BR112020011364A2 - plantas brassica oleracea com inflorescências ou cabeças resistentes a míldio - Google Patents

Abstract

A presente invenção invenção refere-se a plantas Brassica oleracea plantas que têm inflorescências ou cabeças que exibem maior resistência a míldio. Tais plantas podem compreender regiões genômicas introgredidas inovadoras associadas a resistência a doenças da Brassica oleracea MYCOCLP. Em determinados aspectos, são fornecidas composições, que incluem marcadores polimórficos inovadores, e métodos para produzir, melhorar, identificar e selecionar plantas ou germoplasma com um fenótipo resistente a doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTAS

BRASSICA OLERACEA COM INFLORESCÊNCIAS OU CABEÇAS RESISTENTES A MÍLDIO". REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório nº U.S 62/596.601, depositado em 8 de dezembro de 2017, cuja descrição é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se ao campo de agricultura e, mais especificamente, a métodos e composições para produzir plantas Brassica oleracea com inflorescências ou cabeças que exibam resis- tência aprimorada a míldio.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0003] A listagem de sequências contida no arquivo nomeado "SEMBO31WO ST25.txt", que tem 5,4 quilobytes, conforme medido no sistema operacional Microsoft Windows e foi criado em 6 de dezembro de 2018, é depositada eletronicamente com o presente documento e incorporada no mesmo a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A resistência a doenças é um traço importante na agricultu- ra. É particularmente importante para as variedades usadas na produ- ção de culturas de alimento. Além de identificar um alelo de resistência a doenças, marcadores específicos ligados ao alelo de resistência faci- litam a introdução do alelo nas linhagens cultivadas. A seleção auxilia- da por marcador (MAS) nos métodos de melhoria de planta possibilitou selecionar plantas com base em marcadores genéticos ligados aos traços de interesse, neste caso, resistência a doenças. No entanto, a identificação dos marcadores para acompanhar e/ou introduzir traços desejáveis em plantas exige esforço significativo e, deste modo, os marcadores estão, muitas vezes, indisponíveis mesmo se o gene as-

sociado ao traço tiver sido caracterizado. A dificuldade na identificação de marcadores também é complicada por fatores, tais como herança poligênica ou quantitativa, epistasia e um entendimento muitas vezes incompleto dos fundos genéticos subjacentes à expressão de um fenó- tipo desejado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção fornece uma planta Brassica oleracea de uma variedade cultivada, sendo que a planta compreende um pri- meiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cromos- somo 3, em que o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo intro- gredido conferem a uma inflorescência ou cabeça da planta maior re- sistência a míldio em comparação a uma planta que não compreende o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido. Em de- terminadas modalidades, a planta compreende um primeiro alelo intro- gredido e um segundo alelo introgredido no cromossomo 3, em que o primeiro alelo introgredido e o segundo alelo introgredido conferem a uma inflorescência ou cabeça da planta maior resistência a míldio em comparação a uma planta que não compreende os alelos. Em algumas modalidades, uma amostra da semente que compreende o primeiro alelo introgredido e o segundo alelo introgredido foi depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-124338. Em outras modalidades, o primeiro alelo introgredido é flanqueado no genoma da planta por um locus marcador M19 (SEQ ID NO:2) e o locus marcador M20 (SEQ ID NO:3) no cromossomo 3. Ainda em outras modalidades, o segundo alelo introgredido é flanqueado no genoma da planta por um locus marcador M31 (SEQ ID NO:4) e o locus marcador M44 (SEQ ID NO:16) no cromossomo 3. Em modalidades adicionais, a planta Bras- sica oleracea é um brócolis, couve-flor, couve-brócolis, couve-de- bruxelas, repolho branco, repolho roxo, repolho de couve-lombarda, repolho de couve-frisada, repolho de couve-rábano ou planta de repo-

lho português. Em modalidades particulares, a planta é homozigota para o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido.

[0006] A presente invenção fornece uma planta Brassica oleracea de uma variedade cultivada, sendo que a planta compreende um pri- meiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cromos- somo 3, em que o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo intro- gredido conferem a uma inflorescência ou cabeça da planta maior re- sistência a míldio em comparação a uma planta que não compreende o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido. Em de- terminadas modalidades, a semente produz uma planta Brassica ole- racea de uma variedade cultivada, sendo que a planta compreende um primeiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cro- mossomo 3, em que o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido confere a uma inflorescência ou cabeça da planta maior resistência a míldio em comparação a uma planta que não compreen- de o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido.

[0007] produza presente invenção produz adicionalmente uma par- te de planta de uma planta Brassica oleracea de uma variedade culti- vada, sendo que a planta compreende um primeiro alelo introgredido e um segundo alelo introgredido no cromossomo 3, em que o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido confere a uma inflo- rescência ou cabeça da planta maior resistência a míldio em compara- ção a uma planta que não compreende o primeiro alelo introgredido e o segundo alelo introgredido. Em determinadas modalidades, a parte de planta é de uma planta Brassica oleracea de uma variedade culti- vada, sendo que a planta compreende um primeiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cromossomo 3, em que o primei- ro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido confere a uma inflorescência ou cabeça da planta maior resistência a míldio em com- paração a uma planta que não compreende o primeiro alelo introgredi-

do ou o segundo alelo introgredido. Em modalidades particulares, a parte de planta é uma célula, uma semente, uma raiz, um caule, uma folha, um fruto, uma flor, uma inflorescência, uma cabeça ou pólen.

[0008] A presente invenção fornece adicionalmente um fragmento de introgressão que compreende um primeiro segmento cromossômico no cromossomo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP flanqueado pelo marcador M19 (SEQ ID NO:2) e pelo marcador M20 (SEQ ID NO:3) e um segundo segmento cromossômico no cromossomo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP flanqueado pelo marcador M31 (SEQ ID NO:4) e marcador M44 (SEQ ID NO:16). Em determinadas modalidades, o fra- gmento confere maior resistência a míldio. Em outras modalidades, uma amostra da semente que compreende o primeiro segmento cro- mossômico e o segundo segmento cromossômico foi depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-124338.

[0009] A presente invenção também fornece um método para pro- duzir uma variedade cultivada de uma planta Brassica oleracea com uma inflorescência ou cabeça que tem resistência aprimorada a míldio que compreende introgredir na variedade de plantas um primeiro seg- mento cromossômico ou um segundo segmento cromossômico do cromossomo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP que confere resistên- cia aprimorada ao míldio em relação a uma planta que carece a intro- gressão. Em determinadas modalidades, a introgressão compreende cruzar uma planta que compreende o primeiro ou o segundo segmento cromossômico consigo mesmo ou com uma segunda planta Brassica oleracea de um genótipo diferente para produzir uma ou mais plantas progenitoras e selecionar uma planta progenitora que compreende o segmento cromossômico. Em outras modalidades, a seleção de uma planta progenitora compreende detectar pelo menos um primeiro alelo flanqueado pelo marcador M19 (SEQ ID NO:2) e pelo marcador M20 (SEQ ID NO:3) ou um segundo alelo flanqueado pelo marcador M31

(SEQ ID NO:4) e pelo marcador M44 (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, a variedade de plantas é uma variedade de brócolis, couve-flor, couve-brócolis, couve-de-bruxelas, repolho branco, repolho roxo, repolho de couve-lombarda, repolho de couve-frisada, repolho de couve-rábano ou planta de repolho português. Em modalidades adici- onais, a planta progenitora é uma planta progenitora F2, F3, F4, F5 ou F6. Em modalidades particulares, o cruzamento compreende retrocru- zamento. Ainda em outras modalidades, o retrocruzamento compreen- de de 2 a 7 gerações de retrocruzamentos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 gerações de retrocruzamentos. Em modalidades adicionais, o cruzamento compreende seleção auxiliada por marcador. Ainda em modalidades adicionais, uma amostra de semente que compreende o primeiro e o segundo segmentos cromossômicos foi depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-124338.

