BR112012007812B1 - Métodos de determinação da quantidade relativa de uma peste ou patógeno de planta em uma amostra de solo e de tratamento de uma localização com pesticidas - Google Patents

Métodos de determinação da quantidade relativa de uma peste ou patógeno de planta em uma amostra de solo e de tratamento de uma localização com pesticidas Download PDF

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Abstract

patente de invenção: métodos de quantificação de organismos-alvo e criação de plantas de algodão resistentes a reniforme. a presente invenção refere-se a um campo de melhoramento de planta e resistência à doença. mais especificamente, a invenção inclui métodos para avaliar uma localização a fim de determinar a quantidade de infestação por peste ou avaliar uma planta com relação à sua capacidade de resistir à infecção e uso dessa informação para tomar decisões sobre melhoramento e/ou tratamento agronômico. a invenção também proporciona métodos para melhoramento de plantas de algodão contendo um ou mais locide traço quantitativo que estão associados à resistência à infecção por nematoide reniforme. a invenção ainda inclui germplasma e uso de germplasma contendo loci de traço quantitativo (quantitative trait loci - qtl) que reniforme para introgressão em germplasma de elite em um programa de melhoramento, assim, produzindo novo germplasma de elite compreendendo um ou mais loci de resistência a reniforme.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE RELATIVA DE UMA PESTE OU PATÓGENO DE PLANTA EM UMA AMOSTRA DE SOLO E DE TRATAMENTO DE UMA LOCALIZAÇÃO COM PESTICIDAS. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N° 61/250.235, depositado em 09 de outubro de 2009. Toda a descrição do pedido acima é incorporada aqui por referência. INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [0002] A listagem de sequência contida no arquivo denominado
55576_RenSeqs.txt, a qual tem 188 kilobytes (medido no MSWindows®) criada em 11 de Outubro de 2010 é depositada com o mesmo através de remessa eletrônica e incorporada aqui por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO [0003] A presente invenção refere-se a i métodos de quantificação de patógenos de planta presentes em um determinado local, particularmente patógenos de planta que gastam pelo menos parte de seu ciclo de vida na rizosfera de plantas de safra. Modalidades da invenção compreendem métodos de comparação da quantidade de sequência de DNA que é específica para um organismo-alvo em uma amostra de matéria para a quantidade total de DNA na amostra de matéria para somar a quantidade relativa do organismo-alvo presente na amostra de matéria. São fornecidos exemplos não limitativos que divulgam novos métodos de quantificação do número absoluto e do número relativo de nematoides reniformes (Rotylenchulus reniformis) e/ou nematoides da raiz (Meloidogyne incognita), presentes em uma amostra de matéria, por exemplo, o solo. A presente invenção facilita o tratamento e pesquisa de doenças ao permitir que um usuário avalie rapidamente o risco de plantio de uma safra em um determinado local,
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2/47 determine qual a melhor maneira de tratar safras que já estão crescendo em um determinado local em resposta à infestação, antecipe e rastreie o desenvolvimento de infestação dentro ou entre locais e estude a variabilidade de uma planta ou população de plantas para resistir à infecção reniforme.
[0004] Outras modalidades da invenção compreendem marcadores moleculares úteis para detecção de sequências de nucleotídeo em plantas de algodão associadas à resistência a reniforme e métodos de introgressão dessas sequências de uma planta para outra a fim de produzir novo germoplasma compreendendo um ou mais loci de resistência a reniforme.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0005] A invenção divulgada aqui compreende um método rápido de determinação do nível de organismos-alvo em uma amostra de matéria. Esse Método de Índice de Infecção compreende derivação de relações entre a quantidade total de DNA detectada em uma amostra para a quantidade de DNA na amostra detectada através de amplificação por PCR de uma sequência que é específica para o organismoalvo e uso dessa relação ou quaisquer permutações matemáticas dessa relação para quantificar a quantidade de organismo-alvo na amostra.
[0006] A invenção também fornece descrições de como o Método de Índice de Infecção pode ser usado para monitorar a infestação por reniforme em um ou mais locais, de modo que plantio, tratamento de reniforme e planos de alocação de recursos mais eficazes possam ser feitos para um ou mais locais de crescimento.
[0007] A invenção ainda fornece uma descrição de como o índice de infecção para um local pode ser usado para estimar a capacidade de uma planta de resistir à infecção à doença.
[0008] Além disso, a presente invenção descreve como o Método
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3/47 de Índice de Infecção pode ser usado para ajudar a identificar alelos de resistência à doença em DNA genômico de algodão, ajudar a genotipagem de uma planta de algodão com relação à presença ou ausência desses alelos, auxiliar os produtores a rastrear esses alelos em uma população de plantas de algodão conforme eles são herdados de geração para geração e fornecer informação para tomar decisões sobre quais indivíduos selecionar para avanço em um programa de melhoramento.
[0009] Determinados aspectos da presente invenção ainda incluem novos marcadores polimórficos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphic - SNP) úteis para detecção da presença de alelos de resistência a reniforme em uma planta ou uma população de plantas como parte de um programa de melhoramento molecular assistido. Os marcadores SNP divulgados aqui permitem que um produtor realize genotipagem de uma planta com relação à presença de sequências de nucleotídeo associadas à resistência a reniforme, desse modo, reduzindo ou mesmo superando os processos de fenotipagem menos eficientes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00010] A invenção divulgada aqui compreende um método novo e de alto rendimento para determinação da quantidade de organismoalvo em um determinado local. O método é consideravelmente mais eficiente e mais preciso do que os métodos presentes ou anteriormente divulgados na técnica.
[00011] Esse Método de Índice de Infecção compreende quantificação do número de organismos-alvo em uma amostra de matéria por meio de comparação da quantidade de DNA detectada com uma sequência específica para um organismo-alvo para a quantidade total de DNA detectada na amostra de matéria.
[00012] Em uma modalidade do Método de Índice de Infecção, a
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4/47 sequência de DNA que é específica para o organismo-alvo é o gene de rRNA 5.8S da região ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1 - espaçador transcrito interno 1) do nematoide do nó da raiz Meloidogyne incognita. Em outras modalidades, as sequências de ácido nucleico peste-específica detectadas são específicas para outros organismos.
[00013] Modalidades adicionais da invenção divulgada incluem fenotipagem de uma planta quanto à sua suscetibilidade ou resistência a nematoides com base no nível de infestação por nematoide detectada na rizosfera da planta usando o Método de Índice de Infecção.
[00014] Métodos anteriores descritos na técnica, tal como a Técnica de Extração em Funil de Baermann (Baermann Funnel Extraction Technique - BFET) resultam, tipicamente, em remoção incompleta da planta do local de crescimento de forma a coletar o solo. A presente invenção proporciona uma nova forma de alto rendimento e precisa para determinação da capacidade de uma planta de resistir à infecção por pestes específicas sem mudar a planta de onde ela cresce. Assim, a capacidade de uma planta de resistir à infecção pode ser avaliada múltiplas vezes durante um período de crescimento sem amostragem sequencial do solo e a disseminação de infestação pode ser monitorada com o tempo.
[00015] A presente invenção também proporciona métodos de incorporação do Método de Índice de Infecção em esforços convencionais de melhoramento para facilitar a introgressão de alelos favoráveis de uma planta para outra. Em uma modalidade, esse processo compreende as etapas de: 1) fazer cruzamentos entre linhagens parentais; 2) fenotipagem da prole produzida a partir desses cruzamentos usando o Método de Índice de Infecção; e 3) fazer seleções de parentais e/ou da prole com base nesses escores de fenotipagem.
[00016] Além disso, a presente invenção proporciona um método de introgressão de um alelo associado à resistência à doença em uma
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5/47 linhagem de planta compreendendo as etapas de: 1) fornecimento de uma população de plantas; 2) genotipagem de pelo menos uma planta na população com relação a pelo menos um marcador de ácido nucleico genômico selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1112; e 3) seleção, da população, de pelo menos uma planta compreendendo pelo menos um alelo associado à resistência à doença. A população fornecida pode ser derivada através de cruzamento de pelo menos uma planta resistente à doença com pelo menos uma planta sensível à doença para formar uma população.
[00017] A presente invenção também proporciona uma planta de elite produzida através de: 1) fornecimento de uma população de plantas; 2) genotipagem de pelo menos uma planta na população com relação a um marcador de ácido nucleico genômico de algodão selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1-112; e 3) seleção, da população, de pelo menos uma planta compreendendo pelo menos um alelo associado à resistência à doença. A planta de algodão de elite da presente invenção pode exibir um traço transgênico.
[00018] A invenção ainda proporciona uma molécula de ácido nucleico substancialmente purificada para a detecção de loci relacionados à resistência à doença compreendendo uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1-112 e complementos das mesmas. A invenção ainda proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada para detecção de um marcador molecular que representa um polimorfismo em DNA de algodão, em que a molécula de ácido nucleico compreende pelo menos 15 nucleotídeos que incluem ou são adjacentes ao polimorfismo, em que a molécula de ácido nucleico é pelo menos 90 por cento idêntica a uma sequência do mesmo número de nucleotídeos consecutivos em qualquer fita de DNA que inclui ou está adjacente ao polimorfismo e em que o marcador molecular é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1-112. Em
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6/47 um aspecto, o ácido nucleico isolado ainda compreende um rótulo detectável ou permite a incorporação de um rótulo detectável. Em um outro aspecto, o rótulo detectável é selecionado do grupo consistindo de um isótopo, um fluoroforo, um oxidante, um redutor, um nucleotídeo e um hapteno.
[00019] A presente invenção ainda proporciona um conjunto de oligonucleotídeos compreendendo: a) um par de iniciadores de oligonucleotídeo, em que cada um dos iniciadores compreende pelo menos 12 nucleotídeos contíguos e em que o par de iniciadores permite amplificação por PCR de um segmento de DNA compreendendo um marcador molecular selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1112; e b) pelo menos um oligonucleotídeo detector que permite detecção de um polimorfismo no segmento amplificado, em que a sequência do oligonucleotídeo detector é pelo menos 95 por cento idêntica a uma sequência do mesmo número de nucleotídeos consecutivos em qualquer fita de um segmento de DNA de algodão que inclui ou está adjacente ao polimorfismo da etapa (a).
