JP5632114B2 - ニストース結晶含有粉末 - Google Patents

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本特許出願は、２０１２年１１月１２日に提出された日本出願である特願２０１２−２４８３５８および２０１３年８月２９日に提出された日本出願である特願２０１３−１７７８１４の利益を享受する。この先の出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

本発明は、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いが抑制されるニストース結晶含有粉末及びその製造方法に関する。

ニストースは、スクロースにフラクトースが２分子結合した４糖類である。ニストースはフラクトオリゴ糖に含まれている成分の一つである。

ニストースは、難う蝕性、腸内細菌選択資化性等の有用な性質を有している。また、ニストースは強力な吸湿能力を有することから、食品乾燥剤に用いることができる（特許文献１）。

このようなニストースの有用性が着目され、これまでに、高純度なニストース結晶を得ることを目的としたニストース結晶の製造方法が検討されている（特許文献２〜４）。これらの方法によって、ニストース純度が９５〜９９％という高純度ニストース結晶が得られている。

特開平０６−３１１６０号公報 特開平０６−１６５７００号公報 特開平０６−３３９３８８号公報 特開平０５−２５３４０７号公報

従来の方法によって得られる高純度ニストース結晶は、一般的に、流動性が優れた微粉状である。しかしながら、従来の高純度ニストース結晶は、秤量等の一般的な作業を行うだけで粉舞いが発生するため、取扱う際に注意が必要となる。作業場の清潔を維持するために、粉体の粉舞いは可能な限り抑制されることが望ましい。通常、粉体の粉舞いを抑制する手段として、粉体を造粒して顆粒状に加工することが行われている。このような加工を施すためには、造粒加工用の設備が必要となる。ニストース結晶をできるだけ低コストで製造して市場に供給することを目的とする場合は、新たな設備又は工程を導入しない製造方法が望ましい。

そこで、本発明者らは、高純度ニストース結晶に高い湿度条件下で水分を供給することによって、粉舞いの発生を抑制することを試みた。しかしながら、従来の高純度ニストース結晶を３０℃における相対湿度８０％の条件下で吸湿させたところ、粉舞いの発生は抑制できなかった。

本発明は、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いの発生が抑制されるニストース結晶含有粉末とその製造方法を提供することを目的とする。

このような技術的背景において、本発明者らは、特定範囲のニストース純度（ニストース含有率）を有し、さらに微量のグルコン酸を含有し、かつ、特定の水分含量を有するニストース結晶含有粉末が、適切な流動性を有し、かつ、粉舞いが抑制される性質を有することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。

本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ニストース含有率が７１〜９０重量％であり、
ニストース結晶の総重量に対して０．２〜１８．６重量％のグルコン酸を含有し、かつ、
７〜１４重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶含有粉末。
（２）融点が、１２８〜１５０℃である、（１）に記載のニストース結晶含有粉末。
（３）分散度が、１０〜２１％である、（１）または（２）に記載のニストース結晶含有粉末。
（４）ニストース含有率が、８３〜８９重量％である、（１）〜（３）のいずれかに記載のニストース結晶含有粉末。
（５）ニストース結晶の総重量に対して０．２６〜１．０重量％のグルコン酸を含有する、（１）〜（４）のいずれかに記載のニストース結晶含有粉末。
（６）水分含量が、８〜１４重量％である、（１）〜（５）のいずれかに記載のニストース結晶含有粉末。
（７）以下の工程：
（Ａ）β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼとを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成させる工程；
（Ｂ）反応液中のグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸に変換させる工程；
（Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）で得られた溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液からニストース結晶を得る工程；および、
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたニストース結晶の水分含量を調整する工程
を含んでなる、ニストース結晶含有粉末の製造方法。
（８）工程（Ｃ）で得られた溶液中のニストース含有率が５５重量％以上であり、かつ、フラクトシルニストース含有率が１２重量％未満である、（７）に記載の方法。
（９）工程（Ｃ）において、グルコン酸含量の調整が、電気透析により行われる、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）工程（Ｂ）において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去する工程をさらに含んでなる、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって製造される、ニストース結晶含有粉末。

本発明によれば、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いが抑制されるニストース結晶含有粉末を提供することができる。本発明のニストース結晶含有粉末は、改善された取扱性を有するため、各種飲食品及び医薬品等の製品へ好適に使用できる。本発明のニストース結晶含有粉末は、加工された製品に対して、主成分のニストースに由来する優れた難う蝕性及び腸内細菌選択資化性等の有用な性質を付与することができる。本発明のニストース結晶粉末は、また、粉舞いの発生を抑制することを目的とした特別な造粒設備を使用することなく、エージング工程の湿度調整を行うという簡便な手段によって製造することができる。

図１は、実施例１の工程（Ｅ）に関するグラフである。グラフは、３０℃における相対湿度２０％で０〜１４日間エージングしたニストース結晶（純度７１〜９９％）の水分含量の変化を示している。 図２は、実施例１の工程（Ｅ）に関するグラフである。グラフは、３０℃における相対湿度４０％で０〜１４日間エージングしたニストース結晶（純度７１〜９９％）の水分含量の変化を示している。 図３は、実施例１の工程（Ｅ）に関するグラフである。グラフは、３０℃における相対湿度６０％で０〜１４日間エージングしたニストース結晶（純度７１〜９９％）の水分含量の変化を示している。 図４は、実施例１の工程（Ｅ）に関するグラフである。グラフは、３０℃における相対湿度８０％で０〜１４日間エージングしたニストース結晶（純度７１〜９９％）の水分含量の変化を示している。

発明の具体的説明

本発明において「ニストース結晶含有粉末」とは、水分含量が調整されたニストース結晶（粉末状）を意味する。

本発明のニストース結晶含有粉末は、ニストース含有率が、７１〜９０重量％であり、好ましくは、７５〜９０重量％、より好ましくは、７５〜８９重量％、さらに好ましくは８３〜８９重量％である。

ここで「ニストース含有率」は、「ニストース純度」と互換的に使用されるものであり、ニストース結晶含有粉末中に含まれている、グルコン酸以外の糖（中性糖）の総重量に占めるニストースの重量比を意味する。グルコン酸以外の糖（中性糖）としては、例えば、フラクトース、グルコース、スクロース、１−ケストース、ニストース、フラクトシルニストースが挙げられる。例えば、「ニストース結晶含有粉末のニストース含有率が７１〜９０重量％」あるいは「ニストース結晶含有粉末のニストース純度が７１〜９０％」とは、ニストース結晶含有粉末中のグルコン酸以外の糖の総重量に占めるニストースの割合が７１〜９０重量％であることを意味する。ニストース結晶含有粉末のニストース含有率は、ニストース結晶の糖組成に基づいて公知の方法に従って測定することができる。

本発明のニストース結晶含有粉末は、水分含量が、７〜１４重量％であり、好ましくは８〜１４重量％、より好ましくは８〜１２重量％、さらに好ましくは９〜１２重量％である。あるいは、水分含量は８〜１０重量％とすることができる。ニストース結晶含有粉末中の水分含量は、一般的な食品分析方法、例えば加熱乾燥法にしたがって測定することができる。

