MXPA04000697A - Levaduras para la obtencion de jarabes enriquecidos en glucosa y fructosa. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un proceso para la obtencion de jarabes ricos en fructosa o en glucosa, utilizando cepas seleccionadas de levadura para la depuracion de mieles y jarabes. La invencion proporciona cepas de levaduras tolerantes a concentraciones altas de azucares que son utilizadas para la obtencion de jarabes ricos en fructosa y en glucosa a partir de jarabes y mieles con alta concentracion de glucosa y fructosa obtenidos por depuracion quimica, bioquimica y biologica de mieles intermedias de Ingenio o melazas, asi como mezclas de melazas con jarabes de sacarosa invertida y jarabes fructosados grado 42. Las cepas referidas son capaces de consumir selectivamente fructosa o glucosa. Dos son cepas fructofilicas (Zygosaccharomyces rouxii MD y Candida etchellsii ML), y dos glucofilicas (Saccharomyces cerevisiae MPlla, y Issatchenkia orientalis LG). La invencion permite el aprovechamiento de las mieles ricas en sacarosa que bajo inversion quimica o enzimatica generan mieles invertidas, con concentraciones equimolares de glucosa y fructosa. La produccion de jarabes ricos en fructosa o en glucosa se realiza por el metabolismo selectivo de uno , solo de los azucares, por fermentacion por las cepas referidas. Los jarabes fructosados o glucosados obtenidos son competitivos en el mercado de edulcorantes liquidos.

Description

LEVADURAS PARA LA OBTENCIÓN DE JARABES ENRIQUECIDOS EN GLUCOSA Y FRUCTOSA DESCRIPCION CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al área de biotecnología alimentaría, particularmente a la de biotecnología de edulcorantes, y más específicamente al uso de microorganismos con propiedades bioquímicas específicas para generar a partir de azúcares de caña o de maíz, jarabes que contienen mayor concentración de glucosa o mayor concentración de fructosa que el jarabe original, y que son utilizables para la formulación de mieles, jarabes de azúcares, bebidas refrescantes y materias primas para la obtención de otros compuestos derivados de glucosa, azúcares invertidos y fructosa.

ANTECEDENTES Se puede considerar que una de las posibilidades para que la industria cañera mexicana se pueda mantener como proveedor de azúcar industrial, consiste en producir azúcar líquida de caña con un costo más bajo para ser un sustituto competitivo de los jarabes de maíz de alta fructosa (J AF) importados, ya que se estima que a corto plazo los consumidores industriales de azúcar utilizarán en su totalidad azúcar líquido como materia prima, dejando al azúcar estándar o refinada solo para consumo directo. De los edulcorantes, los azúcares líquidos son en la actualidad la fuente principal de azúcar en la industria alimentaria por diversas razones: menor costo de producción, mermas despreciables, un manejo más económico y práctico (ya que al contener de 23 a 33.5 % de agua el transporte es por medio de camiones o pipas) y alta calidad. Esto es posible debido a que se tiene una tasa de recuperación de azúcar líquido a partir de azúcar estándar muy alta (99.5%) y el gasto energético es muy reducido. Además, las posibles fuentes de obtención de i azúcares para formulaciones líquidas son variadas: maíz, remolacha, caña, vegetales y frutas con alto contenido de fructosa (Ray Junk y Pancoast, 1973).

