CN102597263A - 定量目标生物体和产生肾形线虫抗性棉花植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物育种和疾病抗性领域。更具体地，本发明包括测试地点以确定害虫感染的量或测试植物的抗感染能力，以及使用该信息作出农业治疗和/或育种决定的方法。本发明也提供了培育包含一个或多个与肾形线虫感染的抗性相关的数量性状位点的棉花植物的方法。本发明进一步包括种质和使用包含能赋予肾形线虫抗性的数量性状位点(QTL)的种质作为育种程序中用于渗入优良种质中的肾形线虫抗性等位基因的来源，因此产生包含一个或多个肾形线虫抗性基因座的新型优良种质。

Description

定量目标生物体和产生肾形线虫抗性棉花植物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月09日申请的美国临时申请No.61/250,235的优先权。上述申请的完整公开内容都在此处通过引用而包含。

包括序列表

包含在2010年10月11日生成的大小为188kb(MS-

中测定)的名为″55576_RenSeqs.txt″的文件中的序列表，以电子方式提交并在本文中通过引用包括。

技术领域

本发明公开了对存在于特定位置的植物病原体、尤其是在农作物的根围中度过其生活周期的至少一部分的植物病原体进行定量的方法。本发明的实施方式包括将对于物质样品中目标生物体特异性的DNA序列的量与物质样品中DNA的总量相比较以定量物质样品中存在的目标生物体的相对量的方法。提供的非限制性例子公开了定量存在于物质样品如土壤中的肾形线虫(肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis))和/或根结线虫((南方根结线虫)Meloidogyne incognita)的绝对数和相对数的新方法。本发明通过使得使用者能够快速评估在特定地点种植作物的风险、确定如何最好地处理已在特定地点生长的作物以应对感染、预测和追踪在地点内或之间感染的发生以及研究植物或植物种群对抗肾形线虫感染的变异性而帮助疾病控制和研究。

本发明的其它实施方式包括可用于检测棉花植物中与肾形线虫抗性相关的核苷酸序列的分子标志物和将这些序列从一种植物渗入另一种植物以产生包含一个或多个肾形线虫抗性基因座的新种质的方法。

发明内容

这里公开的本发明包括一种测定物质样品中目标生物体水平的快速方法。这种感染指数方法包括得出样品中检测的DNA总量与通过PCR扩增对目标生物体特异性的序列检测的样品中的DNA量的关系，和利用该关系或该关系的任何数学排列来定量样品中目标生物体的量。

本发明也提供了感染指数方法如何可以用来监测一个或多个地点的肾形线虫感染以便可以对一个或多个生长地点进行更有效种植、肾形线虫处理和资源分配规划的描述。

本发明进一步提供了一个地点的感染指数如何可以用来评估植物抵抗疾病感染的能力的描述。

而且，本发明描述了感染指数方法如何可以用来帮助鉴定棉花基因组DNA中的疾病抗性等位基因、帮助相对于这些等位基因的存在或不存在对棉花植物进行基因分型，帮助育种者在棉花植物从一代遗传至另一代时在种群中追踪这些等位基因，并且为决定选择哪个个体用于推进育种程序提供信息。

本发明的某些方面进一步包括作为分子辅助育种计划的一部分的可用于检测植物中或植物群体中肾形线虫抗性等位基因的存在的新的单核苷酸多态性(SNP)标志物。本发明公开的SNP标志物允许育种者针对与肾形线虫抗性相关的核苷酸序列的存在而对植物进行基因分型，从而简化或者甚至绕过低效的表型分型过程。

发明详述

这里公开的本发明包括一种确定给定位置的目标生物体的量的新型且高通量的方法。与本领域现在或以前公开的方法相比，本方法高效且准确得多。

这种感染指数方法包括通过将用目标生物体特异性的序列检测的DNA的量与样品物质中检测的DNA总量进行比较而对样品物质中目标生物体数量定量的方法。

在感染指数方法的一个实施方式中，对目标生物体特异性的DNA序列是肾形线虫肾形肾状线虫ITS1(内部转录间隔子1)区域5.8S rRNA基因。在另一个实施方式中，检测的害虫特异性核酸序列是根结线虫南方根结线虫的ITS1区域5.8 S rRNA基因。在其它实施方式中，检测的害虫特异性核酸序列对其它生物体是特异性的。

公开的本发明的额外实施方式包括基于用感染指数方法在植物的根围中检测的线虫感染水平针对植物对线虫的易感性或抗性对植物进行表型分型。

本领域中描述的先前方法如贝尔曼漏斗提取技术(BaermannFunnel Extraction Technique)(BFET)通常导致为了收集土壤而将生长地点的植物完全去除。本发明提供了在不在其生长处干扰植物的情况下测定植物抗特定害虫感染的能力的新型高通量和准确的方法。因此可以通过连续土壤采样在生长期内多次测定植物抗感染的能力，且感染的传播也可以随时间进行监测。

本发明也提供了将感染指数方法整合到常规育种工作中以帮助有利的等位基因从一个植物渗入另一个植物的方法。在一个实施方式中，该方法包括如下步骤：1)在亲本家系间进行杂交；2)用感染指数方法对从这些杂交产生的后代进行表型分型；和3)基于这些表型分数对亲本和/或后代进行选择。

而且，本发明提供了将与疾病抗性相关的等位基因渗入植物家系的方法，包括如下步骤：1)提供植物群体；2)相对于选自SEQ ID NO：1-112的至少一种基因组核酸标志物在群体中对至少一个植物进行基因分型；和3)从群体中选择至少一个包含至少一种与疾病抗性相关的等位基因的植物。提供的群体可以通过将至少一种疾病抗性植物与至少一种疾病敏感植物杂交以形成群体而获得。

本发明也提供了通过以下步骤产生的优良植物：1)提供植物群体；2)相对于选自SEQ ID NO：1-112的棉花基因组核酸标志物在群体中对至少一个植物进行基因分型；和3)从群体中选择至少一个包含至少一种与疾病抗性相关的等位基因的植物。本发明的优良棉花植物可以表现出转基因性状。

本发明进一步提供了用于检测与疾病抗性相关的基因座的基本上纯化的核酸分子，其包括选自SEQ ID NO：1-112及其互补序列的核酸分子。本发明进一步提供了用于检测代表棉花DNA中的多态性的分子标志物的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含包括或相邻于多态性的至少15个核苷酸，其中该核酸分子与包括或相邻于多态性的任一DNA链中相同数目的连续核苷酸的序列至少90％相同，且其中分子标志物选自于SEQ ID NO：1-112。在一个方面，分离的核酸进一步包含可检测标记或可用于引入可检测标记。在另一个方面，可检测标记选自于同位素、荧光团、氧化剂、还原剂、核苷酸和半抗原。