[00020] A menos que de outro modo mencionado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso universal por aqueles versados na técnica relevante. Definições de termos comuns em biologia molecular podem também ser encontrada em Alberts et al., Molecular Biology of The Cell, 5a Edição, Garland Science Publishing, Inc.: New York, 2007; Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edição, Springer-Verlag: New York, 1991; King et al., A Dictionary of Genetics, 6a ed, Oxford University Press: New York, 2002; e Lewin, Genes IX, Oxford University Press: New York, 2007. A nomenclatura para bases de DNA, conforme apresentado em 37 CFR § 1.822, é usada.
[00021] A rizosfera de uma planta é a região do solo que é influenciada pelas raízes da planta, secreções da raiz e micro-organismos
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7/47 no solo associados à raiz.
[00022] Conforme usado aqui, área de crescimento é qualquer área ou instalação onde plantas são crescidas propositadamente. Exemplos não limitativos incluem campos cultivados, estufas, câmaras de crescimento, vasos ou qualquer outro ambiente industrial, acadêmico, público ou privado onde múltiplas plantas são crescidas para estudo e/ou consumo.
[00023] Conforme usado aqui, uma localização é um local específico dentro de uma área de crescimento. Pelo menos uma modalidade da presente invenção descreve coleta de solo em múltiplas localizações dentro de uma área de crescimento. Exemplos não limitativos de tais localizações seriam seções de 2 pés por 2 pés específicas em um campo em particular ou uma muda que está crescendo em uma seção de 2 por 2 de um vaso em uma câmara de crescimento.
[00024] Conforme usado aqui, RKN significa nematoide do nó da raiz (Root Knot Nematode) ou Meloidogyne incognita.
[00025] Um alelo refere-se a uma sequência alternativa em um locus em particular; o comprimento de um alelo pode ser tão pequeno quanto 1 base de nucleotídeo, mas, tipicamente, é maior.
[00026] Um locus é uma posição sobre uma sequência genômica que é usualmente encontrada por um ponto de referência; por exemplo, uma sequência de DNA que é um gene ou parte de um gene ou região intergênica. Os loci da presente invenção compreendem um ou mais polimorfismos em uma população; isto é, alelos alternativos estão presentes em alguns indivíduos.
[00027] Conforme usado aqui, polimorfismo significa a presença de duas ou mais variações de uma sequência de ácido nucleico ou ácido nucleico característico em um ou mais loci em uma população de um ou mais indivíduos. A variação pode compreender, mas não está restrita a, uma ou mais alterações de base, a inserção de um ou
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8/47 mais nucleotídeos ou a deleção de um ou mais nucleotídeos. Um polimorfismo pode surgir de processos aleatórios em replicação de ácido nucleico, através de mutagênese, como um resultado de elementos genômicos móveis, a partir de variação no número de cópias e durante o processo de meiose, tal como cruzamento desigual, duplicação genômica e rupturas e fusões cromossômicas. A variação pode ser comumente encontrada ou pode existir em baixa frequência dentro de uma população, a primeira tendo maior utilidade em melhoramento de plantas em geral e a última podendo estar associada à variação fenotípica rara, mas importante. Polimorfismos úteis podem incluir polimorfismos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphisms SNPs), inserções ou deleções na sequência de DNA (Indels), repetições de uma única sequência de sequências de DNA (Simple Sequence Repeats - SSRs), um polimorfismo no comprimento de um fragmento de restrição e um SNP tag. Um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, um haplotipo, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região não traduzida 5' de um gene, uma região não traduzida 3' de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional e um padrão de metilação também podem compreender polimorfismos. Além disso, a presença, ausência ou variação no número de cópias dos precedentes pode também compreender polimorfismos.
[00028] Conforme usado aqui, marcador significa uma característica detectável que pode ser usada para discriminar entre organismos. Exemplos de tais características podem incluir marcadores genéticos, composição de proteína, níveis de proteína, composição de óleo, níveis de óleo, composição de carboidrato, níveis de carboidrato, composição de ácido graxo, níveis de ácido graxo, composição de aminoácido, níveis de aminoácido, biopolímeros, produtos farmacêuticos,
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9/47 composição de amido, níveis de amido, amido fermentável, rendimento de fermentação, eficiência de fermentação, rendimento de energia, compostos secundários, metabólitos, características morfológicas e características agronômicas. Conforme usado aqui, marcador genético significa uma sequência de ácido nucleico ou ácido nucleico característico polimórfico. Um marcador genético pode ser representado por uma ou mais sequências variantes particulares ou por uma sequência de consenso. Em outro sentido, um marcador genético é uma variante ou consenso isolada de tal sequência.
[00029] Conforme usado aqui, ensaio de marcador significa um método para detecção de um polimorfismo em um locus em particular usando um método em particular, por exemplo, medição de pelo menos um fenótipo (tal como cor de semente, cor de flor ou outro traço visualmente detectável), polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), extensão de uma única base, eletroforese, alinhamento de sequência, hibridização de oligonucleotídeo alelo específica (Allelic Specific Oligonucleotide - ASO), DNA polimórfico amplificado aleatório (Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD), tecnologias baseadas em microarranjo e tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico, etc.
[00030] Conforme usado aqui, tipagem refere-se a qualquer método pelo qual a forma alelo específica de um determinado polimorfismo genômico de algodão é determinada. Por exemplo, um polimorfismo de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) sofre tipagem determinando qual nucleotídeo está presente (isto é, uma A, G, T ou C). Inserção/deleções (Indels) são determinadas verificando se a Indel está presente. Indels podem sofrer tipagem através de uma variedade de ensaios incluindo, mas não restrito a, ensaios de marcador.
[00031] Conforme usado aqui, a palavra adjacente, quando usada
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10/47 para descrever uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza a DNA contendo um polimorfismo, refere-se a um ácido nucleico que se hibridiza às sequências de DNA que se encontram diretamente na posição de base de nucleotídeo polimórfica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que pode ser usada em um ensaio de extensão de uma única base está adjacente ao polimorfismo.
[00032] Conforme usado aqui, sequência de consenso refere-se a uma sequência de DNA construída a qual identifica polimorfismos SNP e Indel em alelos em um locus. A sequência de consenso pode ser baseada em qualquer fita de DNA no locus e estados da base de nucleotídeo de um de cada SNP no locus e nas bases de nucleotídeo de todos os Indels no locus. Assim, embora uma sequência de consenso possa não ser uma cópia de uma sequência de DNA real, uma sequência de consenso é útil para design preciso de iniciadores e sondas para polimorfismos reais no locus.
[00033] Conforme usado aqui, o termo polimorfismo de um único nucleotídeo, também referido pela abreviação SNP, significa um polimorfismo em um único local, em que o polimorfismo constitui uma alteração de um único par de base, uma inserção de um ou mais pares de base ou uma deleção de um ou mais pares de base.
[00034] Conforme usado aqui, o termo haplotipo significa uma região cromossômica dentro de uma janela de haplotipo definida por pelo menos um marcador molecular polimórfico. As combinações de caracterização de perfil de marcador único em cada janela de haplotipo definem haplotipos individuais para essa janela. Ainda, alterações em um haplotipo, que ocorrem através de recombinação por exemplo, podem resultar na modificação de um haplotipo, de modo que ele compreenda apenas uma porção do haplotipo original (parental) operavelmente relacionado ao traço, por exemplo, via uma ligação física a um gene, QTL, ou transgene. Qualquer uma de tais alterações em um ha
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11/47 plotipo deverá ser incluída em nossa definição daquilo que constitui um haplotipo, contanto que a integridade funcional dessa região genômica não seja alterada ou aprimorada.
[00035] Conforme usado aqui, o termo janela de haplotipo significa uma região cromossômica que é estabelecida por análises estatísticas conhecidas por aqueles versados na técnica e está em desequilíbrio de relação. Assim, identidade por estado entre dois indivíduos endógamos (ou dois gametas) em um ou mais loci de marcador molecular localizados dentro dessa região é tomada como evidência de identidade por descendente da região toda. Cada janela de haplotipo inclui pelo menos um marcador molecular polimórfico. Janelas de haplotipo podem ser mapeadas ao longo de cada cromossomo no genoma. Janelas de haplotipo não são fixas per se e, dada a densidade sempre crescente de marcadores moleculares, a presente invenção prevê que o número e tamanho de janelas de haplotipo irão evoluir, com o número de janelas aumentando e seus respectivos tamanhos diminuindo, assim, resultando em uma confiança de grau sempre crescente na determinação de identidade por descendente, com base na identidade por estado nos loci de marcador.
[00036] Conforme usado aqui, genótipo é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos, em contraste ao traço observável (o fenótipo). O genótipo pode ser indiretamente caracterizado, por exemplo, mediante o uso de marcadores genéticos ou diretamente caracterizado, por exemplo, através de sequenciamento de ácido nucleico. Marcadores adequados incluem um caráter fenotípico, um perfil metabólico, um marcador genético ou algum outro tipo de marcador. Genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais loci conhecidos que o indivíduo herdou de seus parentais ou é capaz de passar para sua prole. O termo genótipo pode ser usado para referir-se à constituição genética de um indivíduo em um único
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12/47 locus, em múltiplos loci, uma porção de um cromossomo, um cromossomo inteiro, uma porção do genoma, o genoma inteiro ou, mais geralmente, o termo genótipo pode ser usado para referir-se à composição genética de um indivíduo para todos os genes em seu genoma. Um genótipo pode constituir um alelo para pelo menos um locus de marcador genético ou um haplotipo para pelo menos uma janela de haplotipo.
[00037] Germoplasma refere-se ao material genético de um indivíduo (por exemplo, uma planta), um grupo de indivíduos (por exemplo, uma linhagem, variedade ou família de planta) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultura. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula ou pode ser separado do organismo ou célula. Em geral, germoplasma fornece material genético com uma composição molecular específica que constitui uma base física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultura de célula. Conforme usado aqui, germoplasma inclui células, semente ou tecidos dos quais novas plantas podem ser crescidas ou partes de planta, tais como folhas, caules, pólen ou células que podem ser cultivadas em uma planta inteira.
[00038] Conforme usado aqui, fenótipo significa as características detectáveis de uma célula ou organismo as quais podem ser influenciadas pelo genótipo.