本発明のニストース結晶含有粉末は、グルコン酸をニストース結晶の総重量に対して０．２重量％以上含有することができるが、呈味の観点から、好ましくは０．２〜１８．６重量％、より好ましくは０．２６〜４．２重量％、さらに好ましくは０．２６〜１．０重量％、さらにより好ましくは０．２６〜０．４８重量％含有することができる。あるいは、グルコン酸を０．２〜０．５重量％含有することができる。ニストース結晶中のグルコン酸の含量は、公知の方法にしたがって測定できる。測定キットも市販されており、例えば、“食品分析試薬 Ｆ−キット Ｄ−グルコン酸／グルコノラクトン（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社製）”等の測定キットによって測定することができる。なお、ニストース結晶に含まれるグルコン酸含量が４．２重量％を超えると、ニストース結晶含有粉末には甘味と同時に塩味が感じられる。さらに、同グルコン酸含量が１８．６重量％の場合は、ニストース結晶含有粉末は甘味よりも塩味が強く感じられる。

本発明のニストース結晶含有粉末の融点は、１２２〜１５０℃であり、好ましくは、１２８〜１５０℃であり、好ましくは１２８〜１３８℃である。融点は、公知の方法（例えば、透明融点法）にしたがって測定することができる。特許文献１には、ニストース含有率８３％、水分含有率６．２％、融点１２０〜１２４℃を有する結晶性ニストース水和物が開示されている。本発明のニストース結晶含有粉末のうち、ニストース含有率８３％を有するものの融点は１２８℃〜１３６℃であることから、特許文献１の結晶性ニストース水和物とは異なるものである。

本発明のニストース結晶含有粉末の分散度は、好ましくは１０〜２１％であり、より好ましくは１２〜２１％である。ここで「分散度」は、粉体の飛散りの起こりやすさを示す指標であり、数値が大きいほど粉舞いし易いことを表す。一般的に、分散度は、粉体の噴流性に関わる因子の一つとされている。例えば、分散度が５０％を超える場合は噴流性が高いとみなされるため、粉塵発生への特別な対策が必要であると考えられる。

分散度は、以下のような方法によって測定される。規定重量（Ｗ）の試料を規定の高さから受け皿に落下させて、受け皿に乗った試料の重量（Ｗ１）を測定する。さらに、次の式によって、分散度を算出する。
分散度（％）＝（Ｗ−Ｗ１）／Ｗ１×１００

本発明のニストース結晶含有粉末の分散度の具体的な測定方法として、試料粉末１０ｇを量りとり、粉体特性評価装置（例えば、製品名：パウダテスタ、ホソカワミクロン製）を用いて測定する方法が挙げられる。

本発明のニストース結晶含有粉末は、従来の高純度ニストース結晶と比較して粉舞いのし易さを示す「分散度」は低い一方で、粉体の流れやすさを示す「流動性」については適切な状態を有するものであることが好ましい。流動性の評価方法として、一般的に複数の方法が知られている。本発明の結晶含有粉末の流動性評価については、粉末の外観の観察により行うことができる。

「粉末の外観の観察」では、粉末を収納している容器から測定機器などの別の容器へ移し替える際の流れやすさを評価する。本発明の結晶含有粉末は、サラサラな粉状か、又は、ゆるやかに固結した細かい粒状であるため、好ましく取り扱うことができる流動性を有する。

本発明のニストース結晶含有粉末は、以下の工程：
（Ａ）β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼとを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成させる工程；
（Ｂ）反応液中のグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸に変換させる工程；
（Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）で得られた溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液からニストース結晶を得る工程；および、
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたニストース結晶の水分含量を調整する工程
を含んでなる方法によって製造することができる。
以下、各工程について、具体的に説明する。

工程（Ａ）
工程（Ａ）においては、β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼとを含有する酵素溶液において、β−フルクトフラノシダーゼをスクロースと接触させることによりニストースを生成させることができる。

酵素溶液は、目的の酵素と溶媒を混合して調製することができる。溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、緩衝液等が挙げられ、好ましくは、水（水溶液）である。酵素溶液中の酵素濃度は、目的とする酵素反応を進行させるのに十分な量であればよく、例えば、スクロース１ｇに対して、β−フルクトフラノシダーゼが、１〜３０Ｕ（特には、２〜１５Ｕ）となるように、かつ、スクロース１ｇに対して、グルコースオキシターゼが、１Ｕ以上（特には、４Ｕ以上（例えば、４〜５０Ｕ））となるように調整することができる。さらに、カタラーゼを使用する場合は、酵素溶液中の酵素濃度は、スクロース１ｇに対して、カタラーゼが、１０Ｕ以上、特には、１００Ｕ以上（例えば、１００〜２００Ｕ）となるように調整することができる。

本発明の方法において、使用するβ−フルクトフラノシダーゼは、スクロースに接触させた場合の、スクロースからニストースへの変換率が４０％以上となるようなフラクトース転移活性を有するものを使用することができる。使用するβ−フルクトフラノシダーゼの由来は特に限定されないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属あるいはスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属が挙げられ、好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来もしくはアスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のものであり、より好ましくは、ＡＴＣＣ２０６１１株由来のものである。

本発明の方法において、β−フルクトフラノシダーゼとスクロースとの接触は溶液中で行われる。その条件は、β−フルクトフラノシダーゼがスクロースに作用可能な態様である限り特に限定されない。具体例を示せば次の通りである。反応液中のスクロースの濃度は、スクロースが溶解可能な範囲であれば、酵素の比活性及び反応温度等を考慮して適宜選択してよい。例えば、５〜８０重量％の範囲が好ましく、より好ましくは３０〜７０重量％の範囲である。後述する反応液中の溶存酸素量の観点から、スクロース濃度は、さらに好ましくは３０〜６０重量％、さらにより好ましくは３０〜４０重量％の範囲とすることができる。スクロースとβ−フルクトフラノシダーゼとの反応における温度及びｐＨは、β−フルクトフラノシダーゼの最適条件下で行うことが好ましい。例えば、温度は２０〜７０℃程度、ｐＨは４〜１０程度の条件下で行うのが好ましく、より好ましくは２５〜４０℃、ｐＨ５〜８の範囲である。β−フルクトフラノシダーゼの添加量は、酵素反応液中のスクロースを十分に利用できる量であればよい。反応時間は、ニストースの生成量が最大となるまでで適宜変更することができる。

なお、本発明の方法では、前記反応系にさらにグルコースオキシターゼが混合されているため、使用するグルコースオキシターゼに応じて適宜これらの条件をさらに変更することができる。グルコースオキシターゼについては後述する。

工程（Ｂ）
工程（Ｂ）においては、β−フルクトフラノシダーゼとスクロースとの接触によりニストースが生成されると同時に副生されるグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸に変換させることができる。

本発明の方法において、スクロースにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させてニストースを生成する反応と同時に、副生するグルコースをグルコースオキシダーゼによってグルコン酸に変換させながら反応を実施する。

本発明の方法に使用するグルコースオキシターゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシターゼ又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来等のものを用いることができる。市販のグルコースオキシダーゼ製剤には、副活性としてインベルターゼ活性を有する場合がある。インベルターゼが含まれている酵素製剤の中には、生成したニストースを加水分解する活性が強く発揮されるものがある。そこで、本発明の方法に使用するグルコースオキシダーゼにおいては、ニストースを加水分解するインベルターゼ活性が弱い、もしくはインベルターゼ活性が含まれていないことが望ましい。

グルコースオキシターゼの添加量は、副生するグルコースを変換するのに十分な量であればよい。また、グルコースオキシターゼによるグルコースからグルコン酸への変換は酸化反応であるため、反応に酸素が必要である。このため、グルコン酸への変換反応においては、反応液中の溶存酸素量を高めるために、反応液に通気しながら高速撹拌することが望ましい。溶存酸素濃度は、原料スクロース濃度又は反応温度を調整することによって高めることができる。すなわち、原料スクロース濃度を６０％以下、好ましくは４０％以下に調整することによって反応溶液中の溶存酸素濃度を高めることができる。

