CN101854799B

CN101854799B - 对玉米根叶甲和欧洲玉米螟的抗性升高的植物

Info

Publication number: CN101854799B
Application number: CN200880112957.8A
Authority: CN
Inventors: 彼得·戈茨; 约翰·A·米姆
Original assignee: Agrigenetics Inc
Current assignee: Agrigenetics Inc
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2028-08-22
Also published as: US9603321B2; CN101854799A; BRPI0816123A2; EP2178359A2; WO2009027347A3; MX2010002201A; MX345716B; WO2009027347A2; US20120222173A1

Abstract

本发明涉及新的玉蜀黍植物，其对西方玉米根虫(WCR)和欧洲玉米螟虫(ECB)都有抗性，且不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质。本发明还涉及那些植物的杂种、后代和种子。

Description

对玉米根叶甲和欧洲玉米螟的抗性升高的植物

发明领域

本发明涉及新的玉蜀黍(Zea may)植物，其对西方玉米根虫(WesternCornRootworm，WCR)和欧洲玉米螟虫(European Corn Borer，ECB)都有抗性，且不表达自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)衍生的杀昆虫性(insecticidal)蛋白质。本发明还涉及那些植物的杂种、后代和种子。

背景技术

目前，植物生命的多样性在前所未有的威胁之下。在农业中，少许改良品种的普遍采用已经使重要食物作物的遗传基础变窄，而且导致数百种地方品种的消失。使用植物遗传多样性对于满足未来的发展需要是至关重要的。本方法是要增加玉米WCR和ECB抗性性能的生物多样性。改善玉米的天然宿主植物抗性能为欧洲病虫害综合治理(integrated pestmanagement，IPM)提供经济学和生态学工具。

耕地玉米(玉蜀黍)是全世界最重要的经济学和生态学作物之一。它作为动物饲料、人消费和工业资源使用的多种可能性已经使其耕种变得必不可少。从上世纪90年代起，玉米的高产量性能由于越来越多地牵涉西方玉米根虫(WCR，玉米根叶甲(Diabroticavirgifera virgifera LeConte))和欧洲玉米螟虫(ECB，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalisHübner))而受到威胁。这两种有害物通过降低产量稳定性而严重地影响商业性玉米生产，而且，另外，受损害的植物常常显示对由镰孢菌(Fusarium spp.)引起的继发性感染的易感性升高。

在EU，玉米占谷物生产的860万公顷，具有约一百亿欧元/年的价值。72％的欧洲玉米收获作为动物饲料(用于牛、猪、家禽)使用，而剩余部分用于人消费(油、淀粉、面粉)。在法国、意大利、西班牙和德国，近几十年，玉米面积和产量随着种植者放弃与谷类进行传统轮种而显著增加。因此，在大片地区中玉米已经变为唯一的种植作物，在同一片土地上年复一年地连续种植。在法国，50％的玉米进行连续种植。

在西班牙，约25％的玉米面积在高玉米螟虫压力地区中，而40％在中等压力地区中。在德国，约25％的玉米面积受到ECB侵袭。在法国，约40％的玉米面积具有平均每株玉米植物一或多只ECB。在意大利，玉米螟虫每年侵袭几乎所有玉米面积，导致7至15％的产量损失。据估计，潜在欧洲玉米产量的5至7％(＝约2.6亿欧元)每年由于螟虫而受到损失，这取决于侵袭强度。每年仅在法国、德国、西班牙和意大利便产生1500万欧元的处理(杀昆虫剂和赤眼蜂应用)成本(Gianessi等，2003)。

对建立潜力的初步研究已经显示了，WCR有可能在欧洲任何种植玉米的地方存活和发育。第一次观察到甲虫后3至5年，有害物会进行繁殖，使得发生显著的产量损失。WCR被列为EU检疫有害物，强制所有欧洲成员国家实施即时措施来阻止有害物的进一步蔓延。专家预测，WCR在欧洲的天然蔓延不能得到终止，而且有害物的进一步蔓延可能会增加损害成本，其与在美国的损害成本相当。针对WCR最有效的措施是立即进行作物轮种，这对于具有高百分比轮种玉米的地区是不适用的。欧洲早就3亿欧元的高损害成本和美国的情况(约10亿美元损失和应用成本)清楚表明本发明的经济学重要性。

西方玉米根虫(WCR，玉米根叶甲)是一种北美甲虫，其初始分布表现为在落基山(Rocky Mountains，Colorado，USA)东边的山麓小丘内。在1909年在科罗拉多州，它第一次被记录为玉米有害物。然后它缓慢向东蔓延至内布拉斯加州(1929)、堪萨斯州(1945)、密苏里州(1960)和伊利诺斯州(1964)。连续种植的玉米(即不进行轮种)很大程度上要为WCR在北美的蔓延负责(Metcalf和Metcalf，1993)。现在从安大略至北卡罗来纳州都能找到它，而且遍及美国中部和东部存在，并且正在加拿大蔓延(安大略和魁北克(Meloche等，2001))。WCR在美国蔓延的速率在44和125km/年之间(Onstad等，2003)。

在欧洲，于1992年7月在靠近贝尔格莱德(南斯拉夫)的Surcin机场附近在小块玉米地(0.5ha)上首次观察到WCR。认为它可能在1990年便已经通过来自北美的军事航空运输引入(EPPO，1996)。现在，显而易见的是，WCR已经从其在1992年的初始侵袭点蔓延至数百公里的范围，影响该地区的许多国家。例如，WCR在意大利于1998年，而在法国于2002年首次发现。具有适合于玉米生产的气候条件的所有欧洲国家和地区在以后数年都有可能受到侵袭。在2007年7月，在德国南部首次观察到WCR(http://www.biosicherheit.de/de/mais/maiswurzelbohrer/330.doku.html)。WCR显著影响玉米产量、农民收入、农村社区的发展，而且经由杀虫剂应用而引起环境负荷的风险。还有，作为检疫有害物的WCR影响玉米在欧洲的贸易。

根虫成虫在耕地内和耕地间以较低高度(小于地平面上5m)爬行或飞行时发生WCR的短距离移动。此类型的移动造成低速率的蔓延。在新交配的雌性在空中在高于10m传播时发生较大的蔓延，均值为每年40km左右。

幼虫的根进食是损害的主要来源，降低营养物摄取和生长(Gavloski等，1992)。幼虫不能辨别植物物种的根(Krysan和Miller，1986)，并且会以离它们孵出的地方最近的根为食。根损害还削弱植物，并使它们对潮湿或刮风环境中的倒伏更易感。这能抑制或者甚至阻止作物收获。成虫以开花的玉米花粉、穗丝、叶和幼嫩的发育种粒为食，但也以来自广泛备选宿主(包括菊科(Asteraceae)、豆科(Fabaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、禾本科(Poaceae)、茄科(Solanaceae)和葫芦科(Cucurbitaceae))的花粉为食。

在匈牙利，据报告幼虫损害阈值为每株植株20-30条幼虫。甚至在用杀昆虫剂诸如特丁硫磷(terbufos)处理的作物中，以7.5％的作物倒伏发生损害。在考虑谷物产量时，成虫以每穗多至20条成虫的密度以玉米粒为食没有引起显著的产量降低，而且可以耐受中等水平的穗丝剪断(Capinera等，1986)。然而，幼虫对根的进食损害正是最显著的。

在美国和欧洲试验中都已经显示了杀昆虫剂Dursban WG(氯吡硫磷(Chlorpyriphos)75％)提供针对WCR成虫的好的结果。出于控制目的，推荐每4周应用Dursban WG，直至10月。因此，在该季节后期，在相对较高的玉米作物中可需要特殊的喷雾机器。这是巴黎附近所使用的控制项目中的关键限制，并且还可以通过提高可变成本来降低毛利润。

已经在塞尔维亚实施关于播种前、播种时或生长季节期间应用的土壤处理的杀昆虫剂功效的试验。结论是播种前用特丁硫磷、林旦(lindane)和联苯菊酯(bifenthrin)；播种时用特丁硫磷、氯吡硫磷、林旦和联苯菊酯；而生长季节期间用丁硫克百威(carbosulfan)、特丁硫磷和甲拌磷(phorate)获得最佳结果。换言之，特丁硫磷一直保持有效。播种时用处理获得最佳保护(EPPO，1996)，且理想地，土壤杀昆虫剂应持续6-10周(Levine和Oloumi-Sadeghi，1991)。可用的种子处理可缺乏足够的持续性，例如“Gaucho”种子处理或“Cruiser”(噻虫嗪(thiamethoxam))的功效可以是距种植3周。

在北美的连续玉米种植和经常使用杀昆虫剂来控制WCR导致上世纪50年代后期形成对氯代烃类的抗性(Metcalf，1976)和新近对其它杀昆虫剂(包括氨基甲酸酯类和有机磷酸酯类(OP))的抗性。杀昆虫剂抗性玉米根虫的问题继续存在，并且在美国每年实施耕地试验来评估备选土壤杀昆虫剂在WCR控制方面的效率。另外，管理策略现在强调更加基于IPM的方法，即利用轮种，勘察(scouting)来确定对控制的需要等。

在引起玉米损害的昆虫有害物中，玉米螟虫的两种物种在欧洲是特别重要的：欧洲玉米螟虫(ECB，欧洲玉米螟)和地中海玉米螟虫(Mediterraneancorn borer，MCB，粉茎螟(Sesamia nonagrioides Lefèbvre))。ECB是欧洲本土的，而且是法国、德国、意大利和西班牙的主要有害物。

欧洲玉米螟虫显著影响中部欧洲的玉米产量。近年来，它在德国的分布已经以每年多至10km向北延伸入较冷气候区中(Langenbruch和Scewczyk，1995)。

在中部欧洲，ECB在正常情况下每年完成一代(一化)。在较温暖的地区，ECB以两代或更多代(多化)发生，这取决于地理纬度和区域性气候条件。ECB成虫在6月末出现，并在开花前不久在轮生期后期将其卵产在植物上。第一龄和第二龄幼虫在进入茎前以叶和花粉为食。幼虫在茎和穗柄中的掘进引起由于生长下降的产量损失和由于脱落穗的收获损失。继发性感染病原体引起茎腐烂和倒伏(Jarvis等，1984)，阻碍机械收获。另外，真菌疾病(尤其是镰孢菌)的较高发生率经由真菌毒素污染而降低饲料质量(Lew等1991)。研究已经显示了在欧洲，每株植物一条ECB幼虫使玉米产量降低6％。