[0010] A presente invenção fornece adicionalmente uma planta Brassica oleracea produzida por um método para produzir uma varie- dade cultivada de uma planta Brassica oleracea com a inflorescência ou cabeça que tem resistência aprimorada a míldio que compreende introgredir na variedade de plantas um primeiro segmento cromossô- mico ou um segundo segmento cromossômico no cromossomo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP que confere resistência aprimorada ao míldio em relação a uma planta que carece a introgressão. Além disto, a presente invenção fornece um método para produzir alimento ou ra- ção que compreende obter uma planta Brassica oleracea de uma vari- edade cultivada, sendo que a planta compreende um primeiro alelo introgressado ou um segundo alelo introgressado no cromossomo 3, em que o primeiro alelo introgressado ou o segundo alelo introgressa- do confere a uma inflorescência ou cabeça da planta maior resistência ao míldio em comparação com uma planta que não compreende o primeiro alelo introgressado ou o segundo alelo introgressado, ou uma planta Brassica oleracea produzida por um método para produzir uma variedade cultivada de uma planta de Brassica oleracea com uma in- florescência ou cabeça com resistência aprimorada a míldio que com- preende introgredir na variedade de plantas um primeiro segmento cromossômico ou um segundo segmento cromossômico do cromos- somo 3 de Brassica oleracea MYCOCLP que confere resistência apri- morada ao míldio em relação a uma planta sem a introgressão, ou uma parte da mesma, e produzir o alimento ou a ração a partir da plan- ta ou parte da mesma.

[0011] Além disto, a presente invenção também fornece um méto- do para selecionar uma planta Brassica oleracea que exibe resistência a míldio que compreende cruzar uma planta Brassica oleracea de uma variedade cultivada, sendo que a planta compreende um primeiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cromossomo 3, em que o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido con- fere a uma inflorescência ou cabeça resistência aumentada a míldio em comparação a uma planta que não compreende o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido, consigo mesma ou com uma segunda planta Brassica oleracea de um genótipo diferente para produzir uma ou mais plantas progenitoras, e selecionar uma planta progenitora que compreende o primeiro ou o segundo alelo introgredi- do. Em determinadas modalidades, a seleção da dita planta progenito- ra compreende identificar um marcador genético ligado geneticamente ao primeiro ou ao segundo alelo introgredido. Em outras modalidades, a seleção da planta progenitora compreende identificar um marcador genético dentro de uma região genômica, ou ligado geneticamente à mesma, entre o locus marcador M19 (SEQ ID NO:2) e o locus marca- dor M20 (SEQ ID NO:3) no cromossomo 3 ou identificar um marcador genético dentro de uma região genômica, ou ligado geneticamente à mesma, entre o locus marcador M31 (SEQ ID NO:4) e o locus marca-

dor M44 (SEQ ID NO:16) no cromossomo 3. Em modalidades adicio- nais, a seleção de uma planta progenitora compreende adicionalmente detectar pelo menos um polimorfismo num locus selecionado a partir do grupo que consiste no locus marcador M33 (SEQ ID NO:5), no lo- cus marcador M34 (SEQ ID NO:6), locus marcador M35 (SEQ ID NO:7), locus marcador M36 (SEQ ID NO:8), locus marcador M37 (SEQ ID NO:9), locus marcador M38 (SEQ ID NO:10), locus marcador M39 (SEQ ID NO:11), locus marcador M40 (SEQ ID NO:12), locus marca- dor M41 (SEQ ID NO:13), locus marcador M42 (SEQ ID NO:14) e no locus marcador M43 (SEQ ID NO:15). Em algumas modalidades adici- onais, a planta progenitora é uma planta progenitora F2, F3, F4, F5 ou F6. Em modalidades adicionais, a produção da planta progenitora compreende retrocruzamento. Em determinadas modalidades, o retro- cruzamento compreende de 2 a 7 gerações do retrocruzamento, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 gerações de retrocruzamento.

[0012] A presente invenção também fornece uma planta Brassica oleracea obtenível pelo método de cruzar uma planta Brassica olera- cea de uma variedade cultivada, sendo que a planta compreende um primeiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cro- mossomo 3, em que o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido confere a uma inflorescência ou cabeça da planta maior resistência a míldio em comparação a uma planta que não compreen- de o primeiro alelo introgredido ou o segundo alelo introgredido, consi- go mesma ou com uma segunda planta Brassica oleracea de um ge- nótipo diferente para produzir uma ou mais plantas progenitoras, e se- lecionar uma planta progenitora que compreende o primeiro ou segun- do alelo introgredido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Figura 1: Resultados de mapeamento QTL para resistência a míldio em inflorescências. Dois QTL são identificados no cromosso-

mo 3 que, juntos, explicam 48,1% da variação fenotípica.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0014] O míldio (DM) é causado por um patógeno fúngico do tipo oomiceto (Hyaloperonospora brassicae, também conhecido como Pe- ronospora parasitica, também conhecido como Hyaloperonospora pa- rasitica). DM é uma doença que é encontrada pelo mundo em muitas espécies de brassica (Brassica oleracea) incluindo, porém sem limita- ção, brócolis, couve-flor, repolho, mostarda, rabanetes e nabo. O DM é mais prevalecente em regiões e estações do ano com clima frio e úmi- do, alta umidade e altos níveis de formação de orvalho. O DM pode infectar as plantas em qualquer estágio de crescimento, porém é iden- tificado mais frequentemente no estágio de plântula e em plantas ma- duras. A infecção pode ocorrer no estágio de cotiledônea, na produção de muda, estágio adulto ou maduro da planta e nas inflorescências de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis) e brócolis (Brassica olera- cea var. ltalica). Embora fungicidas possam ser usados para controlar as infecções por míldio, é preferencial ter variedades com resistência para limitar os danos do DM em cada estágio de planta. Em particular, resistência de inflorescência é desejável, visto que a aplicação de fun- gicidas próximo ao estágio de colheita é limitado devido a regulações.

[0015] Embora determinadas fontes de resistência a míldio em couve-flor tenham sido descritas na literatura, estas fontes foram ge- ralmente testadas apenas quanto à resistência de cotiledônea e não para resistência de planta adulta ou inflorescência. Não há correlação entre a resistência nos diferentes estágios do desenvolvimento de planta, e a resistência num estágio não pode prever a resistência nos outros estágios. Em particular, a resistência no estágio de cotiledônea e/ou resistência no estágio adulto da planta não pode prever a resis- tência na inflorescência. Como resultado, não é possível selecionar uma fonte para a resistência de inflorescência com base em testes fo-

liares nem no estágio de cotiledônea tampouco no estágio adulto da planta. Embora tenham sido identificadas diversas fontes que sugerem resistência no estágio adulto e de cotiledônea da planta, não se sabe se estas mesmas fontes resultaram em inflorescências resistentes. Ademais, embora tenham sido identificados determinados genes de resistência a míldio, a posição genética e os marcadores moleculares para estes genes não foram identificados ou descritos.

[0016] Os experimentos para testar a resistência em inflorescên- cias de couve-flor precisam de longos períodos de tempo e incorrem em custos significativos. O teste exige que as plantas estejam comple- tamente desenvolvidas no campo e que as plantas sejam mantidas além do período normal de colheita para couve-flor. O teste pode to- mar quase um ano para ser conduzido. Além disto, a pressão de míldio varia muitas vezes entre e dentro das estações do ano. Portanto, a fim de obter resultados significativos e confiáveis, diversos testes experi- mentais precisam ser plantados em diferentes períodos de tempo. Es- tes tipos de testes experimentais são muito trabalhosos e precisam de acesso a grandes campos.

[0017] Quando uma fonte é identificada, uma melhoria auxiliada por marcador aprimora e aumenta a introgressão bem-sucedida do traço, e a melhoria de couve-flor com inflorescências resistentes a míil- dio. Um marcador ligado a traço é primariamente útil quando a genéti- ca de um traço é relativamente simples, e o traço é controlado por um número pequeno de loci, de preferência, um ou dois.