反応温度については、温度が高くなるにつれて溶存酸素濃度が低下するので、２０℃〜４０℃に設定することが好ましい。また、グルコースをグルコン酸に変換させる際、グルコン酸により反応液のｐＨが低下する。反応液のｐＨが低下すると、スクロースからニストースへ変換する反応の停止、又は生成したニストースの酸加水分解等が起こる。そのため、反応液に適宜中和剤を投入して、ｐＨを中性付近に調整することが望ましい。使用可能な中和剤としては、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水などが挙げられる。

グルコースオキシターゼによりグルコースをグルコン酸に変換する反応において、過酸化水素が副生する。過酸化水素の酸化作用により酵素を失活させてしまう場合があるため、必要に応じて、過酸化水素を分解するカタラーゼを添加することが望ましい。

したがって、本発明の方法では、グルコースをグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換する工程（Ｂ）において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去する方法もさらに含まれる。使用するカタラーゼとしては、アスペルギルス・ニガー又はミクロコッカス・リソデキティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来等のものが好ましい。また、前記した方法には、グルコースオキシダーゼ製剤とカタラーゼ製剤を併用するだけでなく、副活性としてカタラーゼ活性を有する市販のグルコースオキシダーゼ製剤を選択して用いることも含まれる。

カタラーゼの添加量は、副生する過酸化水素を酸素と水に変換するのに十分であればよい。カタラーゼの反応温度及びｐＨは、ニストースの生成反応及びグルコースオキシダーゼからグルコン酸への変換反応が進行する条件であれば、適宜選択することができる。

工程（Ｂ）は、工程（Ａ）においてニストースが生成されると同時にグルコースが副生されると開始される。

工程（Ａ）は工程（Ｂ）が開始されても進行する。すなわち、工程（Ａ）と工程（Ｂ）とは同時に進行するものである。

工程（Ｃ）
工程（Ｃ）においては、工程（Ａ）および（Ｂ）で得られた溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する。

本発明の方法では、工程（Ａ）及び（Ｂ）で生成されたニストース含有溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程を含む。本発明者らが検討したところ、工程（Ｂ）の後にグルコン酸含量を調整しない場合、ニストース含有溶液に含まれるグルコン酸含量は約４０重量％であった。前記の場合は、ニストース結晶が得られなかった（実施例７）。また、グルコン酸含量を調整した後の溶液において、グルコン酸含量が２０重量％である場合は、グルコン酸含量が１０重量％である場合よりも、結晶の回収率が約１０％減少した（実施例７）。そのため、本発明の方法においては、ニストース含有溶液中のグルコン酸を適切な濃度範囲とすることが好ましい。前記濃度範囲として、好ましくは２０重量％以下、さらに好ましくは０．１〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％、さらに好ましくは０．１〜５重量％、さらに好ましくは０．１〜２重量％、特に好ましくは０．１〜１重量％が挙げられる。

ニストース含有溶液中のグルコン酸含量を調整する方法は、グルコン酸を溶液から選択的に除去できれば、いずれの方法も利用できる。具体的には、電気透析、陰イオン交換クロマトグラフィー、グルコン酸をカルシウム塩として沈殿除去する方法等が挙げられる。ニストース含有溶液中のグルコン酸含量を調整する方法としては、工程中のニストースの損失が少ないという観点から、電気透析を用いることが好ましい。

また、本発明の方法では、グルコン酸含量を調整した後のニストース含有溶液中の糖組成における、ニストース含有率が好ましくは５５重量％以上（例えば、５５〜１００重量％）、より好ましくは６０重量％以上（例えば、６０〜１００重量％）であることが好ましい。ここで「ニストース含有率」とは、ニストース含有溶液中に含まれている、中性糖の糖組成に占めるニストースの比率（重量比）を意味する。「糖組成」を構成する中性糖として、具体的には、フラクトース、グルコース、スクロース、１−ケストース、ニストース、フラクトシルニストースが挙げられる。さらに、グルコン酸含量を調整した後の溶液中の糖組成におけるフラクトシルニストース含有率が１２重量％未満であることが好ましく、より好ましくは、１１重量％以下（例えば、０〜１１重量％または０〜１０．２重量％）である。ここで「フラクトシルニストース含有率」とは、溶液中のグルコン酸を除く中性糖の糖組成に占めるフラクトシルニストースの比率（重量比）を意味する。したがって、本発明の方法の好ましい態様として、グルコン酸含量を調整した後の溶液中の糖組成におけるニストース含有率は、好ましくは５５重量％以上、より好ましくは６０重量％以上であり、かつ、フラクトシルニストース含有率は好ましくは１２重量％未満、より好ましくは１１重量％以下である。ニストース含有率およびフラクトシルニストース含有率については、グルコン酸含量を調整した後のニストース含有溶液中の糖組成を考慮して、さらに調整してもよい。なお、グルコン酸含量を調整した後の溶液において、ニストース含有率が高ければ高いほど、又は、フラクトシルニストース含有率が低ければ低いほど、ニストース結晶を効率的に得られることは、業界における技術常識といえる。

工程（Ｄ）
工程（Ｄ）においては、工程（Ｃ）で得られた溶液からニストース結晶を得ることができる。

工程（Ｃ）によって得られる溶液からニストース結晶を得る方法として、公知の方法を利用することができる。例えば、特許文献３及び特許文献４に記載されている方法をとることができる。具体的には、以下の通りである。糖溶液を６０重量％以上、好ましくは７０重量％以上の固形分濃度となるようにエバポレーターなどの濃縮装置で濃縮する。得られた濃縮液に、ニストース結晶を種晶として添加した後、攪拌して結晶を均一に分散させる。得られた糖液を静置して結晶を析出させる。静置後の結晶混合物を固液分離することにより、ニストース結晶を得ることができる。固液分離する手段は特に限定されないが、上部排出型遠心分離機、底部排出型遠心分離機、板枠型圧濾機（フィルタープレス）、多室円筒型真空濾過機（オリバーフィルター）、スクリュープレス、ベルトプレス等が挙げられる。本発明の方法においては、上部排出型遠心分離機、底部排出型遠心分離機を用いることが好ましい。

前記操作において、固液分離操作の前に脱イオン水を加えること、又は液温を調整すること等によって、固液分離前の溶液の粘度を調整することができる。前記のように粘度を調整することによって、最終的に得られる結晶含有粉末中のニストース含有率を適宜調整することができる。

工程（Ｅ）
工程（Ｅ）においては、工程（Ｄ）で得られたニストース結晶の水分含量を調整する。

工程（Ｅ）は、工程（Ｄ）によって得られたニストース結晶の水分含量を調整する工程である。水分含量を調製する手段は特に限定されないが、特定の湿度条件でエージングすることが好ましい。本発明において「エージング」とは、ニストース結晶を一定条件に置いて所定の水分量を含有させるための操作を意味する。エージングの条件として、３０℃における相対湿度が好ましくは４０〜８０％、より好ましくは４０〜６０％、さらにより好ましくは４０〜５０％の条件が挙げられる。目標とするニストース結晶含有粉末の水分含量は、好ましくは７〜１４重量％、より好ましくは８〜１４重量％、さらに好ましくは８〜１２重量％、さらにより好ましくは９〜１２重量％である。エージングの時間は、ニストース結晶含有粉末が前記した水分含量になるまでに必要な時間とすればよいが、通常は１日〜１週間程度である。エージングの温度は、通常は室温程度、好ましくは２０〜３５℃、より好ましくは３０℃とする。