ECB幼虫在具有高度ECB天然发生的地区引起多至30％的产量损失，这是由于导致穗发育差、茎断裂、和穗脱落的植物中的进食和掘进。大部分产量损失可以归因于植物产生正常量的谷物的能力受损，这是由于叶和传导组织中的幼虫进食损害的生理学效果。在持续的秋季风和干燥天气的情况中，在茎和穗柄中的掘进能增加茎和柄断裂，导致收获期间穗的实质性损失。具有更具刚性的茎和更大的柄的玉米杂种会降低穗损失。此外，假设ECB损害促成继发性霉菌感染诸如镰孢菌或玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，其可导致额外的产量损失，而且不利地影响谷粒质量。茎腐烂的这种加强与钻入茎和穗柄中的ECB幼虫直接相关。由于来自掘进和茎腐烂的茎削弱引起的损失在延迟玉米收获时增加。早期收获会降低由茎腐烂和ECB引起的损失。

在许多玉米种植地区，ECB群体超过经济阈值，因此，农民被迫采取控制措施(Rost，1996)。传统的ECB管理方法是通过碾碎玉米残留和犁地来破坏用于越冬的掩蔽物。此外，针对ECB的多种杀昆虫剂(拟除虫菊酯或有机磷酸酯杀昆虫剂)及细菌(苏云金芽孢杆菌，Bt)和生物制剂(赤眼蜂寄生物)控制方法是可用的。然而，玉米植物上的ECB幼虫难以抗击，因为在它们钻入植物中前它们仅在较短的一段时间暴露于喷雾或拮抗剂，因此处理功效是有限的。

许多玉米杂种对玉米螟虫进食具有一些天然抗性。1996年前，被宣传为“有玉米螟虫抗性的”所有安大略玉米杂种就是此类型。它们遭受玉米螟虫攻击，但是没有受到大量的产量损失。因此，搜索对ECB有抗性的种质对在欧洲的成功育种是至关重要的。玉米针对ECB第二代的宿主植物抗性在数量上得到继承，并且与至少7个基因组区域有关(Jennings等，1974)。Bohn等(2001)发现了关于隧洞长度的6个数量性状基因座(QTL)和关于茎损害评定的5个QTL，这解释早熟欧洲玉米种质中约50％的基因型变异。此外，双列研究和世代均值分析确认主要为加性基因作用和较小程度上为显性和上位相互作用(Jennings等，1974)。得不到用于标记物辅助选择的分子标记。

据报告，基于次生代谢物羟肟酸(2，4-二羟基-7-甲氧基-1，4-苯并噁嗪-3-酮(DIMBOA)，其属于苯并噁嗪类)浓度的抗生在玉米和其它谷类中提供对一些昆虫和真菌疾病的抗性(Niemeyer等，1995；Hansen L.M.，2004)。因此，它代表了一般天然植物防御的重要部分。对ECB第一代的抗生(叶进食抗性)主要基于次生代谢物DIMBOA[2，4-二羟基-7-甲氧基-(2H)-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮]在叶中的浓度(Magg，2004)。另外，对ECB第二代的抗生依赖于许多因素，诸如细胞壁中的去污纤维、纤维素、木质素、和生源硅的浓度和组织韧性。

种子公司现在出售Bt玉米，即生物技术的第一批切实的成果之一，其对于美国和加拿大玉米农民具有实际的应用。Bt玉米杂种生成对某些昆虫(例如蛾、甲虫、蚋或蚊)特异性的杀昆虫毒素，其衍生自细菌苏云金芽孢杆菌，即全球性存在的一种天然存在土壤细菌。这些杂种提供等于，且通常远大于最佳定时杀昆虫剂的针对WCR和ECB的保护。在美国和(针对ECB)在欧洲(西班牙约50000公顷)已经向农民发放了生成针对ECB和WCR的杀昆虫性蛋白质的转基因玉米。

然而，基于单基因的垂直抗性对昆虫群体施加强烈的选择压力。一般而言，垂直抗性受到一种(或者有时少许)主要抗性(R)基因控制，所述主要抗性基因之每一种对应于寄生性匹配基因。植物对一种或数种病原体品种有高度抗性，但是对其它的易感。由于对昆虫群体有强烈的选择压力，对BT有抗性的生物型可以相当快速地形成。Magg等(2001)对用Bt杂种种植的样地观察到每株植物0.08至0.19条存活幼虫和范围为18至31％的受损茎百分比。作者推断万一抗性失效，非转基因宿主植物抗性能起针对靶有害物的第二道屏障的作用。

在非适应的美国材料中，在长期宿主植物抗性项目中鉴定宽生物型非特异性水平抗性供体材料。在欧洲的数个位置在高有害物压力下(WCR在匈牙利而ECB在德国)对未针对欧洲条件适应的此供体材料评估抗性。发明人现在能够提供数种对WCR和ECB有抗性的近交系，其在欧洲条件下显示高水平的抗性。

因此，本发明涉及一种玉蜀黍植物，其对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫都有抗性，其中所述植物不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质。

在本发明的语境中，术语“玉蜀黍”包含植物物种玉蜀黍和特别是亚种玉蜀黍亚种(Zea mays L.ssp.mays)，包括Amylacea组、Everta组、Indentata组、Indurata组、和Saccharata组。在本发明中，术语“玉蜀黍”与术语“玉米”可互换使用，后一种在美国、加拿大、新西兰和澳大利亚是通俗名称。

“植物”可以是成熟植物或幼苗。“成熟植物”应当理解为指幼苗之后的任何发育阶段的植物。“幼苗”应当理解为指在早期发育阶段中的幼年的、未成熟的植物。

术语“西方玉米根虫”(WCR)在本发明的语境中包含物种玉米根叶甲(Diabroticavirgifera，也称作Diabrotica virgifera virgifera和Diabroticavirgifera(virgifera)LeConte)。

术语“欧洲玉米螟虫”(ECB)在本发明的语境中包含物种欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis，也称作Ostrinia nubilalis Hübner)。

术语“有抗性的”或“抗性”指对传染原或病原体的入侵或繁殖，或者对由其毒性产物或任何其它损害因子造成的损害插入屏障的植物机制的总和。因此，植物完全或某种程度上(参看下文)排除或克服传染原、损害因子、病原体或毒性产物的有害效果。通常，认为抗性源自于遗传突变。通过对植物遗传特征搜索认为赋予较低易感性的突变而检测到的抗性称作“基因型抗性”。通过在存在病原体的情况中成功培养植物培养物找到的抗性称作“表型抗性”。一旦检测出表型抗性，可以通过遗传手段来进一步分析或证实植物，并可以检测相应的基因型抗性。在本案中，例如可以通过生成导致幼虫死亡的毒性剂或生成抑制幼虫在根上进食的驱虫剂来介导抗性。

与术语“抗性”形成对比，术语“耐受”或“耐受性”指植物经历暴露于不利环境条件，如潜在有害的病原体或由其毒性产物引起的损害而不显示一种或多种实质性不利的效果(例如没有死亡或遭受严重的损害或作物损失)的能力。耐受性在调节或适应机制中出现。这意味着例如植物受到病原体侵袭，但是它通过提高的生长或代谢(特别在侵袭位置处)来补偿所述侵袭及其后果。对WCR和/或ECB有耐受性且受到WCR和/或ECB幼虫侵袭的玉蜀黍植物可以例如用根生长提高来响应根损害。然而，在耐受性的这种情况中根上的活幼虫数目没有减少，与上文所描述的抗性机制形成对比。例如，非抗性商品化玉米杂种“Zamora”显示对ECB的耐受性，但没有抗性(参见http://www.saatenunion.con/index.cfm/nav/375/article/2664/product/ZAMORA.html)。Zamora在西班牙以登记号980481登记。

在本案中，可以通过例如称作“倒伏评定量表”的因素来测定对WCR和/或ECB的抗性。“倒伏”定义为茎作物自其垂直位置永久偏移的状态。它是茎由于例如植物根上的幼虫侵袭而不能支持植物重量的结果。通常按1至9的量表评定倒伏。得分“1”指直立的植物，得分“5”指相对于地面以45度角倾斜的植物，而得分“9”指植物躺在地面上。下表(表1)代表三项参数“倒伏评定量表”、“倒伏角[度]”与“抗性[％]”之间的关系：

倒伏评定量表	倒伏角(度)	％抗性
			1	0	100
2	11.25	87.5
			3	22.5	75
4	33.75	62.5
			5	45	50
6	56.25	37.5
			7	67.5	25
8	78.75	12.5
			9	90	0

当然，可以依照上文所限定的关系来计算任何“中间”倒伏度或抗性百分比。例如，以4.5度的倒伏角代表95％抗性，以9度的倒伏角代表90％抗性等。

为了确定植物是否对WCR和ECB都有抗性，在具有WCR侵袭的第一耕地、区域或样地中和在具有ECB侵袭的第二耕地、区域或样地中种植植物，并对两块耕地、区域或样地确定倒伏评定。实施例中描述了可能的实验设置，但是技术人员可以应用样地尺寸、繁殖数目等的变化形式。

优选地，依照本发明的玉蜀黍植物的WCR/ECB抗性是至少约50％、55％、或60％，更优选至少约62.5％、65％或70％，特别优选至少约75％、80％或85％，特别优选至少约87.5％、90％或95％，并且最优选约100％，如通过倒伏评定量表所确定的。

依照本发明的植物不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质。术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况中，表达牵涉结构基因转录成mRNA，和mRNA随后翻译成一种或多种多肽或蛋白质。此外，“表达”可以包括转录后过程(如mRNA剪接)和翻译后修饰(如糖基化)以及表达产物靶向入细胞区室中或细胞外部。

如本文中所使用的，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词的列表。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或者通过获得IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。术语“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的寡聚物或多聚物。

术语“杀昆虫性”或“杀昆虫剂”指针对处于所有发育形式的昆虫施加活性的物质。它们包括针对昆虫卵和幼虫使用的杀卵剂和杀幼虫剂及针对成年昆虫使用的杀成虫剂。杀昆虫性物质可以具有专门针对昆虫或者另外还针对其它动物、植物或病原体的活性。

开发“生物学杀昆虫剂”的一个例子是使用苏云金芽孢杆菌，即影响鳞翅目(Lepidoptera)(蛾和蝴蝶)和一些其它昆虫的一种细菌。苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性、土壤居住的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。孢子形成时，苏云金芽孢杆菌形成由cry基因编码的蛋白质性质的杀昆虫性δ-内毒素(Cry毒素)的晶体。Cry毒素具有针对鳞翅目(蛾和蝴蝶)、双翅目(Diptera)(蝇和蚊)和鞘翅目(Coleoptera)(甲虫)物种的特异性活性。如此，苏云金芽孢杆菌起Cry毒素和cry基因的贮存器的作用，用于产生生物学杀昆虫剂和昆虫抗性的经遗传修饰作物。可以经由遗传工程的使用来将一种来自苏云金芽孢杆菌的毒素(Bt毒素)直接掺入植物中。

