JP5784034B2 - 植物培養細胞株を利用した標準物質の製造方法 - Google Patents
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Description
分析試料から導入遺伝子に該当するPCR産物が増幅されたか否かを確認することにより、導入遺伝子を含む遺伝子変形植物が混入されているか否を定性的に分析することができる。または、前記分析試料のPCR産物を、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物をテンプレートとして実行したPCR産物と比較分析することにより、遺伝子変形植物の混入有無を定性的に分析することもできる。
GM大豆(Glycine max)が混合された米国産大豆を無作為で選別して発芽させて栽培した後、個体別、組職別に遺伝子分析を通じてGM大豆であるか否かを決定した。
暗所で大豆を発芽させて土壌に植えた後、培養室(明/暗:16/8時間、22/18℃、湿度80%)で1週程度成長させると、一次葉(primary leaf)が形成され、この植物体の葉を収穫して質量を測定して液体窒素で急冷させた後、ゲノムDNAを抽出してGMであるか否かを遺伝子増幅を通じて決定した。
ゲノムDNAの抽出は、多くの常用化された植物DNA抽出キットを、製造社(Qiagen、Promegaなど)が提案する方法のとおりに使用するかまたは多少変形させて使用するか、食品医薬品安全庁で告示した‘食品の基準及び規格 'のうち‘第10.一般試験法の中で遺伝資材組合食品の試験法'に記述されたCTAB方法を容量を減らした方法で変形して使用した。
定性分析は、GM大豆の変形遺伝子であるグリホサート(glyphosate)系列の除草剤に対する抵抗性遺伝子(EPSPS:5−enolpyruvyl shikimate−3−phosphate synthase)を含むDNA試片をPCR増幅することにより実行した。
本発明によるGM大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムDNAの純度を検証するために、遺伝子変形植物の混入率を定量分析するためのリアルタイム定量PCR(real−time PCR)を実行した。分析試料のGM混入率を決定するためには、上述のように内在遺伝子に対する導入遺伝子の相対的な割合を求めなければならないので、リアルタイムで遺伝子の増幅程度を観察するreal−time PCRを使用した。本実験例では、ABI 7900HTを使用してすべての実験を実行したし、実験の基本的なデザイン及びプライマー、プローブなどの実験構成要素は、食品医薬品安全庁の規格に出た内容によって使用した。
本発明による組職培養細胞株から抽出したゲノムDNAを標準物質で使用して、遺伝子変形植物の混入率を定量分析するためのリアルタイム定量PCR(real−time PCR)を実行した。実験方法は、実験例2と同一であり、但し、実験例2を通じて100%GM割合に近接したと検証された組職培養細胞株から抽出したゲノムDNAを標準物質で使用したし、既にGM混入率が分かっている試料(5%GM大豆ERM、IRMM−410S−5)を分析試料で使用した。
GM遺伝子変形植物は、各々の多様なコピー数の導入遺伝子を有しているので、内在遺伝子との関係において各GM遺伝子変形植物別に補正が必要である。遺伝子変形植物の混入率を決定するための補正係数は、リアルタイム定量PCR(real−time PCR)を実施して算出した。既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドDNA(Nippon Gene、Japan)と自体的に製造してコピー数が既に分かっているプラスミドDNAとを標準曲線を描くための基準物質で使用し、実施例1及び実施例2によって、100%GM大豆の顕濁培養細胞株から抽出したゲノムDNAを分析試料で使用したし、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーを使用してリアルタイム定量PCRを実施した。補正係数の算出に使われた内在遺伝子は、大豆に特異的なレクチン(lectin)遺伝子であり、内在遺伝子検出用正方向プライマーでは、Le1n02−5'(GCCCTCTACTCCACCCCCA)を使用し、逆方向プライマーでは、Le1n02−3'(GCCCATCTGCAAGCCTTTTT)を使用した。検出用プローブでは、Le1−Taq(FAM−AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC−TAMRA)を使用した。導入遺伝子は、RRS遺伝子であり、導入遺伝子検出用正方向プライマーでは、RRS01−5'(CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG)を使用し、逆方向プライマーでは、RRS01−3'(GACTTGTCGCCGGGAATG)を使用し、検出用プローブでは、RRS−Taq(FAM−CGCAACCGCCCGCAAATCC−TAMRA)を使用した。