本发明进一步提供了一组寡核苷酸，包括a)寡核苷酸引物对，其中各引物包含至少12个连续核苷酸，且其中引物对允许PCR扩增包含选自SEQ ID NO：1-112的分子标志物的DNA片段，和b)至少一种允许检测扩增片段中的多态性的检测寡核苷酸，其中该检测寡核苷酸的序列与包括或相邻于步骤(a)中多态性的棉花DNA片段的任一链中相同数目的连续核苷酸的序列至少95％相同。

除非另有注明，根据相关领域的本领域普通技术人员的常规用法来理解术语。分子生物学中常用术语的定义也可参见Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第5版，Garland Science Publishing，Inc.：New York，2007；Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical andMolecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；King等人，ADictionary of Genetics，第6版，Oxford University Press：New York，2002；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：New York，2007。本发明使用了如37CFR§1.822所述的DNA碱基命名法。

植物的“根围”是被植物的根部、根分泌物和根相关的土壤微生物影响的土壤区域。

本发明所用的“生长区域”是植物有目的地生长的任何区域或设施。非限制性实例包括耕种田地、温室、生长室、盆或任何其它工业、学术、公共或私人的场所，其中多种植物生长用于研究和/或消耗。

本发明所用的“地点”是生长区域内的特定位点。本发明的至少一个实施方式描述了在生长区域内的多个地点采集土壤。这种地点的非限制性实例是特定田地中特定的2英尺*2英尺的地块，或者是在生长室中的盆的2英寸*2英寸的地块中生长的幼苗。

本发明所用的RKN是指根结线虫或南方根结线虫。

“等位基因”是指在特定基因座的可选择的序列；等位基因的长度可以小到1个核苷酸碱基，但通常要比这个大。

“基因座”是通常通过参照点找到的基因组序列上的位置，例如，作为基因或者基因或基因间区域的部分的DNA序列。本发明的基因座包括在群体中的一种或多种多态性；即存在于一些个体中的可选择的等位基因。

本发明所用的“多态性”是指在一个或多个个体的群体中一个或多个基因座处存在核酸序列或核酸特征的两种或更多种变异。变异可以包括，但不限于，一个或多个碱基的改变、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可以来自于作为可动基因组元件的结果通过突变产生的核酸复制中的随机过程、来自于拷贝数变异和在有丝分裂过程中，如不等交换、基因组重复及染色体断裂和融合。这种变异可以在群体中常见或者可能以低频率存在，前者在通常植物育种中具有更大作用而后者可能与稀有但重要的表型变异相关。有用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列的插入或缺失(Indels)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性和标签SNP。遗传标志物、基因、DNA衍生序列、单倍体型、RNA衍生序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、微RNA、siRNA、QTL、卫星标志物、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式也可以包含多态性。此外，前述情况的存在、缺失或拷贝数的变异可以包含多态性。

本发明所用的“标志物”是指可用于生物体间进行区分的可检测的特征。这种特征的实例可以包括遗传标志物、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药物、淀粉组成、淀粉水平、可发酵淀粉、发酵产量、发酵效率、能量产量、次生化合物、代谢物、形态学特征和农艺特征。本发明所用的“遗传标志物”是指多态性核酸序列或核酸特征。遗传标志物可以用一种或多种特定的变异序列或通过共有序列代表。在另一种意义中，“遗传标志物”是这种序列的分离的变异体或共有序列。

本发明所用的“标志物分析”是用于使用特定方法检测特定基因座的多态性的方法，例如测定至少一种表型(如种子颜色、花的颜色或其它视觉可检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术等等。

本发明所用的“分型”是指用来测定给定棉花基因组多态性的特定等位基因形式的任何方法。例如，单核苷酸多态性(SNP)通过测定存在哪种核苷酸(即A、G、T或C)而分型。插入/缺失(Indel)通过测定是否存在Indel而确定。Indel可以通过多种分析方法而分型，包括，但不限于，标志物分析。

本发明所用的术语“邻近”当用来描述与含多态性的DNA杂交的核酸分子时，是指与直接邻近多态性核苷酸碱基位置的DNA序列杂交的核酸。例如，可在单碱基延伸分析中使用的核酸分子“邻近”于多态性。

本发明所用的“共有序列”是指鉴别基因座的等位基因中的SNP和Indel多态性的构成性DNA序列。共有序列可以基于该基因座处任一DNA链，且表示基因座中各SNP中任一的核苷酸碱基和基因座中所有Indel的核苷酸碱基。因此，尽管共有序列可以不是实际DNA序列的拷贝，但是共有序列可用于精确设计用于基因座中实际多态性的引物和探针。

本发明所用的术语“单核苷酸多态性”也用缩写“SNP”表示，是指单一位点的多态性，其中该多态性构成单碱基对改变、一个或多个碱基对的插入或一个或多个碱基对的缺失。

本发明所用的术语“单倍体型”是指用至少一个多态性分子标志物限定的单倍体型窗口(haplotype window)内的染色体区域。各个单倍体型窗口中的独特标志物指纹组合限定了该窗口的单个单倍体型。而且，单倍体的改变，例如由重组引起的，可以导致单倍体型的改变以至于它仅包含例如，通过与基因、QTL或转基因的物理连接而可操作地与该性状连锁的原始(亲本)单倍体型的一部分。只要该基因组区域的功能完整性未改变或得到改善，单倍体型中的任何这种改变都被包括我们关于什么构成单倍体型的定义中。

本发明所用的术语“单倍体型窗口”是指用本领域技术人员已知的统计学分析方法建立的且处于连锁不平衡的染色体区域。因此，在位于该区域内的一个或多个分子标志物基因座处两个近交个体(或两个配子)之间的状态的确认被用作整个区域的来源同一(identity-by-descent)的证据。各个单倍体型窗口包括至少一个多态性分子标志物。单倍体型窗口可以沿基因组中各染色体作图。单倍体型窗口本身不固定，且考虑到持续增加的分子标志物密度，本发明预计单倍体型窗口的数目和大小将继续演变，使窗口的数目增加而它们相应的大小减小，因此导致在根据标志物基因座的状态的同一性确定来源同一性时持续提高的置信度。

本发明所用的“基因型”是与可观察的性状(该表型)相对的个体(或个体组)在一个或多个遗传位点处的遗传构成。基因型可以，例如，通过使用遗传标志物间接表征，或者，例如，通过核酸测序直接表征。合适的标志物包括表型特征、代谢谱、遗传标志物或一些其它类型的标志物。基因型由个体从其亲本遗传而来或能够传递给其后代的一个或多个已知基因座的等位基因限定。术语基因型可以用于指在单一基因座、多个基因座、染色体的部分、整个染色体、基因组的部分、整个基因组的个体遗传构成，更通常，术语基因型可用于指其基因组中所有基因的个体遗传组成。基因型可以构成对于至少一个遗传标志物基因座的等位基因或对于至少一个单倍体型窗口的单倍体型。