Bt毒素的一项重要的缺点在于昆虫在Bt毒素存在于全植物中时快速形成抗性。另一项缺点在于Bt基因的表达可以有所变化。例如，若温度不是理想的，则此压力可以降低毒素生成，并使植物更易感。更重要的是，毒素的晚季表达降低已经有记录，可能源自于启动子的甲基化。由于不断暴露于毒素，所以为抗性有害物产生进化选择压力。早已知道小菜蛾(Diamondbackmoth)已经演化出对Bt的抗性。还有一种假设的风险，即例如转基因玉米会与野生草变体杂交，而Bt基因会在天然环境中结束，保留其毒性。最后，直到现在全世界的bt棉花开发人员也不知道主要耕地中bt棉花植物突然死亡的原因。

在一个优选的实施方案中，依照本发明的玉蜀黍植物不表达自细菌衍生的杀昆虫性蛋白质。

“细菌”指原核单细胞微生物。细菌通常长几微米(0.5至5左右)，并且具有许多形状。大多数细菌物种是球形的(称作球菌)或杆状的(称作杆菌)。称作弧菌的一些杆状细菌是略微弯曲的或逗点状的；其它的可以是螺旋形的(称作螺旋菌)或紧密卷曲的(称作螺旋体)。少数物种甚至具有四面体或立方体形状。此极其多种形状是由细菌细胞壁和细胞骨架决定的。

许多细菌物种仅以单细胞存在，其它的以特征性样式联合：奈瑟氏球菌(Neisseria)形成二倍体(成对)，链球菌(Streptococcus)形成链，而葡萄球菌(Staphylococcus)以“成串葡萄”簇聚集在一起。细菌也可以是细长的以形成细丝，例如放线细菌(Actinobacteria)。丝状细菌通常围绕有鞘(sheath)，其含有许多细胞个体；某些类型(诸如诺卡氏菌属(Nocardia)物种)甚至形成复杂的、分枝的细丝，其在外形上类似于真菌菌丝体。

细菌门包含放线细菌属(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、衣原体门(Chlamydiae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)/绿菌门(Chlorobi)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)/酸杆菌(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、粘胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热微菌门(Thermomicrobia)、热袍菌门(Thermotogae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。

在另一个优选的实施方案中，依照本发明的玉蜀黍植物不表达转基因杀昆虫性蛋白质。

术语“转基因”(或“重组”)指人为操作的多核苷酸或人为操作的多核苷酸的拷贝或互补物。例如，包含与第二多核苷酸可操作连接的启动子的转基因表达盒可以包括与第二多核苷酸异源的启动子，这是由于为人操作(例如通过记载于Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)或CurrentProtocols in Molecular Biology卷1-3，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)的方法)构成表达盒的分离的核酸实现的。在另一个例子中，重组表达盒可以包含以如下方式组合的多核苷酸，所述方式的所述多核苷酸极不可能在自然界中找到。例如，人为操作的限制性位点或质粒载体序列可以在第二多核苷酸侧翼或者分开启动子与第二多核苷酸。熟练技术人员应当认可的是，多核苷酸可以以多种方式操作，并且不限于如本文中所描述的例子。

术语“转基因”或“重组”在提及细胞使用时指含有转基因的细胞，或者已经通过导入转基因来改变其基因组的细胞。术语“转基因”在提及组织或植物使用时分别指包含一个或多个包含转基因或者已经通过导入转基因来改变其基因组的细胞的组织或植物。可以通过数种方法来产生转基因细胞、组织和植物，包括通过人为干预的方式(诸如通过技术人员公知的方法)将包含核酸(通常为DNA)的“转基因”导入靶细胞中或者将转基因整合入靶细胞的染色体中。术语“转基因”或“重组”在提及蛋白质使用时指由转基因多核苷酸编码的蛋白质。

在本发明的另一个优选的实施方案中，玉蜀黍植物不表达转基因灭害性(pesticidal)蛋白质。

在本发明的范围中，术语“灭害性”蛋白质指意图用于预防、破坏、驱除任何有害物或者减轻任何有害物的损害的任何蛋白质。灭害性蛋白质可以有针对有害物的活性，所述有害物包括昆虫、植物病原体、杂草、软体动物、鸟类、哺乳动物(如啮齿类)、鱼、线虫和微生物(病毒、细菌、真菌)，它们与人竞争食物，破坏特性，传播疾病或者是疾病的载体或者是令人讨厌的。灭害性蛋白质或“灭害剂”可以例如是杀细菌剂、杀真菌剂(用于控制真菌和卵菌)、除草剂(例如用于控制杂草)、杀昆虫剂(例如杀卵剂、杀幼虫剂或杀成虫剂)、杀螨剂、杀软体动物剂(例如用于控制蛞蝓和蜗牛)、杀线虫剂、杀啮齿类剂或杀病毒剂。

“转基因灭害性蛋白质”指由如上文所定义的转基因编码且展现出如上文所定义的灭害作用的蛋白质，如上文所定义的。

在另一个优选的实施方案中，依照本发明的玉蜀黍植物与Zamora玉米相比对WCR的易感性低至少约2倍，更优选至少约2.5或3倍，特别优选至少约3.5或4倍，特别优选至少4.5或5倍，且最优选至少约5.5或6或7.5或10倍。

还有，在一个优选的实施方案中，所述玉蜀黍植物与Zamora玉米相比对ECB的易感性低至少约2倍，更优选至少约2.5或3倍，特别优选至少约3.5或4倍，特别优选至少4.5或5倍，且最优选至少约5.5或6或7.5或10倍。

术语“易感的”或“易感性”对应于植物不能抵抗传染原或病原体的侵入或繁殖，或者由其毒性产物或任何其它损害性因子引起的损害。由于易感性，植物完全或在某种程度上容易受到传染原、损害性因子、病原体或毒性产物的有害效果影响或者对传染原、损害性因子、病原体或毒性产物的有害效果敏感。换言之，易感性水平升高对应于植物关于给定病原体或有害物的抗性水平降低，且反之亦然，即易感性水平降低对应于抗性水平升高。

可以出于本发明的目的作为参照植物使用的另一种非抗性商品化玉米杂种是“Astor”，其是非抗性商业注册的玉米杂种(可购自Südwestsaat GbR，Rastatt，德国，还可参见因特网页面http://www.saaten-union.de，或者更具体的是http://www.saaten- union.de/index.cfm/portal/l/nav/325/article/1726/page/printl.html)。Astor在法国以名称“Anjou249”和注册号CTPS 1007587注册。

当然，任何其它非抗性玉米植物可以充当本发明的参照植物，诸如实施例中所描述的非抗性植物。

可以充当参照的其它合适的玉米系是玉米系R 6080和玉米系R 1437，由此R 6080是关于ECB易感性的有用参照，而R 1437是关于WCR易感性的有用参照。这两种品系均可购自Südwestsaat GbR(Rastatt，德国)。R 6080还在共同体植物品种局(Community PlantVariety Office)注册(授权号R 16016)。

在一个优选的实施方案中，依照本发明的玉蜀黍植物与玉米系R 1437相比对WCR的易感性低至少约2倍，更优选至少约2.5或3倍，特别优选至少约3.5或4倍，特别优选至少4.5或5倍，且最优选至少约5.5或6或7.5或10倍。

还有，在一个优选的实施方案中，所述玉蜀黍植物与玉米系R 6080相比对ECB的易感性低至少约2倍，更优选至少约2.5或3倍，特别优选至少约3.5或4倍，特别优选至少4.5或5倍，且最优选至少约5.5或6或7.5或10倍。

发明人还已经发现，本发明的玉蜀黍植物比现有技术的WCR抗性植物，例如NGSDCRW1(S2)C4-15-252(Kahler等(1985)Crop Science 25：202)更具对WCR的抗性，所述NGSDCRW1(S2)C4-15-252称作“黄金标准”，因为所有新抗性资源均与此标准检查近交系进行比较(Bohn(2007)Zeitschrift Mais34(2)：40-43)。本发明的植物与NGSDCRW1(S2)C4-15-252相比对WCR的抗性高至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，甚至更优选至少25％，且最优选至少30％。

适合于测定与非抗性参照植物(如“Zamora”、“Astor”、R 1437或R 6080)相比玉米植物对WCR和/或ECB的抗性的一项因素是植物根上的活幼虫数目，其中“活幼虫”指那些能够发育成甲虫的幼虫。在合适的实验设置中，必须在相同环境条件(位置、耕地大小、稳定、湿度、初始有害物侵袭等)下种植依照本发明的植物和参照植物，最合适的是在两块相邻的耕地中。在实施例中描述了合适的测试安排，但是本领域技术人员还可以制定可能的偏差。

若植物与参照植物相比对WCR或ECB的易感性低至少约2倍，则根上分别会有少至少约2倍的WCR或ECB幼虫。例如，非抗性参照植物的根上可以有30条WCR或ECB幼虫的数目，而依照本发明的植物的根上可以有15条WCR或ECB幼虫的最大数目。当然，出于统计学原因，应当分析增加数目的玉米植物和玉米参照植物，例如5、10、20、50或100株植物。

应当理解的是，幼虫对根的进食损害的程度也是合适的抗性指标。为了对由WCR幼虫引起的损害评分，通常使用IOWA量表。有两种不同的可用量表，一种范围为1至6(“旧”IOWA量表，Hills和Peters(1971)J.Econ.Entomol.64(3)：764-765)，而一种范围为1至3(“新”IOWA量表，Oleson等(2005)J.Econ.Entomol.98(1)：1-8)，它们都适合于分析本发明的植物。优选地，使用“新”IOWA量表，因为数值量表与根损伤量之间的关系是线性的，并且容许抗性和易感性植物之间更好的区别。

为了依照IOWA量表确定对根系统的损害，在多年来WCR频繁出现的区域中种植植物。掘出玉蜀黍植物的根系统，并从根除去尽可能多的土壤。在清洗根以使得所有冠根均相当干净后，对损害评分，其中依照新IOWA量表的0数值意味着没有发生对根的可见损害或者根仅显示少许伤痕。根据新Iowa量表的3数值意味着根上超过一节受到完全破坏。关于损害评分的更多信息可以获自Oleson等(2005)J.Econ.Entomol.98(1)：1-8，通过提及而将其收入本文。

本发明植物的IOWA根得分在0.2和1.2之间，优选在0.5和1.2之间，更优选在0.7和1.2之间，且最优选在0.9至1.2之间。

WCR抗性的另一项指标是幼虫回收，其指明植物根上的幼虫数目。如下收集幼虫，即将全部的根团放置在细筛孔聚乙烯袋中，并在温室中将它们悬挂在水盘上方。幼虫会落入水盆中，并可以在95％乙醇中贮存。方法也记载于Hibbard等(2004)J.Econ.Entomol.97(3)：871-882，通过提及而将其收入本文。可以如下提取温室幼虫，即在垃圾或土壤样品中使用产生约14℃的温度梯度的Tullgren漏斗，刺激土壤节肢动物向下移入收集容器中。