本発明のニストース結晶含有粉末は、公知の飲料、食品及び医薬品に適用することができる。本発明のニストース結晶含有粉末は、秤量時の粉舞いの発生が抑制されているため、加工時の取扱いが容易である。従って、本発明のニストース結晶含有粉末は、工業的生産での使用において有利である。

本発明の好ましい態様によれば、
ニストース含有率が８３〜８９重量％であり、
ニストース結晶の総重量に対して０．２〜１８．６重量％のグルコン酸を含有し、かつ、
８〜１４重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶含有粉末が提供される。

本発明のより好ましい態様によれば、
ニストース含有率が８３〜８９重量％であり、
ニストース結晶の総重量に対して０．２〜１．０重量％のグルコン酸を含有し、かつ、
８〜１４重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶含有粉末が提供される。

本発明のさらに好ましい態様によれば、
ニストース含有率が８３〜８９重量％であり、
ニストース結晶の総重量に対して０．２６〜１．０重量％のグルコン酸を含有し、かつ、
８〜１４重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶含有粉末が提供される。

本発明のさらにより好ましい態様によれば、
ニストース含有率が８３〜８９重量％であり、
ニストース結晶の総重量に対して０．２６〜１．０重量％のグルコン酸を含有し、かつ、
８〜１２重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶含有粉末が提供される。

本発明の好ましい態様によれば、以下の工程：
（Ａ）β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼとカタラーゼとを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成させる工程；
（Ｂ１）反応液中のグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸に変換させる工程；
（Ｂ２）反応液中の過酸化水素をカタラーゼにより除去する工程；
（Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）で得られた溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程（ここで、溶液中のニストース含有率が５５重量％以上であり、かつ、フラクトシルニストース含有率が１２重量％未満である）；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液からニストース結晶を得る工程；および、
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたニストース結晶の水分含量を調整する工程
を含んでなる、ニストース結晶含有粉末の製造方法が提供される。

本発明のより好ましい態様によれば、ニストース結晶含有粉末の製造方法であって、以下の工程：
（Ａ）β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼとカタラーゼとを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成させる工程；
（Ｂ１）反応液中のグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸に変換させる工程；
（Ｂ２）反応液中の過酸化水素をカタラーゼにより除去する工程；
（Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）で得られた溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程（ここで、溶液中のニストース含有率が５５重量％以上であり、かつ、フラクトシルニストース含有率が１２重量％未満である）；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液から、ニストース含有率が８３〜８９重量％であるニストース結晶を得る工程；および、
（Ｅ）ニストース結晶含有粉末の水分含量を８〜１４重量％とするために、工程（Ｄ）で得られたニストース結晶の水分含量を調整する工程
を含んでなる方法が提供される。

本発明によれば、以下の発明も提供される。
（１）（ａ）ニストース純度が７５〜９０％であり、
（ｂ）０．２〜０．５重量％のグルコン酸を含有し、さらに、
（ｃ）８〜１４重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶粉末。
（２）（ｄ）融点が１２８〜１５０℃である、（１）に記載のニストース結晶粉末。
（３）（ｅ）分散度が１０〜２１％である、（１）または（２）に記載のニストース結晶粉末。
（４）（ａ）ニストース純度が８３〜８９％である、（１）〜（３）のいずれか一つに記載のニストース結晶粉末。
（５）（ｂ）０．２６〜０．４８重量％のグルコン酸を含有する、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のニストース結晶粉末。
（６）（ｃ）水分含量が９〜１２重量％である、（１）〜（５）のいずれか一つに記載のニストース結晶粉末。
（７）以下の工程を含んでなる、ニストース結晶粉末の製造方法。
（Ａ）β−フルクトフラノシダーゼを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）工程の反応と同時に、反応液中のグルコースにグルコースオキシダーゼを作用させてグルコン酸に変換する工程；
（Ｃ）前記（Ｂ）工程に引き続いて、反応液中のグルコン酸含量を０．１〜１重量％に調整する工程；
（Ｄ）前記（Ｃ）工程によって得られた溶液からニストース結晶を得る工程；および、
（Ｅ）前記（Ｄ）工程のニストース結晶の水分含量を調整する工程。
（８）工程（Ｃ）で得られる溶液中の糖組成におけるニストース含有率が５５％以上、およびフラクトシルニストース含有率が１１％以下である、（７）に記載の方法。
（９）工程（Ｃ）において、グルコン酸含量を調整する手段が電気透析である、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）工程（Ｂ）において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去することをさらに含んでなる、（７）〜（９）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）（７）〜（１０）のいずれか一つに記載の方法によって得られる、ニストース結晶粉末。

本発明によれば、また、以下の発明も提供される。
（１）（ａ）ニストース純度が７１〜９０％であり、
（ｂ）０．２〜１８．６重量％のグルコン酸を含有し、かつ、
（ｃ）７〜１４重量％の水分含量を有する、
ニストース結晶粉末。
（２）（ｄ）融点が１２８〜１５０℃である、（１）に記載のニストース結晶粉末。
（３）（ｅ）分散度が１０〜２１％である、（１）又は（２）に記載のニストース結晶粉末。
（４）（ａ）ニストース純度が８３〜８９％である、（１）〜（３）のいずれか一つに記載のニストース結晶粉末。
（５）（ｂ）０．２６〜１．０重量％のグルコン酸を含有する、（１）〜（４）のいずれか一つに記載のニストース結晶粉末。
（６）（ｃ）水分含量が９〜１２重量％である、（１）〜（５）のいずれか一つに記載のニストース結晶粉末。
（７）以下の工程を含んでなる、ニストース結晶粉末の製造方法。
（Ａ）β−フルクトフラノシダーゼを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）工程と同時に、反応液中のグルコースにグルコースオキシダーゼを作用させてグルコン酸に変換する工程；
（Ｃ）前記（Ａ）及び（Ｂ）工程に引き続いて、反応液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程；
（Ｄ）前記（Ａ）〜（Ｃ）工程によって得られた溶液からニストース結晶を得る工程；及び、
（Ｅ）前記（Ｄ）工程のニストース結晶の水分含量を調整する工程。
（８）工程（Ａ）〜（Ｃ）で得られる溶液中の糖組成におけるニストース含有率が５５％以上、及びフラクトシルニストース含有率が１１％以下である、（７）に記載の方法。
（９）工程（Ｃ）において、グルコン酸含量を調整する手段が電気透析である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）工程（Ｂ）において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去することをさらに含んでなる、（７）〜（９）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）（７）〜（１０）のいずれか一つに記載の方法によって得られる、ニストース結晶粉末。