“种质”是指个体(例如植物)、个体组(例如植物家系、品种或科)或源自系、品种、种属或培养物的克隆的遗传物质或来自以上的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从生物体或细胞分离。通常，种质提供了具有特定分子构成的遗传物质，其为生物体或细胞培养物的一些或所有遗传品质提供了物理基础。如本发明所用的，种质包括细胞、种子或组织(新的植物可以由其生长)，或者可以培养为完整植株的植物部分，如叶、茎、花粉或细胞。

本发明所用的“表型”是指可以被基因型影响的细胞或生物体的可检测的特征。

本发明所用的“连锁”是指杂交中产生的配子类型的相对频率。例如，如果基因座A具有基因”A”或″a″和基因座B具有基因″B″或″b″，且AABB的亲本I和aabb的亲本B的杂交将产生四种可能的配子，其中基因被分隔成AB、Ab、aB和ab。空预期是独立平均分隔成4种可能的基因型中的每一种，也就是各种基因型具有无连锁的1/4的配子。配子分隔进入不等于1/4的基因型是由于连锁。

本发明所用的“连锁不平衡”在单代中许多个体的群中配子类型的相对频率的情况中定义。如果等位基因A的频率为p，等位基因a的频率为p′，等位基因B的频率为q和等位基因b的频率为q′，那么基因型AB的预期频率(没有连锁不平衡)为pq，Ab为pq′，aB为p′q和ab为p′q′。与预期频率的任何偏离被称为连锁不平衡。当两个基因座处于连锁不平衡时，它们被称为“遗传连锁的”。

本发明所用的“数量性状位点(QTL)”是指在某种程度上控制通常连续分布的可数值表示性状的基因座。

本发明所用的“抗性等位基因”是指包括与对疾病的抗性相关的多态性等位基因的核酸序列。

本发明所用的“棉花”是指陆地棉(Gossypium hirsutum)，且包括可用棉花育种的所有植物种类，包括野生棉花品种。更具体地，来自陆地棉品种和陆地棉亚种(Gossypium hirsutum L.)的棉花植物可以用这些组合物和方法进行基因分型。在另外的方面，棉花植物来自于亚洲树棉Gossypium arboreum L.类，另外称为木棉。另一方面中，棉花植物来自于海岛棉(Gossypium barbadense L.)类，另外称为美洲皮马棉或埃及棉。另一方面中，棉花植物来自于草本棉(Gossypium herbaceum L.)类，另外称为草棉。棉属或棉花植物可以包括杂交种、近交系、部分近交系或者定义的或未定义的种群的成员。

本发明所用的术语“包括”是指“包括但不限于”。

本发明所用的术语“优良家系”是指由育种和选择优良农艺性能所得到的任何家系。市场上可得到的优良家系的非限制性例子包括DP 555BG/RR，DP 445BG/RR，DP 444BG/RR，DP 454BG/RR，DP 161 B2RF，DP 141 B2RF，DP 0924 B2RF，DP 0935 B2RF，DP 121RF，DP 174 RF(岱字棉)；ST5599BR，ST5242BR，ST4554B2RF，ST4498B2RF，ST5458B2RF(Stoneville)；FM9058F，FM9180B2F，FM1880B2F，FM1740B2F  (FiberMax)；PHY485WRF，PHY375WRF，PHY745WRF(Acala)(PhytoGen)；和MCS0423B2RF，MCS0508B2RF(Cotton States)。

在本发明中，疾病抗性基因座位于染色体A11上。用于检测肾形线虫抗性存在和监测疾病抗性基因座渗入的SNP标志物包括选自于SEQ ID NO：1-112的那些标志物。用于扩增SEQ ID NO：1-68中的SNP的正向引物在序列表中以SEQ ID NO 113-180提供。用于扩增SEQ ID NO：1-68中的SNP的反向引物在序列表中按相同顺序以SEQ ID NO181-248提供。用于检测SEQ ID NO：1-68中的SNP的探针组也以同样的顺序分别作为SEQ ID NO：249-316和SEQ IDNO：317-384列出。

例如，标志物DNA序列SEQ ID NO：3可以用SEQ ID NO：115和183所示的引物进行扩增并用SEQ ID NO：251和319所示的探针进行检测。说明性的示例标志物DNA序列SEQ ID NO：12可以用SEQ ID NO：124和192所示的引物进行扩增并用SEQ ID NO：260和328所示的探针进行检测。说明性示例标志物DNA序列SEQ IDNO：13可以用SEQ ID NO：125和193所示的引物进行扩增并用SEQ ID NO：261和329所示的探针进行检测。

此外，SEQ ID NO：69-112是可用于检测肾形线虫抗性存在和用于监测疾病抗性基因座渗入的额外SNP标志物。基于这些序列，本领域普通技术人员可以从专门从事该服务的供应商的一些选项中预订检测公开的SNP必需的反应组分，或使用需要本领域普通技术的方法来制备合适的引物和探针。

本发明也提供了包含选自SEQ ID NO：1-112其片段及两者的互补序列的核酸分子、的棉花植物。本发明也提供了包含选自SEQID NO：1-112、其片段及两者的互补序列的核酸分子的优良棉花植物。

本发明也提供了包含疾病抗性基因座的植物。这些等位基因可以是纯合的或杂合的。

如本发明所用的，肾形线虫是指任何肾形线虫变异体或分离物。本发明的棉花植物可以对能引起疾病的与肾形线虫相似的一种或多种线虫具有抗性。一个方面中，本发明提供了抗肾形线虫的植物以及用于筛选对肾形属(Rotylenchulus)导致的肾形线虫病有抗性或易感性的棉花植物的方法和组合物。在优选的方面中，本发明提供了用于筛选对肾形肾状线虫有抗性或易感性的棉花植物的方法和组合物。

一个方面，本发明可用于任何植物。另一个方面，植物选自于棉属。另一个方面，植物选自于陆地棉种。在进一步的方面，植物选自于陆地棉亚种(Gossypium hirsutum L.)。在另外的方面，植物来自于亚洲树棉(Gossypium arboreum L)类，另外也称为木棉。另一个方面，植物来自于海岛棉(Gossypium barbadense L)类，另外也称为美洲皮马棉或埃及棉。另一个方面，棉花植物来自于草本棉(Gossypium herbaceum L)类，另外也称为草棉。棉属或棉花植物可以包括杂交种、近交系、部分近交系或者定义的或未定义的种群的成员。

本发明的植物可以对给定疾病具有非常高的抗性、有抗性、基本上有抗性、有适度抗性、有相对抗性、有部分抗性、的适度易感性或有易感性，或者显示出在抗性或易感性程度上的其它变异。

在优选的方面，本发明提供了被测试对疾病的抗性或易感性的植物，所用测试方法为感染指数方法或者用来确定植物是否对给定疾病有非常高的抗性、有抗性、基本上有抗性、有适度抗性、有相对抗性、有部分抗性、有适度易感性或有易感性或者显示出在抗性或易感性程度上的其它变异的任何方法。