与易感性玉蜀黍植物诸如B37xH84、CRW3(S1)C6和CRW2(C5)(它们均由BruceHibbard，USDA-ARS，205 Curtis Hall，University of Missouri，Columbia，MO，USA开发)相比幼虫回收降低至少20％，优选至少25％或30％，更优选35％至40％，甚至更优选45％至50％，且最优选55％或60％。

术语“根”指植物的地下器官或成分。根可以具有数种功能和特征：它通过将植物锚定至土壤来提供支持，它自土壤吸收和引导水和营养物诸如矿物，并且它可以贮存食物和废物。在支持和贮存外，根在许多情况中还能够与微生物互惠联合和次生生长。通常，根缺乏节、枝条和叶。

在另一个优选的实施方案中，本发明的玉米植物在对WCR和ECB的抗性外还对秋季粘虫(Fall Armyworm)和/或小地老虎(Black Cutworm)有抗性。“秋季粘虫”(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))可以是玉米中更难以控制的昆虫有害物之一。秋季粘虫引起严重的叶进食损害以及对穗的直接损伤。虽然秋季粘虫能在几乎所有发育阶段中损害玉米植物，但是它会在尚未抽穗丝的后期种植上聚集。与欧洲玉米螟虫一样，秋季粘虫受到最有效的控制，虽然幼虫是小的。早期检测和杀昆虫剂应用的适当时机是至关重要的。

“小地老虎”(小地老虎(Agrotis ipsilon))是可以在许多地区找到的分布广泛的物种。侵袭的威胁在免耕(no-till)或多杂草的玉米耕地中，特别在排水不良的区域中表现为最大。小地老虎以广泛的耕地和园艺作物为食。玉米和烟草是其优选作物的两种。其它已知的宿主包括芦笋(asparagus)、豆(bean)、甜菜(beet)、甘蓝/卷心菜(cabbage)、蓖麻(castor bean)、棉(cotton)、葡萄(grape)、莴苣(lettuce)、花生(peanut)、胡椒(pepper)、马铃薯(potato)、萝卜(radish)、菠菜(spinach)、南瓜(squash)、草莓(strawberry)和番茄(tomato)。小地老虎是所有地老虎中最具破坏性的之一。幼虫自土壤线附近的根切断植物；通常没有其它进食损害存在。许多幼虫连续几夜在植物间移动，而一些保持以切割的植物的根和地下茎为食。

在另一个优选的实施方案中，依照本发明的玉蜀黍植物的种子以编号NCIMB41472、NCIMB 41473和NCIMB 41474保藏于“国立工业食品与海洋细菌菌种保藏中心”(National Collections of Industrial Food and MarineBacteria，NCIMB，Aberdeen，UK)(初始保藏日期：2007年2月27日)。各系名称是AT 0039、R 4535和R 7222(参见实施例)。

“种子”指受精发生后发育的器官，即成熟的胚珠。它由胚、营养材料(胚乳)、和保护层组成。

本发明还涉及依照本发明的玉蜀黍植物的杂种。术语“杂种”在本语境中指源自于两种遗传方面不同的亲本植物(在一种或多种基因中有所不同)之间的杂交的后代个体；特别是通过对不同群体、品种、品系、物种、栽培种、基因型或属，但一般不是不同科的植物进行育种所产生的后代。在本语境中，“杂种”指源自于杂交的后代，其中至少一株亲本植物是依照本发明的玉蜀黍植物。优选地，两株亲本植物都是依照本发明的玉蜀黍植物，然而它们遗传方面是不同的，如上文所解释的。例如，杂种Sum1351衍生自仅一株抗性亲本植物(R7240x AJ 1494)，而Sum 1352衍生自都有抗性的两株亲本植物(R 7222x AJ 1499)，参见图6。

在植物育种中，通常产生和选择杂种，因为它们具有亲本个体或群体中没有找到或者不一致存在的想要特性。各群体或各品种之间的这种遗传材料重排也称作杂交。

因为植物无需大量工作便频繁杂交，所以它们通常人为产生以便产生改良的植物。这些改良可以包括为消费产生更多或更好的种子、果实或其它植物部分，或者使植物更加耐寒或耐热。现在用杂种完成了大量的工作以为农业和园艺作物产生更具疾病抗性的植物。在许多组植物中，已经使用杂交来产生更大且更艳丽的花和新的花色。许多植物属和种在多态性方面具有其起源，四倍体在许多不同组植物中是常见的，并且这些植物随着时间能分化成与正常二倍体系不同的物种。四倍体能形成二倍体群体内的育种群体，并且在与二倍体群体形成杂种时，所得的后代趋于是不育的三倍体，如此有效地终止两组植物间的基因混合(除非在罕见的情况中，二倍体产生未减少的配子)。许多杂种是人为产生的，但是也存在天然杂种。特别地，植物杂种通常比任一亲本品种更强壮，即存在时被称为杂种活力(杂种优势)或杂合子优势的一种现象。植物育种人员利用许多技术来产生杂种。

本发明还涉及依照本发明的玉蜀黍植物的后代或依照本发明的玉蜀黍植物的杂种的后代。另外，本发明涉及依照本发明的玉蜀黍植物的种子，依照本发明的玉蜀黍植物的后代的种子及依照本发明的玉蜀黍植物的杂种的种子。

术语“后代”在本语境中定义为繁殖(有性或无性)或复制的产物。它包括可以在繁殖或生殖(有性或无性)中使用的克隆、果实、幼苗、自交后代，及这些之任一项的任何繁殖体诸如切割物等。术语“后代”还涵盖的是作为有性或无性生殖后代的植物，此类植物的克隆或后代，或所述植物、后代、克隆或后代的任何部分或繁殖体。

在“全”植物或“成熟”植物外，本发明还包含自植物衍生的后代、繁殖材料(诸如叶、根、幼苗、果实、花粉、枝条等)、部分(器官、枝条营养结构(例如叶、茎和块茎)、根、花、切割物、和花器官/结构，例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、组织(例如维管组织、基本组织、等)、细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)、细胞培养物、和收获的材料。

如本文中所使用的，术语“细胞”或“植物细胞”指单细胞或细胞群体。群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。同样地，群体可以包含超过一种细胞类型。在本发明中，对细胞群体可以包含的细胞类型的数目没有限制。细胞可以是同步的或不是同步的。本发明意义内的植物细胞可以是分离的(例如在悬浮培养中)或者包含在处于任何发育阶段的植物、植物器官或植物组织中。

关于植物的术语“组织”(或“植物组织”)指多种植物细胞的安排，包括分化的和未分化的植物组织。植物组织可以构成植物器官的部分(例如植物叶的表皮)，但是也可以构成肿瘤组织(例如胼胝体组织)和培养中的各种细胞类型(例如单细胞、原生质体、胚、胼胝体、原球茎样体等)。植物组织可以在植物中、在器官培养、组织培养、或细胞培养中。

本发明的另一个目的包括使用双单倍体技术来开发适应的抗性材料和开发各种分子标志，以便便于有效的基于标志物的选择规程。

例如，通过组合单基因Bt抗性和定量继承的对ECB的抗性的不同来源，可以有可能通过在一种基因型中逐步增加潜在基因来开发具有多种抗性的杂种(Magg，2004)。为了阻止昆虫抗性的失效，可以仅使用转基因玉米作为IPM方案中的一个成分(Schulz等，1997)。因此，有效的抗性管理系统对于预防ECB对Bt毒素的抗性是至关重要的。

IPM是通过以使经济、健康、和环境风险最小化的方式组合生物学、栽培、物理、和化学工具来管理有害物的可持续方法。可以经由利用批准的有害物勘察技术和通过执行经济阈值做出有害物管理决定来使经济风险最小化。可以通过遵循灭害剂标签上提供的所有安全指导来使健康风险最小化。通过在有可能时避免灭害剂使用和通过在必须使用灭害剂时遵循灭害剂标签上提供的所有环境或野生生物安全准则来使环境风险最小化。

已经构建了提供高遗传分辨率的玉米基因组连锁图谱。已经将SSR(简单序列重复)指派给玉米的不同染色体，出于数种原因，SSR对于基因作图是非常有用的标记物系统(Bohn等，2001)。可以有效地与例如分组分离子分析(Bulked Segregant Analysis)组合使用作图标志物(如容易操作的SSR)(Michelmore等，1991)，以便鉴定单一抗性基因(例如Werner等，2000)。并且它们可以作为锚用于为作为QTL分析基础的各次杂交快速构建遗传图谱(例如Scheurer等，2001)。

遗传作图的目的是鉴定与影响数量性状的遗传因素(数量性状基因座或QTL，那些是与特定性状有关的DNA区域；它们在许多情况中通过组合基因来提供等位变异)紧密接近的简单继承标志物。此定位依赖于产生标志物与QTL等位基因间统计学关联的方法和选择性减少该关联(作为标志物与QTL的距离的函数)的方法。在使用近交亲本间的杂交来定位QTL时，在F1杂种中产生所有标志物与自同一亲本衍生的QTL等位基因间的全部关联。产生双单倍体(DH)、F2或重组近交系的减数分裂中的重组减少给定的QTL与远离其的标志物间的关联。

一种备选方法是“关联作图”，其利用相对较久以前产生关联的事件。已经在人类遗传学中大量且有效地使用用于检测QTL的基于关联的方法，然而在大多数植物(除乔木外)中，基于分离的QTL作图方法是主要的。但是，关联研究对于基于植物群体中的连锁不平衡(LD)作图来分析数量性状变得越来越重要(Flint-Garcia等2003)。虽然基于分离的方法在分离群体中直接观察标志物基因座和靶基因的共继承，但是在基于关联的方法中分析个体品系的较大群体，以便揭示标志物样式和性状表达之间的关联。

在针对WCR和ECB的抗性方面可以使用非适应的近交系作为供体来开发适应的双单倍体群体。双单倍体群体具有如下优点，即由于其特殊的遗传构成，与常规衍生的S2或S3近交系群体相比预期QTL作图分析的能力更高。另外，由于非分离双单倍体系的继承性更高，耕地抗性筛选是更精确的。可以依照“Iowa列表”(其对根损害进行评分)来对WCR损害进行评分(Oleson等，2005)。对得分的评估是费时的，因此可以应用有效的评分方法：NIRS技术、分析别的抗性因素，如可消化性(木质素浓度/组成)，出于育种研究目的应用分子标志、微卫星(SSR)、SNP、STS和ISSR标志物等。

