透過した荷電粒子線の侵入する領域とほぼ一致する。よって，発光素子２３で発生する光を効率良く捕集するためには，発光素子２３の厚みは試料９を透過する荷電粒子線が発光素子２３に侵入する深さを上回っていればよい。一方，光学顕微鏡２９による観察を同じ試料台で行う場合は，光信号をできるだけ多く透過させる必要がある。このため，多少の色が混入した発光素子２３を用いる場合は，発光素子２３の厚みは薄い方が好ましい。

本発明で使用される光検出器４として，フォトダイオードや光電子増倍管（ホトマルチプライヤ，ＰＭＴともいう）がある。これらについて，以下で説明する。

フォトダイオードは簡易な回路で動作可能，小型のため設置場所の制限が少ない，ノイズが少ないなどの利点がある。しかし，出力信号が小さく，低Ｓ/Ｎが欠点となる。このため，フォトダイオードを検出器として使用する場合は，出力電流を増幅するためのプリアンプを検出器近傍に設置するとよい。

光電子増倍管は検出面から入射した光を光電子に変換し，その電子をダイノードで最大約６桁程度の増幅率で検出できる素子である。検出器自体に増幅機能があるため，信号を強く出来る利点があり，また，ダイノードの印加電圧で検出感度を調整できる。これにより，荷電粒子線の透過率が異なる構造物を多く含む試料の観察で使用した場合に，光電子増倍管の検出感度を変えて多様な試料情報が得られる。しかし，フォトダイオードと比べサイズが大きく設置自由度が小さい欠点がある。また，センサ動作のために１ｋＶ程度の電圧印加が必要であり，外部から高電圧配線用のフィードスルーや電界が外に漏れないシールド線を接続して使用される。高電圧増倍管と高電圧用回路を組合せて搭載したセンサもあるが，サイズが更に大きくなり，設置場所の制約を受けやすい。

光検出器は光電子増倍管のように自身で増幅作用を有する検出器でもよいし，フォトダイードのように光から電流への変換機能しか有さないものでもよい。

集光手段５０とは，試料を通過した荷電粒子線が発光素子２３により変換された光を
集めて光検出器４の検出面５にて検出させる手段である。具体的には、視野移動や傾斜角度を変えるために試料台ステージが可動（ＸＹ軸及びＺ軸，傾斜回転軸θ軸）した場合でも，光検出器４の検出面５に対して集光される光量の変化を最小限に抑えるように設置された部材である。主に光学レンズ，フレネルレンズ，プリズム，鏡の組み合わせなどにより実現する。試料台ユニットの構造に適した集光手段を設計・作成して適用することで，検出光量の変化を最小限に抑えることができる。

光伝達経路２０３は単なる空間でもよいが、発光素子２３からの光を伝達することが可能なガラスや石英やプラスチックなどの光伝達物質であってもよい。光伝達経路の少なくとも一部を構成する部材を光伝達部材と称することとする。光伝達部材は例えば支持体３３やライトガイドなどの光伝達物質である。また、光伝達経路の途中にレンズなどの集光部材やミラーなどの反射部材がある場合には、これらも光伝達部材に含まれるものとする。

ここで，図５に一般的な荷電粒子線装置に本実施例の試料台ユニット２４を搭載した装置の構成例を記載する。荷電粒子顕微鏡２は，主として，荷電粒子光学鏡筒を装置設置面に対して支持するための筐体１０（以下，真空室と称することもある）およびこれらを制御する制御系によって構成される。荷電粒子顕微鏡２は荷電粒子光学鏡筒３と筐体１０の内部は真空ポンプ７により試料室内の圧力が制御される。真空ポンプ７の起動および停止動作も制御系により制御される。図５中に記載されている真空ポンプ７は一つのみであるが，二つ以上あってもよい。

荷電粒子光学鏡筒３は，一次荷電粒子線を発生する荷電粒子源１１，発生した荷電粒子線を集束して鏡筒下部へ導き，一次荷電粒子線を試料上に収束するためのレンズ１などの要素により構成される。荷電粒子光学鏡筒３は筐体１０内部に突き出すように設置されており，真空封止部材２０を介して筐体１０に固定されている。荷電粒子光学鏡筒３の端部には，上記一次荷電粒子線３５の照射により得られる二次的荷電粒子（荷電粒子線装置が電子顕微鏡の場合は二次電子または反射電子等）を検出する検出器３８が配置される。検出器３８は図示した位置ではなくても筺体１０内部であればどこでもよい。

試料９に到達した荷電粒子線によって試料９内部または表面から反射荷電粒子や透過荷電粒子などの二次的荷電粒子を放出する。この二次的荷電粒子を検出器３８にて検出する。検出器３８はエネルギー数ｋｅＶ〜数１００ｋｅＶで飛来する荷電粒子線を検知及び増幅できる素子である。例えば，シリコン等の半導体材料で作られた半導体検出器や，ガラス面またはその内部にて荷電粒子信号を光に変換することが可能なシンチレータ等である。

本実施例の荷電粒子顕微鏡は，制御系として，装置使用者が使用するコンピュータ１４，コンピュータ１４と接続され通信を行う上位制御部１５，上位制御部１５から送信される命令に従って真空排気系や荷電粒子光学系などの制御を行う下位制御部１６を備える。コンピュータ１４は，装置の操作画面（ＧＵＩ）が表示されるモニタと，キーボードやマウスなどの操作画面への入力手段を備える。上位制御部１５，下位制御部１６およびコンピュータ１４は，各々通信線１７，により接続される。

下位制御部１６は真空ポンプ７，荷電粒子源１１やレンズ１などを制御するための制御信号を送受信する部位であり，さらには検出器３８の出力信号をディジタル画像信号に変換して上位制御部１５へ送信する。図では検出器３８からの出力信号を，プリアンプ３９などの増幅器２８を経由して下位制御部１６に接続している。もし，増幅器が不要であればなくてもよい。

上位制御部１５と下位制御部１６ではアナログ回路やディジタル回路などが混在していてもよく，また上位制御部１５と下位制御部１６が一つに統一されていてもよい。なお，図５に示す制御系の構成は一例に過ぎず，制御ユニットやバルブ，真空ポンプ７または通信用の配線などの変形例は，本実施例で意図する機能を満たす限り，本実施例の荷電粒子線顕微鏡２の範疇に属する。

筐体１０には，一端が真空ポンプ７に接続された真空配管１３が接続され，内部を真空状態に維持できる。同時に，筐体１０内部を大気開放するためのリークバルブ１２を備え，試料台ユニット２４を装置内部に導入時に筐体１０の内部を大気開放することができる。リークバルブ１２は，なくてもよいし，二つ以上あってもよい。また，筐体１０におけるリークバルブ１２の配置箇所は，図５に示された場所に限られず，筐体１０上の別の位置に配置されていてもよい。