[00039] Conforme usado aqui, relação refere-se à frequência relativa na qual tipos de gametas são produzidos em um cruzamento. Por exemplo, se o locus A tem genes A ou a e o locus B tem genes B ou b e um cruzamento entre o parental I com AABB e o parental B com aabb produzirá quatro possíveis gametas onde os genes são segregados em AB, Ab, aB e ab. A expectativa nula é onde há segregação independente igual em cada um dos quatro possíveis genótipos, isto é, sem relação para ¼ dos gametas de cada genótipo. Segrega
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13/47 ção de gametas em um genótipo diferentes de % é atribuída à relação. [00040] Conforme usado aqui, desequilíbrio de relação é definido no contexto da frequência relativa de tipos de gameta em uma população de muitos indivíduos em uma única geração. Se a frequência do alelo A é p, a é p', B é q e b é q', então, a frequência esperada (sem desequilíbrio de relação) do genótipo AB é pq, Ab é pq', aB é p'q e ab é p'q'. Qualquer desvio da frequência esperada é denominado desequilíbrio de relação. Dois loci são ditos como sendo geneticamente relacionados quando eles estão em desequilíbrio de relação.
[00041] Conforme usado aqui, locus de tração quantitativo (Quantitative Trait Locus - QTL) significa um locus que controla, até certo ponto, traços numericamente representáveis que são usualmente distribuídos continuamente.
[00042] Conforme usado aqui, alelo de resistência significa a sequência de ácido nucleico que inclui o alelo polimórfico associado à resistência a uma doença.
[00043] Conforme usado aqui, algodão significa Gossypium hirsutu e inclui todas as variedades de planta que podem ser cruzadas com algodão, incluindo espécies de algodão silvestre. Mais especificamente, plantas de algodão da espécie Gossypium hirsutum e da subespécie Gossypium hirsutum L podem sofrer genotipagem usando essas composições e métodos. Em um aspecto adicional, a planta é do grupo Gossypium arboreum L., de outro modo conhecido como algodão arbusto. Em outro aspecto, a planta é do grupo Gossypium barbadense L., de outro modo conhecido como algodão Egípcio ou American pima. Em outro aspecto, a planta de algodão é do grupo Gossypium herbaceum L., de outro modo conhecido como algodão levant. Gossypium ou plantas de algodão podem incluir híbridos, endógamos parciais ou membros de populações definidas ou indefinidas.
[00044] Conforme usado aqui, o termo compreendendo significa
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14/47 incluindo, mas não limitado a.
[00045] Conforme usado aqui, o termo linhagem de elite significa qualquer linhagem que resultou de melhoramento e seleção para desempenho agronômico superior. Exemplos não limitativos de linhagens de elite que estão comercialmente disponíveis incluem DP 555 BG/RR, DP 445 BG/RR, DP 444 BG/RR, DP 454 BG/RR, DP 161 B2RF, DP 141 B2RF, DP 0924 B2RF, DP 0935 B2RF, DP 121 RF, DP 174 RF (Deltapine); ST5599BR, ST5242BR, ST4554B2RF, ST4498B2RF,
ST5458B2RF (Stoneville); FM9058F, FM9180B2F, FM1880B2F,
FM1740B2F (FiberMax); PHY485WRF, PHY375WRF, PHY745WRF (Acala) (PhytoGen); e MCS0423B2RF, MCS0508B2RF (Cotton States).
[00046] Na presente invenção, um locus de resistência à doença está localizado sobre o cromossomo A11. Marcadores de SNP usados para detectar a presença de resistência a nematoide reniforme e monitorar a introgressão do locus de resistência à doença compreendem aqueles selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1-112. Iniciadores dianteiros Iniciadores usados para amplificar os SNPs em SEQ ID NO: 1-68 são fornecidos na listagem de sequência como SEQ ID NO: 113-180. Iniciadores reversos iniciadores usados para amplificar os SNPs em SEQ ID NO: 1-68 são listados na mesma ordem na listagem de sequência como SEQ ID NO: 181-248. Conjuntos de sonda usados para detectar os SNPs em SEQ ID NO: 1-68 são também listados na mesma ordem como SEQ ID NO: 249-316 e SEQ ID NO: 317-384, respectivamente.
[00047] Por exemplo, a sequência de DNA marcador SEQ ID NO 3 pode ser amplificada usando os iniciadores indicados como SEQ ID NO: 115 e 183 e detectada com sondas indicadas como SEQ ID NO: 251 e 319. A sequência de DNA marcador exemplificativa ilustrativa SEQ ID NO 12 pode ser amplificada usando os iniciadores indicados
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15/47 como SEQ ID NO: 124 e 192 e detectada com sondas indicadas como SEQ ID NO: 260 e 328. A sequência de DNA marcador exemplificativa ilustrativa SEQ ID NO: 13 pode ser amplificada usando os iniciadores indicados como SEQ ID NO: 125 e 193 e detectada com sondas indicadas como SEQ ID NO: 261 e 329.
[00048] Além disso, SEQ ID NO: 69-112 são marcadores de SNP adicionais úteis para detecção da presença de resistência a nematoide reniforme e para monitoramento da introgressão do locus de resistência à doença. Com base nessas sequências, aqueles versados na técnica podem solicitar os componentes de reação necessários para detectar os SNPs divulgados de várias opções de vendedores especializados em tais serviços ou simplesmente criar os iniciadores e sondas apropriados usando métodos que requerem apenas capacidade comum na técnica.
[00049] A presente invenção também proporciona uma planta de algodão compreendendo uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1-112, fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. A presente invenção também proporciona uma planta de algodão de elite compreendendo uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1112, fragmentos das mesmas e complementos das mesmas.
[00050] A presente invenção também proporciona uma planta compreendendo um locus de resistência à doença. Tais alelos podem ser homozigóticos ou heterozigóticos.
[00051] Conforme usado aqui, reniforme refere-se à qualquer variante ou isolado de reniforme. Uma planta de algodão da presente invenção pode ser resistente a um ou mais nematoides capazes de causar doença similar ao reniforme. Em um aspecto, a presente invenção proporciona plantas resistentes a reniforme, bem como métodos e composições para triagem de plantas de algodão com relação à resis
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16/47 tência ou suscetibilidade a reniforme, causada pelo gênero Rotylenchulus. Em um aspecto preferido, a presente invenção proporciona métodos e composições para triagem de plantas de algodão com relação à resistência ou suscetibilidade a Rotylenchulus reniformis.
[00052] Em um aspecto, a presente invenção poderia ser usada sobre qualquer planta. Em outro aspecto, a planta é selecionada do gênero Gossypium. Em outro aspecto, a planta é selecionada da espécie Gossypium hirsutum. Em um outro aspecto, a planta é selecionada da subespécie Gossypium hirsutum L. Em um aspecto adicional, a planta é do grupo Gossypium arboreum L., de outro modo conhecido como algodão arbusto. Em outro aspecto, a planta é do grupo Gossypium barbadense L., de outro modo conhecido como algodão Egípcio ou American pima. Em outro aspecto, a planta de algodão é do grupo Gossypium herbaceum L., de outro modo conhecido como algodão levant. Gossypium ou plantas de algodão podem incluir híbridos, endógamos parciais ou membros de populações definidas ou indefinidas. [00053] Plantas da presente invenção podem ser muito resistentes, resistentes, substancialmente resistentes, moderadamente resistentes, comparativamente resistentes, parcialmente resistentes, moderadamente suscetíveis ou suscetíveis a uma determinada doença ou mostrar outras variações nos graus de resistência ou suscetibilidade.
[00054] Em um aspecto preferido, a presente invenção proporciona uma planta a ser ensaiada com relação à resistência ou suscetibilidade a uma doença através do Método de Índice de Infecção ou através de qualquer outro método para determinar se a planta é muito resistente, resistente, substancialmente resistente, moderadamente resistente, comparativamente resistente, parcialmente resistente, moderadamente suscetível ou suscetível a uma determinada doença ou mostra outras variações nos graus de resistência ou suscetibilidade.
[00055] Em outro aspecto, a planta de algodão pode mostrar uma
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17/47 resistência comparativa com relação a uma planta de algodão de controle não resistente. Nesse aspecto, uma planta de algodão de controle será, de preferência, geneticamente similar, exceto quanto ao alelo ou alelos de resistência à doença em questão. Tais plantas podem ser crescidas sob condições similares com exposição equivalente ou quase equivalente ao patógeno.
[00056] Um QTL de resistência à doença da presente invenção pode ser introduzido em uma linhagem de elite. Uma linhagem de elite é qualquer linhagem que resultou de melhoramento e seleção para desempenho agronômico superior.
[00057] Um QTL de resistência da presente invenção pode também ser introduzido em uma planta de algodão de elite compreendendo um ou mais transgenes que conferem tolerância a herbicida, rendimento aumentado, controle de inseto, resistência à doença fúngica, resistência a vírus, resistência a nematoide, resistência à doença bacteriana, resistência à doença por micoplasma, produção modificada de óleos, alta produção de óleo, alta produção de proteína, controle de germinação e crescimento de muda, nutrição animal e humana intensificada, baixo teor de rafinose, resistência a estresse ambiental, digestibilidade aumentada, enzimas industriais, proteínas farmacêuticas, peptídeos e pequenas moléculas, traços de processamento aprimorados, aroma aprimorado, fixação de nitrogênio, produção de semente híbrida, alergenicidade reduzida, biopolímeros e biocombustíveis, dentre outros. Em um aspecto, a tolerância a herbicida é selecionada do grupo consistindo de herbicidas de glifosato, dicamba, glufosinato, sulfoniluréia, bromoxinila e norflurazon. Esses traços podem ser proporcionados por meio de métodos de biotecnologia de planta, como transgenes em plantas.
[00058] Um alelo ou alelos de QTL de resistência à doença pode ser introduzido a partir de qualquer planta que contém esse alelo (do
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18/47 ador) em qualquer planta recipiente. Em um aspecto, a planta recipiente pode conter loci de resistência à doença adicionais. Em outro aspecto, a planta recipiente pode conter um transgene. Em outro aspecto, enquanto se mantém o QTL introduzido, a contribuição genética da planta que confere o QTL de resistência à doença pode ser reduzida através de retrocruzamento ou outras abordagens apropriadas. Em um aspecto, o material genético nuclear derivado do material doador na planta pode ser menos do que ou cerca de 50%, menos do que ou cerca de 25%, menos do que ou cerca de 13%, menos do que ou cerca de 5%, 3%, 2% ou 1% do que o material genético contém o locus ou loci de resistência de interesse.