本方法用来：

·通过鉴定新的昆虫抗性基因来提高农业中的生物多样性，

·将天然宿主植物抗性改良为在经济学和生态学方面有希望的用于控制WCR和ECB侵袭的手段，

·开发适应的抗性良种近交系，其可以用于分析和了解针对WCR/ECB的抗性机制以进行高产量杂种开发，

·开发用于WCR损害的有效评分方法，

·鉴定紧密连锁的如下分子标志，其便于有效组合对WCR/ECB的抗性与卓越的农艺学性能，及

·开发可以作为成分用于高产量抗性杂种的适应的良种近交系。

用与标志物辅助育种组合的双单倍体技术分析对WCR和ECB的宿主植物抗性的遗传学需要经典的育种技术、耕地测试、分子植物育种技术应用和用于抗性和易感性的有效筛选系统的专业知识。DH系的开发和在耕地试验中对它们测试WCR/ECB抗性得到化学分析和病毒抗性基因作图支持。具有高的天然ECB压力的位置容许在天然有害物压力下的有效大规模材料筛选项目。使用经天然WCR侵袭的耕地来筛选非适应的和开发的适应的良种育种群体。

现今，WCR抗性的遗传学和机制是未知的，并且仅有限的关于ECB抗性的信息是可用的。通过本方法，可以避免或限制未来的WCR和ECB蔓延，并且与分子标志一起的抗性玉米登记(accession)可以充当用于抗性适应良种育种群体的有效育种的基础。改良玉米的天然宿主植物抗性对于整个农业界而言具有创新的影响。它为欧洲提供了用于有害物综合治理系统的一种经济学和生态学工具，为欧洲农民降低了产量损失的风险。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫都有抗性的玉蜀黍植物，其中针对西方玉米根虫的抗性是通过分子标志手段确定的，且其中所述植物不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质。

在本发明的另一个实施方案中，提供了对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫都有抗性的玉蜀黍植物，其中针对欧洲玉米螟虫的抗性是通过分子标志手段确定的，且其中所述植物不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质。

在本发明的又一个实施方案中，提供了对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫都有抗性的玉蜀黍植物，其中针对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫的抗性都是通过分子标志手段确定的，且其中所述植物不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质。

技术人员知道的是，有可能组合分子标志用于测定对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫两者的抗性的用途与用于测定抗性的其它方法(例如本文中所描述的倒伏评定量表)。

用于检测QTL并与分离群体中直接观察到的基于分离的方法比较以便揭示SSR标志物样式与性状表达间的关联的方法为整个农业界提供了高度创新。(The approach forthe detection of QTLs and the comparison to thesegregation-based approachdirectly observed in a segregating population in orderto reveal associationsbetween SSR marker patterns and trait expressions offers ahigh degree ofinnovation for the whole agricultural community.)平行实施这两种策略以提高成功的可能性。

有效筛选方法和工具的开发使发明人能够开发更有效且更快速的抗性杂种，并向市场供应非GMO抗性杂种。特别在公众对GMO产品接受度低的国家，宿主植物抗性帮助农民保护产量。另一方面，与GMO抗性组合的宿主植物抗性有助于降低抗性失效的风险。

通过此方法，可以避免未来的WCR和ECB蔓延，并且与分子标志一起的抗性/耐受性玉米登记可以充当用于抗性适应良种育种群体的创新且有效的育种的基础。

本发明的一项益处是，一方面，新开发的且充分表征的植物材料(如适应的WCR和ECB抗性近交系和杂种)，和另一方面，关于连锁分子标志(其使得能够通过标志物辅助育种来有效开发新的抗性近交系和杂种)的知识。

“分子标志”在本发明的意义内指就是其核苷酸序列在不同生物体(例如抗性和易感性植物)间有所不同，并且因此可用于区分这些生物体的特定DNA区段。

可以使用适应的抗性良种近交系来分析和了解针对WCR和ECB的抗性机制以进行未来的高产量杂种开发。可以组合用于评估预筛选的供体材料的广泛耕地试验与易于操作的评分系统的建立。基于鉴定的非适应抗性供体材料，可以产生至少两种双单倍体作图群体，其可以用于抗性的遗传分析和连锁分子标志的鉴定。为了鉴定主要抗性基因，组合使用SSR与分组分离子分析。

1.对ECB/WCR有抗性的适应良种育种群体的开发

在德国在诱导隔离群中诱导群体1(POP1)。将经诱导的种子运往冬季苗圃(智利)以进行单倍体选择和D0繁殖(染色体加倍、成功加倍植物的自交)。在同一时间段中，实施群体2(POP2)的初始杂交，因此随后进行诱导杂交。POP1的世代D1会是可获得的，并且会准备好世代D1中POP2的种子。另外，使用有效筛选方法的开发来在适应的和非适应的良种育种中筛选抗性。

2.在耕地条件下评估作图群体POP1和POP2

在天然昆虫压力下在重复耕地观察中评估作图POP1和POP2的近交系(位置＝4，重复＝3)。因此，对WCR侵袭的耕地评估幼虫污染/分布(卵计数/kg土壤)以确保对调查材料的同质昆虫压力。依照“Iowa量表”对WCR损害评分，所述Iowa量表对根损害评分(Oleson等，2005)。为了评估ECB症状，选择具有高风险的ECB侵袭的地区中的耕地/环境。

3.有效用于WCR损害的评分方法的开发

对于WCR，开发评分方法来实现对调查近交系的根损害的高通量评分。到现在为止，不得不用手掘出受损害植物的根，这是极其劳动密集的。

4.作图群体的分子遗传表征

对POP 1的亲本成分筛选多态性SSR标志物。使用多态性SSR来作图，主要聚焦于WCR。收获200种双单倍体近交系的叶材料，并自其分离DNA。用大量的抗性和易感性DH系实施别的进一步标志物筛选。使用具有2年性状评估结果的200种DH系的标志物结果(每个200种多态性SSR)计算对WCR的QTL分析。

另一种用于鉴定分子标志的方法是SNP(单核苷酸多态性)分析，其是本发明的一种优选的方法。SNP指基因组区域诸如基因内的特定位置处的单DNA碱基交换或单碱基插入/删除。群体中的数个个体可以例如具有碱基腺嘌呤，而其它个体在基因内的同一位置处具有碱基胞嘧啶。这些交换可以指明表型特征诸如疾病抗性。

可以在DNA芯片或微阵列上通过例如等位基因特异性杂交或引物延伸来检测点突变。这些检测方法基于寡核苷酸，所述寡核苷酸以所谓阵列的形式排列在芯片上，即预先确定的排列，以便经由杂交或者经由杂交及随后排列的寡核苷酸的DNA聚合酶依赖性引物延伸来检测。对于这两种技术，在芯片上的特定位置处排列和固定探针，即各种寡核苷酸，而要检查的样品的核酸分子以杂交溶液形式存在。使此溶液与芯片接触并一起温育，容许样品的DNA分子(其存在于溶液中)寻找其在生物芯片表面上的合适杂交配偶，即匹配各分子的寡核苷酸探针，并与其杂交。SNP检测的另一种方法是多重寡核苷酸连接/聚合酶链式反应及随后的毛细管电泳，如记载于本申请的实施例中的。

优选地，本发明的玉蜀黍植物具有至少一项位于选自下组的位置处的SNP：染色体5上的197cM_IBM_map；染色体2上的221cM_IBM_map；染色体1上的1008cM_IBM_map；染色体1上的1015cM_IBM_map；染色体1上的659cM_IBM_map；染色体1上的327cM_IBM_map；染色体2上的383cM_IBM_map；染色体3上的192cM_IBM_map；染色体3上的511cM_IBM_map；染色体8上的105cM_IBM_map；染色体4上的251cM_IBM_map；染色体5上的664cM_IBM_map；染色体7上的258cM_IBM_map；染色体5上的250cM_IBM_map；染色体6上的374cM_IBM_map；染色体6上的302cM_IBM_map；染色体6上的277cM_IBM_map；染色体8上的269cM_IBM_map；染色体7上的86cM_IBM_map；染色体8上的241cM_IBM_map；染色体8上的389cM_IBM_map；染色体8上的461cM_IBM_map；染色体9上的238cM_IBM_map；染色体9上的230cM_IBM_map和染色体2上的314cM_IBM_map。

优选地，本发明的玉蜀黍植物具有至少2、3、4或5项SNP，更优选至少6、7、8、9或10项SNP，甚至更优选至少11或12项SNP，且最优选至少13或14项位于选自上文给定位置的位置处的SNP。

本发明的玉蜀黍植物可以进一步包含一项或多项位于选自下组的位置处的SNP：染色体1上的142cM_cons_map；染色体2上的72cM_cons_map；染色体2上的90cM_cons_map；染色体3上的127cM_cons_map；染色体4上的54cM_cons_map；染色体6上的148cM_cons_map；染色体7上的80cM_cons_map；染色体7上的81cM_cons_map；染色体8上的93cM_cons_map；染色体8上的115cM_cons_map；染色体9上的98cM_cons_map；染色体10上的74cM_cons_map和染色体10上的35cM_cons_map。

在本发明的一个实施方案中，玉蜀黍植物具有位于如下位置处的SNP的组合：染色体5上的197cM_IBM_map；染色体2上的221cM_IBM_map；染色体1上的1008cM_IBM_map；染色体1上的1015cM_IBM_map；染色体1上的327cM_IBM_map；染色体2上的383cM_IBM_map；染色体4上的251cM_IBM_map；染色体5上的664cM_IBM_map；染色体7上的258cM_IBM_map；染色体6上的302cM_IBM_map；染色体6上的277cM_IBM_map；染色体8上的269cM_IBM_map；染色体9上的238cM_IBM_map和染色体9上的230cM_IBM_map。它可以进一步包含位于如下位置处的SNP的组合：染色体1上的142cM_cons_map；染色体4上的54cM_cons_map；染色体6上的148cM_cons_map；染色体7上的80cM_cons_map和染色体10上的74cM_cons_map。

在本发明的另一个实施方案中，玉蜀黍植物具有位于如下位置处的SNP的组合：染色体5上的197cM_IBM_map；染色体1上的659cM_IBM_map；染色体2上的383cM_IBM_map；染色体3上的192cM_IBM_map；染色体3上的511cM_IBM_map；染色体8上的105cM_IBM_map；染色体5上的250cM_IBM_map；染色体6上的374cM_IBM_map；染色体7上的86cM_IBM_map；染色体8上的241cM_IBM_map；染色体8上的389cM_IBM_map；染色体8上的461cM_IBM_map和染色体2上的314cM_IBM_map。它可以进一步包含位于如下位置处的SNP的组合：染色体2上的72cM_cons_map；染色体2上的90cM_cons_map；染色体3上的127cM_cons_map；染色体7上的81cM_cons_map；染色体8上的93cM_cons_map；染色体8上的115cM_cons_map；染色体9上的98cM_cons_map和染色体10上的35cM_cons_map。