另一个方面中，棉花植物可以显示出相比于非抗性的对照棉花植物的相对抗性。在这个方面，对照棉花植物优选是除了所述的一种或多种疾病抗性等位基因之外遗传相似的棉花植物。这种植物在具有等同或近似的病原体暴露的相似条件下生长。

本发明的疾病抗性QTL可以引入优良家系中。“优良家系”是由育种和优良农艺性能的选择所得到的任何家系。

本发明的抗性QTL也可以引入包含赋予除草剂耐受性、产量增加、昆虫防治、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、改变的油产量、高油产量、高蛋白产量、发芽或幼苗生长控制、加强的动物和人类营养性、低棉子糖、环境压力抗性、增强的消化性、工业酶、药用蛋白、肽和小分子、改善的加工特性、改良的口味、固氮作用、杂交种子产生、减轻的变应原性、生物聚合物和特别地生物柴油的一种或多种转基因的优良棉花植物。一个方面中，除草剂耐受性选自草甘膦、麦草畏、草丁膦、磺酰脲、溴苯腈和达草灭除草剂。这些性状可以通过如植物中的转基因的植物生物技术方法提供。

一种或多种疾病抗性QTL等位基因可以从包含该等位基因的任何植物(供体)引入任何受体植物中。一个方面中，受体植物可以包含额外的疾病抗性基因座。另一个方面中，受体植物可以包含转基因。另一个方面中，在维持引入的QTL的同时，提供疾病抗性QTL的植物遗传贡献成分可以通过回交或其它适当方式降低。一个方面中，来自于植物的供体材料的核遗传物质可以低于或约50％、低于或约25％、低于或约13％、低于或约5％、3％、2％或1％，但是该遗传物质包含感兴趣的一个或多个抗性基因座。

可以进一步理解，本发明的植物可以表现出任何相对成熟期组的特征。一个方面，成熟期组选自早熟品种、中早熟品种(mid seasonmaturing variety)和全季节品种(full season variety)。

QTL的等位基因可以包含甚至在连续基因组区域或连锁群如单倍体型中的多个基因或其它遗传因子。如本发明所用的，疾病抗性基因座的等位基因因此可以涵盖超过一种基因或其它遗传因子，其中各单个基因或遗传成分也能表现出等位基因变异和其中各基因或遗传因子也能诱发对所述数量性状的表型效应。本发明的一个方面中，QTL的等位基因包含也能够表现出等位基因变异的一种或多种基因或其它遗传因子。因此，使用术语“QTL的等位基因”并非有意排除包含超过一种基因或其它遗传因子的QTL。具体而言，本发明中出现的“QTL的等位基因”可以表示在其中表型可以是疾病抗性的单倍体型窗口内的单倍体型。单倍体型窗口是可以用一个或多个多态性标志物的组定义或追踪的连续基因组区域，其中多态性表示来源同一。该窗口内的单倍体型可以通过各标志物处的独特等位基因指纹来定义。本发明所用的等位基因是占据染色体上的给定基因座的基因的几种可选形式中的一种。当存在于染色体上给定基因座的所有等位基因是相同的，那么该植物在该基因座是纯合的。如果存在于染色体上给定基因座的等位基因不同，那么该植物在该基因座是杂合的。本发明的植物在任何特定疾病基因座或对于特定多态性标志物是纯合的或杂合的。

本发明也提供了本发明植物的部分。植物的部分非限制性地包括种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明的特别优选的方面中，该植物部分是种子。

本文引用了各种专利和非专利文献，其中各文献的公开内容都通过引用完整地包含在本文中。

由于在不偏离本发明范围的情况下可以对本文描述和说明的结构和方法进行各种修改，前面说明中包含或附图中所示的所有内容应当被解释为说明性的而非限制性的。本发明的广度和范围不应当被上述任何示例性的实施方式所限制，而应当仅仅根据后面随附的权利要求及其等同特来限定。

实施例

下面包括的实施例展示了本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该能理解，下面的实施例公开的技术代表了发明人在本发明的实践中发现效果良好的技术，因此可以被认为构成了用于其实施的优选方式。

然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解可以在本发明公开的特定实施方式中进行许多变化且在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下仍然得到相像或类似的结果。更具体地，显然，化学和生理学相关的特定试剂可以替代当本文所述的试剂而获得同样或相似的结果。所有这种对本领域技术人员显而易见的相似的替代和变化被视为在所附的权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。

实施例1：确定感染指数

土壤采样及DNA提取

为了确保从特定地点采样的土壤是该地点的代表性土壤，从该地点的各个不同位置收集了4份200-300克的土壤样品，合并，彻底混合以形成“整体样品”。使用UltraClean^TM Mega Soil DNA分离试剂盒并根据制造商的方案从整体样品中取出的一份或多份5-7克的土壤分样品中提取DNA。

总DNA定量

在从土壤样品中提取DNA后，使用Quant-iT^TM

试剂盒并根据制造商的方案对土壤样品中的DNA总量进行定量。使用以各种浓度加入40μl TE缓冲液和50μl

试剂中的10μl鲑鱼精DNA获得四点标准曲线。将土壤样品中检测的DNA量映射到标准曲线中以获得从土壤样品中分离的DNA的总量(表1)。

表1DNA定量分析的内容(μl)

肾形线虫ITS1基因定量

通过实时PCR定量从上述土壤样品中提取的DNA分离物中肾形线虫ITS1基因的量。进行分离物的100倍稀释液，将2μl的该稀释液与3μl ITS1引物-探针混合物以及5μl

UniversalPCR Mastermix混合。引物-探针混合物的内容如表2中显示，且随后PCR反应的内容如表3中所示。

表2.用于定量肾形线虫的肾形线虫ITS 1引物-探针混合物的内容。

表3.用于定量肾形线虫的PCR反应的内容

反应物配好后，用本领域已知的标准技术在ABI 7900HT序列检测系统中进行PCR以扩增两个引物特异性的序列。将总DNA的量和通过ITS引物-探针混合物在PCR反应中扩增的DNA的量与用肾形线虫ITS质粒的10倍稀释物通过ABI 7900HT产生的标准曲线进行比较。这种比较提供了样品中DNA总量和肾形线虫ITS1 DNA量的估计。

感染指数计算

总DNA量和在PCR反应中扩增的DNA的量用于使用下式来计算该样品的感染指数：

实施例2.感染指数和贝尔曼漏斗提取技术之间关系的证明

从在肾形线虫感染田地中显示不同水平肾形线虫抗性的棉花家系的根围收集90克土壤样品。从每份90克样品中，取出5-7克分样品以通过感染指数方法评估其感染水平。剩余的83-85克土壤通过贝尔曼漏斗提取技术(BFET)进行分析。回归分析得到如下线性模型：