[0018] A presente invenção representa um avanço significativo pe- lo fato de que fornece dois QTLs de resistência que fornecem maior resistência a míldio em inflorescências. Além disto, são fornecidos marcadores ligados a traço que podem ser usados para introgredir o traço e na melhoria de couve-flor com míldio inflorescências resisten- tes. Os QTLs podem ser introgredidos em linhagens de elite de cultu-

ras cultivadas de Brassica oleracea. Estas culturas podem incluir, po- rém sem limitação, variedades cultivadas de brócolis, couve-flor, cou- ve-brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, repolho roxo, repolho de cou- ve-lombarda, repolho de couve-frisada, repolho de couve-rábano e re- polho português. |. Plantas Brassica oleracea

[0019] Brassica é um gênero de planta da família de brassicaceae (denominado anteriormente de cruciferae). Os membros deste gênero são conhecidos como repolho ou mostarda. O gênero Brassica com- preende um número de espécies importantes no comércio e na agricul- tura. Dentre todas estas espécies, a Brassica oleracea é a mais diver- sa que contém pelo menos dez variedades comerciais diferentes culti- vadas, incluindo brócolis, couve-flor, couve-brócolis, couve-de- bruxelas, repolho, repolho roxo, repolho de couve-lombarda, repolho de couve-frisada, repolho de couve-rábano e repolho português. A me- lhoria entre estes tipos é comum e facilmente feita devido ao fato de que estes tipos, embora altamente diversos quanto a fenótipo, são da mesma espécie, o que significa que um cruzamento entre os diferentes tipos pode ser produzido sem ter de superar qualquer barreia de espé- cies genéticas. No entanto, um arraste gênico (linkage drag) significati- va ainda pode ocorrer para cruzamentos entre cultivares, especialmen- te durante o cruzamento entre cultivares (geneticamente) distantes (por exemplo, um cruzamento entre repolho e brócolis ou couve-flor). Deste modo, embora a ausência de uma barreira de espécie permita que cruzamentos sejam feitos entre todos os cultivares, é provável que o arraste gênico seja associado a tal cruzamento. Il. REGIÕES GENÔMICAS, ALELOS E POLIMORFISMOS ASSOCI- ADOS À RESISTÊNCIA A MÍLDIO EM PLANTAS BRASSICA OLE-

RACEA

[0020] Os dois QTLs de resistência a míldio da presente invenção foram identificados no cromossomo 3. Cada QTL fornece resistência a míldio, e quando combinados, a resistência é aditiva.

Os fragmentos de introgressão recombinantes foram identificados com o uso de me- lhoria auxiliada por técnicas de marcador e os fragmentos de intro- gressão gerados tiveram tamanhos de cerca de 11 centiMorgans (cM) e 15 cM.

O mapeamento destes segmentos cromossômicos constatou que o primeiro QTL para resistência ao míldio é flanqueado pelos mar- cadores M19 (uma alteração no SNP [G/A] a 15.890.285 bp; SEQ ID NO:2) e M20 (uma mudança de SNP [T/C] a 10.184.762 bp; SEQ ID NO:3), e o segundo QTL é flanqueado pelos marcadores M31 (uma mudança de SNP [T/A] a 3.226.172 bp; SEQ ID NO:4) e M44 (uma mudança de SNP [C/T] a 1.221.810 bp; SEQ ID NO:16). Marcadores intersticiais, como M33, uma mudança de SNP [G/A] a 3.178.026 bp (SEQ ID NO:5), M34, uma mudança de SNP [T/C] a 2.874.663 bp (SEQ ID NO:6), M35, uma mudança de SNP [A/G] a 2.354.342 bp (SEQ ID NO:7), M36, uma mudança de SNP [C/T] a 2.168.486 bp (SEQ ID NO:8), M37, uma mudança de SNP [A/C] a 2.212.440 bp (SEQ ID NO:9), M38, uma mudança de SNP [C/A] a 1.973.175 bp (SEQ ID NO:10), M39, uma mudança de SNP [T1/G] a 1.391.141 bp (SEQ ID NO:11), M40, uma mudança de SNP [A/G] a 1.932.167 bp (SEQ ID NO:12), M41, uma mudança de SNP [A/G] a 2.091.771 bp (SEQ ID NO:13), M42, uma mudança de SNP [A/G] a 1.220.020 bp (SEQ ID NO:14) e M43, uma mudança de SNP [A/G] a 1.219.392 bp (SEQ ID NO:15), podem ser usados além dos marcadores de flanque- amento para seleção para o segundo QTL de resistência no cromos- somo 3. Em determinadas modalidades, um dentre ou ambos os mar- cadores de flanqueamento para o segundo QTL de resistência são marcadores intersticiais entre M31 e M44, tais como M33, M34, M35, M36, M37, M38, M39, M40, M41, M42 ou M43. As posições públicas do genoma se baseiam na versão 2.1 do genoma da Brassica olera-

cea(plantas.ensembl.org/Brassica oleracea/Info/index).

[0021] Uma pessoa versada na técnica entenderá que os valores de intervalo podem variar com base em fatores, tais como o mapa de referência o mapa de referência que é usado, a cobertura de sequen- ciamento e os ajustes de software em conjunto. No entanto, tais parâà- metros e protocolos de mapeamento são conhecidos na técnica e uma pessoa de habilidade comum na técnica pode usar as sequências de marcador fornecidas no presente documento para ancorar física e ge- neticamente as introgressões descritas no presente documento a qualquer mapa determinado com o uso de tal metodologia. As intro- gressões inovadoras da presente invenção conferem propriedades agronômicas exclusivas significativamente aprimoradas em relação às introgressões de resistência a míldio divulgadas anteriormente.

[0022] Deste modo, em determinadas modalidades, a presente invenção fornece plantas Brassica oleracea que compreendem um in- tervalo genômico introgredido flanqueado por marcadores M19 e M20 ou marcadores M31 e M44. Em outras modalidades, a presente inven- ção fornece plantas Brassica oleracea que compreende um intervalo genômico introgredido flanqueado por marcadores M31 e M43, M31 e M42, M31 e M41, M31 e M40, M31 e M39, M31 e M38, M31 e M37, M31 e M36, M31 e M35, M31 e M34, M31 e M33, M33 e M44, M34 e M44, M35 e M44, M36 e M44, M37 e M44, M38 e M44, M39 e M44, M40 e M44, M41 e M44, M42 e M44, M43 e M44, M31 e M44, M33 e M43, M34 e M42, M35 e M41, M36 e M40 ou M37 e M39. Em modali- dades adicionais, a presente invenção fornece métodos para produzir plantas Brassica oleracea selecionando-se com qualquer um dos mar- cadores acima. Ill. INTROGRESSÃO DE REGIÕES GENÔMICAS ASSOCIADAS À

RESISTÊNCIA A DOENÇAS

[0023] A introgressão auxiliada por marcador envolve a transfe-

rência de uma região cromossômica definida por um ou mais marcado- res de um primeiro fundo genético para um segundo fundo genético. À prole de um cruzamento que contém a região genômica introgredida pode ser identificada pela combinação de marcadores característicos da região genômica introgredida desejada de um primeiro fundo gené- tico e tanto de marcadores ligados quanto de marcadores não ligados característicos do segundo fundo genético.

[0024] A presente invenção fornece marcadores inovadores para identificar e acompanhar a introgressão de uma ou mais dentre as re- giões genômicas da Brassica oleracea MYCOCLP (ATCC nº de Aces- so PTA 124338), divulgado no presente documento em linhas cultiva- das de Brassica oleracea. A invenção fornece adicionalmente marca- dores para identificar e acompanhar as introgressões inovadoras di- vulgadas no presente documento durante melhoria de planta.

[0025] Os marcadores dentro ou ligados a qualquer um dos inter- valos genômicos da presente invenção podem ser usados em vários esforços de melhoria que incluem introgressão de regiões genômicas associadas à resistência a doenças num fundo genético desejado. Por exemplo, um marcador dentro de 20 cM, 15 cM, 10 cM, 5 cM, 2 cM ou 1 cM de um marcador associado a resistência a doenças descritas no presente documento pode ser usado para introgressão auxiliada por marcador de regiões genômicas associadas a um fenótipo tolerante a doenças.