筐体１０は側面に開口部４０を備えており，この開口部４０には蓋部材２２及び真空封止部材２０によって装置内部の真空気密を保っている。本実施例の荷電粒子顕微鏡２は，前述のように試料台２５に搭載された試料９を筺体１０内部に導入した後に試料９と荷電粒子光学鏡筒３との位置関係を変更するための試料ステージ８を備えている。試料ステージ８には前述の発光素子２３または発光素子２３を有する試料台２５が着脱できるように配置される。蓋部材２２が支持する底板となる支持部材２１が取り付けられており，ステージ８が支持部材２１に固定されている。ステージ８は，面内方向へのＸＹ駆動機構および高さ方向へのＺ軸駆動機構などを備えている。支持部材２１は，蓋部材２２の対向面に向けて筺体１０内部に向かって延伸するよう取り付けられている。Ｚ軸駆動機構およびＸＹ駆動機構からはそれぞれ支軸が伸びており，各々蓋部材２２が有する操作つまみ１８−１および操作つまみ１８−２と繋がっている。装置ユーザは，これらの操作つまみ１８−１，１８−２を操作することにより，試料９の位置を調整することが可能である。また，後述するように，蓋部材２２上には光学顕微鏡２９が具備できる構成としてもよい。

試料ステージ８の上には発光素子２３を具備した試料台２５を搭載できる。前述の通り発光素子２３では荷電粒子線を光に変換する。この光を検出して電気信号に変換及び信号増幅するための光検出器４を試料ステージ上またはステージ近傍，筐体１０外に備える。

なお、発光素子２３及び試料台２４，試料台ユニット２５，集光手段５０の性能は装置内雰囲気に関係しないため，大気圧状態から高真空状態までさまざまな真空度条件下で使用可能である。

以下で，本実施例の試料台を用いた光検出方法及び透過荷電粒子線画像の取得原理について説明する。図４は，発光素子２３上に試料９が載置された状態を示す。試料台２５の下には光検出器４を示している。光検出器４は発光素子２３からの光信号を電気信号に変換または増幅することが可能である。この発光をできるだけ多く光検出器４にもたらすために集光手段５０が設けられる。集光手段５０は，光学レンズ，フレネルレンズ，プリズム，鏡の組み合わせなどにより実現され，発光素子２３から出てきた発散する光１０８を集めるように配される。変換または増幅された電気信号は通信線１７を介して制御部やコンピュータ１４に入力され，これらの制御系により画像化され，これが透過荷電粒子線画像１５３となる。この透過荷電粒子線画像１５３は，必要に応じてモニタ等に出力されるものとする。

光検出器４と試料台２５との間（図中ｈ部分）の空間領域は，集光手段５０に依存して光を可能な限り効率よく検出するように，最良の範囲が決まる。最良の範囲とは、例えば、集光手段として凸レンズを使用する場合、発光素子の発光が検出器の検出面に対して最も集光できる焦点距離のことである。

ここでは，試料内で密度が高い部位１００と密度が低い部位１０１があることを考える。試料内で密度が高い部位１００に一次荷電粒子線３５が照射された場合，荷電粒子線の一部が後方散乱されるため，発光素子２３に到達する透過荷電粒子の数は少ない。一方，試料内で密度が低い部位１０１に一次荷電粒子線３５が照射された場合，荷電粒子線の大多数は散乱されずに発光素子２３まで透過する。その結果，発光素子２３で試料９内部の密度差を検出することが可能となる。この時，透過する荷電粒子線量は，照射される荷電粒子線３５のエネルギーに依存する。そのため，荷電粒子線のエネルギーを変えることで観察したい内部情報やその領域を変えることも可能である。

図１９に、本実施例の検出原理で取得した透過像（図１９−（ａ））と反射電子検出器で取得した表面像（図１９−（ｂ））を示す。表面像では得られなかった情報が透過像では多く確認できた。ここで、図１９の撮影条件は、印加電圧５ｋＶ、倍率が約４０００倍である。

細胞の内部構造はその細胞の種類によって異なり，核を中心にミトコンドリア，ゴルジ体，小胞体等の様々な小器官を有する。透過する荷電粒子線量は内部構造体の位置や部位に依存する。このため，試料９の傾斜角度を変えて荷電粒子線３５を照射し，透過した荷電粒子を検出し，複数の方向から取得した透過荷電粒子線画像を三次元的に再構成することで，内部構造の位置や部位が可視化される。

次に，図３を用いて荷電粒子線による試料９の内部構造の可視化原理を説明する。図では試料９と荷電粒子線３５が照射される際の相互関係を示す。試料９には密度が比較的小さい物質１０１の中に，密度が比較的大きい内部物質１００と内部物質１０２と内部物質１０３を持つ。内部物質１０３は内部物質１００，１０２に比べサイズおよび密度が小さいとする。試料９として例えば細胞試料などを考えると，物質１０１は細胞内部であり，この物質１０１の内部に含まれる内部物質１００，１０２，１０３は細胞核などの細胞小器官などに対応する。

試料９に照射された荷電粒子線３５は，荷電粒子光学鏡筒３の軸である光軸１０６に対し垂直な面内で走査され，その結果，発光素子２３によって光信号に変換された信号を顕微鏡画像としてモニタ上に表示される。図３（ａ）において，密度が小さい内部物質１０３と比べ密度が大きい内部物質１００，１０２で後方散乱される荷電粒子線３５が多い。このため，試料９上で荷電粒子線を走査した際に試料９下側で検出して得られる画像（または検出画像，透過荷電粒子画像）は投影画像１５０のようになる。このため，図３（ａ）に示すように，投影画像１５０上の内部物質１００と内部物質１０２との距離Ｃは実際の距離とは異なる。内部物質１０３付近に照射された荷電粒子線の多くは後方散乱される荷電粒子の数が内部物質１００，１０２と比べて少なく，透過して検出される結果，検出信号が物質１０１と比べ差が小さい場合は検出されず，投影画像１５０には反映されない。

次に，図３（ｂ）は荷電粒子線３５のエネルギーＥを図３（ａ）の場合よりも小さくした場合の説明図およびその場合に得られる投影画像１５１である。図３（ａ）や図３（ｂ）において，エネルギーＥの大きさは図中矢印の太さで明示的に図示されている。エネルギーＥが小さい場合，内部物質１０３で後方散乱される荷電粒子の数が増える。これによって，投影画像（または検出画像，透過荷電粒子画像）１５１には内部物質１００，１０２の構造に加えて内部構造１０３の情報が反映される。これは，エネルギーの小さい荷電粒子線ほど物質での散乱を受けやすくなる性質に起因する。

図３（ａ）と図３（ｂ）で得られる投影画像からは，内部物質１００と内部物質１０２と内部物質１０３の三次元位置関係は不明である。そこで，荷電粒子線３５の入射方向と試料との相対角度を変えて複数の投影画像を取得する。具体的には試料９自体を傾斜するか荷電粒子線３５の入射方向自体を光軸１０６に対して傾斜する。この複数の投影画像に基づいて内部構造の三次元位置配置を把握することが可能となる。図３（ｃ）では試料台２３を角度θ傾斜することによって，荷電粒子線を斜めから試料９に照射する様子を図示する。投影画像１５１と投影画像（または検出画像）１５２を比較すると，内部物質１００と内部物質１０２と内部物質１０３の間の距離が変化する（図中Ｃ’部やＤ’部）。さらに，物質１０１の大きさも変化する（図中Ｂ’部）。つまり，投影画像１５１と投影画像１５２比較して観察して変化量をみることによって，試料９全体及び内部の三次元内部構造観察をすることが可能となる。

また，図示しないが，荷電粒子線３５のビーム径および検出器４，３９の検出信号はビーム電流量に依存する。このため，前記ビーム電流を変えることによって，観察したい内部構造のサイズを制御できる。つまり，試料内部の見たい情報と見たくない情報を分離する目的で，荷電粒子線のビーム電流量を制御パラメータとして利用することができる。