Log(Nem/g)＝0.7866+1.2883 Log(ITS/DNA)

其中R²＝0.742且其中g＝克，Nem＝通过BFET测定的肾形线虫的数目，

和DNA＝通过标准DNA定量方案测定的总DNA的ng数。

为了证明BFET和感染指数方法的相关性，将通过BFET收集的对于各土壤样品的肾形线虫幼虫悬浮于小管中的1.5ml水中，在显微镜下人工计数。然后这些样品各通过感染指数方法评估，其中各管的DNA如前面所述的如同5-7g土壤样品一样进行提取。回归分析得到如下线性拟合模型：

Log(Nem/g)＝0.3156+3.1713 Log(ITS/DNA)

其中，R²＝0.779和其中g＝克，Nem＝通过BFET测定的肾形线虫的数目，

和DNA＝用DNA定量方案检测的总DNA的ng数。

因此，无论是土壤样品还是基本上是纯化的肾形线虫的悬浮液，感染指数方法与物质样品中的肾形线虫数目相关(R²＞0.74)。

实施例3.用感染指数方法监测不同生长区域间的肾形线虫感染

在本发明的一个实施方式中，可以使用感染指数方法来测定不同生长区域中的肾形线虫感染水平(接种密度)。从产棉地带(表4)中的各个城市附近的8块棉田中，在各田地的代表性位置收集5份200-300克土壤样品。然后将这5份在单一田地收集的样品合并、彻底混合和随后被认为代表该生长地域的集体土壤。

从代表不同田地的8份样品中的每一份中，5克分样品如实施例1所述通过感染指数方法处理，而剩余土壤中的100克通过BFET处理。不幸的是，由于从Havana和Leesburg采集的土壤样品的意外丢失，剩余的量不足以对这些生长地域进行BFET。将得到的数据纳入表4中，并进行回归分析以揭示两种方法产生的结果之间的关系(R²＝0.81)。

表4.在几个生长地域的感染指数方法结果相比于贝尔曼漏斗提取技术的结果

*观察到许多死亡或失活的线虫

**样品尺寸太小(60克)而不能用于提取

因此，可以使用感染指数方法来确定跨广大地理范围分布的各个生长地域的目标生物体的存在。而且，表4所列的第一Laurinburg，NC地点的感染指数方法和BFET结果之间的差异突显了感染指数方法相比于本领域中所描述的现有方法的更高准确性，因为在该地点观察到许多死亡或失活的线虫。本领域技术人员可以认识到BFET结果倾向于低估在在采集样品的时间许多线虫为死亡的或失活的地点处的线虫感染值。因此，在第一Laurinburg地点，感染指数方法相比于BFET检测到高得多的线虫数目表明，与本领域中所述的现有方法不同，感染指数方法不会被土壤样品中不成比例的死亡或失活线虫数目混淆。

表4也表明了当土壤样品容量对于其它方法而言太小的条件下感染指数方法准确测定感染水平的能力，因为对于土壤不足以用于进行BFET的地点，感染指数方法获得了清楚的结果。

可以对于各生长地域在种植前、种植后、生长季节期间、收获后和/或其组合方式测定感染指数。可以在特定时间点、时间期间，根据种植地域随时间连续采集的一份或多份样品而测定特定生长地域的平均感染指数。

在一个实施方式中，可以比较一个或多个生长地域的平均感染指数以确定和/或对比其间的感染水平。可以利用该信息来开发生长地域间处理感染的优先性和策略，更好地进行作物生产和管理决定，以及确定植物的抗病能力。

例如，在种植前测定的感染指数可以提供生长地域的感染“基线”水平，从而允许种植者根据种植者的需要决定是否在该地点种植或决定特定作物的哪一品种更合适该环境。例如，如果一个田地的平均肾形线虫感染指数特别高，种植者可以选择在该生长地域种植特别对抗肾形线虫的品种或者也许选择在一段时间内休耕。

以同样的方式，根据前一年在种植前、生长季节期间或收获后在该生长地域测定的感染指数，种植者可以决定下一年选择何种作物品种，如果有的话，种植于该特定生长地域。

因此，那些农作物种子工业的工作者可以快速地进行那种栽培品种相比于另一个生长地域更适合于一个生长地域的准确推荐，或者进行类似的比较和决定在相同生长地域内的不同地点种植哪种栽培品种。

为了根据不同生长地域的肾形线虫感染的水平恰当地做出位点特异性的决定以及分配化学处理的资源，感染指数可以与VART(可变应用率技术)相结合。例如，可以根据如通过感染指数方法测定的种植前初始感染水平来将包括化学品、设备和/或人力的资源或其它资源或其组合以相比于另一生长地域更高的集中度分派到某一生长地域。以类似的方式，可以做出这些关于资源分配的决定来在植物生长的同时处理或预测在生长地域内不同地点的作物的最佳处理，并相应地分配资源。

在另一个实施方式中，可以使用各个不同生长地域的平均感染指数监测或侦测在多个生长地域的感染水平随时间的变化。根据这些水平的变化，可以按照感染水平趋势预测变化的预测将资源分配到不同生长地域。

实施例4.用感染指数方法监测给定地理位置内的肾形线虫感染

在本发明的一个实施方式中，可以使用感染指数方法来测定单一生长地域或单一生长地域内多个地点间的肾形线虫感染水平。

在给定生长地域内的多个地点收集土壤并如实施例1所述通过感染指数方法进行处理。可以在种植前、种植后、植物生长期间、收获后和/或其任意组合测定各样品的感染指数。

在一个实施方式中，可以基于在一个或多个时间点从生长地域内的特定地点采集的一份或多份样品来测定在一段时间内该地点的平均感染指数。或者，生长地域可以被分为地块，各地块由一个或多个样品地点组成，且可以通过将该地块内采集的一份或多份样品测定的感染指数平均而测定该地块的平均感染指数。

表5表明从生长地域内多个地点采集的土壤样品产生的感染指数数据，像从靠近Parksdale，AR的棉花栽种田地得到的，如何可以映射到生长地域的图示中。这揭示了在特定时间点田地中多个地点间的感染水平是如何不同的。

表5.在Parksdale，AR附近的田地中多个地点的肾形线虫感染的种植前评估(每品脱土壤的肾形线虫的数目)的图示

产生可靠的肾形线虫疾病评价数据的问题之一是缺少在特定田地或群体中害虫的均一分布。在本发明的一个实施方式中，使用感染指数方法来监测生长地域中小块土地、地点、地块或多个地点或地块的感染水平随时间的变化，这允许种植者追踪感染在田地中不同地点的传播。