[0026] Plantas Brassica oleracea que compreendem uma ou mais regiões introgredidas associadas a um fenótipo desejado em que pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90% ou 99% das sequências genômicas restantes portam marcadores característicos do germoplasma também são fornecidas. São fornecidas, também, plantas Brassica oleracea que compreendem uma região introgredida que compreendem regiões ligadas próximas ou adjacentes às regiões genômicas e aos marcado-

res fornecidos no presente documento e associados a fenótipo resis- tente a doenças de míldio. IV. DESENVOLVIMENTO DE VARIEDADES DE BRASSICA OLE-

RACEA RESISTENTES A DOENÇAS

[0027] Para a maior parte dos objetivos de melhoria, melhoristas comerciais trabalham no germoplasma que é de uma "variedade culti- vada" ou "elite". Este germoplasma é mais fácil de submeter à melho- ria devido ao fato de que tem bom desempenho quando avaliado em relação ao desempenho em horticultura. Inúmeras variedades de cultu- ra Brassica oleracea cultivadas (cultivares) foram desenvolvidas, inclu- indo, porém sem limitação, brócolis, couve-flor, couve-brócolis, couve- de-bruxelas, repolho, repolho roxo, repolho de couve-lombarda, repo- lho de couve-frisada, repolho de couve-rábano e repolho português. No entanto, a vantagem de desempenho que um germoplasma culti- vado ou de elite fornece pode ser desviada por uma falta de diversida- de de alelos. Os melhoristas geralmente aceitam esta troca devido ao fato de que o progresso durante o trabalho com material cultivado é mais rápido que o progresso durante a melhoria com fontes genetica- mente diversas.

[0028] O processo de introgredir genes com resistência desejável de linhagens não cultivadas em linhagens cultivadas de elite ao mes- mo tempo que evita problemas com arraste gênico ou baixa herdabili- dade é um processo longo e, muitas vezes, árduo. O sucesso na im- plantação de alelos derivados de parentes selvagens, portanto, depende fortemente de introgressões mínimas ou truncadas que não apresentam efeitos prejudiciais e ensaios confiáveis de marcadores que substituem as telas fenotípicas. Portanto, o sucesso no desenvolvimento de alelos derivados de parentes selvagens depende fortemente de introgressões mínimas ou truncadas que não têm efeito prejudiciais e testes confiá- veis de marcador que substituam as triagens fenotípicas. Ademais, o processo de introgredir regiões genômicas das linhagens não cultiva- das pode ser facilitado consideravelmente pela disponibilidade de mar- cadores informativos.

[0029] Um especialista na técnica entenderia, portanto, que os ale- los, polimorfismos e marcadores fornecidos pela invenção permitem o rastreamento e a introdução de qualquer uma das regiões genômicas identificadas no presente documento em qualquer contexto genético para o qual uma espécie de Brassica oleracea possa ser cruzada. Além disto, as regiões genômicas associadas à resistência a doenças divulgadas neste documento podem ser introgressadas de um genóti- po para outro e rastreadas fenotipicamente ou geneticamente. Deste modo, o desenvolvimento da Requerente de marcadores para a sele- ção da resistência a doenças facilita o desenvolvimento de plantas Brassica oleracea que têm fenótipos benéficos. Por exemplo, plantas e sementes podem ser genotipadas usando os marcadores da presente invenção, a fim de desenvolver variedades compreendendo a resistên- cia desejada à doença. Ademais, a seleção auxiliada por marcador (MAS) permite a identificação de plantas que são homozigotas ou he- terozigotas em relação à introgressão desejada.

[0030] A recombinação meiótica é essencial para o melhoramento de plantas, pois permite a transferência de alelos favoráveis entre ori- gens genéticas, a remoção de fragmentos genômicos deletérios e ca- racterísticas de pirâmide que estão geneticamente ligadas. Na ausên- cia de marcadores precisos, a recombinação limitada força os melho- ristas a ampliar populações em segregação para triagens de progênie. Ademais, a avaliação fenotípica é demorada, dispendiosa em termos de recurso e não pode ser reproduzida em qualquer ambiente, particu- larmente para traços como resistência a doenças. Os marcadores for- necidos pela invenção oferecem uma alternativa eficaz e, portanto, re- presentam um avanço significativo na técnica.

[0031] Muitos traços desejáveis que são introduzidos com êxito através da introgressão também podem ser introduzidos diretamente numa planta pelo uso de técnicas moleculares. Um aspecto da inven- ção inclui plantas com um genoma que foi mudado por qualquer méto- do com o uso de técnicas de modificação de genoma sítio-específica. As técnicas de modificação genoma sítio-específica incluem o uso de enzimas, tais como, endonucleases, recombinases, transposases, heli- cases e qualquer combinação das mesmas. Num aspecto, uma endo- nuclease é selecionada a partir de uma meganuclease, uma nuclease de dedos de zinco (ZFN), uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma Argonaute e uma nuclease guiada por RNA, tal como uma nuclease associada a CRISPR.

[0032] Em outro aspecto, a endonuclease é uma proteína de fusão de dCas9-recombinase. Conforme usado no presente documento, uma "dCas9" se refere a uma proteína Cas9 endonuclease com uma ou mais mutações de aminoácido que resultam numa proteína Cas9 sem atividade de endonuclease, porém retendo ligação de DNA sítio-espe- cífica guiada por RNA. Conforme usado no presente documento, uma "proteína de fusão de dCas9-recombinase" é uma dCas9 com uma proteína fundida à dCas9, de tal maneira que a recombinase esteja cataliticamente ativa no DNA.

[0033] Os exemplos não limitativos de recombinase incluem uma tirosina fixada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecido no presente documento que é selecionada a partir do grupo que consiste numa Cre recombinase, uma Gin recombinase, uma Flp recombinase e uma Tnp1i recombinase. Num aspecto, uma Cre recombinase ou uma Gin recombinase fornecida no presente documento é amarrada a um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco ou um domínio de ligação de DNA de TALE ou uma Cas9 nuclease. Em outro aspecto, uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de

DNA fornecida no presente documento é selecionada a partir do grupo que consiste numa PhiC31 integrase, uma R4 integrase e uma TP-901 integrase. Em outro aspecto, uma DNA transposase fixada a um domí- nio de ligação ao DNA fornecida no presente documento é selecionada a partir do grupo que consiste num TALE-piggyBac e TALE-Mutator.

[0034] As enzimas de modificação genoma sítio-específicas indu- zem uma modificação de genoma, tal como uma ruptura de DNA de dupla fita (DSB) ou ruptura de DNA de fita única no sítio-alvo de uma sequência genômica que é, em seguida, reparado pelos processos naturais da recombinação homóloga (HR) ou união de extremidade não homóloga (NHEJ). Modificações de sequência ocorrem nos locais clivados, que podem incluir deleções ou inserções que resultam em rompimento de genes no caso de NHEJ ou integração de sequências exógenas por recombinação homóloga.

[0035] Outro aspecto da invenção inclui células de planta transgê- nica, tecidos de planta transgênicas, plantas transgênicas e sementes transgênicas que compreendem as moléculas de DNA recombinantes e proteínas modificadas fornecidas pela invenção. As plantas que compreendem as moléculas de DNA recombinantes e proteínas modi- ficadas ou plantas produzidas a partir das células, tecidos ou sementes têm inflorescências ou cabeças que exibem maior resistência a míldio. Os métodos adequados para transformação de células hospedeiras de planta para uso com a presente invenção incluem praticamente qual- quer método pelo qual o DNA pode ser introduzido numa célula (por exemplo, em que um construto de DNA recombinante é estavelmente integrado num cromossomo de planta) e são bem conhecidos na téc- nica. Um método exemplificativo e amplamente utilizado para introduzir um construto de DNA recombinante em plantas é o sistema de trans- formação Agrobacterium, que é bem conhecido pelas pessoas versa- das na técnica. Outro método exemplificativo para introduzir um cons-

truto de DNA recombinante em plantas é a inserção de um construto de DNA recombinante num genoma de planta num sítio predetermina- do por métodos de integração sítio direcionada. As plantas transgêni- cas podem ser regeneradas de uma célula vegetal transformada pelos métodos de cultura de células vegetais. Uma planta transgénica ho- mozigótica com respeito a um transgene (isto é, duas cópias alélicas do transgene) pode ser obtida por autopolinização ("selfing") de uma planta transgénica auto-polinizadora que contém um único transgene alelo com ela mesma, por exemplo, uma planta RO, para produzir se- mentes R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigoto com relação ao transgene. As plantas cultivadas da germinação da semen- te R1 podem ser testadas para zigosidade, com o uso de um ensaio de SNP, sequenciamento de DNA ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos, denomina- dos de ensaio de zigosidade.