以上をまとめると，三次元内部構造観察を実施するためには，荷電粒子線３５が試料９に照射される際の相対的な照射角度θ，のエネルギーＥ，およびビーム電流量Ｉが重要となる。これは荷電粒子線３５のベクトルそのものである。本明細書において，上記θ，Ｅ，Ｉを組にしてベクトルパラメータと称する。すなわち，ベクトルパラメータとは一次荷電粒子線３５と試料９との相互関係を決定するパラメータであるといえる。つまり，ベクトルパラメータ（θ，Ｅ，Ｉ）を制御することによって，ベクトルパラメータを変えて取得した複数の透過荷電粒子画像に基づいて試料台上の試料９の内部構造を観察できる。これらの画像を並べて観察したり，連続的に表示することにより，内部構造の詳細を三次元的に把握できる。また，内部構造の距離や面積などの大きさを計測していくつかの画像を比較することによって三次元内部構造の定量化も可能となる。なお，上記「ベクトルパラメータの変更」とは，一次荷電粒子線３５と試料９との相対的な角度θ，一次荷電粒子線の入射エネルギーＥ，荷電粒子線のビーム電流量Ｉの少なくとも一つを変更することを意味する。

また，リアルタイムに内部情報を迅速に取得したい場合がある。例えば，後述するように，試料９が自動で動いてコンピュータ１４断層撮影法（ＣＴ）によりトモグラフィー化する際などである。この場合，荷電粒子線装置内部に配置される時間が限られる。このような場合は，照射角度θとエネルギーＥとビーム電流量Ｉをセットにしてリアルタイムに変更してもよい。これにより，試料内部の可視化したい情報をより迅速に取得できるようになる。

本発明の第二の実施例として，集光手段５０として集光凸レンズ５１を用いた場合の構成例について，図６を用いて説明する。図示しないが，本実施例で集光される発光素子２３の発光波長は，可視光，紫外光，赤外光のうち特定のまたは任意のいずれかの波長領域とする。

集光手段５０がない場合，発光素子２３と光検出器４を限界まで近接させることで，より多くの光を光検出器４にもたらすことができるが，その場合，観察視野を広くしようとすると，光検出器４の検出面５を大きくする必要がある。このため，検出面５の大きいフォトダイオードを光検出器４として用いると，静電容量の増加に起因して検出に要する応答時間が増大し，像取得およびその再構築に要する時間が増えるため，粒子線装置で非点調整や焦点合わせなどがしにくくなるという問題がある。また，フォトダイオードの代わりに光電子増倍管を光検出器４として用いる場合は，光検出器４全体のサイズが大きくなる。このため，試料室サイズが大きくなるに伴う製造コストの増大や，光検出器４の設置自由度が悪くなるなどの課題が生じる。これらの問題を回避するには，光検出器４の検出面５は小さいもののほうが好ましい。応答周波数にして百ｋHz以上あれば，比較的遅いスキャンで像形成し，これを目視で確認しながら焦点合わせや非点補整を行うことで，最適分解能の画像が得られる。応答速度がより高速，例えば数百ｋHzとなれば，比較的速いスキャンでこれらを実行できるため，より高い効果が得られる。さらに高速で１MHｚ以上，典型的には１秒間に三十フレーム以上の帯域があれば，テレビレートのスキャンでの観察が可能となり，帯電しやすい試料を観察する際に有利である。

図６（ａ）は，発光素子２３と光検出器４の間に発光素子２３からの放出された光１０８を集光するための集光レンズ５１−１を配置する構造の例である。図中の試料台２５を支えている部材２１は導電性及び非磁性体の材質，例えばステンレス等であるとよい。集光レンズ５１−１は，発光素子２３から発光した光１０８を効率的に検出面５へ，集光させる役割を持っている。また，図示はしないが集光レンズの焦点距離を最適化することで光検出器４の検出面５に集光される光のスポット径を調整できる。これにより，検出面５の小さい光検出器４，典型的には，高速処理可能なPIN-フォトダイオードや小型の光電子増倍管等でも高感度での検出が可能となる。図６（ｂ）は，試料台に発光素子２３用のくぼみを形成，そのくぼみに発光素子２３を設置する構造例である。くぼみにはめることで，試料ステージ可動時の衝撃による，発光素子２３の位置ずれを低減できる。

集光レンズの材質は，光を集光出来るものであれば何でもよい。集光レンズの材質がガラスやプラスチック等の非導電性材料である場合，荷電粒子線が照射されるとチャージアップが発生する。その対策として，光が透過可能な透明導電膜を集光レンズにコートするとよい。

図７に示すように，支持部材が図６（ａ）および図６（ｂ）における集光レンズとして使用される構成としても構わない。図７に示した例は，支持部材がフレネルレンズ５４で構成されている場合を示す。

図６および図７の可動領域１５４に含まれている部材，具体的には発光素子２３，試料台２４，集光手段５０，光検出器４は試料ステージ８と一体化しているため，試料ステージ８の動きに追従する構造になっている。そのため，発光素子２３から光検出器４間に光路変化が無いので，集光効率変化が少ないといえる。

図８に，発光素子２３の支持部材２１への固定方法の例を示す。これらの固定方法は試料台ユニットや試料台ステージにも設置可能である。図８（ａ）は，導電性テープを使用して発光素子２３を支持部材２１へ固定した例である。この場合，なるべく発光行路を阻害しないように発光素子２３の両端を留めるとよい。また，荷電粒子線顕微鏡用の導電性テープ１１２を使用し，アースに落とすことにより，試料台のチャージアップ防止対策になる。図８（ｂ）は，両面テープを使用して発光素子２３を支持部材２１へ固定した場合の例である。発光素子２３全面に試料があるときでも，試料を傷つけずに固定できるメリットがある。図８（ｂ）では発光素子２３に両面テープ１１３を接触させることによる汚れが発生する恐れがある。これを回避するため，図８（ｃ）に，発光素子２３と支持部材２１を金属等の部材で機械的に固定する方法の例を示す。上から押さえつける形態の場合，支持基板となる試料台の構成で発光素子２３のサイズが制約されてしまうため，専用の構造を試料台ユニットに対して設計・作製する必要があるが，繰り返し何度も使用できるため，発光素子２３を何度も交換するような観察用途の場合に便利である。図示はしないが，図８−（ａ），（ｂ），（ｃ）において固定する部材は発光素子２３と試料台ユニットまたはステージでもよい。