例如，通过监测感染水平随时间的变化，种植者或科学家可以确定在某一点的感染水平的差异是否受初始感染水平的差异或一些其它因素，如对肾形线虫感染的植物抗性的过度影响。

以前，由于在处理之前、期间和之后分析各生长地域或生长地域内的地点必需的相当大的时间和资源的投入，很难精确评估给定处理对肾形线虫感染在地点间传播的影响。例如，这些研究的结果可能很容易被地点或生长地域间初始感染水平的差异所混淆，除非采用考虑到那些初始差异的高成本的手段。另一方面，感染指数方法提供了校正这些差异的可行的方式，从而提供对于生长地域内基本所有地点分析多个时间的地点-地点或地块-地块的感染的相对快捷和廉价的方式。

可以利用这一信息开发生长地域内各地点间处理感染的处理优先性和策略。例如，在种植前测定的田地中特定地点或地块的感染指数可以提供该地点的感染基线水平，从而允许种植者根据该地点预先测定的感染指数决定哪种作物品种，如果有的话，种植于该田地中的特定地点。

也可以结合VART使用感染指数方法来预期在植物种植前或正在生长期间处理植物的准备中将资源分配到生长地域内的不同地点。例如，可以根据种植前的感染指数来将包括化学品、设备和/或人力的资源或其它资源或其组合以相比于另一地点或地块更高的集中度分配到田地中的某地点或地块。以相同的方式，可以在植物生长的同时做出这些关于资源分配的决定来处理植物或预测在生长地域内的植物的所需处理，并相应地分配资源。

在另一个实施方式中，可以使用生长地域中地块的平均感染指数感染指数监测感染水平随时间的变化。随着这些水平的变化，可以按照未来感染水平趋势的预期将资源分配到生长地域的不同地块。

实施例5.感染指数方法可以用于针对肾形线虫抗性的而对植物进行可靠的表型分型的证明

本实施例描述了感染指数方法可如何用来测定存在于作物根围中的肾形线虫的数目以及该信息可如何用来根据作物针对对抗肾形线虫感染的能力而对其进行表型分型。

相对抗性和易感性表型的确立

7-10天大的亚洲棉Lonren-1和Lonren-2家系的群体以约2500肾形线虫幼虫/植物接种并在生长室中繁殖45-50天，之后从各植物的根围独立收集约90g土壤，并用标准BFET技术定量各植物的肾形线虫感染的水平。

具有最高肾形线虫水平的植物之后被认为具有相对“易感性”的表型，而那些具有最低肾形线虫数目的植物随后被认为具有用于进一步分析的相对“抗性”表型。所有植物都在同样的环境条件下生长。

数据收集

将6个易感性最强和6个抗性最强的家系种植于生长室中，且各植物以约2500个线虫接种，4份重复。各表型的2个另外的植物不接种以作为活的对照品，且含有土壤但没有植物的两个盆进行接种以用作休耕对照。两个月后收获所有植物，并从各植物的根围收集土壤。这次，除了收集90g土壤以通过BFET对肾形线虫感染进行定量外，还收集5-7g样品以通过感染指数方法对肾形线虫感染进行定量。

结果

该两种表型和该对照的平均感染指数如表6所示(根据ANOVA分析，接种的易感植物之一的感染指数为73.72作为离群值排除)。平均来说，易感表型的感染指数比具有抗性表型的植物高约23倍，显示了感染指数方法在评价植物抗线虫感染能力方面的能力(注意，包括离群值使得这种差异甚至更高)。

表6.计算的肾形线虫抗性和肾形线虫易感性表型的感染指数的结果

以这一方式，对于从植物根围收集的土壤样品计算的感染指数可用作植物抗肾形线虫感染的能力的指标，且从而用作植物的有效表型。因此，对于一个植物或植物群体计算的感染指数可以与另一植物或另一植物群体相比较，以比较和对抗性的相对水平评分。

然后，这种方法允许使用者通过类似于与实施例1-4中所述的在生长地域之内或之间的地点比较感染指数的方式比较单一生长地域中或跨生长地域的植物间的相对抗性表型。感染指数随时间的变化可以揭示关于群体中或群体间感染的传播的重要信息。而且，也可以测定植物家系抗感染的能力。例如，可以将种植季节中特定时间点的群体中植物计算的感染指数与种植前感染指数相比较以更精确地对植物抗感染的能力进行表型分型。它允许使用者确定两个作物感染指数的差异有多少是由于相对于植物种植地点的土壤中种植前肾形线虫感染水平的差异的植物实际抗感染的能力的差异。甚至可以测定植物抗感染的能力随时间的变化。

该信息对于帮助种植者或育种者确定如何最佳地分配资源或对植物应用处理以应对肾形线虫感染以及允许植物育种者更准确地测量作物抗感染的能力也可能非常重要。

实施例6.感染指数方法可用于除肾形线虫以外的其他物种

装配各含5克不含根结线虫(RKN)的土壤的圆锥管(50ml)，手工计数特定数目的RKN J2期幼虫并与各管中的土壤混合。加入各管中的RKN的数目为0，10，100，250，500，1000，1500，2000，2500，5000，7500或10,000，每个数目重复3次，总共为36管。将各管中的每5克样品在室温下保存3天，然后根据实施例1所述的过程(除了使用针对RKN特异性的引物和探针，表7)计算总DNA量和PCR反应中扩增的RKN DNA的量。用下式计算各样品的感染指数：

表7.用于定量RKN感染的感染指数方法中RKN ITS 1引物-探针混合物组分的浓度。

表8比较了针对各个接种水平的3份重复平均的感染指数对于接种样中手工计数的线虫数目的对数。

表8.含指定数目RKN的样品计算的感染指数

表8显示了感染指数方法用于定量土壤样品中已知数目RKN的准确度(R²＝99％)以及该方法对于除线虫以外的其它生物体的可用性。可以预期，可以利用对其特异性的引物和探针以这种方式定量其它生物体。

可以预期，感染指数方法可用于对感染除棉花之外的其它植物物种的线虫的数目进行定量。例如，在大豆或玉米生长地域的线虫感染水平也可以用表2(肾形线虫)和/或表7(RKN)中所述的引物和探针进行测定。

感染指数方法的广泛应用的一个非限制性的预言性例子是使用它来利用对西部玉米根虫(Diabrotica virgifera)特性的DNA序列测定玉米田地中西部玉米根虫的感染水平。

实施例7.感染指数方法对于引物和探针靶向的生物体是特异性的且可以用来同时对多个物种的感染进行定量

用2500枚RKNF卵接种含土豆和棉花幼苗的5个盆。用2500个肾形线虫幼虫接种第二组含土豆和棉花幼苗的5个盆。60天后，从各个盆的各植物的根围收集4份5-7克土壤分样品并混合。测定总DNA和用表7所述的探针和引物以对RKN特异性的PCR反应扩增的DNA并用来计算各植物的感染指数。

接下来，然后从Lubbock TX附近的肾形线虫感染的田地中收集一系列100克的土壤样品。尽管Lubbock田地被肾形线虫感染，那里却没有检测到RKN。从各100克的样品中，通过感染指数方法用表7所述的RKN特异性引物和探针处理5-7克分样品。