V. TÉCNICAS DE MELHORIA MOLECULAR AUXILIADAS

[0036] Os marcadores genéticos que podem ser usados na prática da presente invenção incluem, porém sem limitação, polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs), polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs), repetições de se- quências simples (SSRs), polimorfismos de comprimento de sequência simples (SSLPs), polimorfismos de nucleotídeo único (SNP's), polimor- fismos de inserção/deleção (Indels), repetições em tandem de número variável (VNTRs) e DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD), iso- zimas e outros marcadores conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Os melhoristas vegetais usam marcadores moleculares para interrogar um genoma de cultura e classificar o material com base em diferenças genéticas e não fenotípicas. As tecnologias de marcado avançadas se baseiam em sequências de genoma, a ordem de nucle- otídeo de genótipos polimórficos distintos dentro de uma espécie. Tais plataformas possibilitam a seleção para traços horticulturas com mar- cadores ligados a alelos favoráveis, além da organização de germo- plasma com o uso de marcadores distribuídos aleatoriamente por todo o genoma. No passado, faltava conhecimento a priori do genoma para as principais culturas vegetais que agora foram sequenciadas. Os ci- entistas exploraram a homologia de sequência, em vez de polimorfis- mos conhecidos, para desenvolver plataformas de marcadores. Molé- culas de DNA produzidas pelo homem são usadas para iniciar a répli- ca de fragmentos de genoma quando hibridizados em par na presença de uma enzima DNA polimerase. Esta síntese é regulada por condi- ções de ciclagem térmica que controlam a hibridização e réplica de fitas de DNA na reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplifi- car fragmentos de DNA de um comprimento dependente da distância entre cada par inicial. Estes fragmentos são, então, detectados como marcadores e os exemplos comumente conhecidos incluem AFLP e RAPD. Uma terceira técnica, a RFLP, não inclui uma etapa de amplifi- cação de DNA. A tecnologia de polimorfismo de comprimento de frag- mento amplificado (AFLP) reduz a complexidade do genoma. Primei- ramente, através de enzimas digestivas que clivam o DNA de maneira específica em relação à sequência. Em seguida, os fragmentos são selecionados em relação ao seu tamanho e, por fim, replicado com o uso de oligonucleotídeos seletivos, cada um homólogo a um subcon- junto de fragmentos de genoma. Como resultado, a tecnologia de AFLP amplifica consistentemente fragmentos de DNA nos genótipos, experimentos e laboratórios.

[0037] Os polimorfismos que compreendem a pequena quantidade de uma única mudança de nucleotídeos podem ser testados de várias maneiras. Por exemplo, a detecção pode ser feita por técnicas de ele- troforese que inclui um polimorfismo conformacional de fita única (Ori- ta, et al., Genomics 8:271-278, 1989), eletroforese de gel gradiente de desnaturação (Myers, EP 0273085) ou polimorfismos de comprimento de fragmento de clivagem (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), porém a disponibilidade ampla de sequenciamento de DNA muitas ve- zes facilita o simples sequenciamento direto de produtos amplificados. Quando a diferença de sequência polimórfica é conhecida, testes rápi- dos podem ser projetados para teste de progenitor, envolvendo tipica- mente alguma versão de amplificação de PCR de alelos específicos (PASA; Sommer, et al., Biotechniques 12:82 a 87, 1992) ou amplifica- ção de PCR de múltiplos alelos específicos (PAMSA; Dutton e Som- mer, Biotechniques 11:700-702, 1991).

[0038] Os marcadores polimórficos servem como ferramentas úteis para testar plantas para determinar o grau de identidade das |i- nhagens ou variedades (Patente nº U.S. 6.207.367). Estes marcadores formam a base para determinar associações com fenótipos e podem ser usados para acionar o ganho genético. Em determinadas modali- dades de métodos da invenção, ácidos nucleicos polimórficos podem ser usados para detecção numa planta Brassica oleracea um genótipo associado a resistência a doenças, identificar uma planta Brassica ole- racea com um genótipo associado à resistência a doenças e selecio- nar uma planta Brassica oleracea com um genótipo associado à resis- tência a doenças. Em determinadas modalidades dos métodos da in- venção, os ácidos nucleicos polimórficos podem ser usados para pro- duzir uma planta Brassica oleracea que compreende em seu genoma um locus introgredido associado à resistência a doenças. Em determi- nadas modalidades da invenção, os ácidos nucleicos polimórficos po- dem ser usados para melhorar plantas Brassica oleracea progenitoras que compreendem um locus associado à resistência a doenças.

[0039] Os marcadores genéticos podem incluir marcadores "domi- nantes" ou "codominantes". Os marcadores “codominantes” revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por diploide individual). Marca-

dores "dominantes" revelam a presença de apenas um único alelo. Os marcadores são herdados, de preferência, de maneira codominante de modo que a presença de ambos os alelos num locus diploide ou múlti- plos alelos em loci triploide ou tetraploide sejam prontamente detectá- veis e estejam livres de variação ambiental, isto é, sua herdabilidade é

1. Um marcador genótipo compreende tipicamente dois alelos marca- dores em cada locus num organismo diploide. A composição alélica do marcador de cada locus pode ser ou homozigota ou heterozigota. À homozigosidade é uma afecção em que ambos os alelos num locus são caracterizados pela mesma sequência de nucleotídeos. A hetero- zigosidade se refere a diferentes condições do alelo num locus.

[0040] A análise com base em ácido nucleico para determinar a presença ou ausência do polimorfismo genético (isto é., para genoti- pagem) pode ser usada em programas de melhoria para identificação, seleção, introgressão e semelhantes. Uma ampla variedade de marca- dores genéticos para a análise de polimorfismos genéticos está dispo- nível e é conhecida por aqueles versados na técnica. A análise pode ser usada para selecionar genes, porções de genes, QTL, alelos ou regiões genômicas que compreendem ou são ligados a um marcador genético que está ligado ou associado à resistência a doenças em plantas Brassica oleracea.

[0041] Conforme usado no presente documento, métodos de aná- lise de ácido nucleico incluem, porém sem limitação, métodos de de- tecção com base em PCR (por exemplo, testes TaqMan), métodos de microarranjo, métodos com base em espectrometria de massa e/ou métodos de sequenciamento de ácido nucleico, incluindo sequencia- mento de genoma inteiro. Em determinadas modalidades, a detecção de sítios polimórficos numa amostra de DNA, RNA ou cDNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácido nuclei- co. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de poli-

nucleotídeos que expandem o sítio polimórfico ou incluem aqueles sítio e sequências localizados ou distas ou próximos ao mesmo. Tais molé- culas amplificadas podem ser prontamente detectadas por eletroforese de gel, métodos de detecção de fluorescência ou outros meios.

[0042] Um método para alcançar esta amplificação emprega a re- ação em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, 1986; Patente Europeia 50.424; Paten- te Europeia 84.796; Patente Europeia 258.017; Patente Europeia

237.362; Patente Europeia 201.184; Patente US 4.683.202; Patente US 4.582.788; e Patente US 4.683.194), utilizando pares de iniciado- res capazes de hibridar com as sequências proximais que definem um polimorfismo em sua forma de fita dupla. Métodos para digitar DNA com base em espectrometria de massa também podem ser usados. Tais métodos são revelados nas Patentes U.S. nº 6.613.509 e

6.503.710, e referências encontradas nas mesmas.