また、固定する部材は接着剤等接着効果を有するものでも可能であるが、真空装置内に入れる際は、ガスの発生しないものを使用するほうがよい。

図９に，四角形の板状の発光素子２３内部で発光した光のうち、発光素子２３の側面から放出される光を集光する構造の例について説明する。図９（ａ）は断面図，図９（ｂ）は鳥瞰図である。本実施例に使用される発光素子において，光が発光素子２３の外部放出される面は試料が載置される面（上面），試料が載置される面と平行な裏面（下面），および４つの側面である。光は全方位に均等に放射するが、発光素子の屈折率が大きいため、光の一部は下面で全反射され、その一部は各側面から発光素子外部に放出される。この時、各側面から放出される光量は下面と概ね同量となるため、下面に加え側面から放出される光を検出した場合、下面のみの場合と比較して検出量が約５倍ものと期待される。側面からの光１１０を集光する手段として，発光素子２３側面に側面ミラー６１を配置した。側面ミラー６１で反射した光は支持部材２１を通過し，集光手段５０にて集光され，光検出器４の検出面５で検出される。側面ミラー６１の材質はアルミニウム（Ａｌ）や金（Ａｕ）等の光を反射するものであればなんでも構わない。この時，支持部材２１は光を透過することが出来る部材，たとえば石英，ガラス，プラスチック等であることが望ましい。支持部材２１が非導電性の場合は，荷電粒子線照射時にチャージアップが発生するため，支持部材２１に光の通過を阻害しない透明導電膜を作成することがよい。また，側面ミラー６１は支持部材２１と一体化，もしくは可動した際に支持部材２１に一緒に動くような構造である。図９（ｃ）は，側面ミラー６１を楕円形ではなく，表面が平らな斜面ミラーを用いた構造である。楕円ミラーと比べて集光効率は低下するが，作製が容易なため安価である。

また、図９で示した側面ミラーを設置して発光素子２３の側面から発光素子外に放出される光を検出器に導く構造は図６，図７の構造に対しても適用可能である。

図１０に集光ミラー５６−１及び集光レンズ５１−１を組み合わせた構造の例を示す。図１０（ａ）は，図中の破線で囲われた範囲内に記載された全ての部材が試料ステージ８と設置している構造である。試料ステージ移動時も発光素子２３−集光レンズ５１−１−光検出器４間の行路に位置的な変動がないため，集光効率の変化が少ない点が特徴である。図１０（ｂ）は，破線で範囲内にある発光素子２３，支持部材２１，集光ミラー５６−１，集光レンズ５１−１，レンズ支え５７は試料ステージ８と機械的に固定している。そのため，試料ステージの可動に追従するが，光検出器４は試料ステージに固定されていないため，試料ステージの可動には追従しない。図示しないが，より集光効率を向上する目的で，集光レンズ５１−１と光検出器４間に集光レンズを複数枚重ねて設置しても良い。

図１０（ｃ）は，光検出器４が大気側に設定される場合の例である。発光素子２３で発生した光は，ミラー５６−１で集光レンズ５１−１の方向に反射される。集光レンズ５１−１で集光された光は，再びミラー５６−２および，ミラー５６−３で集光レンズ５１−２の方向に反射される。集光レンズ５１−２で集光された光は光伝達路６４に入射し，大気側にある光検出器４検出される。本実施の構造で試料ステージ８に接合している部材は図中の破線で囲まれたエリアの部材，たとえば支持部材２１，集光ミラー５６−１，−２，集光レンズ５１−１である。また，集光ミラー５６−３および集光レンズ５１−２は，できるだけサイズが大きいもので構成した場合の方が，試料ステージ移動による集光効率の変化が少ない。ここで重要なことは，傾斜試料の透過像を取得する際に，異なる傾斜角度ごとの検出信号の変化をできるだけ小さくすることである。この目的のために，図１０（ｃ）に一点鎖線で図示した傾斜回転軸は，試料９を通り光伝達路６４の真空側端面を通る直線となっている。このように集光手段５０を構成することで，発光素子２３からの光を効率良く光伝導路に入射させることができる。これにより，ステレオ観察や試料内部情報の三次元観察のための透過荷電粒子線画像を取得する際に，試料傾斜角度によらず光の捕集効率は一定となり，明るさの補正を不要となる。また，試料を大きく傾斜しても透過荷電粒子線画像を取得できる。図１０（ｃ）の構成の場合，観察視野を変えて同様の手段によってステレオ観察や試料内部情報の三次元観察のために，試料ステージ全体を一点鎖線で図示される傾斜回転軸の方向に平行移動することが可能である。その際，光伝達路６４の端面のどこかに光路が入っていれば同様の効果が得られるため，光伝達路６４の端面の大きさは装置使用の可能な範囲で大きくすることが有効となる。

図１０（ｄ）は，光検出器４を大気側においた例である。試料９に照射した荷電粒子線３５が試料９を透過して発光素子２３を発光させる。その光は集光ミラー５６−１，集光レンズ５１−１を通過後，反射円柱ミラー６５で集光後，光伝達路６４を伝い大気側に設置された光検出器４で検出される。本実施構造で試料ステージに接合している部材は図中の破線で囲まれたエリア１５４の部材である。ここでは光取り込み口の面積を大きくすることで，試料９の傾斜角度を変えたり，観察視野を変えるために光軸と垂直方向に試料９を移動しても取り込まれる光の量の変化が少ない。この光取り込み口を構成するものとしては，レンズや鏡，ライトガイドなどが用いられる。また，細長い中空のキャピラリーを光伝送方向に向けて多数束ねた物を使うと一層効果的である。

また、図９の発光素子２３側面から発光素子外に放出される光を検出器に導く構造は図１０の構造に対しても適用可能である。

図１２（ａ）は発光素子２３からの発光を効率良く集光しようとする場合の例である。図１１に示すように，回転楕円体の内面を鏡面とした場合，ひとつの焦点Ａから出た光は回転楕円体の表面で反射し，もうひとつの焦点Ａ‘に集まる性質がある。この性質を利用して，図１２（ａ）発光素子２３からの発光点，すなわち荷電粒子源１１から発生した荷電粒子線３５の照射位置を焦点Ａに重ね，光伝達路６４の入り口部分をもう一つの焦点Ａ’に重ねる。また，回転楕円体と荷電粒子線の光軸が交わる位置に，荷電粒子線３５の通過孔６６を設ける。以下，このような内面を鏡面とした回転楕円体を楕円ミラー６２と表記する。光伝達路６４の入り口部に集光した光は光伝達路６４内を通過し，光検出器４で検出後，信号線３７で外部へ出力される。楕円ミラーと光伝達路，光検出器で構成可能なため，少ない部品点数で集光できるメリットがある。

図１２（ｂ）には，２つの楕円ミラー及び２つの光検出器４を使用した試料台の構成を示す。２つの楕円の長手方向の中心軸が重なった部分（Ａ）が焦点となるよう発光素子２３をＡに設置する。発光素子２３上面からの発光は，上部に設置された楕円ミラー６２で反射，もうひとつの焦点（Ａ’）である光伝達路６４の入り口部分に集光され，光検出器４で検出される。また，上面同様に発光素子２３下面の発光は下面に設置された楕円ミラー６２と光伝達路および光検出器４で検出される。発光素子２３側面からの光は上下に設置された光検出器４のどちらかで検出される。楕円ミラーが上下で別の構造体となっているため，もし，本構造で二次電子像を観察したい場合は，上部楕円ミラー及び上部光検出器４を試料上部から移動できる構成とすれば良い。図示はしないが，ここで発光素子２３は試料ステージに接合しており，集光ミラー６２と光伝達路６４および光検出器４は固定部材である。