本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１：β−フルクトフラノシダーゼの調製
粉末ブイヨン２．０％、スクロース５．０％、ＣＭＣ０．５％を含む培地３５０ｍＬを三角フラスコに入れて殺菌した後、アスペルギルス・ジャポニカス ＡＴＣＣ２０６１１株を植菌し、２８℃で２０時間培養して、種培養液を調製した。３０Ｌジャーファーメンターにショ糖５．０％、酵母エキス３．６％、ＣＭＣ０．５％を含む培地１５Ｌを入れて、ｐＨ６．５に調節した後、１２０℃で３０分殺菌した。次いで、前記培地に前記種培養液３５０ｍＬを無菌的に植菌し、２８℃で７２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して、さらに凍結乾燥することにより、フラクトース転移活性を有する粗酵素菌体を得た。前記粗酵素菌体のフラクトース転移活性は、１，５８０Ｕ／ｇ（菌体重量）であった。なお、前記フラクトース転移活性は、２５％スクロース溶液２．０ｍＬ、酵素液１．０ｍＬ、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）２．０ｍＬをそれぞれ混合して、４０℃で６０分反応させた時に、１分間に１μｍｏｌのＧＦ２を生成させる酵素量を１Ｕ（単位）として定義した値である。前記粗酵素菌体を凍結乾燥して、以降の試験におけるβ−フルクトフラノシダーゼとして用いた。

実施例１：ニストース結晶含有粉末の製造（１）

工程（Ａ）及び工程（Ｂ）
スクロース５７８ｇを蒸留水１３５０ｇで溶解して、スクロース３０重量％を含有する基質溶液を調製した。基質溶液を３Ｌジャーファーメンターに入れて、以下の酵素：β−フルクトフラノシダーゼ（参考例１）３，０００Ｕ、及びグルコースオキシダーゼ（商品名：ハイデラーゼ１５、天野エンザイム株式会社製）３，０００Ｕを添加した。酵素反応条件は、温度：３０℃、ｐＨ：７．０、攪拌速度：６００ｒｐｍ、通気量：３Ｌ／分とした。酵素反応開始から０、２、４時間後、及び２０〜２４時間後にサンプリングを行った。反応開始から２４時間後の反応溶液を、８２℃に設定した湯浴で３０分間加熱して酵素を失活させることにより、反応を終了させた。さらに、反応後の溶液に活性炭を基質重量に対して０．３％の割合で添加した。引き続き、前記溶液をろ紙でろ過した後、０．４５μｍのフィルターでろ過した。

得られた各反応溶液について糖組成分析を行った。糖組成分析は以下の条件で行った。カラム：ＲＴ２５０−４．０ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｏｒ １００ ＮＨ２（Ｃｉｃａ−Ｒｅａｇｅｎｅｔ社）、移動相：６６％アセトニトリル、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：示差屈折計。結果の一例を表１に示した。

表１より、反応開始から２０時間経過すると、反応溶液中のニストース含有率は５０％以上となった。反応開始から２４時間経過するとニストース含有率は６０％以上となった。

工程（Ｃ）
前記（Ａ）及び（Ｂ）工程によって得られたろ過後の反応溶液中に含まれるグルコン酸の含量を、電気透析によって調整した。

グルコン酸含量は、食品分析試薬 Ｆ−キット Ｄ−グルコン酸／グルコノラクトン（Ｊ．Ｋ．インターナショナル製）を用いて測定した。

電気透析は、以下の条件で行った。電気透析装置：マイクロ・アシライザーＳ３（アストム社製）、カートリッジ：ＡＣ−２２０−５５０（アストム社製）。反応溶液を電気透析装置の脱塩液槽側から供給し、反応溶液と等量の脱イオン水を濃縮液槽側から供給して、電気透析を７．５時間行った。電気透析を開始直後から、一定の間隔でサンプリングを行った。電気透析処理後の脱塩液をニストース含有画分、処理後の濃縮液をグルコン酸含有画分とした。それぞれの画分について固形分濃度（Ｂｒｉｘ）、ｐＨ、電気伝導度（ＥＣ）、グルコン酸含量（ＧＡ）を測定した。結果を表２に示した。

表２の結果より、ニストース含有画分の電気伝導度及びグルコン酸含量は、電気透析を行うことによって低下した。電気透析開始から７時間後のニストース含有画分の電気伝導度は１．２ｍＳ／ｃｍ、７．５時間後は０．４８ｍＳ／ｃｍを示した。また、ニストース含有画分に含まれているグルコン酸含量は、電気透析開始時は１１％（Ｗ／Ｖ）以上であったが、電気透析開始から７時間後には１．０％（Ｗ／Ｖ）に、７．５時間後には０．３％（Ｗ／Ｖ）となった。

また、表２の結果より、ニストース含有画分のｐＨは、透析前のｐＨ６．４からｐＨ４．５まで低下した。なお、ニストースはｐＨ５．０以下で分解されやすいため、電気透析後のニストース含有画分について、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ６．５に調整した。

電気透析開始から７．５時間後のニストース含有画分について糖組成分析を行った。結果を表３に示した。

表３の結果より、電気透析開始から７．５時間後のニストース含有画分中のニストース含有率は６０％以上であった。

工程（Ｄ）
工程（Ｃ）によって得られたニストース含有画分を、エバポレーターを用いて固形分濃度が７６重量％となるまで濃縮した。濃縮後の溶液に、種晶（純度９５％のニストース結晶；特開平６−３１１１６０の実施例１に記載の方法に従って得られた結晶）を３０ｒｐｍで攪拌しながら添加した。さらに３０ｒｐｍで攪拌を続けて、約４８時間かけて５５℃から３０℃まで徐々に液温を下げて、結晶を析出させた。

前記晶析操作の後、小型遠心分蜜機を用いて分蜜を行い、ろ布内に残った結晶を７０℃で減圧乾燥した。結晶純度を調整するために、分蜜工程の前処理として以下の操作を実施した。

（前処理ａ）：分蜜工程の前に、晶析操作後の処理液の液温を２０℃に調整した後、脱イオン水を加えて処理液中の固形分濃度を５６重量％に調整した。
（前処理ｂ）：分蜜工程の前に、晶析操作後の処理液の液温を５５℃に調整した。
（前処理ｃ）：分蜜工程の前に、晶析操作後の処理液の液温を４５℃に調整した。

得られたニストース結晶の純度とグルコン酸含量を表４に示した。グルコン酸含量は、工程（Ｃ）と同様に市販キットを使用して測定した。

表４の結果より、工程（Ａ）〜（Ｄ）によって、ニストース純度が７１〜８９％の結晶が得られた。また、前記結晶のグルコン酸含量は０．２〜０．７重量％であった。

工程（Ｅ）
前記工程（Ａ）〜（Ｄ）によって得られたニストース結晶（純度７１％、８３％、８９％）、及び、特許文献１に記載されたニストース含有率（純度）９９％のニストース結晶を、７０℃減圧下で一昼夜予備乾燥した後、同様に予備乾燥させたサンプル瓶に１ｇずつ秤量して、０日目の重量を測定した。前記サンプルを３０℃における相対湿度２０％、４０％、６０％、８０％に調整された密封容器内にそれぞれ入れてエージングした。それぞれの条件下で１、２、３、７、１４日間エージングしたサンプルを取り出して、重量を測定した。水分含量を以下のように算出した。

水分含量（％）＝（エージング後サンプル重量−０日目重量）／０日目重量×１００

水分含量の変化について、相対湿度２０％、４０％、６０％、８０％の結果を、それぞれ図１、図２、図３、図４に示した。

また、それぞれのサンプルについて、別の容器に移し替える時の流れやすさを流動性として以下のように評価した。５：非常にサラサラな微粉状、４：サラサラな粉状、３：やわらかく固結した粒状、２：塊が形成されている状態、１：潮解している状態。取扱いに適した状態は、前記５〜３をいう。