[00059] É ainda entendido que uma planta da presente invenção pode exibir as características de qualquer grupo de maturidade relativa. Em um aspecto, o grupo de maturidade é selecionado do grupo consistindo de variedades de maturação precoce, variedades de maturação no meio da estação e variedades de estação total.
[00060] Um alelo de um QTL pode compreender múltiplos genes ou outros fatores genéticos mesmo dentro de uma região genômica contígua ou grupo de relação, tal como um haplotipo. Conforme usado aqui, um alelo de um locus de resistência à doença pode, portanto, abranger mais de um gene ou outro fator genético onde cada gene individual ou componente genético é também capaz de exibir variação alélica e onde cada gene ou fator genético é também capaz de estimular um efeito fenotípico sobre o traço quantitativo em questão. Em um aspecto da presente invenção, o alelo de um QTL compreende um ou mais genes ou outros fatores genéticos que também são capazes de exibir variação alélica. O uso do termo um alelo de um QTL, assim, não se destina a excluir um QTL que compreende mais de um gene ou outro fator genético. Especificamente, um alelo de um QTL, na presente invenção, pode denotar um haplotipo dentro de uma janela de
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19/47 haplotipo, em que um fenótipo pode ser resistência à doença. Uma janela de haplotipo é uma região genômica contígua que pode ser definida e rastreada com um conjunto de um ou mais marcadores polimórficos, em que os polimorfismos indicam identidade por descendente. Um haplotipo dentro dessa janela pode ser definido pela caracterização de perfil única de alelos em cada marcador. Conforme usado aqui, um alelo é uma de várias formas alternativas de um gene que ocupa um determinado locus sobre um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um determinado locus sobre um cromossomo são os mesmos, essa planta é homozigótica nesse locus. Se os alelos presentes em um determinado locus sobre um cromossomo diferem, a planta é heterozigótica nesse locus. As plantas da presente invenção podem ser homozigóticas ou heterozigóticas em qualquer locus de doença em particular ou para um marcador polimórfico em particular.
[00061] A presente invenção também proporciona partes das plantas da presente invenção. Partes de planta, sem limitação, incluem semente, endosperma, óvulo e pólen. Em um aspecto particularmente preferido da presente invenção, a parte de planta é uma semente.
[00062] Várias publicações de patente e não-patente são citadas aqui, as divulgações de cada uma das quais são incorporadas aqui por referência na íntegra.
[00063] Uma vez que diversas modificações poderiam ser feitas nas construções e métodos descritos e ilustrados aqui sem se desviar do escopo da invenção, pretende-se que todo o assunto contido na descrição a seguir ou mostrado nos desenhos em anexo seja interpretado como ilustrativo, ao invés de limitativo. A amplitude e escopo da presente invenção não deverão estar limitados por qualquer uma das modalidades exemplificativas descritas acima, mas serão definidos apenas de acordo com as reivindicações em anexo a seguir e seus equivalentes.
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EXEMPLOS [00064] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que os métodos divulgados nos exemplos os quais seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção e, assim, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática.
[00065] Contudo, aqueles versados na técnica apreciarão, à luz da presente divulgação, que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas divulgadas aqui e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem se desviar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes os quais são química e fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes descritos aqui, ao mesmo tempo em que resultados similares ou idênticos são obtidos. Todos de tais substituintes e modificações similares evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do escopo, espírito e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo. Exemplo 1. Determinação de Índices de Infecção
Amostragem de Solo e Extração de DNA [00066] Para assegurar que o solo coletado de uma determinada localização era representativo do solo naquela localização, quatro amostras de solo de 200-300 g foram obtidas de várias posições naquela localização, combinadas e totalmente misturadas para formar uma amostra agregada. Usando o kit UltraClean® Mega Soil DNA Isolation e seguindo os protocolos do fabricante, DNA foi extraído de uma ou mais subamostras de solo de 5-7 g tomadas da amostra agregada.
Quantificação de DNA Total [00067] Após extração de DNA de amostras do solo, a quantidade
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21/47 total de DNA na amostra de solo foi quantificada usando um kit QuantiT® PicoGreen® e seguindo os protocolos do fabricante. Uma curva padrão de quatro pontos foi gerada usando 10 qL de DNA de esperma de salmão, em várias concentrações, adicionada a 40 ql de tampão TE e 50 qL de reagente PicoGreen®. A quantidade de DNA detectada na amostra de solo foi mapeada à curva-padrão para chegar à quantidade total de DNA isolada da amostra de solo (tabela 1).
Tabela 1. Conteúdos dos ensaios de quantificação de DNA (ql).
Produto DNA de concenReagente de PCR tração conhecida
DNA 2 10
Tampão TE 48 40
Reagente Picogreen® diluído 200 vezes 50 50
Total: 100 100
Quantificação de Gene de ITS1 de Reniforme [00068] A quantidade de gene de ITS1 no isolado de DNA extraído da amostra de solo acima foi quantificada por meio de PCR em Tempo Real. Uma diluição de 100 vezes do isolado foi criada e 2 qL dessa diluição foram misturados com 3 qL de mistura de iniciador-sonda para ITS1 e 5 qL de TaqMan® Universal PCR Mastermix. Os conteúdos da mistura de primer-sonda são mostrados na tabela 2 e os conteúdos da subsequente reação de PCR são mostrados na tabela 3.
Tabela 2. Conteúdos da mistura de iniciador-sonda para ITS1 de reniforme usada para quantificar nematoide reniforme [Reagente]
Sequência (5'^ 3') Volume (qL)
100 qM Inciador dianteiro GCTGCGCTGGCGTCTCT 330
100 qM Inciador reverso GGACGTAGCACATTAGCAATGC 330
100 qM Sonda CGTTGTTGAGCAGTTGT 67
Água - 9273
Total: 10000
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Tabela 3. Conteúdos da reação de PCR usada para quantificar nematoide reniforme
Componente Vol (pL)
TaqMan® Universal PCR Mastermix 5
Mistura de Iniciador-Sonda para ITS 3
DNA diluído 2
Total: 10 [00069] Após as reações serem montadas, PCR foi realizada em um ABI 7900HT Sequence Detection System usando técnicas padrões conhecidas no campo para amplificar a sequência específica aos dois iniciadores. A quantidade de DNA total e a quantidade de DNA amplificado na reação de PCR pela mistura de iniciador-sonda para ITS foram comparadas com uma curva padrão geradas pelo ABI 7900HT usando diluições de 10 vezes do plasmídeo ITS de reniforme. Essa comparação forneceu uma estimativa da quantidade total de DNA e da quantidade de DNA de ITS1 de reniforme na amostra.
Cálculo do Índice de Infecção [00070] A quantidade de DNA total e a quantidade de DNA amplificado na reação de PCR foram usadas para calcular o índice de infecção para essa amostra usando a fórmula a seguir:
ng de DNA de gene de ITS1 de reniforme índice de infecção =___________________________________________________ ng de DNA total
Exemplo 2. Demonstração da relação entre o Índice de Infecção vs. a Técnica de Extração com Funil de Baermann [00071] Noventa gramas de amostras de solo foram coletados das rizosferas de linhagens de algodão que exibem níveis variados de resistência a reniforme em campos infestados de reniforme. De cada amostra de 90 g, uma subamostra de 5-7 g foi tomada para avaliar o nível de infestação via o Método de Índice de Infecção. Os 83-85 g restantes de solo foram analisados via a Técnica de Extração com Funil de Baermann (Baermann Funnel Extraction Technique - BFET).
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Uma análise por regressão produziu o modelo linear a seguir: Log(Nem/g) = 0,7866 + 1,2883 Log(ITS/DNA) com R2 = 0,742 e onde g = gramas, Nem = o número de nematoides reniformes determinado através de BFET, ITS = o ng previsto de sequência gênica de rRNA de ITS1 5.8S de reniforme detectado por Taqman® Real time PCR e DNA = o ng de DNA total detectado através do protocolo de padrão quantificação de DNA.
[00072] Para demonstrar a correlação entre BFET e o Método de Índice de Infecção, jovens reniformes que foram coletados via BFET para cada amostra de solo foram suspensos em 1,5 mL de água em pequenos tubos e contados manualmente sob um microscópio. Cada uma dessas amostras foi, então, avaliada via o Método de Índice de Infecção, em que o DNA de cada tubo foi extraído como se ali houvesse uma amostra de solo de 5-7 g, conforme descrito anteriormente. Uma análise por regressão produziu o modelo de adaptação linear a seguir:
Log(Nem/g) = 0,3156 + 3,1713 Log(ITS/DNA) com R2 = 0,779 e onde g = gramas, Nem = o número de nematoides reniformes determinado através de BFET, ITS = o ng previsto de sequência gênica de rRNA de ITS1 5.8S de reniforme detectado por Taqman® Real Time PCR e DNA = o ng de DNA total detectado através do protocolo de padrão quantificação de DNA.
[00073] Assim, o Método de Índice de Infecção correlaciona (R2 > 0,74) com o número de nematoides reniformes em uma amostra de matéria se ela é uma amostra de solo ou uma suspensão substancialmente purificada de nematoides reniformes.
Exemplo 3. Uso do Método de Índice de Infecção para monitorar infecção por reniforme entre diferentes áreas de crescimento [00074] Em uma modalidade da presente invenção, o Método de Índice de Infecção pode ser usado para determinar o nível de infesta
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24/47 ção por reniforme (densidade de inóculo) em diferentes áreas de crescimento. De 8 campos de algodão próximos de várias cidades no Cinturão do Algodão (tabela 4), cinco amostras de solo de 200-300 g foram coletadas de localizações representativas dentro de cada campo. As cinco amostras coletadas em um único campo foram, então, agrupadas, totalmente misturadas e, após o que, consideradas como representando o solo coletivo para essa área de crescimento.