然后测定对各样品计算的各感染指数的对数(表9)。数据的回归分析得到如下线性拟合模型：

每份样品的RKN＝313+1621 Log*(感染指数)

其中R²＝0.59。然后用这个方程计算每份样品的预测RKN数目并输入表9中。

表9.对于来自RKN感染的培养盆和肾形线虫感染的田地的样品计算的感染指数

表9揭示了当使用RKN特异性探针和引物时感染指数方法仅用于定量RKN感染水平的特异性。因此，感染指数方法不仅是有效的和准确的，而且对于仅定量处理中所用的引物和探针靶向的生物体也是高度特异性的。在本发明的一个实施方式中，可以使用感染指数方法来检测RKN和肾形线虫特定的生长地域间的交叉污染。在另一个实施方式中，可以使用对于其它生物体特异性的探针和引物来检测和定量其它生物体的污染。

感染指数方法的结果不会被土壤中非目标生物体的存在而混淆这一事实揭示了本发明的再另一个实施方式。可以针对给定地点同时测定的超过一种生物体的相对感染水平。可以预期，可以在相同PCR反应中将对RKN特异性的一组引物和探针与对肾形线虫特异性的引物和探针结合以通过感染指数方法同时测定两种生物体感染的总量。

在本发明的另一个实施方式中，从相同地点或相同植物的根围取得的分样品可以独立地但同时地通过感染指数方法处理以测定该地点或植物的相对肾形线虫感染水平的RKN感染水平。

本实施例也揭示了利用感染指数方法来检测存在于土壤中的专性体内寄生虫如RKN的新概念。由于假定需要从生活在植物组织内部的寄生虫提取DNA，现有技术没有教导或暗示这种定量是可能的。本实施例显示了令人惊讶的结果，即通过分析基本上非破坏性地从植物根围收集的土壤而对体内寄生虫感染进行定量的确是可能的，推测是因为寄生虫的生活周期包括在植物组织外的一些时候且不是所有寄生虫同时存在于生活周期的相同点。因此，感染指数方法对于定量像RKN的专性体内寄生虫的相对量是有用的工具。

可以预期，感染指数方法可以与等温PCR技术结合使用。因此，本发明的一个实施方式包括在不离开田地或生长地域的情况下利用感染指数测定样品中目标生物体的量。

实施例8：使用以常规育种技术来选择肾形线虫抗性植物的感染指数方法的预言性实施例

如实施例1-6所述的感染指数方法可以用于测量植物的疾病抗性，且可以利用这一信息来指导关于选择在后续世代中用作亲本的植物的决定。

例如，可以在棉花家系和在肾形线虫感染的土壤中生长的后代间进行杂交。使用感染指数方法，可以测定后代抗感染的能力以及各亲本家系产生抗肾形线虫感染的后代的能力。

可以使用该系统来通过继续选择有利的疾病抗性表型(如通过感染指数方法测定的)确定在将来杂交中使用哪个后代和/或那个亲本来产生肾形线虫抗性家系。可以使用本领域已知的选择方案或育种程序的多种变型与感染指数方法结合，包括但不限于，轮回选择、谱系选择和/或单粒传法。

在一个实施方式中，还可以通过与具有恒定抗性表型的轮回亲本反复回交并伴随着选择以保留轮回供体亲本的抗性表型而实现一个或多个抗性基因座的渗入。这种回交程序在家系发生的任何阶段实施，并与优秀农艺特征或一种或多种感兴趣的性状(包括转基因和非转基因性状)的选育相结合发生。

这种方法也可以用来发现种质中或种质间的新的抗性资源。

或者，采用了正向育种方法，其中可以在易感亲本与用检测抗性表型的感染指数方法进行表型分型的后续世代杂交后监测成功的渗入。这种抗性表型的选择可以与一种或多种感兴趣的另外性状(包括转基因和非转基因性状)的选择同时进行。

实施例9：感染指数方法可如何用于鉴定与抗肾形线虫基因相关的SNP标志物的证明

从肾形线虫抗性亲本LONREN-2与肾形线虫易感亲本GV061(ATCC保藏号#PTA-XXXX)杂交开发了作图群体。产生了用于作图群体的总共135个近等基因系(NIL)。如实施例1所述用感染指数方法对各个系的10个重复进行表型分型，且在NIL群体中多态性的SNP用来对各植物进行基因分型。然后采用序列捕捉技术和混合分群分析(BSA)鉴定与抗性相关的额外SNP并作图。鉴定了能检测肾形线虫抗性和存在和监测疾病抗性基因座的渗入的总共112个SNP并映射于区域中的棉花基因组(表10)。尽管没有提供对于每个SNP的引物和探针，但是可以从专门从事该服务的供应商的几个选择中预定检测公开的SNP必需的组分或简单地采用需要本领域普通技术的方法来制备合适的引物或探针。

表10.在染色体A11上的能检测肾形线虫抗性和监测疾病抗性基因座渗入的SNP标志物。

*单核苷酸缺失

**准确位置未确定

¹在所示的SEQ ID NO中的核苷酸位置

实施例10：使用SNP标志物检测肾形线虫抗性和监测抗性基因座从一种植物家系至另一种的渗入。

用实施例1-5所述的感染指数方法对肾形线虫抗性亲本如LONREN-2和肾形线虫易感亲本如GV061对抗肾形线虫感染的能力进行表型分型。或者，可以使用贝尔曼漏斗提取技术或另一种肾形线虫抗性表型分型方法。

表型分型后，相对于从表10选择的与抗性相关联的一种或多种标志物测定亲本的基因型。或者，可以使用落入公布的标志物CGR6333和BNL1231 b之间的基因组区域内的任何DNA标志物。

接下来，将抗性亲本和易感亲本杂交。在本发明的一个实施方式中，然后通过将后代在从表10选择的一个或多个标志物基因座或落入公布标志物CGR6333和BNL1231 b之间的基因组区域内的任何DNA标志物处的基因型与亲本在一个或多个标志物基因座的基因型进行比较而将后代的基因型与亲本的表型关联起来。与抗性亲本共有这些标志物的SNP等位基因的个体随后被选择用于继续育种程序。具有与抗性亲本不匹配或与易感亲本相匹配的这些标志物的SNP等位基因的个体将被放弃。

这种方法避免了与亲本杂交以验证后代群体中抗性或易感性个体而省去了既费力又费时的手工进行后代表型分型的过程。

在不改变本文所述方法的情况下，可以将本发明应用于本申请特别描述的群体之外的群体。尽管不同亲本可能在不同标志物处有不同的基因型，本发明的使用方法基本是相同的。

如通过在表10中提供的一个或多个标志物或者映射在公布标志物CGR6333和BNL1231b之间的任何标志物处的抗性亲本基因型所确定的，植物育种者可以选择抗性基因型以在选择在邻近染色体区域中的受体基因组的同时选择具有来自供体的肾形线虫抗性的植物。实践中，这降低了来自供体基因组的可能与不良农艺或纤维质量特性相关的连锁累赘(linkage drag)的量。