さらに、前記取扱いに適した状態のサンプルについては、容器に移し替える時に発生する粉舞いについて以下のように評価した。＋＋：粉舞いが発生する、＋：粉舞いがやや発生する、−：粉舞いが発生しない。

純度９９％のニストース結晶含有粉末
全てのエージング条件において、１日目から１４日目の水分含量は７．６〜９．２重量％でほぼ一定の値を示した（図１〜４）。また、全てのエージング条件の全てのサンプルにおいて、非常にサラサラな微粉状であったが、粉舞いは発生した（評価：５，＋＋〜＋）。

純度８３％及び純度８９％のニストース結晶含有粉末
相対湿度２０％で１〜１４日間エージングしたところ、水分含量が４．４〜７．６重量％となった（図１）。前記結晶は、いずれも非常にサラサラな微粉状であったが、粉舞いは発生した（評価：５，＋＋）。

相対湿度４０％でエージングしたところ、エージング１日目では、水分含量が８．３〜８．６重量％となり（図２）、いずれも非常にサラサラな微粉状でありながら、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：５，−）。エージング２〜１４日目では、水分含量が９．１〜９．７重量％となり（図２）、いずれもサラサラな粉状であり、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：４，−）。すなわち、３０℃における相対湿度４０％でエージングされた、ニストース純度８３％〜８９％の結晶含有粉末は、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：４〜５，−）。前記結晶含有粉末の水分含量は８〜１０重量％の範囲内であった。

相対湿度６０％でエージングしたところ、ニストース純度８９％の結晶含有粉末は、エージング１〜１４日目において水分含量が１０．７〜１０．８重量％でほぼ一定であり（図３）、いずれもサラサラな粉状であり、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：４，−）。また、ニストース純度８３％の結晶含有粉末は、エージング１〜１４日目において水分含量が１０．７〜１１．２重量％でほぼ一定であり（図３）、いずれもやわらかく固結した粒状であり、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：３，−）。すなわち、３０℃における相対湿度６０％でエージングされた、ニストース純度８３％〜８９％の結晶含有粉末は、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：３〜４，−）。前記結晶含有粉末の水分含量は１０〜１２重量％の範囲内であった。

相対湿度８０％でエージングしたところ、ニストース純度８９％の結晶含有粉末は、エージング１〜３日目においては水分含量が１１．１〜１１．８重量％であり（図４）、いずれもサラサラな粉状であり、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：４，−）。さらにエージング７〜１４日目においては水分含量が１１．９〜１２．０重量％であり（図４）、いずれもやわらかく固結した粒状であり、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：３，−）。また、ニストース純度８３％の結晶含有粉末は、エージング１〜１４日目において水分含量が１１．１〜１３．６重量％であり（図４）、いずれもやわらかく固結した粒状であり、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：３，−）。すなわち、３０℃における相対湿度８０％でエージングされた、ニストース純度８３％〜８９％の結晶含有粉末は、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：３〜４，−）。前記結晶含有粉末の水分含量は１１〜１４重量％の範囲内であった。

純度７１％のニストース結晶含有粉末
相対湿度２０％で１４日間エージングしたところ、水分含量が４．２〜６．５重量％となった（図１）。前記結晶は、いずれも非常にサラサラな微粉状であったが、粉舞いは発生した（評価：５，＋＋）。また、相対湿度４０％でエージングしたところ、エージング１〜１４日目で、水分含量が７．９〜９．０重量％となり（図２）、いずれもサラサラな粉状であり、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：４，−）。

相対湿度６０％及び８０％でそれぞれ１〜１４日間エージングしたところ、それぞれの水分含量は１０．８〜１２．３重量％、１１．３〜１６．９重量％となった（図３および４）。全てのエージング条件の全てのサンプルは、塊が形成されている状態であった（評価：２）。

以上の結果より、工程（Ｅ）において、ニストース純度７１〜８９％の結晶含有粉末を、３０℃における相対湿度が４０〜８０％の条件下（ただし、ニストース純度７１％の場合は、実施例２の結果も考慮して５０％未満）でエージングさせることにより、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いの発生が抑制されているニストース結晶含有粉末を得ることができた。前記結晶含有粉末の水分含量は７．９〜１４重量％の範囲内であった。工程（Ｄ）の結果から、前記結晶含有粉末に含まれているグルコン酸含量は、０．２〜０．７重量％の範囲内であった。

なお、前記した範囲の中でも、特に好ましい性質（流動性の評価が４〜５、粉舞いの発生が−）を有するニストース結晶含有粉末は、ニストース純度が８３〜８９％、ニストース結晶中のグルコン酸含量が０．２〜０．５重量％、及び水分含量が８〜１２重量％の範囲内の性質を有していた。前記結晶含有粉末は、３０℃における相対湿度が４０〜６０％で１〜１４日間エージングすることによって得られた。

実施例２：ニストース結晶含有粉末の分散度測定

実施例１の工程（Ｅ）にしたがって得られた、ニストース純度７１％・８３％・８９％の結晶含有粉末、及び、特許文献１に記載されたニストース含有率（純度）９５％・９９％のニストース結晶を用いて、分散度を測定した。なお、エージング条件は、０日目（予備乾燥後）、３０℃における相対湿度４０％、５０％でそれぞれ３日間とした。

粉体特性評価装置（製品名：パウダテスタＰＴ−Ｅ、ホソカワミクロン製）を用いて分散度を測定した。分散度測定用ユニットの最上部に、調製したサンプル１０ｇ（＝Ｗ）を量り入れて、下部に置いたウォッチグラスの上にサンプルを落下させた。ウォッチグラスの上に積もったサンプル重量（＝Ｗ１）から、以下の計算式によって分散度を求めた。結果を表５に示した。また、それぞれのサンプルの粉舞いの評価を実施例１と同様に行い、表５に結果を示した。

分散度（％） ＝ （Ｗ−Ｗ１）／ Ｗ ×１００

ニストース純度が９５％及び９９％の結晶含有粉末についてはいずれの試験区においても粉舞いが発生した。前記試験区の分散度は２７％以上であった。一方、ニストース純度が７１〜８９％の結晶含有粉末を３０℃における相対湿度４０〜５０％でエージングしたサンプル（水分含量８．８〜１２．２重量％）は粉舞いが発生しなかった。前記試験区の分散度は１０〜２５％であった。ただし、ニストース純度７１％の結晶含有粉末を相対湿度５０％でエージングしたサンプルは、塊が存在する状態であった。したがって、粉舞いの発生が抑制されたニストース結晶含有粉末の分散度は１０〜２１％であった。実施例１で特に好ましい性質が得られた、ニストース純度８３〜８９％の結晶含有粉末については、分散度は１２〜２１％を示した。

実施例３：ニストース結晶含有粉末の融点測定

実施例１により得られたニストース純度が７１％、８３％、８９％の結晶含有粉末について、７０℃に設定した減圧乾燥機で一昼夜乾燥したサンプル（予備乾燥品）、及び３０℃における相対湿度６０％で３日間エージングしたサンプル（エージング品）を用いて融点を測定した。あわせて、実施例１の工程（Ｄ）の前処理温度を調整することによって得られたニストース純度８５％、８０％、７５％の結晶含有粉末についても、同様にエージングして融点を測定した。測定は、日本食品分析センターに依頼して、透明融点法で実施した。結果を表６に示した。

表６の結果より、ニストース純度７５〜８９％の結晶含有粉末の融点は１２８〜１５０℃であった。エージングされたニストース純度７１〜８９％の結晶含有粉末の融点は、１２２〜１３８℃であった。エージングされたニストース純度８３〜８９％の結晶含有粉末の融点は、１２８〜１３８℃であった。