図１３に楕円ミラーを使用した場合の集光構造例を説明する。本構成のメリットは，ミラーが導電性の材料もしくは導電材料でコートされた部材であるため，チャージアップの心配がない点である。図１３（ａ）に，楕円ミラーを使用して放射した光を光検出器４の検出面５に集光する機能をもった構造を説明する。図１３（ａ）中の一点鎖線で示す観察細胞を通る軸のまわりで試料ステージを傾斜する際，試料ステージは光検出器４とは同一の動きをしないため，ステージ移動により光路が変動する。この変動によって検出器４の集光効率が低下しないように，楕円ミラー６２の一方の焦点を試料，もう一方の焦点を検出面４近傍に設定することにより，細胞のステレオ観察や三次元観察等が容易に行えることは前述のとおりである。

図１３（ｂ）は，発光素子２３及び集光用の楕円ミラー６２，光検出器４等が同一の部材で試料ステージに接合している構造例である。試料ステージ可動時に発光素子２３−光検出器４間の行路に変化がないことから，集光効率の変化を少なくできる。

図１３（ｃ）に大気側に光検出器４を設置した場合についての構造図を示す。発光素子２３から出た光が楕円ミラーで反射，光伝達路６４に集光され，光伝達路６４を通って，大気側に設置されている光検出器４で検出される構成になっている。この場合も同様に細胞のステレオ観察や三次元観察等が容易に行えるという特徴がある。光伝達路６４は，光を伝達することが可能な固体物質でもよいし，空気中や真空中などでもよい。発光の波長領域を通過させることが可能な固体材料とは，例えば，石英，ガラス，光ファイバー，プラスチック等，光に対して透明または半透明な材料である。

図１３（ｃ）は検出器が大気空間にあり，試料ステージに発光素子２３，支持部材２１，集光ミラー及び光検出器４が同一部材で接合している場合の構成例である。試料ステージの傾斜および移動に伴う集光効率の変化が小さい点を特徴とする。

本実施例で示したように、発光素子からの発光を集光手段を使用して検出器へ集光することで集光効率を向上させ、より明瞭な透過像観察が可能となる効果が得られた。また、試料を傾斜させて実施する立体観察においても、試料台傾斜による集光効率の低下を抑制することが可能である。

本実施例では，高分解能観察が可能なインレンズ型の走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＳＥＭ）や（Ｓ）ＴＥＭで主に使用されているサイドエントリー方式向けの試料台ユニットの構成例について説明する。実施例２の方式と比較して，微細な構造の観察が可能であり，さらに試料ステージの傾斜自由度が高いため，試料の立体構造観察の為のトモグラフィー観察を容易に実施できる。

本実施例における試料台ユニットの全体構成図を図１４(a)に、基本構成の断面図を図１４（ｂ）に、試料台ユニット先端部の斜視図を図１４（ｃ）示す。

本試料台ユニットは、試料ホルダを有し、少なくとも発光素子２３が載置可能な発光部材載置部２１５と、発光素子２３からの光を伝達する経路２０３が具備され本試料台ユニットの主部材となる棒形状の支持体３３と、光検出器４と、取っ手３４によって構成される。光検出器４は配線を経由して制御部１６などに接続される。光伝達経路２０３は単なる空間でもよいが、発光素子２３からの光を伝達することが可能なガラスや石英やプラスチックなどの光伝達物質であってもよい。光伝達経路の少なくとも一部を構成する部材を光伝達部材と称することとする。光伝達部材は例えば支持体３３、あるいはライトガイドや光ファイバーなどの光伝達物質である。また、光伝達経路の途中にレンズなどの集光部材やミラーなどの反射部材がある場合には、これらも光伝達部材に含まれるものとする。光検出器４あるいは光伝達部材のいずれかには真空と外気との気密を保つことが可能な真空封止部材であるＯリング３２が具備される。また、筐体１０などとの真空気密封じが可能なＯリング３２を支持体３３に備えてもよい。発光素子２３が載置可能な発光部材載置部２１５には図示しない固定部材等で発光素子２３が固定されて発光部材載置部２１５に固定されているものとする。また、試料台ユニットは図１４には図示されない駆動機構を備え、これによって必要量に応じた観察位置の移動や傾斜角度の変更が可能な構成となっているものとする。

本構成で発光素子２３に荷電粒子線が照射されると発光素子の内部で光が発生し、その光は発光素子表面から放出される。発光素子表面には、試料が載置されている面（上面）とその他の面がある。図９で説明したように、特に発光素子が四角形の板状の場合には、試料が載置される面（上面）、試料が載置される面と平行な裏面（下面）、そして、試料が載置される面に非平行な側面、つまり、４つの側面から発光素子２３の外部に光が放出される。図１４（ｃ）の構成は、発光素子２３の光検出器側の側面、およびその対向面から発光素子２３の外部に放出され発光部材載置部２１５との接触面で反射された光が光検出器４によって検出される構成となっている。

発光部材載置部２１５の先端部の形状はこれに限らず、図１４（ｄ）に示すように，回転軸２０２と直交する方向の発光素子２３側面から放出された光を検出するために、反射された光を光検出器４に導く構成となっていても良い。また、発光部材２３の形状もこれには限らず、図１４（e）に示すように、発光素子２３が台形の板状で側面部がミラーとなっており、反射された光が検出器４に光を導く構成となっていても良い。また、発光素子２３の側面は曲面でもよい。

図９で説明したとおり、四角形の板状の発光素子２３側面から発光素子外に放出される光は，試料が載置面と平行な裏面（下面）に加え，側面からも放出される。このため、下面および側面から発光素子外に放出される光を検出した場合、下面だけを検出する場合と比べ検出信号量が約５倍になると期待される。発光素子２３の側面から発光素子外に放出される光を検出器に導くことで、検出される信号強度が増大し、本実施例における透過像を高精度、高効率に取得することが可能となる。そのため、発光部材の試料の載置される面と非平行な面からも出射される光を検出器の方向へ伝達する光伝達経路を構成する光伝達部材を備えるようにする。後述するように発光部材載置部２１５には発光素子２３からの光を光検出器４の方向へ誘導するための反射材５０がもうけられていてもよい。反射材５０とは発光部材載置部２１５がミラー加工されている場合や、発光部材載置部２１５が金属部材からなる場合も含む。これらの場合は発光部材載置部が反射材となる。

また、サイドエントリー型試料台は、試料を載せた発光部材を筐体１０の横方向から光軸１０６のある箇所まで挿入できるようにするための試料台であり、取っ手３４方向に検出器を設けているため、光伝達経路も試料設置箇所の下から横方向へ伸びるようになっている。このサイドエントリー型試料台において、傾斜試料の透過像を取得する際に，傾斜角度を変えた際の検出信号の変化が小さい構成となっている。図１４(a)に一点鎖線で図示した傾斜回転軸２０２は，試料を通り検出器４の検出面５に中心に重なっている。また，発光素子２３、集光手段５０、光検出器４等は機械的に接合しているため、図１４(a)の構成で試料ステージを移動および傾斜して同様の観察を行う際に光の行路が変化しない。このため、ステレオ観察や試料内部情報の三次元観察のための透過荷電粒子線画像を取得する際に，試料傾斜角度によらず光の捕集効率は一定となり，異なる条件で取得した検出画像間で明るさの補正が不要となる。また，試料を大きく傾斜した場合も透過荷電粒子線画像を取得できる。なお、観察装置がＳＥＭの場合、対物レンズは、レンズ磁界の分布のさせ方に依存して様々な構成となるが、いかなるタイプの構成に対しても適用可能である。サイドエントリー型試料ステージは、既存装置では試料をレンズ磁界中に浸漬させるインレンズ型対物レンズの構成で主に使用されている。この構成に適用した場合、高分解能観察ができる。いずれのタイプの構成でも、試料台ユニットには、観察視野や試料傾斜角度を変更するための機構部２１６が設けられる。