遺伝子変形植物の混入率を定量分析するために、既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドDNA(Nippon Gene、Japan)と自体的に製造してコピー数が既に分かっているプラスミドDNAとを標準曲線を描くための基準物質で使用し、100%GM大豆の顕濁培養細胞株から抽出したゲノムDNAを分析試料で使用してリアルタイム定量PCR(real−time PCR)を実行した。前記二つの基準物質の標準曲線から分析試料の導入遺伝子と内在遺伝子のコピー数を求めた後、実験例4から算出した補正係数を適用してGM混入率を決定し、100%に近接した結果を得たかを確認した。補正係数を適用してGM混入率を決定する計算式は次のようである。
Claims (11)
- 遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用の標準物質を製造する方法であって、
遺伝子解析を用いて、ランダムに混合された遺伝子変形植物と遺伝子非変形植物の中から、100%遺伝子変形植物と100%遺伝子非変形植物を各々分離する段階と、
前記100%遺伝子変形植物および前記100%遺伝子非変形植物を各々組織培養する段階と、
各々の前記組織から各々の組織培養細胞株を取得する段階と、を含み、
前記標準物質は、前記100%遺伝子変形植物の組織培養細胞株、前記100%遺伝子非変形植物の組織培養細胞株、およびこれらを混合したものからなる群から選択される、
ことを特徴とする方法。 - 前記遺伝子変形植物および遺伝子非変形植物の各々の組織培養細胞株を所定割合で混合する段階を追加で含むことを特徴とする
請求項1に記載の方法。 - 遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用の標準物質を製造する方法であって、
遺伝子解析を用いて、ランダムに混合された遺伝子変形植物と遺伝子非変形植物から、100%遺伝子変形植物と100%遺伝子非変形植物をそれぞれ分離する段階と、
前記100%遺伝子変形植物および前記100%遺伝子非変形植物を各々組織培養する段階と、
各々の前記組織から各々の組織培養細胞株を取得する段階と、
前記組織培養細胞株からゲノムDNAを各々抽出する段階と、を含み、
前記標準物質は、前記100%遺伝子変形植物の組織培養細胞株から抽出されたゲノムDNA、前記100%遺伝子非変形植物の組織培養細胞株から抽出されたゲノムDNA、およびこれらを混合したものからなる群から選択される、
ことを特徴とする方法。 - 前記遺伝子変形植物および前記遺伝子非変形植物からの各々のゲノムDNAを所定割合で混合する段階を追加で含むことを特徴とする
請求項3に記載の方法。 - 請求項3に記載された100%遺伝子変形植物を組織培養して得た組織培養細胞株から抽出したゲノムDNAをテンプレートとして、導入遺伝子の塩基序列に特異的なプライマーを製作して分析試料のPCRを実行することと、
前記標準物質として用いられるゲノムDNAを、遺伝子変形植物の混入率分析用の分析試料から得たPCR産物と比較することと、
導入遺伝子に対応したPCR産物が分析試料から増幅するかを調査することによって遺伝子変形植物の混入有無を定性的に分析すること、
を特徴とする遺伝子変形植物の混入有無分析方法。 - 請求項3に記載された前記100%遺伝子変形植物または前記100%遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムDNAと、分析試料から得たリアルタイムPCR産物とを比較し、
前記ゲノムDNAは、遺伝子変形植物の混入率分析用の標準物質として用いられ、
前記分析試料から得たリアルタイムPCRの産物と前記標準物質との比較は、遺伝子コピー数に対してPCRのサイクル数をプロットした標準曲線を用いて行われ、
前記標準曲線は、検出用プローブと、導入遺伝子を検出するためのプライマーと、内在遺伝子の検出と蛍光の測定のためのプライマーを用いて、前記標準物質にリアルタイムPCRを行うことによって計算される、
ことを特徴とする遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。 - 前記標準曲線は、遺伝子変形植物を組織培養して得た組織培養細胞株から抽出したゲノムDNAを所定割合で希釈して相違である遺伝子コピー数を有する複数個の標準試料に対してPCRを実行し、それから得た遺伝子コピー数に対するPCRサイクル数を適用して算出されることを特徴とする
請求項6に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。 - 前記標準曲線は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組織培養細胞株から抽出した各々のゲノムDNAを所定割合で混合して相違である遺伝子コピー数を有する複数個の標準試料に対してPCRを実行し、それから得た遺伝子コピー数に対するPCRサイクル数を適用して算出されることを特徴とする
請求項6に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。 - 前記遺伝子変形植物の試料内混入率は、分析試料を検出用プローブ、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでPCRして測定した蛍光量を、標準曲線に代入して算出した遺伝子コピー数を利用して測定されることを特徴とする
請求項6又は請求項9に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
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