通过与轮回亲本重复回交并伴随选择以保留来自供体亲本的一个或多个肾形线虫抗性基因座而实现一个或多个抗性基因座的渗入。这种回交程序在家系发展的任何阶段实施并与优秀农艺特征或一种或多种感兴趣的性状(包括转基因和非转基因性状)的选育相结合。

或者，采用了一种正向选育方法，其中在易感性亲本与对于一个或多个肾形线虫抗性基因座和对于一种或多种感兴趣的额外性状(包括转基因和非转基因性状)基因分型的后续世代杂交后监测一个或多个肾形线虫抗性基因座的成功渗入。

*****

鉴于上述内容，可见本发明实现并取得了多个优点。选择并描述实施方式是为了最好地解释本发明的原理和其实际应用，从而使得本领域其他技术人员能够以各种实施方式和适用于设想的具体应用的各种修改最好地实施本发明。

本文引用了各种专利和非专利公开文献，其中各文献的公开内容都在必要的程度上完整地通过引用包含在本文中。由于在不偏离本发明范围的情况下可以对本文描述和说明的结构和方法进行各种修改，前面说明中包含或附图中所示的所有内容应当被解释为说明性的而非限制性的。本发明的广度和范围不应当被上述示例性的实施方式所限制，而应当仅仅根据后面随附的权利要求及其等同物而限定。

Claims (28)

1.一种测定物质样品中目标生物体的相对量的方法，该方法包括：

a.测定样品中DNA的总量；

b.分析样品中针对目标生物体特异性的至少一种DNA序列的存在以定量样品中目标特异性DNA的量；和

c.计算对应于样品中目标生物体的相对量的目标特异性DNA与总DNA的比例。

2.根据权利要求1的方法，其中所述物质样品是土壤或植物材料。

3.根据权利要求1的方法，其进一步包括将所述比例与标准比较以确定所述样品中目标生物体的数量。

4.根据权利要求1的方法，其中所述目标生物体是植物病原体。

5.根据权利要求1的方法，其中所述目标生物体是线虫。

6.根据权利要求1的方法，其中所述目标生物体是肾形线虫。

7.根据权利要求1的方法，其中所述目标生物体是根结线虫。

8.根据权利要求1的方法，其中所述比例用于表示在物质样品取样地点的植物抗目标生物体感染的能力。

9.根据权利要求8的方法，其中所述比例用于决定是否在育种程序中使用该植物或其后代。

10.根据权利要求8的方法，其中所述植物是棉花植物。

11.根据权利要求1的方法，其中所述比例用于选择至少一种处理以应用于生长区域内的至少一个地点。

12.根据权利要求11的方法，其中所述至少一种处理选自化学品、机械、电子设备、探针、装置、灌溉、人、动物、肥料、其结合和其制剂。

13.根据权利要求12的方法，其中所述化学品是杀线虫剂。

14.一种用杀虫剂处理某地点的方法，包括(a)计算该地点的害虫特异性核酸的量与收集的核酸总量的比例，和(b)与(a)中计算的比例成比例地应用杀虫剂于该地点。

15.一种检测棉花植物中肾形线虫抗性存在或不存在的方法，其通过进行标志物检测分析以检测选自SEQ ID NO：1-112的一种或多种序列的存在或不存在。

16.一种检测棉花植物中肾形线虫抗性的存在或不存在的方法，该方法包括检测棉花植物中至少一种标志物的等位基因，其中该至少一种标志物在棉花基因组中CGR6333和BNL1231 b之间的染色体区间上或之内。

17.一种培育肾形线虫感染抗性的棉花植物的方法，该方法包括：

a.提供棉花植物的群体；

b.对于在CGR6333和BNL1231 b之间的染色体区间上或之内的等位基因对群体中的至少一个棉花植物进行基因分型；

c.鉴定包含至少一种与肾形线虫抗性相关的等位基因的至少一个棉花植物。

18.一种培育能够抗肾形线虫感染的棉花植物的方法，该方法包括：

a.提供棉花植物的群体；

b.相对于选自SEQ ID NO：1-112的棉花基因组核酸标志物对群体中的至少一个棉花植物进行基因分型；

c.鉴定包含至少一种与肾形线虫抗性相关的等位基因的至少一个棉花植物。

19.根据权利要求18的方法，其中所述群体通过将至少一种肾形线虫抗性棉花植物与至少一种肾形线虫敏感植物杂交而形成群体而获得。

20.一种优良棉花植物，通过如下步骤产生：

a.提供棉花植物的群体；

b.相对于选自SEQ ID NO：1-112的棉花基因组核酸标志物对群体中的至少一个棉花植物进行基因分型；

c.从群体中挑选包含至少一种与肾形线虫抗性相关的等位基因的至少一个棉花植物。

21.根据权利要求20的优良棉花植物，其中所述优良棉花植物表现出转基因性状。

22.根据权利要求21的优良棉花植物，其中所述转基因性状选自除草剂耐受性、产量增加、昆虫防治、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、改变的油产量、高油产量、高蛋白产量、发芽和/或幼苗生长控制、加强的动物和人类营养性、低棉子糖、环境压力抗性、增强的消化性、改进的加工特性、改良的口味、固氮作用、杂交种子产生和降低的变应原性。

23.根据权利要求22的优良棉花植物，其中除草剂耐受性选自草甘膦、麦草畏、草丁膦、磺酰脲、溴苯腈、2，4-二氯苯氧基乙酸和达草灭除草剂。

24.一种用于检测与肾形线虫抗性相关的基因座的基本上纯化的核酸分子，包括选自SEQ ID NO：1-112及其互补序列的核酸分子。

25.一种用于检测代表棉花DNA中的多态性的分子标志物的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含包括或相邻于该多态性的至少15个核苷酸，其中该核酸分子与包括或相邻于该多态性的任一DNA链中相同数目连续核苷酸的序列至少90％相同，且其中该分子标志物选自于SEQ ID NO：1-112。

26.根据权利要求25的分离的核酸分子，其中所述核酸进一步包含可检测标记或可用于引入可检测标记。

27.根据权利要求26的分离的核酸分子，其中所述可检测标记选自于同位素、荧光团、氧化剂、还原剂、核苷酸和半抗原。

28.一组寡核苷酸，包含：

a.寡核苷酸引物对，其中各引物包含至少12个连续核苷酸，且其中引物对允许PCR扩增包含选自SEQ ID NO：1-112的分子标志物的DNA片段；

b.至少一种允许检测扩增片段中的多态性的检测寡核苷酸，其中该检测寡核苷酸的序列与包括或相邻于步骤(a)中多态性的棉花DNA片段的任一链中相同数目的连续核苷酸的序列至少95％相同。