最优选地，本发明的玉蜀黍植物具有位于位置染色体5上的197cM_IBM_map和染色体2上的383cM_IBM_map处的SNP的组合。

优选地，染色体5上的位置197cM_IBM_map处的SNP是A/T交换；染色体2上的位置221cM_IBM_map处的SNP是C/T交换；染色体1上的位置1008cM_IBM_map处的SNP是A/C交换；染色体1上的位置1015cM_IBM_map处的SNP是A/T交换；染色体1上的位置659cM_IBM_map处的SNP是C/T交换；染色体1上的位置327cM_IBM_map处的SNP是A/C交换；染色体2上的位置383cM_IBM_map处的SNP是A/C交换；染色体3上的位置192cM_IBM_map处的SNP是A/G交换；染色体3上的位置511cM_IBM_map处的SNP是C/G交换；染色体8上的位置105cM_IBM_map处的SNP是C/T交换；染色体4上的位置251cM_IBM_map处的SNP是G/T交换；染色体5上的位置664cM_IBM_map处的SNP是A/G交换；染色体7上的位置258cM_IBM_map处的SNP是C/T交换；染色体5上的位置250cM_IBM_map处的SNP是A/G交换；染色体6上的位置374cM_IBM_map处的SNP是A/G交换；染色体6上的位置302cM_IBM_map处的SNP是A/G交换；染色体6上的位置277cM_IBM_map处的SNP是A/G交换；染色体8上的位置269cM_IBM_map处的SNP是A/T交换；染色体7上的位置86cM_IBM_map处的SNP是C/G交换；染色体8上的位置241cM_IBM_map处的SNP是G/T和/或C/G交换；染色体8上的位置389cM_IBM_map处的SNP是C/G和/或C/T交换；染色体8上的位置461cM_IBM_map处的SNP是A/C交换；染色体9上的位置238cM_IBM_map处的SNP是A/C交换；染色体9上的位置230cM_IBM_map处的SNP是C/G交换，而染色体2上的位置314cM_IBM_map处的SNP是A/T交换。

优选地，染色体1上的位置142cM_cons_map处的SNP是G/T交换；染色体2上的位置72cM_cons_map处的SNP是A/T交换；染色体2上的90cM_cons_map处的SNP是A/G交换；染色体3上的127cM_cons_map处的SNP是A/G交换；染色体4上的54cM_cons_map处的SNP是A/C交换；染色体6上的148cM_cons_map处的SNP是C/T交换；染色体7上的80cM_cons_map处的SNP是C/G交换；染色体7上的81cM_cons_map处的SNP是A/G交换；染色体8上的93cM_cons_map处的SNP是G/T交换；染色体8上的115cM_cons_map处的SNP是A/G交换；染色体9上的98cM_cons_map处的SNP是C/T交换；染色体10上的74cM_cons_map处的SNP是A/C交换，而染色体10上的35cM_cons_map处的SNP是C/T交换。

如下检测SNP的存在，即比较通过其在抗性植物和易感性植物染色体上的位置鉴定的特定基因座的序列与亲本植物中的同一基因座的序列，并测定与预期等位基因频率的偏差。若一个等位基因与另一个等位基因相比显示高至少两倍的频率，且若等位基因频率间的差异为至少0.2，则认为与预期等位基因频率的偏差是显著的。

以cM_IBM_map描述本发明SNP的位置是基于IBM2 2005 Neighbours图谱，其在http://www.maizegdb.org/map.php#rep下可获得，并且其还记载于Schaeffer等(2006)Plant and Animal Genome Conference XIV(P372)：200。以cM_cons_map描述本发明SNP的位置是基于共有图谱，其由公司TraitGenetics开发。关于所使用的分子标志及其位置的更多信息可获自TraitGenetics，Am Schwabeplan Ib，06466Gatersleben，Germany。技术人员知道如何基于此信息来确定SNP的位置。术语“cM”在用于描述SNP的遗传基因座时指单位“厘摩”，其在遗传学中作为度量用于描述沿着染色体的距离，例如染色体上的两个基因间的相对距离。1厘摩对应于染色体上的一处遗传基因座的标志物会由于交换而与第二处基因座的标志物分开的机率为1％。

本发明还涉及一种鉴定对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫都有抗性或者对西方玉米根虫有抗性的植物的方法，其通过在自所述植物分离的遗传材料中检测至少一种上文所列出的单核苷酸多态性来进行。优选地，通过选自下组的方法来确认具有至少一种单核苷酸多态性的植物的抗性：根据1-9倒伏评定量表来确定倒伏，通过使用0-3Iowa量表来确定根损害或者测定幼虫回收。本发明还涉及通过此方法鉴定的植物。

使用以下实施例来例示本发明，但是不应解释为限制性的。

实施例

1：WCR/ECB抗性玉米系的生成

用于抗性系的育种方法如下：重组亲本材料，后续自交世代处于WCR和ECB幼虫依照文献中所记载的火箭筒(bazooka)技术进行的同时人工侵袭。系AT0039、R4535、和R7222的亲本材料(参见下表)是遗传方面广泛，但杂合方面明确限定的合成物，其中25％的部分为HPR外来植物。

HPR外来植物衍生自热带/亚热带遗传材料。HPR供体是“(天然)宿主植物抗性”供体，其已经随着人工侵袭一起进行过育种以展现出针对大量玉米有害物的稳定抗性。

火箭筒技术是一种用于在玉米植物上靶向应用某种量的幼虫的方法。它由J.A.Mihm博士于1979年开发。还可参见Wiseman，B.R；Widstrom，N.W.Comparison ofmethods of infesting whorl-stage corn with fall army-worm larvae.Journal ofEconomical Entomology卷73，第440页-第442页，1980。依照植物与昆虫之间的天然关系在代表玉米植物供幼虫进食最佳生长的时间点时发生幼虫应用。

生成了下列玉蜀黍系(表2)：

系	遗传起源	亲本材料	状态
				AT0039	美国BSSS Dent，外来植物	BSSS与HRP供体杂交	有抗性的
AT6004	美国Lancaster Dent	Lancaster良种重组	易感的
				R1437	Europa-FlintxDent	良种Flint-BSSS合成物	易感的
R4535	美国BSSS Dent，外来植物	BSSS与HRP供体杂交	有抗性的
				R5525	美国Reid Dent，外来植物	良种Reid-Dent与HRP供体	有抗性的
R6080	美国/欧洲Dent混合物	3种良种Dentlines的重组	易感的
				R6305	Arg./欧洲Cateto/Flint	Cateto-Flint集合的重组	易感的
R7222	美国/欧洲Dent，外来植物	美国/欧洲良种Dent与HRP供体的重组	有抗性的
				R7226	美国/欧洲Dent，外来植物	美国/欧洲良种Dent与HRP供体的重组	有抗性的
AJ1499	欧洲-dent x外来植物	欧洲早期dent与HRP供体杂交	耐受性的
				AT3030	美国/欧洲dent	美国/欧洲良种Dent的重组	有抗性的

BSSS定义为Iowa硬茎合成物，如记载于Hallauer和Miranda(Hallauer，A.R.；Miranda Filho，J.B.Quantitative genetics in maize breeding.第2版Ames：IowaState University Press，1988)的。BSSS是用于温带玉米种植的公知的杂合方面重要的基因集合。

2：耕地的选择

在那些多年来有害物频繁出现并在正常年份中引起实质性经济损失的地区中选择测试区域。为了选择区域，考虑支持高侵袭压力的所有参数，诸如：玉米后玉米种植、无轮种(返种)土壤工作或犁地等。另外，对于WCR位置，在冬季中采集土壤样品，以便通过自土壤清洗WCR卵或者通过对实验室中孵出的幼虫进行计数来选择最受侵袭的位置。

3：实验设置

在匈牙利针对WCR、在德国针对ECB和在美国针对WCR和ECB实施近交植物的测试。在美国的位置处，应用额外的WCR或ECB幼虫以提高侵袭压力。

一般测试安排是随机化区组安排。在5米土块长度的两排中且以3倍再现实施实验。

为了控制抗性的稳定性，用选定的杂种以4倍再现实施约80平方米的土块大小的所谓带测试。在欧洲测试4处位置：两处位置在匈牙利，其中一处位置显示重度WCR侵袭，而在另一处位置中没有可见的根损害，但是在陷阱中找到一些成年昆虫。采用这两处位置进行生产。另两处位置在德国，其中一处位置显示晚期/中等ECB攻击，而采用一处位置进行生产。

4：对WCR的测试评估

自6月中旬起，在每处测试位置安装数个信息素陷阱，并以3天的时间间隔分析WCR甲虫。此规程容许对侵袭压力进行评估。在开花时，关于由于WCR幼虫引起的根损害导致的倒伏实施目视评定。基于这些结果，掘出一些选定的植物来对根评定。依照在美国常用的Iowa量表来实施此评定。

已经建立了Iowa量表用于评估由玉米根上的玉米根叶甲幼虫进食引起的损害量。可以通过掘出采取约25cm直径至15cm深度的根系统来完成此评估。通过温和摇动和/或拍打(小心不要弄断任何冠根)来自根部除去尽可能多的土壤。然后清洗根系统以使得所有冠根都相当干净。

可以通过使用诸如下列各项的量表来评估对根系统的损害(“破坏的”指“对植物没有功能价值”)：

1＝没有可见的损害或仅很少的次要进食伤痕；

2＝存在可见的进食伤痕，但是植物没有被吃掉至4cm内的根，或者具有一条或两条缩短的根，如果系统的剩余部分相对没有损害的话；

3＝植物的数条根被吃掉至4cm内，但是根整节的等同物从未受到破坏；

4＝根的一节受到破坏或者等同物受到完全破坏；

5＝根的两节受到完全破坏；

6＝三节或更多节受到完全破坏(不是例示性的，但是与五的评定类似)。

收获前不久，关于由于WCR幼虫引起的根损害导致的倒伏实施另一次评定。实施收获，如必要的话。

5：针对ECB的测试评估

自7月中旬起，以定期的时间间隔对测试区域检查ECB侵袭。在区别侵袭时，实施评定。在收获前不久实施最重要的评定。实施收获，如必要的话。

下表显示了结果的汇总(表3)：

n＝结果的数目

ll＝倒伏的水平(量表1＝高度有抗性的至9＝高度易感的)

6：评估不同筛选位置的有害物压力

为了评估不同筛选位置的有害物压力，2008年6月开端在每处位置上建立4个信息素陷阱，并对陷阱中抓获的甲虫量定期计数，并计算4个信息素陷阱的均值。图9中显示了位置Villany、和Dalmand上的评估结果。

所有位置的天然有害物压力都是高的，范围为Villany中的1374至中的1876和Dalmand中的多至1896。文献报告陈述，若每株植物找到0,5至1,0只成年甲虫，则发生经济损害。观察到的甲虫数目指明所有三处筛选位置的高有害物压力或高经济损害。