図１４(a)では本試料台ユニットを動かすための機構部に関して説明する。機構部２１６は筐体１０あるいは支持部材２１７に挿入された試料台ユニット２４を動かすことが可能である。機構部には試料台ユニット２４を図中左右方向に上下方向に駆動可能である。また、本試料台ユニットの中心軸に対して回転させることが可能な駆動機構を有する。なお、図１４(a)では制御部を介して機構部２１６を自動で動かす例を示したが、ユーザ自身の手で動かしてもよい。本試料台ユニットの場合、試料を傾斜させるために本試料台ユニットの中心軸に対して回転させても、発光素子２３と光検出器４の位置関係は変わらない。このため前述の実施例と比較して試料傾斜を簡便に観察できるといった特徴がある。

なお，各レンズ２００を制御するための制御系や，検出信号を検出するための検出系や，筐体１０や荷電粒子光学鏡筒３内部を排気するための真空ポンプ７等，実施例１に記載した共通の構成についての記載は省略する。実施例１および実施例２と同様，試料が載置された発光素子２３は，試料を透過した荷電粒子線の入射により発光，放出された光を集光手段５０で集め，光伝達経路２０３を介して検出器４に導き，電気信号に変換されて検出される。

ここで，この集光手段５０は，図１５（ａ）および図１５（ｂ）に示されるように，透明媒質よりなる光伝送路２０３の一部と，その周りを覆う光反射材，この場合，例えばアルミニウム（Ａｌ）などの反射材２０６を有する。その形状は曲面あるいは平面等であり，発光素子２３から検出器４とは直接向かわない方向に放出された光を検出器側に反射させる作用がある。本試料台ユニット２４は，実施例１または実施例２の構成では検出されない可能性のある光を，光伝達路２０３を介して検出できる可能性を高め，試料台ユニット２４移動時の集光効率の変動が少なく，簡易な構造かつ少ない部材での試料台ユニット２４を構成できる点に利点がある。本実施例では荷電粒子線装置３６が電子顕微鏡の場合について説明するが，他の荷電粒子線装置３６の場合も，得られる効果は同様となる。

図１５に，サイドエントリー型試料ユニットの先端形状及び集光手段を示す。図１５の構造の場合も、発光素子２３表面上に傾斜時の中心軸が重なるように配置されることで図１４(a)と同様に、試料台を傾斜した際にも、集光効率を変化させず観察が可能であり、試料台ユニットの可動構成についても図１４(a)と同様である。

図１５の試料台ユニット構造は、図１４(a)の構成の場合と同様に、筐体あるいは支持部材に挿入された機構部によって駆動できる構成となっている。試料台ユニットの傾斜回転軸２０２をＸ軸、荷電粒子線が照射される方向をＺ軸、Ｘ軸とＺ軸の両方に直交する方向をＹ軸と定める。この場合の試料台ユニットは導電膜２０６機構部には試料台ユニット２４をＸＹ面内またはＺ方向に駆動できる。また、本試料台ユニットは回転軸２０２のまわりで回転可能な駆動機構を有する。なお、制御部を介して機構部を自動で動かす例を示したが、ユーザ自身により手動で動かす構成でもよい。本試料台ユニットの場合、本試料台ユニットの中心軸に対して回転させて荷電粒子線の照射方向を変えた場合も、発光素子２３と光検出器４の位置関係は変わらない。このため、前述の実施例２と比べて簡便に試料を傾斜して観察できるといった特徴がある。

図１５（ａ）は楕円形状，図１５（ｂ）はフラットな斜面形状をしている。先端部が楕円形状にした場合は，荷電粒子線の照射位置付近に図１１のＡ点が配置されるように構成することによって，斜面ミラーよりも効果的に発光素子で発生した光が検出器方向に伝達されることが期待される。一方，斜面ミラーとした場合は楕円ミラーよりも構造が簡便であり，安価に作製できる。発光素子２３から放出される光の検出効率をさらに高めるために，先端部の側壁部分も回転楕円体もしくは斜面ミラーとして構成しても良い。

試料台先端に試料を載置した発光素子２３を配置し，試料に照射され透過した荷電粒子が発光素子２３にて発光し光が放出される。この光が試料台支柱部分の光伝達路２０３を通り，大気領域に設置された光検出器４で検出される。試料台ユニットの支柱部分が光伝達路２０３で出来ており，発光素子２３設置部分以外の光伝達路２０３の表面をアルミニウム（Ａｌ）等の反射材で被覆される。この場合は発光体２３の下面から放出された光のみが集光される。固定方法は実施例２と同様であり，図８のように導電テープや，両面テープ，機械的な固定具，接着剤等のいずれの構成でも構わない。

図１５−（ｃ），（ｄ）は，試料台先端部に発光素子２３を設置するためのくぼみを形成し，そのくぼみに対して発光素子を設置する例である。この構成だと発光体下面だけでなく，側面から放出された光も集光でき，検出される光量が増大する。発光素子２３を設置するためのくぼみの部分で，発光体と接合する部分以外の表面には，発光素子２３の側面または下面からの放出される光を反射させて集光するために，例えばアルミニウム（Ａｌ）などの反射材２０６で覆われる。

また，発光素子２３と光伝達路２０３の間に隙間があると，発光体で発生した光が屈折し，集光効率が低下する虞がある。これを回避するには，発光素子２３を光伝達路としてもよい。

また，荷電粒子装置の試料室内部の空間が狭い場合、または対物レンズ内に試料を配置する構成のような場合は、荷電粒子線が照射されると，この空間内で多重散乱が生じる。このため，上記の事由で光伝達路２０３の指定した部分をアルミニウム（Ａｌ）などの導電性の反射材で被覆しておくことによって，石英，ガラス，光ファイバー，プラスチック等の非導電性材質で作られた光伝達路２０３のチャージアップ防止策となる。また，チャージアップの防止効果を高めるために，発光素子２３全体を透明な導電性薄膜で被覆する構成でも構わない。ただし，この構成の場合は，試料に照射する荷電粒子線のエネルギーと試料および導電性薄膜の膜厚を考慮し，荷電粒子線が試料および導電性薄膜を透過して発光素子２３に到達できる条件となっている必要がある例えば，Ｐｔ等の金属では１０ｎｍ前後以下，ＩＴＯ，ＮＥＳＡ膜では２０ｎｍ以下程度がよい。また，光学顕微鏡による観察に配慮して，導電性薄膜の表面が，試料観察に影響を及ぼさない程度に平坦であることが必要となる。

図１４，１５では，光伝達路２０３の先端部が集光手段５０になっている。発光素子２３から放出された光が効率良く伝達路２０３方向に反射される構成が好ましい。特に，発光素子２３から検出器４とは違う向きに放出された発光体２３の光を検出器方向に反射させるように先端形状が構成される。