[00075] De cada uma das 8 amostras que representam um campo diferente, uma subamostra de 5 g foi processada através do Método de Índice de Infecção, conforme descrito no Exemplo 1, enquanto que 100 g do solo restante foram processados através de BFET. Infelizmente, em virtude da perda inadvertida de solo das amostras tiradas em Havana e Leesburg, restaram quantidades insuficientes para realizar BFET para essas áreas de crescimento. Os dados gerados foram inseridos na tabela 4 e uma análise de regressão foi realizada para revelar a relação entre os resultados gerados a partir dos dois métodos (R2 = 0,81).
Tabela 4. Resultados do Método de Índice de Infecção versus resultados da Técnica de Extração com Funil de Baermann para várias áreas de crescimento
Reniforme por 100 g de solo
Técnica de Extração ,
Método de Índice
Área de crescimento com Funil de de Infecção
Baermann
Caledonia, MS 1360 1154
Burtihatchie, MS 129 105
Starkville, MS 381 52
Minturn, SC 592 638
Laurinburg, NC* 1151* 2181
Laurinburg, NC 322 125
Havana,, FL 0** 301
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Reniforme por 100 g de solo
Técnica de Extração ,
Método de Índice Área de crescimento com Funil de de Infecção Baermann
Leesburg, FL 0** 285
*Muitos nematoides mortos ou inativos observados **Tamanho de amostra muito pequeno (60 g) para extração [00076] Assim, o Método de Índice de Infecção pode ser usado para determinar a presença de organismos-alvo em várias áreas de crescimento distribuídas através de uma ampla faixa geográfica. Além disso, a discrepância entre os resultados do Método de Índice de Infecção e BFET para a primeira localização, Laurinburg, NC, listada na tabela 4 destaca a precisão aprimorada do Método de Índice de Infecção com relação a métodos anteriores descritos na técnica porque, nessa localização, muitos nematoides mortos ou inativados foram observados. Aqueles versados na técnica entenderão que os resultados de BFET tendem a ser subestimativas de infecção por nematoide em localizações onde muitos dos nematoides estão mortes ou inativos no momento em que as amostras foram tomadas. Assim, o número muito maior de reniformes detectado através do Método de Índice de Infecção, comparado com BFET na primeira localização, Laurinburg, ilustra que, diferente dos métodos atuais descritos na técnica, o Método de Índice de Infecção não é confundido por números desproporcionais de nematoides mortos ou inativados em uma amostra de solo.
[00077] A tabela 4 também ilustra a capacidade do Método de Índice de Infecção de determinar precisamente os níveis de infestação sob condições onde os tamanhos de amostra de solo são muito pequenos para outros métodos, uma vez que resultados claros foram obtidos com o Método de Índice de Infecção para localizações onde solo insuficiente estava disponível para realizar BFET.
[00078] Índices de infecção podem ser determinados para cada
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26/47 área de crescimento antes de plantio, após plantio, durante a estação de crescimento, após colheita e/ou em qualquer combinação dos mesmos. Um índice de infecção médio pode ser determinado para uma área de crescimento em particular para um ponto de tempo específico ou durante um período de tempo, com base em uma ou mais amostras tomadas sequencialmente dessa área de crescimento com o tempo.
[00079] Em uma modalidade, o índice de infecção médio para uma ou mais áreas de crescimento pode ser comparado para determinar e/ou contrastar o nível de infestação entre as mesmas. Essa informação pode ser usada para desenvolver prioridades e estratégias de tratamento para tratamento de infestação entre áreas de crescimento, tomar melhores decisões sobre tratamento e produção de uma safra e determinar a capacidade das plantas de resistir à doença.
[00080] Por exemplo, índices de infecção determinados antes de plantio podem constituir um nível de linha de base de infestação para uma área de crescimento, permitindo que um produtor decida se planta naquela localização ou decida qual variedade de uma determinada safra seria melhor adequada àquele ambiente, com base nas necessidades do produtor. Por exemplo, se o índice de infecção por reniforme médio para um campo é particularmente alto, um produtor pode selecionar plantar uma variedade particularmente resistente a reniforme naquela área de crescimento ou talvez escolher deixá-la vazia durante um período de tempo.
[00081] Da mesma forma, um produtor pode basear decisões sobre qual variedade de safra, se houver, plantar em uma área de crescimento em particular no anos seguinte com base nos índices de infecção medidos naquela área de crescimento, quer antes de plantio, durante a estação de crescimento ou após colheita, no ano anterior.
[00082] Assim, aqueles que trabalham na indústria de sementes de
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27/47 safra podem fazer rapidamente recomendações precisas sobre quais cultivares são mais adequados a uma área de crescimento versus outra ou fazer comparações análogas e tomar decisões sobre quais cultivares plantar em diferentes localizações dentro da mesma área de crescimento.
[00083] O índice de infecção pode ser combinado com VART (Variable Application Rate Technologies - Tecnologias de Taxa de Aplicação Variável) de forma a tomar decisões específicas para um local e alocar recursos para tratamentos químicos apropriados, com base no nível de infestação por reniforme em diferentes áreas de crescimento. Por exemplo, recursos compreendendo produtos químicos, equipamento e/ou mão de obra, ou outros recursos, ou combinações dos mesmos poderiam ser depreendidos em maior concentração para uma área de crescimento em oposição à outra, dependendo do nível inicial de infestação antes de plantio, conforme determinado por meio do Método de Índice de Infecção. De forma análoga, essas decisões sobre alocação de recursos podem ser tomadas para tratar ou antecipar tratamentos ótimos de plantas em várias localizações dentro de uma área de crescimento enquanto as plantas estão crescendo e recursos depreendidos consequentemente.
[00084] Em outra modalidade, o índice médio de infecção de várias áreas de crescimento pode ser usado para monitorar ou classificar a alteração nos níveis de infestação em múltiplas áreas de crescimento com o tempo. Uma vez que esses níveis mudam, recursos poderiam ser alocados à diferentes áreas de crescimento em antecipação às alterações previstas nas tendências de nível de infestação.
Exemplo 4. Uso do Método de Índice de Infecção para monitorar infecção por reniforme em uma dada localização geográfica [00085] Em uma modalidade da presente invenção, o Método de Índice de Infecção pode ser usado para determinar o nível de infesta
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28/47 ção por reniforme para uma única área de crescimento ou entre múltiplas localizações dentro de uma única área de crescimento.
[00086] Solo é coletado em múltiplas localizações dentro de uma determinada área de crescimento e processado através do Método de índice de Infecção, conforme descrito no Exemplo 1. índices de infecção podem ser determinados para cada amostra antes de plantio, após plantio, durante o período de crescimento das plantas, após colheita e/ou em qualquer combinação dos mesmos.
[00087] Em uma modalidade, um índice médio de infecção pode ser determinado para uma localização em particular em uma área de crescimento durante um período de tempo com base em uma ou mais amostras tomadas dessa localização em um ou mais pontos de tempo. Alternativamente, a área de crescimento pode ser dividida em seções, cada uma consistindo em uma ou mais localizações de amostra e um índice médio de infecção dessa seção pode ser determinado calculando-se a média dos índices de infecção determinados a partir de uma ou mais amostras tomadas dentro dessa seção.
[00088] A tabela 5 ilustra como dados de índice de infecção gerados a partir de amostras de solo tiradas de múltiplas localizações dentro de uma área de crescimento, tal como aqueles gerados a partir de um campo de algodão cultivado próximo de Parksdale, AR, podem ser mapeados sobre uma representação gráfica da área de crescimento. Isso revela como níveis de infestação diferiam entre localizações dentro do campo em um ponto de tempo em particular.
Tabela 5. Uma representação da avaliação pré-plantio de infestação por nematoide reniforme (número de reniforme por pinto de solo) através de múltiplas localizações em um campo próximo de Parksdale, AR.
A B C D E F G
4735 3906 3095 4811 10862 11276 8333
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4037 6516 4591 5404 12153 7577 11985
5042 5504 4389 5953 6506 9971 7685
14251 5327 11990 12558 13361 7116 14707
Alta infestação
Infestação moderada
Baixa infestação [00089] Um dos problemas de geração de dados de avaliação de doença por reniforme confiáveis é a falta de distribuição uniforme da peste em um dado campo ou população. Em uma modalidade da presente invenção, o Método de índice de Infecção é usado para monitorar a alteração dos níveis de infestação para um vaso, localização, seção ou múltiplas localizações ou seções de uma área de crescimento com o tempo, o qual permite que um produtor rastreie a disseminação de infestação através de diferentes localizações dentro do campo.
[00090] Por exemplo, por meio de monitoramento da alteração nos níveis de infestação com o tempo, um produtor ou cientista pode determinar se diferenças nos níveis de infestação em algum ponto são indevidamente influenciadas por diferenças nos níveis iniciais de infestação ou algum outro fator, tal como resistência da planta à infecção por nematoide reniforme.
[00091] Anteriormente, era difícil medir precisamente os efeitos de um determinado tratamento sobre a disseminação de infestação por reniforme através de localizações em virtude de investimentos consideráveis no tempo e recursos necessários para avaliar cada área de crescimento ou localização dentro de uma área de crescimento antes, durante e após o tratamento. Os resultados de tais estudos, por exemplo, poderíam ser facilmente confundidos por diferenças nos níveis iniciais de infestação através de localizações ou áreas de crescimento, a menos que medidas caras fossem tomadas para levar em conta essas
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30/47 diferenças iniciais. O Método de Índice de Infecção, por outro lado, constitui uma forma viável de corrigir tais diferenças, proporcionando uma forma relativamente rápida e barata de avaliar a infestação em uma base localização por localização ou seção por seção em múltiplos tempos para substancialmente todas as localizações em uma área de crescimento.
[00092] Essa informação pode ser usada para desenvolver prioridades e estratégias de tratamento de infecção entre locais dentro de uma área de crescimento. Por exemplo, índices de infecção determinados para localizações ou seções específicas do campo, antes do plantio, podem fornecer um nível de base de infecção para essa localização, permitindo que um produtor decida qual variedade de safra, se houver, plantar em uma localização em particular no campo, com base no índice de infecção previamente determinado para essa localização. [00093] O Método de Índice de Infecção pode também ser usado em conjunto com VART para prever a alocação de recursos a diferentes localizações dentro de uma área de crescimento no preparo de tratamento de plantas antes que elas sejam plantadas ou enquanto elas estão crescendo. Por exemplo, recursos compreendendo produtos químicos, equipamento e/ou mão de obra ou outros recursos ou combinações dos mesmos poderiam ser depreendidos em maior concentração para uma localização ou seção de um campo em oposição à outra, dependendo de seu índice de infecção antes de plantio. Da mesma forma, essas decisões sobre alocação de recursos podem ser feitas para tratar ou antecipar tratamentos desejados de plantas em uma área de crescimento enquanto as plantas estão crescendo e recursos depreendidos consequentemente.