7：杂种植物的WCR抗性

为了证明/确认SWS杂种的西方玉米根虫抗性，用预期的易感性竞争者杂种检验物(DKC5143、PR37F73、PR35P12、DK440、PR38R92、DKC3511和PR36K67)和1种SWS易感性杂种检验物(ZAMORA)和5种用具有西方玉米根虫抗性的亲本成分开发的实验杂种开始评估试验。在三处位置(Dalmand、Villany和)上种植杂种，其中以每排平均20粒种植的种子在3m样地中进行4次重复。在每次重复(＝排)中，挖掘5株单植物，并测量Iowa根得分(0-3)来评估由西方玉米根虫幼虫引起的根损害。

下表显示了在三处匈牙利位置(Dalmand、和Villany)上获得的每种杂种的平均根得分(表4)：

杂种名称	谱系	状态	Iowa量表0-3
				DKC5143	DKC5143	检验物品种	1,52
PR37F73	PR37F73	检验物品种	1,66
				PR35P12	PR35P12	检验物品种	1,56
ZAMORA	ZAMORA	检验物品种	1,58
				DK440	DK440	检验物品种	1,52
PR38R92	PR38R92	检验物品种	1,60
				DKC3511	DKC3511	检验物品种	1,42
PR36K67	PR36K67	检验物品种	1,56
				SUM2163	AJ1453/AT3030	SWS抗性品种	1,15
SUM2169	AT0039/AT3030	SWS抗性品种	1,11
				SUM2170	AJ1472/R6306	SWS抗性品种	1,01
SUM2162	R7222/R6306	SWS抗性品种	1,16
				R6309/AJ1453	R6309/AJ1453	SWS抗性品种	1,10

遗传率或遗传度定义为遗传方差对表型方差的比例。如下计算运算遗传率，即确定方差分量，并通过以下公式计算遗传率：

h^{2} = \frac{{vc}_{G}}{{vc}_{G} + \frac{{vc}_{GO}}{N_{O}} \frac{{vc}_{GJ}}{N_{J}} + \frac{{vc}_{GOJ}}{N_{(OJ)}} + \frac{{vc}_{arror}}{N_{(OJR)}}}

1,0的遗传率意味着WCR抗性的差异完全基于遗传学，而0的数值意味着差异完全基于环境。

使用Plabstat(即即一种用于使用以下模型来评估植物育种试验的计算机软件)来计算实验的运算遗传率：

G＝基因型

L＝位置

R＝重复

Y＝G+L+R:L+GL+GR:L

计算遗传率为：

位置Dalmand：0.66

位置0.21

位置Villany：0.52

所有位置：0.72

基因型、位置和重复之间的差异均是高度显著性的(α＝0.01)。所有测试SWS抗性杂种与所有测试易感性杂种相比显示更低的根损害得分。SWS抗性杂种(1.11)与所有易感性杂种的平均值(1.55)相比显示低平均28.4的根损害。具有根得分1.01的最好杂种SUM2170与最易感的杂种PR37F73(1.66)相比显示低39.2％的根损害。

8：近交系的WCR抗性

为了证明/确认SWS近交系的西方玉米根虫抗性，在2008年用一种易感性检验物(AC3512)和一种普遍知道的抗性来源(NGSDCRW1(S2)C4-15-252)及两种SWS近交系开始评估试验。

AC3512是没有涉及西方玉米根虫抗性的任何遗传背景的SWS良种近交系(易感性检验物)。NGSDCRW1(S2)C4-15-252是西方玉米根虫抗性近交系，其是经由4轮对合成NGSDCRW1(S2)C4的轮回选择开发的。NGSDCRW1(S2)C4-15-252称作“黄金标准”，所有新的抗性来源都与此标准检验物近交系进行比较(Bohn，M.2007.Der Maiswurzelbohrer in denUSA，Zeitschrift Mais 34，2：40-43)。R7222和AT3030是具有高度西方玉米根虫抗性的SWS近交系。

因此，在具有可靠的且均质天然的西方玉米根虫压力的三处匈牙利位置(Dalmand、Villany和)上，分别以2次重复(R7222，AT3030)和4次重复(AC3512，NGSDCRW(S2)-15-252)在3m排中种植4种近交系。在每次重复中，挖掘5株单植物，并测量Iowa根得分(0-3)来评估由西方玉米根虫幼虫引起的根损害。对AC3512和NGSDCRW1(S2)C4-15-252的总共60株单植物和R7222和AT3030的总共30株单植物评分。

下表显示了根据Iowa量表0-3的4种近交系的根得分均值(表5)：

如所预期的，AC3512对西方玉米根虫是易感的(得分均值2.01)，而黄金标准NGSDCRW1(S2)C4-15-252显示至少一些耐受性，平均根得分1.34。高度抗性的近交系R7222与AC3512相比显示低52.2％的平均根损害，并且与黄金标准相比甚至仍显示低28.4％的平均根损害。

9：分子标志的作图

a)试验评估

在2008年，在耕地试验中测试两种双单倍体群体(H06103＝R2721/R7222；H06107＝AJ1472/AL0158)来分析WCR和ECB抗性的遗传机制。这两种群体是在没有WCR/ECB抗性的良种亲本(R2721；AL0158)和具有观察到的对WCR/ECB的抗性的亲本(R7222；AJ1472)间杂交的。因此，在受到重度WCR侵袭(天然侵袭)的匈牙利4处位置(Dalmand、Villany、Nagyszenas)和具有重度ECB损害(自以前年份的评估知道)的德国2处位置(Oderbruch、Kraichgau)和法国1处位置(Reitwiller)上测试群体H060107的37种基因型(DH系)和H060103的143种基因型(DH系)和两种作图群体的4种亲本。在每处位置上，在2008年春季种植以每次20颗谷粒/4m排的4次重复。在WCR位置上，评估根倒伏和根损害(Iowa量表0-3)。因此，用铲挖掘每排的5株植物，并在用高压清洁器清洁后，通过目视逐根评分。

如用Iowa量表(0-3)测定的不同位置/重复(R1-4)中的群体平均值是(表6)：

图10中显示了根据Iowa量表的群体H06107和H06103的单一系分布。

b)分组分离子分析

为了鉴定与ECB/WCR抗性有关的分子标志，使用SNP标志物进行分组分离子分析。SNP是最丰富的基因组标志物，并且因此SNP基因型分型是一种用于对遗传变异进行全基因组分析的关键技术。

对于分子标志分析，使用由APPLIED BIOSYSTEMS开发的SNP分析平台SNPlex。此系统使用多重寡核苷酸连接/聚合酶链式反应和毛细管电泳来分析二等位单核苷酸多态性基因型。它自单一96孔板产生4608个数据点。与内置质量控制特征、数据分析工具和自动化测定设计一起，这种通量现在容许在极短的一段时间内以高精确性实施大规模研究。SNPlex基因型分型系统由一组预先优化的、通用测定试剂组成，所述试剂独立于所研究的特定SNP利用。测定法仅有的SNP特异性成分是连接探针，其参与寡核苷酸连接(OLA)。目前，可以在一次OLA反应中同时解决多至48种SNP。用于SNPlex基因型分型系统的测定工作流程牵涉下列7步：(1)使用等位基因特异性和基因座特异性引物进行的等位基因特异性OLA反应；(2)通过核酸外切消化过量的探针和接头来纯化OLA产物；(3)使用通用引物进行通用PCR反应来扩增连接产物；(4)在经链霉亲合素包被的微量滴定板中捕获经生物素标记的PCR产物；(5)荧光Zipchute探针对单链PCR产物的结合；(6)杂交的Zipchute探针的洗脱；和(7)在ABI3730xl测序仪中通过毛细管电泳进行的荧光检测。使用GeneMapper4.0遗传分析软件来实施分析。GeneMapper使用经验参数(诸如信号强度和簇分离)来确定SNP的绘图特征是否在测定规格内。

在第一种方法中，用4种亲本(两份)、6种技术对照和来自这两种群体的82种基因型形成一块96孔板。使用两处最具信息的位置的WCR Iowa量表根得分来选择基因型。使用覆盖总共288种不同SNP的6种不同SNPlex测定法来测定两种群体的亲本成分的标志物多态性，并且还用来评估易感性和抗性基因型之间的等位基因频率差异。因此，使易感性和抗性基因型分组。对于抗性分组，仅使用具有＜1.2的Iowa根损害均值的基因型，而作为易感的，使用具有＞1.5的根得分的所有基因型。将具有1.2和1.5之间的根得分的基因型分类为耐受的，并且因此自分组分离子分析排除。

易感性分组H06103：12种基因型

抗性分组H06103：26种基因型

易感性分组H06107：6种基因型

抗性分组H06107：9种基因型

在数条染色体上，观察到与预期等位基因频率的显著偏差(参见表7)。若一个等位基因与另一个等位基因相比显示高至少两倍的频率，且若差异为至少0.2，则说明与预期等位基因频率的偏差。

在依照共有图谱的群体H06103的染色体1(6种SNP标志物，86cM-197cM)和染色体6(3种SNP标志物，56cM-68cM)上和在依照共有图谱的群体H06107的染色体8(7种SNP标志物，65cM-115cM)上检测主要效果。

表7：与群体H06103和H06107的易感性(S)和抗性(R)分组的预期等位基因频率具有偏差(用*标示)的SNP标志物。

X交换：指明SNP标志物的核苷酸交换；Chr和cM_cons_map显示SNP标志物在共有图谱上的染色体位置

10：具有人工病原体侵袭的玉米植物对WCR的抗性

在美国密苏里州哥伦比亚东部9km的密苏里大学(University of Missouri，MU)Bradford研究和推广中心由Bruce E.Hibbard(USDA-ARS，205CurtisHall，University ofMissouri，Columbia，MO，USA)遵循与Hibbard等(2007)J.Plant Regist.1：151-152类似的评估方案来进行研究。

为研究选择的三处耕地(Bradford4，Brookings，Rollins)在上年度种植大豆，因此在所使用的样地中不会找到野生西方玉米根虫。将卵在稀释的(0.15％)琼脂中悬浮，并校准应用以使得每30.5cm约1200粒卵在受侵袭植物的任一侧发生。用为此特别制作的拖拉机器械注射琼脂(Moellenbeck等(1994)J.Kans.Entomol.Soc.67：46-52)。另两块耕地(Bradford 1和Poultry)含有西方玉米根虫的天然侵袭，其用每30.5cm 500粒卵提升。Bradford农场和Poultry农场位置具有墨西哥粉粒壤土类型，其被测定为2％砂粒、70％粉粒、和28％粘土。Rollins位置具有Haymond壤土，其为50％砂粒、38.5％粉粒、12.5％粘土。虽然Brookings，South Dakota位置没有土壤测试，但是已经使用该土地进行成功的根虫试验达多年之久。