実施例４：ニストース結晶含有粉末の製造（２）;工程（Ｂ）カタラーゼ添加検討

工程（Ａ）及び工程（Ｂ）
スクロース５７８ｇを蒸留水１３５０ｇで溶解して、スクロース３０重量％を含有する基質溶液を調製した。基質溶液を３Ｌジャーファーメンターに入れて、以下の酵素を添加して反応を開始した。

全試験区に添加：β−フルクトフラノシダーゼ（参考例１）８，７００Ｕ。

各試験区に添加：グルコースオキシダーゼとして、以下の酵素をそれぞれ添加した。
（１）ハイデラーゼ１５（天野エンザイム製）２７，２００Ｕ。
（２）マキサザイム（ＤＳＭジャパン製）２７，４００Ｕ。
（３）ベイクザイム（ＤＳＭジャパン製）２７，３５０Ｕ。
（４）スミチームＧＯＰ（新日本化学工業製）２７，２５０Ｕ。
（５）スミチームＰＧＯ（新日本化学工業製）２７，２５０Ｕ。
なお、グルコースオキシダーゼの酵素単位（Ｕ）は以下のように測定した。グルコースを基質としてグルコースオキシダーゼを作用させて、過酸化水素を生成させた。生成した過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びフェノールの存在下において、パーオキシダーゼを作用させて、発生したキノイミン色素を波長５００ｎｍで測定して定量した。ｐＨ７．０の条件で１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１単位（Ｕ）とした。

カタラーゼ添加なしの試験区では、β−フルクトフラノシダーゼと前記グルコースオキシダーゼ１種を添加して反応を開始した。カタラーゼを添加した試験区では、β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼ１種に加えて、以下の酵素を添加した。レオネット（ナガセケムテックス製）１００，０００Ｕ。

酵素反応条件は、温度：３０℃、ｐＨ：６．０、攪拌速度：８００ｒｐｍ、通気量：３Ｌ／分とした。酵素反応開始から０〜８時間まで１時間ごとにサンプリングを行った。得られた各反応溶液について、実施例１に記載の方法にしたがって糖組成分析を行った。結果を以下の表に示した。表７：ハイデラーゼ１５＋カタラーゼ、表８：ハイデラーゼ１５（カタラーゼ無添加）、表９：マキサザイム＋カタラーゼ、表１０：マキサザイム（カタラーゼ無添加）、表１１：ベイクザイム+カタラーゼ、表１２：ベイクザイム（カタラーゼ無添加）、表１３：スミチームＧＯＰ＋カタラーゼ、表１４：スミチームＧＯＰ（カタラーゼ無添加）、表１５：スミチームＰＧＯ＋カタラーゼ、表１６：スミチームＰＧＯ（カタラーゼ無添加）。

ハイデラーゼ１５（表７〜８）、及び、スミチームＧＯＰ（表１３〜１４）については、カタラーゼ添加区と無添加区とで糖組成に大きな変化がみられなかった。いずれの試験区でも、ニストース含有率は５０％以上であり、かつ、フラクトース転移反応を阻害するグルコースの含有率は１０%未満に維持されていた。

一方、マキサザイム（表９〜１０）、ベイクザイム（表１１〜１２）、及びスミチームＰＧＯ（表１５〜１６）については、カタラーゼ添加区ではいずれもニストース含有率が５０％を超えるのに対して、カタラーゼ無添加区ではニストース含有率が３３％未満であった。また、グルコース含有率は反応開始から２時間を経過した時点で１０％以上となった。カタラーゼ無添加区でニストース含有率が低い理由として、グルコースオキシダーゼがグルコースに作用することによって生成される過酸化水素が反応溶液中に蓄積すること、引き続き反応溶液中にヒドロキシラジカル等が発生すること、前記ヒドロキシラジカル等がグルコースオキシダーゼを失活させることが推測される。

なお、ハイデラーゼ１５及びスミチームＧＯＰは、副活性としてカタラーゼを含むことが知られている。したがって、ハイデラーゼ１５及びスミチームＧＯＰについては、酵素製剤中の副活性であるカタラーゼ活性によって生成した過酸化水素が分解されたものと推測される。

実施例５：ニストース結晶含有粉末の製造（３）；結晶化を阻害する成分に関する検討１

工程（Ｄ）の結晶を得る工程において、グルコン酸、酵素、フラクトシルニストース（ＧＦ４）を添加したモデル溶液を用いて結晶化に影響を及ぼす成分について検討した。

実施例１の工程（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）にしたがって、結晶化前のニストース含有画分を得た。ただし、酵素反応条件は以下のように設定した。
使用酵素：
参考例１のβ−フルクトフラノシダーゼ ４，３８２ Ｕ
グルコースオキシダーゼ（ハイデラーゼ１５） ２２，０００ Ｕ
カタラーゼ（レオネット） １００，０００ Ｕ
基質溶液： スクロース５７８ｇを蒸留水１３５０ｇで溶解（Ｂｒｉｘ３０）
温度 ： ３０℃
ｐＨ ： ７．３
通気 ： ３Ｌ／ｍｉｎ
攪拌数 ： ８００ｒｐｍ
反応時間： ２４時間
電気透析： 脱塩液の電気伝導度が０．８ｍＳ／ｃｍ以下となったら終点とする（すなわち、グルコン酸濃度を０．１〜２．０重量％に調整）。

前記ニストース含有画分の糖組成は以下のとおりであった。フラクトース２．６重量％、グルコース０重量％、スクロース３．０重量％、１−ケストース２０．５重量％、ニストース６２．０重量％、フラクトシルニストース１１．９重量％。

モデル溶液（１）として、フラクトシルニストースを含有しない糖溶液を調製した。以下に示した配合で、既存の各糖成分を脱イオン水に溶解した。フラクトース３．６重量％、スクロース１．７重量％、１−ケストース３２．２重量％、ニストース６２．３重量％。

モデル溶液（２）として、グルコン酸を豊富に含有する糖溶液を調製した。モデル溶液（２）には、前記モデル溶液（１）に対して、グルコン酸ナトリウム（和光純薬工業製、特級）を３．３重量％添加した。

モデル溶液（３）として、失活させた酵素溶液を追加した糖溶液を調製した。本実施例５で前記した使用酵素３種を前記した比率で混合して脱イオン水に溶解して、酵素溶液を調製した。調製した酵素溶液を十分に煮沸して失活させた後、０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ過後の酵素溶液をモデル溶液（１）に添加した。モデル溶液（３）に含まれている酵素溶液の濃度は、前記したニストース含有画分中に含有する酵素単位と同等になるように調整した。

モデル溶液（４）として、フラクトシルニストースを豊富に含有する糖溶液を調製した。以下に示した配合で、既存の各糖成分を脱イオン水に溶解した。フラクトース５．４重量％、グルコース２．３重量％、スクロース３．３重量％、１−ケストース１１．６重量％、ニストース６２．４重量％、フラクトシルニストース１４．７重量％。

工程（Ｄ）において、ロータリーエバポレーターで、前記ニストース含有画分、モデル溶液（１）〜（４）をそれぞれ濃縮して糖固形分濃度７５重量％とした。それぞれの濃縮後の溶液に、糖固形分濃度に対して０．１重量％の種晶（ニストース結晶）を攪拌しながら添加して晶析を開始した。晶析開始時の温度は５５℃とした。前記溶液を、約４０時間かけて徐々に温度を下げて、４０〜４５℃まで下げて結晶を析出させた。晶析操作の後、小型遠心分蜜機を用いて分蜜を行い、ろ布内に残った結晶を７０℃で減圧乾燥させた。ニストースの回収率と純度を算出した。結果を表１７に示した。