[0043] Polimorfismos em sequências de DNA podem ser detecta- dos ou tipados por uma variedade de métodos eficazes bem conheci- dos na técnica incluindo, sem limitação, aqueles divulgados nas Paten- tes U.S. nº 5.468.613. 5.217.863; 5.210.015; 5.876.930; 6.030.787;

6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; 5.945.283; 5.468.613;

6.090.558; 5.800.944; 5.616.464; 7.312.039; 7.238.476; 7.297.485;

7.282.355; 7.270.981 e 7.250.252 todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência em suas totalidades. No entanto, as composições e métodos da presente invenção podem ser usadas em combinação com qualquer método de tipagem de polimor- fismo para tipar os polimorfismos em amostras de DNA genômico. As amostras de DNA genômico incluem, porém sem limitação, DNA ge- nômico isolado diretamente de uma planta, DNA genômico clonado ou DNA genômico amplificado.

[0044] Por exemplo, os polimorfismos em sequências de DNA po-

dem ser detectados por hibridização para sondas de oligonucleotídeo alelo-específico (ASO), conforme divulgado nas Patentes nº U.S.

5.468.613 e 5.217.863. A Patente nº U.S. 5.468.613 divulga hibridiza- ções de oligonucleotídeo alelo-específico em que variações de um úni- co nucleotídeo ou de múltiplos nucleotídeos na sequência de ácidos nucleicos podem ser detectadas em ácidos nucleicos por um processo em que a sequência que contém a variação de nucleotídeo é amplifi- cada, observada numa membrana e tratada com uma sonda de oligo- nucleotídeo identificada como sequência-específica.

[0045] A sequência-alvo de ácidos nucleicos também pode ser de- tectada por métodos de ligação de sonda, por exemplo, conforme di- vulgado na Patente nº U.S. 5.800.944 em que a sequência de interes- se é amplificada e hibridizada para sondas seguido pela ligação para detectar uma parte identificada da sonda.

[0046] Microarranjos também podem ser usados para detecção de polimorfismo, em que os conjuntos de sonda de oligonucleotídeo são montados de forma sobreposta para representar uma única sequência de tal modo que uma diferença na sequência-alvo num ponto resultaria em hibridização de sonda parcial (Borevitz, et al., Genome Res. 13:513-523, 2003; Cui, et al., Bioinformatics 21:3852-3858, 2005). Em qualquer microarranjo, espera-se que haverá uma pluralidade de se- quências-alvo, que podem representar genes e/ou regiões de não co- dificação em que cada sequências-alvo é representada por uma série de oligonucleotídeos em sobreposição e não por uma única sonda. Esta plataforma fornece triagem de alto rendimento de uma pluralidade de polimorfismos. A tipagem de sequências-alvo por métodos com ba- se em microarranjos é divulgada nas Patentes nº U.S. 6.799.122;

6.913.879; e 6.996.476.

[0047] Outros métodos para detectar SNPs e Indels incluem méto- dos de extensão de base única (SBE). Os exemplos de métodos de

SBE incluem, porém sem limitação, aqueles divulgados nas Patentes nº U.S. 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; e 5.945.283.

[0048] Em outro método para detectar polimorfismos, os SNPs e Indels podem ser detectados por métodos divulgados na Patente nº U.S. 5.210.015; 5.876.930; e 6.030.787 em que uma sonda de oligo- nucleotídeo que tem um corante repórter fluorescente 5' e um corante arrefecedor brusco 3' ligado de maneira covalente às extremidades 5' e 3' da sonda. Quando a sonda estiver intacta, a proximidade entre o corante repórter e o corante arrefecedor brusco resulta na supressão da fluorescência corante repórter, por exemplo, por transferência de energia do tipo Forster. Durante a PCR, os iniciadores direto e reverso hibridizam para uma sequência específica do DNA-alvo que flanqueia um polimorfismo ao mesmo tempo que a sonda de hibridização hibridi- za para a sequência que contém polimorfismo dentro do produto de PCR amplificado. No ciclo subsequente de PCR, a polimerase de DNA com atividade de exonuclease 5' > 3' cliva a sonda e separa o corante repórter do corante de arrefecimento brusco resultando em fluorescên- cia aumentada do repórter.

[0049] Em outra modalidade, um locus ou loci de interesse pode ser sequenciado diretamente com o uso de tecnologias de sequencia- mento de ácido nucleico. Os métodos para sequenciamento de ácido nucleico são conhecidos na técnica e incluem as tecnologias forneci- das pela 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Be- verly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Biosciences (Lincoln, NE), NimbleGen Systems (Madison, WI), Illumina (San Diego, CA) e VisiGen Biotechnologies (Houston, TX). Tais tecnologias de se- quenciamento de ácido nucleico compreendem formatos, tais coimo arranjos de microesferas paralelos, sequenciamento por ligação, ele- troforese capilar, microchips capilares, "biochips", microarranjos, mi- crochips paralelos e arranjos de molécula única.

DEFINIÇÕES

[0050] As definições a seguir são fornecidas para melhor definir a presente invenção e orientar aqueles de habilidades comum na técnica na prática da presente invenção. Salvo quando indicado de outro mo- do, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencio- nal por aqueles de habilidade comum na técnica relevante.

[0051] Conforme usado no presente documento, o termo "planta" inclui células de planta, protoplastos de planta, células de planta de cultura de tecido das quais plantas Brassica oleracea podem ser rege- neradas, calos de planta, tufos de planta e células de planta que são intactas em plantas ou partes de plantas, tais como pólen, flores, inflo- rescências, cabeças, sementes, folhas, caules e semelhantes.

[0052] Conforme usado no presente documento, o termo "popula- ção" significa uma coleta de plantas geneticamente heterogêneas que compartilham uma derivação parental comum.

[0053] Conforme usado no presente documento, os termos "varie- dade" e "cultivar" significam um grupo de plantas semelhantes que por seus pedigrees e desempenho podem ser identificadas a partir de ou- tras variedades dentro das mesmas espécies.

[0054] Conforme usado no presente documento, um "alelo" se re- fere a uma dentre duas ou mais formas alternativas de uma sequência genômica num determinado locus num cromossomo.

[0055] Um "Locus de Traço Quantitativo (QTL)” é uma localização cromossômica que codifica pelo menos um primeiro alelo que afeta a expressividade de um fenótipo.

[0056] Conforme usado no presente documento, um "marcador" significa uma característica detectável que pode ser usada para distin- guir organismos. Os exemplos de tais características incluem, porém sem limitação, marcadores genéticos, marcadores bioquímicos, meta- bólitos, características morfológicas e características agronômicas.

[0057] Conforme usado no presente documento, o termo "fenótipo" significa as características detectáveis de uma célula ou organismo que podem ser influenciados por expressão gênica.

[0058] Conforme usado no presente documento, o termo "genóti- po" significa a formação alélica específica de uma planta.

[0059] Conforme usado no presente documento, o termo "genóti- po" significa a formação alélica específica de uma planta. Uma "planta de elite" refere-se a uma planta pertencente a uma variedade de elite. Inúmeras linhagens de elite estão disponíveis e são conhecidas pelos versados na técnica de melhoramento genético de milho. Uma "popu- lação de elite" é uma variedade de indivíduos ou linhagens de elite que podem ser usados para representar o estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de culti- vo, tal como milho. De modo semelhante, um "germoplasma de elite" ou cepa de elite do germoplasma é uma germoplasma superior em termos agronômicos.

[0060] Como aqui utilizado, o termo "introgressado", quando usado em referência a um locus genético, refere-se a um locus genético que foi introduzido num novo contexto genético, como por meio de retro- cruzamento. A introgressão de um locus genético pode ser obtida atra- vés de métodos de melhoria de planta e/ou por métodos genéticos mo- leculares. Tais métodos genéticos moleculares incluem, porém sem limitação, seleção auxiliada por marcador.

[0061] Conforme usado no presente documento, os termos "re- combinante" ou "recombinado" no contexto de um segmento cromos- sômico se referem a sequências de DNA recombinantes que compre- endem um ou mais loci genéticos numa configuração na qual não são encontrados na natureza, por exemplo, como resultado de um evento de recombinação entre cromossomos homólogos durante meiose.