[00094] Em outra modalidade, o índice médio de infecção de uma seção de uma área de crescimento pode ser usado para monitorar a alteração nos níveis de infestação com o tempo. Uma vez que esses
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31/47 níveis mudam, recursos poderiam ser alocados a diferentes seções de uma área de crescimento em antecipação de futuras tendências quanto ao nível de infecção.
Exemplo 5. Demonstração de que o Método de Índice de Infecção pode ser usado para fenotipagem confiável de plantas com relação à resistência a nematoide reniforme [00095] Esse exemplo descreve como o Método de Índice de Infecção pode ser usado para determinar o número de nematoides reniformes presentes na rizosfera de uma planta e como essa informação pode ser usada para fenotipagem da planta com relação à sua capacidade de resistir à infecção por nematoide reniforme.
Estabelecimento de fenótipos relativamente resistentes e suscetíveis [00096] Uma população de linhagens Lonren-1 e Lonren-2 de Gossypium arboretum de 7-10 dias de idade foram inoculadas com aproximadamente 2500 nematoides reniformes jovens por planta e propagada em uma câmara de crescimento durante 45-50 dias, após o que aproximadamente 90g de solo foram separadamente coletados da rizosfera de cada planta e o nível de infestação por nematoide reniforme foi quantificado para cada planta usando técnicas BFET padrão.
[00097] As plantas com maiores níveis de nematoides reniformes foram consideradas, após o que, como tendo um fenótipo relativamente suscetível e aquelas com o menor número de nematoides reniformes foram, após o que, consideradas como tendo um fenótipo relativamente resistente para subsequentes análises. Todas as plantas foram crescidas sob condições ambientais idênticas.
Coleta de Dados [00098] As seis linhagens mais suscetíveis e as seis mais resistentes foram plantadas em uma câmara de crescimento e cada planta inoculada com aproximadamente 2500 nematoides, com quatro réplicas. Duas outras plantas de cada fenótipo não foram inoculadas para
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32/47 servir como controles vivos e dois vasos contendo solo, mas não plantas, foram inoculados para servir como controles vazios. Todas as plantas foram colhidas após dois meses e solo coletado da rizosfera de cada planta. Nesse momento, além de 90 g de solo coletado para quantificar a infecção por nematoide via BFET, amostras de 5-7 g foram também coletadas para quantificar a infecção por nematoide via o Método de Índice de Infecção.
Resultados [00099] Os índices médios de infecção para os dois fenótipos e os controles são apresentados na tabela 6 (um índice de infecção de 73,72 para uma das plantas suscetíveis inoculadas foi excluído como um dado inconsistente, com base em uma análise ANOVA). Em média, os fenótipos suscetíveis tinham índices de infecção aproximadamente 23 vezes maiores do que plantas com fenótipos resistentes, demonstrando a capacidade do Método de Índice de Infecção de avaliar a capacidade de plantas de resistir à infecção por nematoide (note que inclusão do dado inconsistente teria feito essa diferença ainda maior).
Tabela 6. Resultados de índices de infecção calculados sobre fenótipos resistente a reniforme e suscetível a reniforme
Genótipo Tratamento Índice médio de infecção*
Resistente Inoculado 0,76
Controle 0,00
Suscetível Inoculado 17,18
Controle 0,01
Vazio Inoculado 0,02
ng de DNA de gene de ITS1 de reniforme *índice de infecção = ___________________________________________________ ng de DNA total [000100] Dessa maneira, o índice de infecção calculado para uma amostra de solo coletada da rizosfera de uma planta pode servir como
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33/47 uma indicação da capacidade da planta de resistir à infecção por reniforme e, consequentemente, servir como o fenótipo efetivo de oxigênio. Assim, o índice de infecção calculado para uma planta ou uma população de plantas pode ser comparado com aquele de outra planta ou população de plantas para comparar e classificar níveis relativos de resistência.
[000101] Esse método, então, permite que o usuário compare fenótipos de resistência relativa entre plantas em uma única área de crescimento ou através de áreas de crescimento de forma análoga conforme índices de infecção podem ser comparados para localizações dentro ou entre áreas de crescimento, conforme descrito nos Exemplos 1-4. Alterações nos índices de infecção com o tempo podem revelar informação importante sobre a disseminação de infecção em uma população ou entre populações. Além disso, as capacidades de linhagens de planta de resistir à infecção também podem ser determinadas. Por exemplo, índices de infecção calculados para plantas em uma população em um ponto de tempo específico na estação de crescimento podem ser comparados com índices de infecção pré-plantio para fenotipagem mais precisa da capacidade de uma planta de resistir à infecção. Ele permite que o usuário determine quanta diferença entre os índices de infecção de duas plantas é em virtude de diferenças nas capacidades das plantas de resistir realmente à infecção versus diferenças em níveis pré-plantio de infestação por reniforme no solo nas localizações onde as plantas foram plantadas. Mesmo alterações na capacidade de uma planta de resistir à infecção com o tempo podem ser determinadas.
[000102] Essa informação pode também ser muito importante ao ajudar os produtores ou criadores a determinar como melhor alocar recursos ou aplicar tratamentos às plantas em resposta à infestação por reniforme e permitir que os produtores de planta avaliem mais prePetição 870190082259, de 23/08/2019, pág. 46/60
34/47 cisamente a capacidade de uma planta de resistir à infecção.
Exemplo 6. O Método de Índice de Infecção pode ser usado em outras espécies que não nematoide reniforme [000103] Frascos cônicos (50 mL), cada um contendo 5 g de solo sem nematoide do nó da raiz (root knot nematode - RKN), foram montados e um número específico de jovens no estágio J2 de RKN foi contado manualmente e misturado com o solo dentro de cada frasco. O número de RKN adicionado a cada frasco foi 0, 10, 100, 250, 500, 100, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500 ou 10.000, com 3 réplicas de cada número, para um total de 36 frascos. Cada 5 g de amostra em cada frasco foram armazenados em temperatura ambiente durante 3 dias, então, a quantidade de DNA total e a quantidade de DNA de RKN amplificado em uma reação de PCR foram calculadas para cada amostra seguindo o processo descrito no Exemplo 1, exceto que iniciadores e sondas específicos para RKN foram usados (tabela 7). O índice de infecção foi, então, calculado para cada amostra usando a fórmula a seguir:
ng de DNA de gene de ITS1 de RKN
Índice de infecção = ng de DNA total
Tabela 7. Concentrações de componentes da mistura de iniciadorsonda para ITS1 de RKN usada no Método de Índice de Infecção para quantificar infestação por RKN
Vol.
Reagente Sequência (5'^ 3') (μί)
100 mM Inciador dianteiro CGT AAC TTA CAC TCA GAT CTG TCC AAT 330
100 mM Inciador reverso GGT ACC CAA ACG GTG TTA GCA TTT 330
100 mM Sonda TAC ACG TGA GCC ATA CTC AAA TGC CCA A 67
Água - 9273
Total: 1000
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Vol. Reagente Sequência (5'^ 3') (úL) 0 [000104] A tabela 8 compara o log da média do índice de infecção para as 3 réplicas de cada nível de inóculo com o número de nematoides manualmente contados no inóculo.
Tabela 8. Índices de infecção calculados para amostras contendo números especificados de 2
Número de RKN no solo Log de infecção Desvio padrão
0 0 0
10 -1,7276 0,2268
100 -0,5857 0,1152
250 0,5911 0,0984
500 1,1138 0,1603
1.000 1,679 0,3536
1.500 1,8025 0,1464
2.000 2,1834 0,1174
2.500 2,1402 0,0243
5.000 2,8862 0,2988
7.500 3,1898 0,1574
10.000 3,1376 0,0231
[000105] A tabela 8 revela a precisão do Método de Índice de Infecção para quantificação do número conhecido de RKN em uma amostra de solo (R2 = 99%), bem como a aplicabilidade do método a outros organismos que não reniforme. É previsto que outros organismos poderiam ser quantificados dessa maneira usando iniciadores e sondas específicos aos mesmos.
[000106] É previsto que o Método de Índice de Infecção pode ser usado para quantificar o número de nematoides que infectam outras espécies de planta que não algodão. Por exemplo, os níveis de infestação por nematoide em áreas de crescimento de soja ou milho também poderiam ser determinados usando os iniciadores e sondas desPetição 870190082259, de 23/08/2019, pág. 48/60
36/47 critos na tabela 2 (reniforme) e/ou tabela 7 (RKN).
[000107] Um exemplo profético não limitativo da ampla aplicabilidade do Método de Índice de Infecção seria usar o mesmo para determinar o nível de infestação por Diabrotica virgifera em um campo de milho usando sequências de DNA específicas para Diabrotica virgifera.
Exemplo 7. O Método de Índice de Infecção é específico para o organismo objetivado pela seleção de iniciador e sonda e pode ser usado para quantificar infestação por múltiplas espécies simultaneamente [000108] Cinco vasos contendo mudas de tomate e algodão foram inoculados com 2500 ovos de RKN. Um segundo conjunto de cinco vasos contendo mudas de tomate e algodão foram inoculados com 2500 jovens reniformes. Após 60 dias, quatro subamostras de 5-7 g de solo da rizosfera de cada planta em cada vaso foram coletadas e compostas. O DNA total e DNA amplificado em uma reação de PCR específica para RKN usando as sondas e iniciadores descritos na tabela 7 foram determinados e usados para calcular um índice de infecção para cada planta.
[000109] Em seguida, uma série de 100 g de amostras de solo foram, então, coletadas de um campo infectado por reniforme próximo de Lubbock TX. Embora o campo em Lubbock estivesse infectado com reniforme, nenhum RKN foi detectado ali. De cada amostra de 100 g, subamostras de 5-7 g foram processadas através do Método de Índice de Infecção usando os iniciadores e sondas RKN-específicos descritos na tabela 7.