発光素子の側壁部から放出される光を検出する場合には，図１５(c) −１または図１５(ｄ)−１のような構成とすれば良い。この構成を斜視図として見たものを図１５(ｃ) −２または図１５(ｄ) −２にそれぞれ示す。図１５(a)，図１５(ｂ) ，図１５(ｃ) −１，図１５（ｄ）−１，図１５(ｃ) −２，図１５(ｄ) −２に記載のいずれの発光素子も，図９に記載されるように，導電テープ１１２などで，サイドエントリー型の試料台先端部に固定される。この時，導電テープ１１２等の固定具は，チャージアップしないように表面を被覆された導電性の材質で出来た部材と導通を取るように設置されることが望ましい。

図１６に，サイドエントリー方式において試料室スペースを大きく確保できない場合の試料台ユニット構成例を示す。図１６に示すように，発光体それ自体に楕円型または斜面型の反射機構を付与し，これを支持体３３に作成したくぼみにはめ，固定具２０７で発光素子２３と支持体３３を機械的に固定し，発光素子２３−光検出器４を接触させて設置する。これにより，発光素子２３を発光光線１０８が発光素子２３自体を光伝達路として通過し，検出器まで集光する機能を有している。また，図示しないが発光素子２３−光検出器４間に光伝達路２０３を設置する構成としても良い。この構成は，図１６に示すように，サイズの小さい光検出器４を使用する場合，発光体２３の部分を回転楕円体の回転軸２０２と一致する構成とし，荷電粒子線の照射位置２０９を一方の焦点に重ね，小型の光検出器４の検出面５または光伝達路の取り込み口に重なるように配置すると，より一層効果的にフォーカスできる。発光素子２３と光伝達路２０３の間隙部はオプティカルセメントなどで屈折率の急峻な変化が生じないように構成することが望ましい。検出面５の位置は，図１６(ａ)(ｂ)に示すように発光素子の近くに置いてもよいし，図示しないが放出された光１０８が光伝達路を通過して光検出器４で検出される構成でも構わない。

光検出器４がサイドエントリーステージの取っ手近傍の試料ユニット端部に設置される場合，放出された光１０８を光検出器４の方向に効率よく反射させるために，発光素子４と光伝達路２０３の間の屈折率変化を利用しても良い。このような構成も，集光手段５０の一部として考えることができる。

また、図１６の試料台ユニットの構造においても、発光素子２３表面上に傾斜時の中心軸が重なるように配置することで図１４(a)と同様に、試料台を傾斜した際にも、集光効率を変化させずに観察が可能となる。試料台ユニットの可動構成は図１４(a)と同様である。

図１６の試料台ユニット構造の可動方法は、図１４(a)の構成の場合と同様に、筐体あるいは支持部材に挿入された機構部によって駆動できる構成となっている。試料台ユニットの傾斜回転軸２０２をＸ軸、荷電粒子線が照射される方向をＺ軸、Ｘ軸とＺ軸の両方に直交する方向をＹ軸と定める。この機構部によって、試料台ユニット２４をＸＹ面内またはＺ方向に駆動できる。また、本試料台ユニットは回転軸２０２のまわりで回転可能な駆動機構を有する。なお、制御部を介して機構部を自動で動かす例を示したが、ユーザ自身によって手動で動かす構成でもよい。本試料台ユニットの場合、本試料台ユニットの中心軸に対して回転させて荷電粒子線の照射方向を変えた場合も、発光素子２３と光検出器４の位置関係は変わらない。このため前述の実施例２と比べて簡便に試料を傾斜して観察できるといった特徴がある。

図１７(ａ)(ｂ)に，光検出器４の検出面５が試料台ユニット２４と比較して小さい場合の構成及び集光手段について示す。光伝達路２０３としてライトガイドを用い，検出面５の小さな光検出器４で発光素子２３からの光を検出しなければならない場合に，発光素子２３の接合部の検出面と光検出器４の検出面５の間を緩やかなテーパー角で囲うようにライトガイドを構成し、必要があればそのテーパー部の表面を金属薄膜などの反射材２０６で被覆することによって、発光素子からの発光を集光１０９することが可能あるため、光捕集効率の改善が期待される。

本実施例のサイドエントリー方式の試料台ユニット２４でステレオ観察や試料内部情報の三次元観察の際の透過荷電粒子線画像を取得する場合の試料回転軸２０２は，検出される光量が傾斜角度に依存しないようにするために，図１７に示すように試料台の長手方向の軸と平行であり，試料を載置した発光素子の表面付近を通る直線と重なっていることが好ましい。

また、図１７の試料台ユニットの構造においても、発光素子２３表面上に傾斜時の中心軸を配置することで図１４(a)と同様に、試料台を傾斜した際にも、集光効率を変化させず観察が可能となる。試料台ユニットの可動構成は図１４(a)と同様である。

図１７の試料台ユニット構造は、図１４(a)の構成の場合と同様に、筐体あるいは支持部材に挿入された機構部によって駆動できる構成となっている。試料台ユニットの傾斜回転軸２０２をＸ軸、荷電粒子線が照射される方向をＺ軸、Ｘ軸とＺ軸の両方に直交する方向をＹ軸と定める。この機構部によって、試料台ユニット２４をＸＹ面内またはＺ方向に駆動できる。また、本試料台ユニット回転軸２０２のまわりで回転可能な駆動機構を有する。なお、制御部を介して機構部を自動で動かす例を示したが、ユーザ自身により手動で動かす構成でもよい。本試料台ユニットの場合、本試料台ユニットの中心軸に対して回転させて荷電粒子線の照射方向を変えた場合も、発光素子２３と光検出器４の位置関係は変わらない。このため前述の実施例２と比べて簡便に試料を傾斜して観察できるといった特徴がある。

図１８に，図１５−（ｃ）の構成を使用して，細胞試料内の特定領域に染色材を導入し，その分布情報を得る方法についての構成例を示す。なお，発光素子２３や反射材２０６，検出信号を検出するための検出系等の図１５に記載した共通の構成についての記載は省略する。図中の本実施例のサイドエントリー型の試料台を用いて細胞試料を観察する場合，光学顕微鏡観察時に使用される染色剤と同様の方式で荷電粒子線を照射した際に特定の波長の発光が起こる荷電粒子顕微鏡用の染色材２１０−１を導入する。この時，図１８に示すように，この構成で荷電粒子線３５を照射すると，透過荷電粒子が発光素子２３に照射されて放出される光２１１（図中、破線）と，各染色材２０１−１に荷電粒子線が照射された際に放出される光２１２（図中、点線）が，ともに光検出器４によって検出されるようになる。この２種類の光が分光器や波長フィルタなどの分光手段２１３によって別々に検出できる構成となっていれば，透過荷電粒子２１４による透過像を得ると共に，特定領域の分布像を得ることができる。この構成の場合，荷電粒子線によって励起する染色材の種類は，分光手段２１３によっては波長を識別し別々の光信号として検出することができる限り，別の染色剤２１０−２のように複数の染色材が導入されていても構わない。また，試料ユニットの構成は図１５，図１６，図１７に応用可能である。

なお、図１８の試料台ユニットの構造においても、発光素子２３表面上に傾斜時の中心軸を配置することで図１４と同様に、試料台を傾斜した際にも、集光効率を変化させず観察が可能となる。試料台ユニットの可動構成は図１４(a)と同様である。

なお、本実施例において、光検出器の搭載場所を試料ユニット内に限定していたが、光伝達部−光検出器間に光ファイバー等の光伝送手段を使用することで、光検出器を試料ユニット外に置くことが可能であり、本実施例による効果が同様にあることは明確である。