表１７の結果において、モデル溶液（４）については、前記した条件ではニストースの結晶がほとんど析出しなかったため、結晶の回収ができなかった。また、フラクトシルニストースが１１．９重量％含まれているニストース含有画分については、結晶の回収率が低く、具体的には１１％であった。一方、フラクトシルニストースを含有しないモデル溶液（１）〜（３）については、グルコン酸又は酵素溶液を含有しているにも関わらず、結晶回収率は良好であり、具体的には約４０％であった。これらの結果から、結晶化前の溶液におけるフラクトシルニストース含有率が１２％以上である場合は、ニストース結晶の回収率が低下する傾向があると考えられた。

実施例６：ニストース結晶含有粉末の製造（３）；結晶化を阻害する成分に関する検討２

実施例５と同様にして、ニストース含有率及びフラクトシルニストース含有率が異なるモデル溶液（５）〜（９）を調製して、ニストース結晶の回収率と純度に及ぼす影響について検討した。結果を表１８に示した。

表１８の結果から、ニストース含有率が５５重量％以上であり、かつ、フラクトシルニストース含有率が１０．２重量％以下である場合は、ニストース結晶を良好に回収することが可能であった。

実施例７：ニストース結晶含有粉末の製造（４）；結晶化におけるグルコン酸含量の影響

実施例１の工程（Ａ）〜（Ｂ）と同様に実施して、ろ過後の反応溶液として「溶液７」を得た。工程（Ａ）の酵素反応時間は２４時間とした。前記「溶液７」を用いて、実施例１の工程（Ｃ）にしたがって電気透析を７．５時間実施して、電気伝導度が０．８ｍＳ／ｃｍ以下の「ニストース含有画分７ａ」と「グルコン酸含有画分７ｂ」を得た。続いて、前記ニストース含有画分７ａの固形分濃度が８０重量％となるまでエバポレーターを用いて濃縮して、濃縮後の溶液として「母液７１」を得た。前記母液７１の糖組成は以下のとおりであった。フラクトース２．５重量％、グルコース０．５重量％、スクロース２．３重量％、１−ケストース２３．９重量％、ニストース６１．６重量％、フラクトシルニストース９．２重量％。母液７１のグルコン酸含量は１．０重量％であった。

母液７１に対して、前記グルコン酸含有画分７ｂを固形分濃度が８０重量％となるまでエバポレーターを用いて濃縮した溶液を添加して、グルコン酸含量が１．０、５．０、１０、２０、４０重量％となるようにそれぞれ調整した。

工程（Ｄ）：表１９に示された試験区の各母液に、糖固形分濃度に対して０．１重量％の種晶（実施例１と同様のニストース結晶）を攪拌しながら添加して晶析を開始した。晶析開始時の温度は５５℃とした。前記溶液を、約４０時間かけて徐々に温度を下げて、４０〜４５℃まで下げて結晶を析出させた。晶析操作の後、小型遠心分蜜機を用いて分蜜を行い、ろ布内に残った結晶を７０℃で減圧乾燥させて、ニストース結晶を得た。溶液７に対しては、ロータリーエバポレーターを用いて糖固形分濃度８０重量％となるまで濃縮した後、前記母液と同様の操作を行ってニストース結晶を得た。得られた結晶の糖組成、グルコン酸含量、結晶の回収率をそれぞれ分析又は算出した。結果を表１９に示した。

表１９の結果より、工程（Ｄ）に用いる溶液中のグルコン酸含量が１．０〜２０重量％である場合（母液７１〜７２０）は、ニストース結晶を得ることができた。ただし、前記グルコン酸含量が２０重量％の場合（母液７２０）は、同含量が１０重量％の場合（母液７１０）よりも結晶の回収率が約１０％減少した。また、工程（Ｃ）として電気透析を実施しない場合（溶液７）、及び母液中のグルコン酸含量が４０重量％である場合（母液７４０）は、ニストース結晶を得ることができなかった。

工程（Ｅ）：得られたニストース結晶について、実施例１の工程（Ｅ）と同様に水分調整した後、水分含量の変化、流動性、粉舞い、及び分散度（実施例２を参照）を評価した。前記水分調整は、３０℃における相対湿度５０％で７日間エージングすることにより実施した。結果を表２０に示した。

さらに、７名の専門パネルが、得られたニストース結晶含有粉末の呈味を官能評価した。評価点数は、甘味及び塩味をそれぞれ１０段階（１：強い〜１０：弱い）、総合的な味の好ましさをそれぞれ１０段階（１：好ましい〜１０：好ましくない）とした。７名の評価点数の平均値を算出して、表２０において以下のように示した。平均値１〜２：＋＋＋、３〜５：＋＋、６〜８：＋、９〜１０：−。

表２０の結果から、ニストース純度が８２〜８５％を有する結晶含有粉末において、ニストース結晶中のグルコン酸含量が０．３〜１８．６重量％である場合は、取扱いに適した流動性を有し、かつ、粉舞いの発生が抑制されていた（評価：３〜４，−）。また、分散度は１７．９〜１９．６％を示した。前記結晶含有粉末の水分含量は７．１〜８．４重量％の範囲内であった。ただし、ニストース結晶中のグルコン酸含量が１０重量％の場合は、甘味に加えて塩味が感じられた。さらに、同グルコン酸含量が２０重量％の場合は、甘味はほとんど感じられず、塩味が非常に強く感じられた。本発明の結晶含有粉末において、酸味はほとんど感じられなかった。

Claims (9)

1. ニストース含有率が７１〜９０重量％であり、
   ニストース結晶の総重量に対して０．２〜１８．６重量％のグルコン酸を含有し、
   ７．９〜１４重量％の水分含量を有し、かつ、
   分散度が、１０〜２１％である、
   ニストース結晶含有粉末。
2. 融点が、１２８〜１５０℃である、請求項１に記載のニストース結晶含有粉末。
3. ニストース含有率が、８３〜８９重量％である、請求項１または２に記載のニストース結晶含有粉末。
4. ニストース結晶の総重量に対して０．２６〜１．０重量％のグルコン酸を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のニストース結晶含有粉末。
5. 水分含量が、８〜１４重量％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のニストース結晶含有粉末。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のニストース結晶含有粉末の製造方法であって、以下の工程：
   （Ａ）β−フルクトフラノシダーゼとグルコースオキシダーゼとを含有する酵素溶液とスクロースを反応させることによりニストースを生成させる工程；
   （Ｂ）反応液中のグルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸に変換させる工程；
   （Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）で得られた溶液中のグルコン酸含量を０．１〜２０重量％に調整する工程；
   （Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液からニストース結晶を得る工程；および、
   （Ｅ）工程（Ｄ）で得られたニストース結晶の水分含量を調整する工程
   を含んでなる、方法。
7. 工程（Ｃ）で得られた溶液中のニストース含有率が５５重量％以上であり、かつ、フラクトシルニストース含有率が１２重量％未満である、請求項６に記載の方法。
8. 工程（Ｃ）において、グルコン酸含量の調整が、電気透析により行われる、請求項６または７に記載の方法。
9. 工程（Ｂ）において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去する工程をさらに含んでなる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。