[000110] O log de cada índice de infecção calculado para cada amostra foi, então, determinado (tabela 9). Uma análise de regressão dos dados produziu o modelo de adaptação linear a seguir:
RKN por amostra = 313 + 1621 Log * (índice de infecção) com R2 = 0,59. O número de RKN previsto por amostra foi, então, calculado usando essa equação e inserido na tabela 9.
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Tabela 9. Índices de infecção calculados para amostras de vasos de cultura infestados de RKN e campos infestados de reniforme log #RKN/Amostra
Fonte (índice de infecção) previsto
RKN vaso de cultura 0,37 906,26
RKN vaso de cultura 0,18 596,95
RKN vaso de cultura 0,24 699,11
RKN vaso de cultura 0,14 535,05
RKN vaso de cultura 0,95 1856,41
REN vaso de cultura 0 0
REN vaso de cultura 0 0
REN vaso de cultura 0 0
REN vaso de cultura 0 0
REN vaso de cultura 0 0
Wilson, TX (Campo infestado de reniforme) 0 0
Wilson, TX (Campo infestado de reniforme) 0 0
Wilson, TX (Campo infestado de reniforme) 0 0
Wilson, TX (Campo infestado de reniforme) 0 0
[000111] A tabela 9 revela a especificidade do Método de Índice de Infecção para quantificação apenas dos níveis de infestação por RKN quando sondas e iniciadores RKN-específicos são usados. Assim, o Método de Índice de Infecção não apenas é eficiente e preciso, mas é também altamente específico para quantificação apenas dos organismos objetivados pelos iniciadores e sondas usados no processo. Em uma modalidade d antígeno, o Método de Índice de Infecção pode ser usado para detectar contaminação cruzada entre áreas de crescimento RKN e reniforme-especificadas. Em outra modalidade, contaminação por outros organismos poderia ser detectada e quantificada usando sondas e iniciadores específicos para esses organismos.
[000112] O fato de que os resultados do Método de Índice de Infecção não são confundidos pela presença de organismos não-alvo no solo revela ainda outra modalidade da invenção. Os níveis relativos de
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38/47 infestação de mais de um organismo podem ser determinados para uma dada localização simultaneamente. É previsto que um conjunto de iniciadores e sondas específicos para RKN poderia ser combinado com iniciadores e sondas específicos para reniforme na mesma reação de PCR para determinar a quantidade total de infestação por ambos os organismos ao mesmo tempo via o Método de Índice de Infecção.
[000113] Em outra modalidade da invenção, subamostras tomadas da mesma localização ou rizosfera da mesma planta poderiam ser processadas através do Método de Índice de Infecção separada, mas simultaneamente, para determinado o nível de infestação por RKN versus o nível de infestação por reniforme para essa localização ou planta.
[000114] Esse exemplo também revela o novo conceito de uso do Método de Índice de Infecção para detectar a quantidade de endoparasitas obrigatórios, tal como RKN, presentes no solo. A técnica anterior falha em ensinar ou sugerir que tal quantificação é possível em virtude da suposição de que seria necessário extrair DNA de parasitas que vivem dentro do tecido da planta. Esse exemplo demonstra o resultado surpreendente de que é, na verdade, possível quantificar infestação por endoparasita avaliando o solo coletado das rizosferas de plantas de modo substancialmente não destrutivo, presumivelmente porque o ciclo de vida do parasita inclui algum tempo fora do tecido da planta e nem todos os parasitas estão no mesmo ponto do ciclo de vida ao mesmo tempo. Assim, o Método de Índice de Infecção é uma ferramenta útil para quantificação da quantidade relativa de endoparasitas obrigatórios, tal como RKN.
[000115] Também é previsto que o Método de Índice de Infecção poderia ser usado em conjunto com técnicas de PCR isotérmica. Assim, uma modalidade da presente invenção compreende uso de um índice
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39/47 de infecção para determinar a quantidade de organismos-alvo em uma amostra sem deixar o campo ou área de crescimento.
Exemplo 8: Exemplo profético de uso do Método de Índice de Infecção para selecionar plantas resistentes a reniforme usando técnicas de melhoramento convencionais [000116] A resistência à doença de uma planta pode ser avaliada usando o Método de Índice de Infecção descrito nos Exemplos 1-6 e essa informação pode ser usada para orientar decisões sobre a seleção de plantas para servir como parentais em subsequentes gerações. [000117] Por exemplo, cruzamentos podem ser feitos entre linhagens de algodão e a prole crescida em solo infectado com reniforme. Usando o Método de Índice de Infecção, a capacidade da prole de resistir à infecção pode ser determinada, bem como a capacidade de cada linhagem parental de produzir prole resistente à infecção por reniforme.
[000118] Esse sistema pode ser usado para determinar qual prole e/ou quais parentais usar em futuros cruzamentos continuando a selecionar fenótipos de resistência à doença favoráveis, conforme determinado por meio do Método de Índice de Infecção, para gerar linhagens resistentes a reniforme. Qualquer número de variações em esquemas de seleção ou programas de melhoramento conhecidos na técnica pode ser usado em conjunto com o Método de Índice de Infecção incluindo, mas não restrito à, seleção recorrente, seleção de pedigree e/ou descendente de uma única semente.
[000119] Em uma modalidade, a introgressão de um ou mais loci de resistência pode também ser obtida via retrocruzamento repetido com um parental recorrente, com um fenótipo consistentemente resistente, acompanhado por seleção para reter o fenótipo resistente do parental doador recorrente. Esse procedimento de retrocruzamento é implementado em qualquer estágio no desenvolvimento da linhagem e ocorre em conjunto com melhoramento de características agronômicas su
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40/47 periores ou um ou mais traços de interesse, incluindo traços transgênicos e não transgênicos.
[000120] Esse método pode também ser usado para descobrir novas fontes de resistência dentro ou entre germoplasmas.
[000121] Alternativamente, uma abordagem de melhoramento antecipada é empregada, em que um fenótipo resistente pode ser monitorado com relação à introgressão com sucesso após um cruzamento com um parental suscetível com fenotipagem de subsequentes gerações usando o Método de Índice de Infecção para detectar o fenótipo resistente. Essa seleção do fenótipo resistente pode ser feita simultaneamente com seleção por um ou mais traços de interesse adicionais, incluindo traços transgênicos e não transgênicos.
Exemplo 9: Demonstração de como o Método de Índice de Infecção pode ser usado para identificar marcadores de SNP associados a um gene de resistência a reniforme [000122] Uma população de mapeamento foi desenvolvida com cruzamento do parental resistente a reniforme LONREN-2 com o parental suscetível a reniforme GV061 (Depósito ATCC # PTA-XXXX). Total de 135 linhagens quase isogênicas (Near-Isogenic Lines - NILs) foram desenvolvidas para a população de mapeamento. Dez réplicas de cada linhagem sofreram fenotipagem com relação à resistência a reniforme usando o Método de Índice de Infecção conforme descrito no Exemplo 1 e SNPs que eram polimórficos na população NIL foram usados para genotipagem de cada planta. Técnicas de captura de sequência e Bulked Segregant Analysis (BSA) foram, então, usadas para identificar e mapear SNPs adicionais associados à resistência. Um total de 112 SNPs capazes de detecção da presença de resistência a reniforme e monitoramento da introgressão do locus de resistência à doença foram identificados e mapeados ao genoma de algodão na região (tabela 10). Embora iniciadores e sondas não sejam fornecidos
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41/47 para cada SNP, pode-se solicitar os componentes necessários para detectar os SNPs divulgados de várias opções de vendedores especializados em tais serviços ou simplesmente criar os iniciadores e sondas apropriados usando métodos que requerem habilidade comum na técnica.
Tabela 10. Marcadores de SNP sobre o cromossomo A11 capazes de detecção de resistência a reniforme e monitoramento de introgressão do locus de resistência à doença.