図１８の試料台ユニット構造は、図１４(a)の構成の場合と同様に、筐体あるいは支持部材に挿入された機構部によって駆動できる構成となっている。試料台ユニットの傾斜回転軸２０２をＸ軸、荷電粒子線が照射される方向をＺ軸、Ｘ軸とＺ軸の両方に直交する方向をＹ軸と定める。この機構部によって、試料台ユニット２４をＸＹ面内またはＺ方向に駆動できる。また、本試料台ユニットは回転軸２０２のまわりで回転可能な駆動機構を有する。なお、制御部を介して機構部を自動で動かす例を示したが、ユーザ自身により手動で動かす構成でもよい。本試料台ユニットの場合、本試料台ユニットの中心軸に対して回転させて荷電粒子線の照射方向を変えた場合も、発光素子２３と光検出器４の位置関係は変わらない。このため、前述の実施例２と比べて簡便に試料を傾斜して観察できるといった特徴がある。

１：レンズ，２：荷電粒子線顕微鏡，３：荷電粒子光学鏡筒，４：光検出器，５：検出面，７：真空ポンプ，８：試料ステージ，９：試料，１０：筐体，１１：一次荷電粒子源，１２：リークバルブ，１３：真空配管，１４：コンピュータ，１５：上位制御部，１６：下位制御部，１７：通信線，１８−１：操作つまみ，１８−２：操作つまみ，２０：真空封止部材，２１：支持部材，２２：蓋部材，２３：発光素子，２４：試料台ユニット，２５：試料台，２６：試料土台支持支柱，２７：試料土台支持土台，２８：増幅器，２９：光学顕微鏡，３０：押さえ治具，３１：土台，３２：Ｏリング，３３：支持体（非磁性体），３４：取っ手，３５：一次荷電粒子線，３６：荷電粒子線装置，３７：信号線３８：検出器，３９：プリアンプ，４０：開口部，５０：集光手段，５１：集光凸レンズ，５４：フレネルレンズ，５６−１，５６−２，５６−３，５６−４：集光ミラー，６１：側面ミラー，６２：楕円ミラー，６４：光伝達路，６５：反射円柱ミラー，６６：通過孔，１００：密度の高い部分，１０１：密度の低い部分，１０２：大きい内部物質，１０３：内部物質，１０６：光軸，１０８：発光した光，１０９：集光された光，１１０：発光体の側面部から放出された発光，１１２：導電テープ，１１３：両面テープ，１１４：押さえ治具，１５０：投影画像，１５１：投影画像，１５２：投影画像（または検出画像），１５３：透過像，１５４：可動領域，２００：荷電粒子線装置の対物レンズ，２０１：サイドエントリー型試料ステージ，２０２：サイドエントリー型試料ステージの傾斜回転軸，２０３：光伝達経路，２０４：ライトガイド，２０５：光ファイバー，２０６：光反射材としての導電性の薄膜，２０７：発光体の固定具，２０８：発光体と光伝達手段の境界部で屈折された光，２０９：荷電粒子線の照射位置，２１０−１：蛍光物質Ａ，２１０−２：蛍光物質Ｂ，２１１：荷電粒子線照射により蛍光物質から放出された光，２１２：荷電粒子線照射により発光体から放出された光，２１３：分光手段，２１４：荷電粒子線，２１５：発光部材載置部、２１６：機構部、２１７：支持部材。

Claims (21)

1. 設置される試料の内部を透過又は散乱した荷電粒子により発光する発光部材が載置される試料載置部と、
   前記発光部材の前記試料が載置される面と非平行な面から出射される光を検出器の方向へ伝達する光伝達経路を構成する光伝達部材と、を有することを特徴とする試料ホルダ。
2. 前記試料が載置される面と非平行な面は前記発光部材の側面であることを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
3. 前記発光部材と前記光伝達部材とは一体として可動することを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
4. 前記光伝達部材は前記発光部材の傾斜移動に連動することを特徴とする請求項３に記載の試料ホルダ。
5. 前記光伝達部材によって伝達された光を検出する検出器を有することを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
6. 前記発光部材と前記光伝達部材と前記検出器は一体として可動することを特徴とする請求項５に記載の試料ホルダ。
7. 前記光伝達手段は前記発光部材からの光を集光する集光手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
8. 前記集光手段は、前記発光部材からの光であって検出器に直接向かわない光を反射して前記検出器に向かわせる反射部材であることを特徴とする請求項７に記載の試料ホルダ。
9. 前記反射部材は前記発光部材を内包する楕円の少なくとも一部を構成する形状であって、前記楕円の２つの焦点位置を含むように前記発光部材と前記検出器はそれぞれ配置されていることを特徴とする請求項８に記載の試料ホルダ。
10. 前記光伝達経路は、前記発光部材で生じた光を波長に応じて分ける分光手段を有することを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
11. 前記発光部材からの光が出射する出射面は前記検出器の検出面よりも大きく、前記発光部材と前記検出器との間はテーパー状の光伝達手段を有することを特徴とする請求項５に記載の試料ホルダ。
12. 荷電粒子線を発生する荷電粒子線源と、
    設置される試料の内部を透過又は散乱した荷電粒子により発光する発光部材と、
    前記発光部材の前記試料が設置される面と非平行な面から出射される光を検出する検出器と、
    前記検出器からの信号に基いて前記試料の像を生成する画像生成部と、
    を有することを特徴とする観察システム。
13. 前記発光部材の前記試料が設置される面と非平行な面から出射される光を前記検出器の方向へ伝達する光伝達経路を構成する光伝達部材を有することを特徴とする請求項１２に記載の観察システム。
14. 前記発光部材と前記光伝達部材とは一体として可動することを特徴とする請求項１３に記載の観察システム。
15. 荷電粒子により発光する発光部材に載置された試料に対し、荷電粒子線を照射する工程と、
    前記試料を透過又は散乱した荷電粒子により前記発光部材から生じた光を、前記発光部材の前記試料が載置される面と非平行な面から出射する工程と、
    前記出射された光を検出器の方向へ伝達する工程と、
    前記伝達された光を前記検出器により検出する工程と、
    前記検出器からの信号に基いて前記試料の像を生成する画像生成工程とを有することを特徴とする画像生成方法。
16. 前記発光部材と、前記発光部材から生じた光を前記検出器の方向へ伝達する光伝達経路を構成する光伝達部材とを、一体として動かす工程を有することを特徴とする請求項１５に記載の画像生成方法。
17. 設置される試料の内部を透過又は散乱した荷電粒子により発光する発光部材が載置される試料載置部と、
    前記発光部材からの光を検出器の方向へ集光する集光手段と、を有することを特徴とする試料ホルダ。
18. 前記発光部材と前記集光手段は一体として可動することを特徴とする請求項１７に記載の試料ホルダ。
19. 前記発光部材を支持する支持台を有し、
    前記集光手段は前記支持台に形成されることを特徴とする請求項１７に記載の試料ホルダ。
20. 前記発光部材の前記試料が設置される面と前記集光手段が配置される側の面との間からの発光を反射させて前記集光手段へ向かわせる反射部材を有することを特徴とする請求項１７に記載の試料ホルダ。
21. 前記集光手段は、前記発光部材からの光であって検出器に直接向かわない光を反射して前記検出器に向かわせる反射部材であることを特徴とする請求項１７に記載の試料ホルダ。

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