[0062] Conforme usado no presente documento, o termo "ligado",

quando usado no contexto de marcadores de ácido nucleico e/ou regi- ões genômicas, significa que os marcadores e/ou regiões genômicas estão localizados no mesmo grupo de ligação ou cromossomo de mo- do que tendam a segregar na meiose.

[0063] Conforme usado no presente documento, "locus de resis- tência" significa um locus associado a resistência ou tolerância à do- ença. Por exemplo, um locus de resistência de acordo com a presente invenção pode, numa modalidade, resistência de controle ou suscetibi- lidade de planta inflorescências ou cabeças a míldio.

[0064] Conforme usado no presente documento, "alelo de resis- tência" significa a sequência de ácidos nucleicos associada a resistên- cia ou tolerância à doença.

[0065] Conforme usado no presente documento "resistência" ou "resistência aprimorada" numa planta a afecções de doença é uma in- dicação de que a planta é menos afetada pelas afecções de doença com relação a rendimento, capacidade de sobrevivência e/ou outras medidas agronômicas relevantes, em comparação a uma planta me- nos resistente, mais “suscetível”. A resistência é um termo relativo, que indica que uma planta “resistente” sobrevive e/ou produz mais rendi- mentos em afecções de doença em comparação a uma planta diferen- te (menos resistente) que cresceu em afecções de doença semelhan- tes. Conforme usado na técnica, “tolerância” à doença é usado algu- mas vezes de maneira intercambiável com "resistência" à doença. Uma pessoa versada na técnica observará que a resistência da planta às afecções de doença varia amplamente e pode representar um es- pectro de fenótipos mais resistentes ou menos resistentes. No entanto, por meio de uma simples observação, uma pessoa versada na técnica pode determinar geralmente a resistência ou suscetibilidade relativa de diferentes, linhagens de planta ou famílias de planta sob afecções de doença e, além disto, também reconhecerá as gradações fenotípicas de "resistente".

[0066] O termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão de erro para o dispositivo ou método que é emprega- do para determinar o valor. O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", salvo quando indicado explicitamente para indica alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusi- vas, embora a descrição sustente uma definição que se refere apenas a alternativas e a "e/ou". Quando usadas em combinação com a pala- vra "que compreende" ou outra linguagem aberta nas reivindicações, as palavras "um" e "uma" denotam "um ou mais", salvo quando obser- vado especificamente. Os termos "compreendem", "tem" e "incluem" são verbos de ligação em aberto. Quaisquer formas ou conjugações de um ou mais destes verbos, tais como "compreende", "que compre- ende", "tem", "que tem", "inclui" e "que inclui", também estão em aber- to. Por exemplo, qualquer método que "compreende", "tem" ou "inclui" uma ou mais etapas não é limitado a possuir apenas aquelas um ou mais etapas também cobre outras etapas não listadas. De modo se- melhante, qualquer planta que "compreende", "tem" ou "inclui" um ou mais traços não está limitada a possuir apenas aqueles um ou mais traços e cobre outros traços não listados. VI. INFORMAÇÕES DE DEPÓSITO

[0067] Foi feito um depósito de pelo menos 2.500 sementes de cepa de couve-flor MYCOCLP (Brassica oleracea), que compreende os dois QTLs de resistência a míldio no cromossomo 3, conforme des- crito no presente documento. O depósito foi feito com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va.

20.110 a 2.209 EUA. Ao depósito é atribuído nº de Acesso ATCC PTA- 124338, e a data do depósito foi 28 de julho de 2017. O acesso ao de- pósito estará disponível durante a pendência do pedido a pessoas com direito ao mesmo mediante solicitação. O depósito será mantido no

Depósito ATCC, que é um depósito público, por um período de 30 anos ou 5 anos após a solicitação mais recente ou durante a vida exe- cutável da patente, o que durar mais, e será substituído caso se torne inviável durante este período. A Requerente não renuncia qualquer violação de seus direitos concedidos sob esta patente ou qualquer ou- tra forma de proteção de variedade, incluindo o Ato de Proteção de Variedade de Plantas (7 U.S.C. 2321 et seg.). EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE ALELOS DE RESISTÊNCIA A MÍLDIO E MA-

PEAMENTO

[0068] A fonte de resistência MYCOCLP foi depositada com o ATCC e recebeu o nº de Acesso PTA-124338. MycoCLP foi cruzado com linhagem de couve-flor brilhante sensível a míldio BSCLPN para criar uma população de mapeamento. As plantas resultantes F1 foram usadas para desenvolver uma população haploide duplicada. No total, 198 linhagens haploides duplicadas da primeira geração (DH) foram desenvolvidas e usadas para avaliação de teste e para o mapeamento de genótipos junto das linhagens parentais como controles sensíveis e resistentes.

[0069] A resistência a míldio para esta população de mapeamento foi determinada nas localizações em campo. Cada teste conteve 3 ré- plicas com 10 plantas para cada linhagem de DH em cada réplica. Nestes testes, isolados de míldio naturais foram tomados como base para infectar as plantas. Os testes foram semeados alternadamente conforme o tempo a fim de antecipar taxas de infecção natural variá- vel, porém também para sustentar diferentes taxas de florescimento entre as linhagens diferentes. Nesta população de mapeamento, uma diferença na maturação da cabeça de cerca de um mês foi observada entre as diferentes linhas dependendo das condições ambientais. Num primeiro experimento, seis testes alternados foram realizados com seis datas de semeadura durante um período de seis semanas nos meses de abril e meio e de seis datas de plantio durante um período de seis semanas em junho. As avaliações para este experimento ocorreram de agosto a novembro. Num segundo experimentos, os testes foram plan- tados ao mesmo tempo em duas localizações, com três testes em ca- da localização. Para estes testes, os materiais foram plantados com três datas de semeadura num período de três semanas nos meses de abril e maio e três datas de plantio respectivas durante um período de três semelhantes em junho. Estes testes foram avaliados de agosto a novembro.

[0070] A fim de determinar a taxa de infecção por míldio, inflores- cências maduras foram avaliadas uma semana após um cultivador co- lher normalmente as culturas, que está entre três e quatro meses após o plantio. As inflorescências foram colhidas e abertas por fatiamento diversas vezes para determinar o nível de míldio presente. Subsequen- temente, cada planta recebeu uma pontuação de 1 (sem sintomas), 5 (alguns sintomas) ou 9 (múltiplos sítios de infecção e/ou >1/3 da inflo- rescência infectada). Para cada linha, os resultados dos dois ensaios experimentais foram combinados e a pontuação do míldio foi resumida na média do quadrado mínimo.

[0071] Cada linhagem de DH foi genotipada, e as análises de QTL foram realizadas com MapQTL5 com o uso de mapeamento de inter- valo num tamanho de etapa de mapeamento de 1 cM. Os limites de significância foram determinados por testes de permutação com 1.000 permutações cada um e um limiar de p=0,05. A análise de mapeamen- to de QTL identificou dois QTLs no cromossomo 3 que juntos explicam 48,1% da variação fenotípica ao redor da resistência a míldio nas inflo- rescências de couve-flor (Figura 1).

[0072] A fim de reduzir o tamanho do primeiro QTL (entre os mar- cadores M13 a M20), os recombinantes foram identificados com o uso dos marcadores de flanqueamento M13 e M20 na geração F2 de um cruzamento entre os mesmos progenitores, conforme usado para o mapeamento de QTL. Estes recombinantes foram homozigotos para os pontos de ruptura recombinantes na geração F3. As famílias de re- combinantes de geração F4 foram plantadas em testes para resistên- cia a míldio. O teste foi replicado em seis semeaduras e plantios alter- nados e foi plantado em duas localizações. Alinhando-se o nível de média dos quadrados mínimos de resistência para cada uma destas famílias recombinantes para os respectivos pontos de ruptura de re- combinação dos mesmos entre M13 e M20, os inventores identificaram que a região entre marcadores M19 e M20 forneceu a resistência transportadas pelo QTL mapeado.

[0073] As sequências para os marcadores descritas no presente documento são mostradas na Tabela 1.