SEQ ID NO:
SEQ ID NO Posição de cad. (cM) Posição de SNP1 Alelo 1 Alelo 2 Iniciador Fwd Iniciador Rev Sonda 1 Sonda 2
1 145 253 A G 113 182 251 320
2 152,2 253 G T 114 183 252 321
3 163,6 122 A G 115 184 253 322
4 172,2 143 C T 116 185 254 323
5 158,4 325 C G 117 186 255 324
6 142,5 303 A C 118 187 256 325
7 166,4 125 A C 119 188 257 326
8 147 382 A G 120 189 258 327
9 143 367 A G 121 190 259 328
10 181,1 409 A T 122 191 260 329
11 150,7 447 A G 123 192 261 330
12 165,5 209 A G 124 193 262 331
13 171,3 354 C T 125 194 263 332
14 169,8 254 A T 126 195 264 333
15 183,5 218 A T 127 196 265 334
16 163,9 449 C T 128 197 266 335
17 160,8 220 G * 129 198 267 336
18 160,1 385 A G 130 199 268 337
19 145,9 333 A T 131 200 269 338
20 183,5 322 A G 132 201 270 339
21 180,1 166 A T 133 202 271 340
22 180,1 219 C T 134 203 272 341
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SEQ ID NO:
SEQ ID NO Posição de cad. (cM) Posição de SNP1 Alelo 1 Alelo 2 Iniciador Fwd Iniciador Rev Sonda 1 Sonda 2
23 160,1 59 A T 135 204 273 342
24 182,4 525 C G 136 205 274 343
25 178,5 221 C T 137 206 275 344
26 159,2 272 A T 138 207 276 345
27 150,7 149 A C 139 208 277 346
28 165,7 310 C G 140 209 278 347
29 160,1 520 A T 141 210 279 348
30 159,8 62 A G 142 211 280 349
31 182,2 192 G T 143 212 281 350
32 181,2 255 A G 144 213 282 351
33 174,4 381 A G 145 214 283 352
34 160,1 107 A C 146 215 284 353
35 150,7 171 A G 147 216 285 354
36 180,1 356 A G 148 217 286 355
37 150,7 323 C T 149 218 287 356
38 171,2 188 A G 150 219 288 357
39 174,9 188 T C 151 220 289 358
40 174,9 683 G A 152 221 290 359
41 166,6 619 C T 153 222 291 360
42 175,5 338 G A 154 223 292 361
43 174,9 152 T G 155 224 293 362
44 170,4 163 G A 156 225 294 363
45 174,9 312 A G 157 226 295 364
46 167,7 82 C T 158 227 296 365
47 175,2 708 C A 159 228 297 366
48 174,9 225 G C 160 229 298 367
49 160,1 197 G T 161 230 299 368
50 170,7 106 T C 162 231 300 369
51 174,9 207 A G 163 232 301 370
52 174,9 553 A G 164 233 302 371
53 168,9 152 C T 165 234 303 372
54 174,6 208 T C 166 235 304 373
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SEQ ID NO:
SEQ ID NO Posição de cad. (cM) Posição de SNP1 Alelo 1 Alelo 2 Iniciador Fwd Iniciador Rev Sonda 1 Sonda 2
55 170,7 531 T C 167 236 305 374
56 174,9 139 C T 168 237 306 375
57 174,6 159 A G 169 238 307 376
58 162 51 G A 170 239 308 377
59 170,7 139 G A 171 240 309 378
60 175,5 318 A G 172 241 310 379
61 174,9 143 A G 173 242 311 380
62 175,5 105.0 T A 174 243 312 381
63 170,7 160 C G 175 244 313 382
64 172,6 168 G T 176 245 314 383
65 174,9 565 T G 177 246 315 384
66 170,1 165 C T 178 247 316 385
67 174,9 118 C T 179 248 317 386
68 170,7 96 C A 180 249 318 387
69 170,4 609 G A 181 250 319 388
70 ** 131 A G -- -- -- --
71 ** 205 G C -- -- -- --
72 174,9 739 T A -- -- -- --
73 174,9 186 C T -- -- -- --
74 174,9 262 G T -- -- -- --
75 174,9 270 A T -- -- -- --
76 174,9 419 C A -- -- -- --
78 167,7 121 T C -- -- -- --
77 167,7 26 A G -- -- -- --
79 175,2 760 C A -- -- -- --
80 174,9 286 A T -- -- -- --
81 174,6 264 A G -- -- -- --
82 174,6 316 T C -- -- -- --
83 168,9 190 G A -- -- -- --
84 168,9 394 T A -- -- -- --
85 168,9 431 A T -- -- -- --
86 168,9 469 A G -- -- -- --
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44/47
SEQ ID NO:
SEQ ID NO Posição de cad. (cM) Posição de SNP1 Alelo 1 Alelo 2 Iniciador Fwd Iniciador Rev Sonda 1 Sonda 2
87 168,9 489 T C -- -- -- --
88 168,9 573 G A -- -- -- --
89 168,9 580 G T -- -- -- --
90 174,9 72 G A -- -- -- --
91 174,9 76 T C -- -- -- --
93 170,7 227 C T -- -- -- --
94 170,7 269 A G -- -- -- --
95 170,7 285 A C -- -- -- --
96 170,7 294 A G -- -- -- --
92 170,7 72 A G -- -- -- --
98 174,9 201 A G -- -- -- --
99 174,9 246 T C -- -- -- --
97 174,9 36 C T -- -- -- --
102 174,6 185 G A -- -- -- --
100 174,6 51 G C -- -- -- --
101 174,6 52 T C -- -- -- --
103 174,9 53 A G -- -- -- --
104 175,5 370 G A -- -- -- --
105 175,5 252 G A -- -- -- --
106 175,5 256 A G -- -- -- --
107 175,5 326 C A -- -- -- --
108 174,9 193 T A -- -- -- --
109 174,9 665 C T -- -- -- --
110 ** 3 C T -- -- -- --
111 ** 5 G A -- -- -- --
112 174,9 72 A G -- -- -- --
* deleção de um único nucleotídeo ** localização exata não determinada 1 Posição de nucleotídeo na SEQ ID NO. Indicada
Exemplo 10: Detecção de resistência a reniforme e monitoramento da introgressão do locus de resistência de uma linhagem de planta para
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45/47 outra usando marcadores de SNP [000123] Um parental resistente a reniforme, tal como LONREN-2 e um parental suscetível a reniforme, tal como GV061, podem sofrer fenotipagem com relação à sua capacidade de resistir à infecção por reniforme usando o Método de Índice de Infecção descrito nos Exemplos 1-5. Alternativamente, a Técnica de Extração com Funil de Baermann ou outro método de fenotipagem de resistência a reniforme pode ser usado.
[000124] Após fenotipagem, os genótipos dos parentais serão determinados com relação a um ou mais marcadores relacionados à resistência selecionados na tabela 10. Alternativamente, qualquer marcador de DNA que cai dentro da região genômica entre os marcadores CGR6333 e BNL1231b públicos pode ser usado.
[000125] Em seguida, o parental resistente e o parental suscetível deverão ser cruzados. Em uma modalidade da presente invenção, o genótipo da prole, então, seria cruzado. Em uma modalidade da presente invenção, o genótipo da prole estaria, então, associado ao fenótipo dos parentais comparando-se o genótipo da prole em um ou mais loci de marcador selecionados da tabela 10 ou qualquer marcador de DNA que cai dentro da região genômica entre os marcadores CGR6333 e BNL1231b públicos com o genótipo dos parentais em um ou mais loci de marcador. Indivíduos que compartilham alelos de SNP para esses marcadores com o parental resistente seriam, então, selecionados para avanço no programa de melhoramento. Indivíduos com alelos de SNP para esses marcadores que não correspondem ao parental resistente ou que não correspondem ao parental suscetível poderiam ser descartados.
[000126] Esse processo poupa o processo trabalho e que consome tempo de fenotipagem manual da prole de cruzamentos com esses parentais para verificar os indivíduos resistentes ou suscetíveis na po
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46/47 pulação de prole.
[000127] A presente invenção pode ser usada sobre outras populações que não aquelas especificamente descritas no presente pedido sem alterar os métodos descritos aqui. Embora diferentes parentais possam ter diferentes genótipos em diferentes marcadores, o método de uso da presente invenção é fundamentalmente idêntico.
[000128] Um produtor de planta pode selecionar genótipos resistentes, conforme determinado pelo genótipo do parental resistente, em um ou mais marcadores fornecidos na tabela 10 ou qualquer marcador que mapeia entre os marcadores CGR6333 and BNL1231b públicos para selecionar plantas resistentes a reniforme que surgem do doador, ao mesmo tempo em que seleciona o genoma recipiente nas regiões cromossômicas adjacentes. Na prática, isso reduz a quantidade de transferência de relação do genoma do doador que pode estar associada às propriedades de qualidade de fibra ou agronômicas indesejáveis.
[000129] A introgressão de um ou mais loci de resistência é obtida via retrocruzamento repetido com um parental recorrente acompanhado por seleção para reter um ou mais loci de resistência a reniforme do parental doador. Esse procedimento de retrocruzamento é implementado em qualquer estágio no desenvolvimento da linhagem e ocorre em conjunto com melhoramento de características agronômicas superiores ou um ou mais traços de interesse, incluindo traços transgênicos e não transgênicos.
[000130] Alternativamente, uma abordagem de melhoramento antecipada é empregada, em que um ou mais loci de resistência a reniforme podem ser monitorados com relação à introgressão com sucesso após um cruzamento com um parental suscetível com genotipagem de subsequentes gerações com relação a um ou mais loci de resistência a reniforme e um ou mais traços de interesse adicionais, incluindo tra
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47/47 ços transgênicos e não transgênicos.
[000131] Em vista do precedente, será observado que as diversas vantagens da invenção são obtidas e atingidas. As modalidades foram escolhidas e descritas de forma a explicar melhor os princípios da invenção e sua aplicação prática para, desse modo, permitir que outros versados na técnica utilizem melhor a invenção em várias modalidades e com várias modificações, conforme adequado ao uso considerado em particular.
[000132] Várias publicações de patente e não-patente são citadas aqui, as divulgações de cada uma das quais são, até o ponto necessário, incorporadas aqui por referência na íntegra. Uma vez que diversas modificações poderiam ser feitas nas construções e métodos aqui descritos e ilustrados sem se desviar do escopo da invenção, pretende-se que todo o assunto contido na descrição precedente ou mostrado nos desenhos em anexo seja interpretado como ilustrativo, ao invés de limitativo. A amplitude e escopo da presente invenção não deverão estar limitados por qualquer uma das modalidades exemplificativas descritas acima, mas deverão ser definidos apenas de acordo com as reivindicações em anexo a seguir e seus equivalentes.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de determinação da quantidade relativa de um nematoide peste de planta em uma amostra de solo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) determinação da quantidade total de DNA na amostra de solo;
    (b) ensaio com relação à presença de pelo menos uma sequência de DNA na amostra que é específica para um nematoide peste de planta para quantificar a quantidade de DNA alvo-específico na amostra de solo; e (c) cálculo da proporção de DNA específico de um nematoide peste de planta para DNA total que corresponde à quantidade relativa do nematoide peste de planta na amostra de solo.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a comparação da referida proporção com um padrão para determinar o número de organismos-alvo na referida amostra.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo-alvo é um nematoide reniforme.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo-alvo é nematoide do nó da raiz.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção é usada para representar a capacidade de uma planta, na localização onde a amostra de matéria foi tirada, de resistir à infecção pelo nematoide peste de planta.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proporção é usada para decidir usar a planta ou sua prole em um programa de melhoramento.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de algodão.
    Petição 870190082259, de 23/08/2019, pág. 7/60
    2/2
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção é usada para selecionar pelo menos um tratamento a aplicar a pelo menos uma localização em uma área de crescimento.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um tratamento compreende o uso de produtos químicos, máquinas, sondas, irrigação, fertilizante, combinações dos mesmos e formulações dos mesmos.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o produto químico é um nematicida.
  11. 11. Método de tratamento de uma localização com pesticidas contra um nematoide peste de planta, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) determinação da quantidade total de DNA em uma amostra de solo da localização;
    (b) ensaio com relação à presença de pelo menos uma sequência de DNA na amostra de solo que é específica para um nematoide peste de planta para quantificar a quantidade de DNA específico do nematoide peste de planta na amostra de solo;
    (c) cálculo da relação da quantidade de um ácido nucleico específico do nematoide peste de planta para a quantidade total de ácidos nucleicos coletados na amostra de solo da localização, e (d) aplicação de um pesticida à localização proporcional à relação calculada em (c).
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