在5处不同耕地上以5次重复进行耕地试验，而温室试验具有2种不同处理(草/无草保护作物)，具有5次样地重复，其中每次2次取样重复。使用草保护作物来模拟杂草。文献报告陈述，如果主要的食物来源(玉米根)不可获得或者玉米品种不是优选的进食位置，那么西方玉米根虫幼虫使用杂草作为食物来源以进一步发育。总共测试不同起源的10种杂种，一些具有已经知道的易感性(B37xH84)或抗性(MIR604)。事件MIR604是由SyngentaSeeds开发用于赋予针对西方玉米根虫和北方玉米根虫的耕地保护的经过遗传修饰的(GM)玉米。它还表达充当选择标志的标志蛋白，即PMI，其容许植物利用甘露糖作为碳源。

在第二龄早期和第三龄早期为幼虫取样(Hibbard等(2004)J.Econ.Entomol.97(3)：871-882)定时以进行幼虫回收。将全部的根团温和地放置在细筛孔聚乙烯袋中，并悬挂在关闭冷却的温室中的水盘上方。将落入水盆中的西方玉米根虫幼虫在95％乙醇中贮存，直至它们可以进行加工。挖掘分开的样地，清洗，并通过使用基于切断根节数目的Iowa量表0-3来对损害评定(Oleson等(2005)J.Econ.Entomol.98：1-8)。在所有5块耕地上对根损害评分，而仅在耕地Rollins、Bradford 1和Bradford 2上评估幼虫回收。通过使用Tullgren漏斗来提取温室幼虫。Tullgren漏斗在垃圾或土壤样品中产生约14℃的温度梯度，刺激土壤节肢动物向下移入收集容器中。

表8：2008年Bradford研究和推广中心(MO，USA)具有用西方玉米根虫卵进行的人工侵袭的重复耕地试验的根损害得分和幼虫回收的均值

表9：2008年Bradford研究和推广中心(MO，USA)具有用西方玉米根虫卵进行的人工侵袭的重复耕地试验的不同耕地的根损害(RD)和幼虫回收(LR)数目的均值

表10：在具有两种处理(具有/没有作为保护作物的草的样地)的试验中在用西方玉米根虫卵人工侵袭的温室样地上种植的10种杂种的幼虫回收均值

在具有针对西方玉米根虫的预期抗性的所有所测试的常规杂种中，SUM2162显示最低的根损害得分(表1和表2)。仅杂种MIR604(其通过GMO性状赋予保护)具有较低的根损害评定。SUM2068和SUM2162的幼虫回收与在具有GMO杂种MIR604的样地上观察到的幼虫回收相当。与试验的最易感的杂种，即MIR604的非GMO型式(等值线)相比，SUM2068显示低59.4％的幼虫回收，并且对SUM2162观察到甚至更多的降低，为60.9％。与其它被分类为抗性的杂种(CRW3(S1)C6、NSS1xCRW3(S1)C6、PI583927、CRW2(C5)、AR17056_16)相比，SUM2068和SUM2162在幼虫回收方面是卓越的(与最好的其它抗性杂种NSS1xCRW3(S1)C6相比，SUM2068的幼虫回收要低20.4％而SUM2162的幼虫回收要低23.3％)。

幼虫回收数目在耕地和温室实验中是一致的。还有，在这些试验中，杂种SUM2068和SUM2162与所有所测试的常规杂种相比显示最低的幼虫回收数目(表3)。在温室实验中，SUM2162与“没有草”保护作物处理中的MIR604显示相同的低幼虫回收数目。

附图简述

图1：来自已经在针对WCR和/或ECB的抗性方面进行过测试的近交系的结果。在长度为5米的两排中以随机化区组安排播种近交系。重复实验。植物的绝对数和“倒伏的”植物(即对WCR和ECB易感的植物)的百分比表示在Y轴上。评估基于1(抗性)至9(易感性或敏感性)的倒伏评定量表。图形显示了植物总数、易感性(敏感性)植物数目和抗性植物总数及各种植物群体相对于植物总数的百分比。将抗性植物进一步细分成对WCR和ECB都有抗性的植物和仅对WCR或EBC有抗性的植物。

图2：与图1相同的呈现，但用杂种植物。

图3：用WCR侵袭杂种植物。对杂种进行所谓的带测试(strip test)，即将它们在受到WCR污染的耕地(带)上种植。在此耕地的一部分上安排网帐篷，并通过对被帐篷下的信息素陷阱吸引的WCR甲虫数目计数来对侵袭定量。图3a显示了与其它位置相比发生相对较低WCR侵袭的HSB位置处的侵袭。图3b显示了存在相对较高WCR侵袭压力的HBB位置处的侵袭。下方的线显示了在各个时间点时计数的甲虫数目，而上方的线显示了整个时间段里的累积侵袭。

图4：易感性(左侧照片)和抗性(右侧照片)杂种的照相呈现，其中易感性杂种由于根损害而“倒伏”，而抗性杂种以垂直位置保持。

图5：根损害的照相呈现，其中易感性杂种(左侧照片)显示了生长受妨碍强烈的根，而抗性杂种(右侧照片)显示了正常的根生长。

图6：不同杂种(Astor、Sum 1351、Zamora、Sum 1352)的WCR损害结果。单独地或另外与杀昆虫剂物质噻虫胺(clothianidin)(63g/50000颗玉米粒)一起用杀真菌剂TMTD(二硫化四甲基秋兰姆(tetramethylthiuram disulfide)，30g TMTD/50000颗玉米粒)处理杂种。呈现由于WCR损害而“倒伏”的植物的百分比。评估是基于倒伏评定量表。“Astor”是非常易感的杂种植物。“Zamora”是由于极好的根系统而在某些条件下显示对WCR的耐受性的杂种。杂种Sum 1351衍生自仅一种抗性亲本植物(R7240x AJ 1494)，而杂种Sum1352衍生自都有抗性的两种亲本植物(R 7222x AJ 1499)。

图7：产量结果(带测试)。在由四排(每排测量25米)构成的一块土地上重复实验四次。杂种Astor和Zamora比杂种SUM 1351和SUM 1352显示更好的产量，因为后两种还不是良种材料。

图8：不同位置上的产量结果(带测试)。德国位置Lichtenau仅显示轻微的ECB侵袭，而匈牙利位置HBB显示高WCR侵袭压力。认为位置HSB显示中等WCR侵袭。SUM1352杂种在高WCR袭位置中比非常易感的杂种Astor显示更好的产量结果。

图9：2008年在匈牙利位置Villany(a)、Dalmand(b)和(c)上来自4处信息素陷阱的抓获WCR甲虫的平均数。

图10：群体H06107(a)和H06103(b)关于WCR抗性的单一系分布。用0-3的新Iowa量表评估根损害。呈现了位置Dalmand和Villany的均值。

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Claims

1.用于鉴定对西方玉米根虫和欧洲玉米螟虫都有抗性的玉蜀黍近交植物的方法，其中所述近交植物不表达自苏云金芽孢杆菌衍生的杀昆虫性蛋白质，包括下列步骤：a)在自玉蜀黍近交植物分离的遗传材料中检测至少一种位于选自下组的位置上的单核苷酸多态性：染色体5上的197cM_IBM_map；染色体2上的221cM_IBM_map；染色体1上的1008cM_IBM_map；染色体1上的1015cM_IBM_map；染色体1上的659cM_IBM_map；染色体1上的327cM_IBM_map；染色体2上的383cM_IBM_map；染色体3上的192cM_IBM_map；染色体3上的511cM_IBM_map；染色体8上的105cM_IBM_map；染色体4上的251cM_IBM_map；染色体5上的664cM_IBM_map；染色体7上的258cM_IBM_map；染色体5上的250cM_IBM_map；染色体6上的374cM_IBM_map；染色体6上的302cM_IBM_map；染色体6上的277cM_IBM_map；染色体8上的269cM_IBM_map；染色体7上的86cM_IBM_map；染色体8上的241cM_IBM_map；染色体8上的389cM_IBM_map；染色体8上的461cM_IBM_map；染色体9上的238cM_IBM_map；染色体9上的230cM_IBM_map和染色体2上的314cM_IBM_map，b)鉴定具有至少一种单核苷酸多态性的近交植物。

2.依照权利要求1所述的方法，其中所述抗性是通过使用1-9倒伏评定量表确定的，其中量表得分1代表100％抗性，且量表得分9代表0％抗性，所述近交植物的抗性至少是50％、55％、或60％。

3.依照权利要求1所述的方法，其中所述对西方玉米根虫的抗性是通过使用0-3Iowa根得分量表确定的。

4.依照权利要求2所述的方法，其中所述对西方玉米根虫的抗性是通过使用0-3Iowa根得分量表确定的。

5.依照权利要求3所述的方法，其中所述Iowa根得分在0.2和1.2之间。

6.依照权利要求4所述的方法，其中所述Iowa根得分在0.2和1.2之间。

7.依照权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述对西方玉米根虫的抗性是通过至少一种分子标记确定的。

8.依照权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述近交植物不表达其他自细菌衍生的杀昆虫性蛋白质。

9.依照权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述近交植物不表达转基因杀昆虫性蛋白质。

10.依照权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述近交植物不表达转基因灭害性蛋白质。

11.依照权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述近交植物与参照玉蜀黍植物R1437相比对西方玉米根虫的易感性低至少两倍。

12.依照权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述近交植物与参照玉蜀黍植物R6080相比对欧洲玉米螟虫的易感性低至少两倍。

13.依照权利要求11所述的方法，其中所述易感性是通过根上的幼虫数目确定的。

14.权利要求12所述的方法，其中所述易感性是通过根上的幼虫数目确定的。

15.依照权利要求13所述的方法，其中所述近交植物对秋季粘虫和/或小地老虎有抗性。

16.权利要求14所述的方法，其中所述近交植物对秋季粘虫和/或小地老虎有抗性。

17.依照权利要求13所述的方法，所述近交植物的种子以编号41472、41473或41474保藏于NCIMB。

18.权利要求14所述的方法，所述近交植物的种子以编号41472、41473或41474保藏于NCIMB。

19.依照权利要求13所述的方法，其中检测至少两种单核苷酸多态性，包括位于位置染色体5上197cM_IBM_map和染色体2上383cM_IBM_map上的单核苷酸多态性。

20.权利要求14所述的方法，其中检测至少两种单核苷酸多态性，包括位于位置染色体5上197cM_IBM_map和染色体2上383cM_IBM_map上的单核苷酸多态性。

21.依照权利要求13所述的方法，其进一步包括确认具有至少一种单核苷酸多态性的近交植物对西方玉米根虫的抗性的步骤，其中所述确认通过选自下组的方法来进行，即根据1-9倒伏评定量表来测定倒伏，通过使用0-3Iowa量表来测定根损害或测定幼虫回收。

22.依照权利要求14所述的方法，其进一步包括确认具有至少一种单核苷酸多态性的近交植物对西方玉米根虫的抗性的步骤，其中所述确认通过选自下组的方法来进行，即根据1-9倒伏评定量表来测定倒伏，通过使用0-3Iowa量表来测定根损害或测定幼虫回收。