TABELA 1

Marcador QTL iPosiçãonoMapa Posição SNP Tamanho de Posição de SNP Mudança Sequência o a oAIas lara) acata) pomada BS

&

[0074] Todas as composições e/ou métodos divulgados e reivindi- cados no presente documento podem ser realizados e executados sem experimento indevido à luz da presente invenção.

Embora as composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferenciais, ficará evidente para as pes- soas versadas na técnica que as variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito no presente documento sem haver afastamento do conceito, espírito e escopo da invenção.

Mais especificamente, ficará evidente que determinados agentes que estão relacionados tanto quí- mica quanto fisiologicamente podem ser substituídos pelos agentes descritos no presente documento e os mesmos resultados ou resulta- dos semelhantes são obtidos.

Todos os substituintes semelhantes e modificações evidentes às pessoas versadas na técnica são conside- rados como dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, con- forme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. Planta Brassica oleracea de uma variedade cultivada, ca- racterizada pelo fato de que a planta compreende um primeiro alelo introgredido ou um segundo alelo introgredido no cromossomo 3, em que o dito primeiro alelo introgredido ou o dito segundo alelo introgre- dido confere a uma inflorescência ou cabeça da dita planta maior resis- tência a míldio em comparação a uma planta que não compreende o dito primeiro alelo introgredido ou o dito segundo alelo introgredido.

2. Planta Brassica oleracea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita planta compreende um primei- ro alelo introgredido e um segundo alelo introgredido no cromossomo 3, em que o dito primeiro alelo introgredido e o dito segundo alelo in- trogredido conferem a uma inflorescência ou cabeça da dita planta maior resistência a míldio em comparação a uma planta que não com- preende os ditos alelos.

3. Planta Brassica oleracea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma amostra da semente que com- preende o dito primeiro alelo introgredido e o dito segundo alelo intro- gredido foi depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-124338.

4. Planta Brassica oleracea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro alelo introgredido é flanqueado no genoma da dita planta pelo locus marcador M19 (SEQ ID NO:2) e pelo locus marcador M20 (SEQ ID NO:3) no cromossomo

3.

5. Planta Brassica oleracea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito segundo alelo introgredido é flanqueado no genoma da dita planta pelo locus marcador M31 (SEQ ID NO:4) e pelo locus marcador M44 (SEQ ID NO:16) no cromossomo 3.

6. Planta Brassica oleracea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita planta Brassica oleracea é um brócolis, couve-flor, couve-brócolis, couve-de-Bruxelas, repolho bran- co, repolho roxo, repolho de couve-lombarda, repolho de couve- frisada, repolho de couve-rábano ou planta de repolho português.

7. Planta Brassica oleracea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é homozigota para o dito primeiro alelo introgredido ou o dito segundo alelo introgredido.

8. Semente caracterizada pelo fato de que produz a planta Brassica oleracea, como definida na reivindicação 1.

9. Parte de planta caracterizada pelo fato de que é da plan- ta Brassica oleracea como definida na reivindicação 1.

10. Parte de planta, de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizada pelo fato de que a dita parte de planta é uma célula, uma semente, uma raiz, um caule, uma folha, um fruto, uma flor, uma inflo- rescência, uma cabeça ou pólen.

11. Fragmento de introgressão caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro segmento cromossômico no cromosso- mo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP flanqueado pelo marcador M19 (SEQ ID NO:2) e pelo marcador M20 (SEQ ID NO:3) e um segundo segmento cromossômico no cromossomo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP flanqueado pelo marcador M31 (SEQ ID NO:4) e marcador M44 (SEQ ID NO:16).

12. Fragmento de introgressão, de acordo com a reivindica- ção 11, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento confere maior resistência a míldio.

13. Fragmento de introgressão, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizado pelo fato de que uma amostra de semente que compreende o dito primeiro segmento cromossômico e o dito segundo segmento cromossômico foi depositado sob o Número de Acesso ATCC PTA-124338.

14. Método para produzir uma variedade cultivada de uma planta Brassica oleracea com uma inflorescência ou cabeça que tem resistência aprimorada a míldio caracterizado pelo fato de que com- preende introgredir na dita variedade de plantas um primeiro segmento cromossômico ou um segundo segmento cromossômico do cromos- somo 3 da Brassica oleracea MYCOCLP que confere resistência apri- morada ao míldio em relação a uma planta que carece da dita intro- gressão.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a dita introgressão compreende: a) cruzar uma planta que compreende o dito primeiro ou segundo segmento cromossômico consigo mesma ou com uma se- gunda planta Brassica oleracea de um genótipo diferente para produzir uma ou mais plantas progenitoras; e b) selecionar uma planta progenitora que compreende o di- to segmento cromossômico.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que selecionar uma planta progenitora compreende detectar pelo menos um primeiro alelo flanqueado pelo marcador M19 (SEQ ID NO:2) e pelo marcador M20 (SEQ ID NO:3) ou um segundo alelo flanqueado pelo marcador M31 (SEQ ID NO:4) e pelo marcador M44 (SEQ ID NO:16).

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a dita variedade de plantas é uma variedade de brócolis, couve-flor, couve-brócolis, couve-de-bruxelas, repolho branco, repolho roxo, repolho de couve-lombarda, repolho de couve-frisada, repolho de couve-rábano ou planta de repolho português.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta progenitora é uma planta progenitora F2-F6.

19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o dito cruzamento compreende retrocruzamento.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que o dito retrocruzamento compreende de 2 a 7 gera- ções de retrocruzamentos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o dito cruzamento compreende seleção auxiliada por marcador.

22. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que uma amostra de semente que compreende o dito primeiro e o dito segundo segmentos cromossômicos foi depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-124338.

23. Planta Brassica oleracea caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido na reivindicação 14.

24. Método para produzir alimento ou ração caracterizado pelo fato de que compreende obter uma planta, como definida na rei- vindicação 1 ou 23, ou uma parte da mesma, e produzir o dito alimento ou ração da dita planta ou parte da mesma.

25. Método para selecionar uma planta Brassica oleracea que exibe resistência a míldio caracterizado pelo fato de que compre- ende: a) cruzar a planta Brassica oleracea, como definida na rei- vindicação 1, consigo mesmo ou com uma segunda planta Brassica oleracea de um genótipo diferente para produzir uma ou mais plantas progenitoras; e b) selecionar uma planta progenitora que compreende o di- to primeiro ou segundo alelo introgredido.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a seleção da dita planta progenitora compreende identificar um marcador genético ligado geneticamente ao primeiro ou ao segundo alelo introgredido.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza-

do pelo fato de que a seleção da dita planta progenitora compreende: a) identificar um marcador genético dentro de uma região genômica, ou geneticamente ligado à mesma, entre o locus marcador M19 (SEQ ID NO:2) e o locus marcador M20 (SEQ ID NO:3) no cro- mossomo 3; ou b) identificar um marcador genético dentro de uma região genômica, ou ligado geneticamente à mesma, entre o locus marcador M31 (SEQ ID NO:4) e locus marcador M44 (SEQ ID NO:16) no cro- mossomo 3.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteriza- do pelo fato de que selecionar uma planta progenitora compreende adicionalmente detectar pelo menos um polimorfismo num locus sele- cionado a partir do grupo que consiste no locus marcador M33 (SEQ ID NO:5), no locus marcador M34 (SEQ ID NO:6), locus marcador M35 (SEQ ID NO:7), locus marcador M36 (SEQ ID NO:8), locus marcador M37 (SEQ ID NO:9), locus marcador M38 (SEQ ID NO:10), locus mar- cador M39 (SEQ ID NO:11), locus marcador M40 (SEQ ID NO:12), lo- cus marcador M41 (SEQ ID NO:13), locus marcador M42 (SEQ ID NO:14) e no locus marcador M43 (SEQ ID NO:15).

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a planta progenitora é uma planta progenitora F2-Fe.

30. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que selecionar a dita planta progenitora compreende retrocruzamento.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que o retrocruzamento compreende de 2 a 7 gerações de retrocruzamento.

32. Planta Brassica oleracea caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo método, como definido na reivindicação 25.