Existen varios tipos de azucares líquidos disponibles en el mercado, estos han sido desarrollados a través de los años en respuesta a necesidades específicas de los productores de alimentos. Los tipos más importantes de azúcares líquidos son el azúcar líquido de sacarosa y el azúcar líquido invertido. El azúcar líquido de sacarosa convencional fue el primero de los azucares líquidos, y es elaborado por la disolución en agua de azúcar granulada refinada. En años recientes otro líquido de grado industrial disponible en el mercado es el fabricado por un proceso directo sin pasar a través de un paso de cristalización, o es elaborado por una segunda disolución de azúcar granulada. La mayoría de los líquidos de sacarosa preparados a partir de azúcar granulada pasan por un paso de filtración para refinar el producto. Otras soluciones de sacarosa son refinadas por filtración y un tratamiento de intercambio de iones. Los azúcares líquidos de sacarosa se caracterizan por su bajo contenido de cenizas. Los líquidos hechos de azúcar granulada generalmente tienen un contenido de cenizas de 0.01 % o menor, mientras que los refinados por intercambio de iones contienen la mitad o menos, dependiendo de la eficiencia del tratamiento (Ray Junk y Pancoast, 973). Los azúcares líquidos de sacarosa se emplean en productos en los que no se desea una inversión, como son en helados, bebidas cítricas carbonatadas y dulces. La desventaja del azúcar líquido es su baja concentración de sólidos solubles (66.5 - 68 °Bx). A estas densidades, el producto es susceptible a la contaminación por levaduras y hongos. Para evitar el deterioro por microorganismos, algunos fabricantes ajustan el pH de la sacarosa líquida a 8, tal y como lo describen Leethem y Eis, 1963). En el caso del azúcar líquido invertido la solución de sacarosa se somete a un proceso de hidrólisis. La hidrólisis de sacarosa teóricamente produce una mezcla 50:50 de D-glucosa (dextrosa) y D-fructosa (levulosa). Si la hidrólisis no se completa, pueden quedar residuos de sacarosa en el producto. El término azúcar invertido fue aplicado al hidrolizado porque el plano de luz polarizada, que inicialmente rota a la derecha para una solución de sacarosa, al llevarse a cabo la hidrólisis, el plano de la luz polarizada se invierte y rota a la izquierda para la mezcla de monosacáridos. Existen tres métodos para la fabricación de estos azucares: 1) con ácidos orgánicos débiles o minerales fuertes; 2) con la enzima invertasa, y 3) con resinas de intercambio iónico (Royer, 1973). Los azúcares líquidos invertidos están disponibles en el mercado como productos con porcentajes variables de azúcar invertido, que oscilan entre 10 y 90 % del total de los azúcares. Estos jarabes se producen a mayores concentraciones que los de sacarosa, ya que la presencia de los monosacáridos minimiza el peligro de cristalización. En la mezcla de azúcares la fructosa presenta la mayor solubilidad, lo cual favorece la retención de agua, y reduce la tendencia de que la sacarosa presente se cristalice (Ray Junk y Pancoast, 1973; Royer, 1973). Los azúcares líquidos en sus diferentes porcentajes de inversión son muy populares debido a que su alta concentración los hace resistentes al crecimiento de levaduras y mohos, y permiten almacenar más azúcar y menos agua en un tanque, además de disminuir el costo del flete por unidad de sólidos durante la distribución del jarabe. El azúcar invertido al 50% puede alcanzar concentraciones de 77 °Bx y almacenarse a temperatura ambiente sin la formación de cristales. Estos jarabes medio invertidos o de inversión media contienen sólo 23 % de agua en comparación con 33.5 % de agua que como mínimo debe tener un jarabe de sacarosa pura para almacenarse en forma estable. Los azúcares líquidos invertidos son ampliamente usados en bebidas carbonatadas, enlatadas, frutas en almíbar, mermeladas, dulces entre otros muchos productos (Ray Junk y Pancoast, 1973).

Entre los azúcares naturales el caso más relevante de los últimos diez años ha sido el jarabe de maíz de alta fructosa (JMAF en español, o HFCS por sus siglas en inglés), conocido en Europa como isoglucosa. Este producto es resultado de importantes adelantos tecnológicos que han hecho posible la producción a partir del maíz, de un agente edulcorante comercialmente aceptable y que abre la posibilidad de emplear otras fuentes de carbohidratos en el futuro. Los jarabes fructosados son mezclas liquidas de glucosa y fructosa obtenidas por hidrólisis del almidón seguidas de una etapa de isomerización. Los jarabes fructosados se obtienen industrialmente por el tratamiento enzimático del almidón. Se han desarrollado comercialmente tres tipos de jarabes fructosados, JMAF42, JMAF55 y J AF90 (El número corresponde al porcentaje de fructosa del total de azúcares, Cordovés, 1988). El JMAF 42 se fabrica a partir de la transformación de almidón de maíz. El almidón de maíz suspendido en agua es continuamente licuado por el uso de alfa-amilasa a temperaturas elevadas. El hidrolizado licuado tiene un equivalente dextrosa (DE) en el intervalo de 10 a 20. Después, el pH y la temperatura se ajustan, para que el hidrolizado sea sacarificado mediante un tratamiento con la enzima glucoamilasa, hasta alcanzar un contenido de dextrosa de entre 94 y 96 %. El licor sacarificado es refinado por filtración para remover sólidos insolubles, y por un tratamiento posterior con carbón clarificante e intercambio de iones. La solución de glucosa refinada es isomerizada pasándola a través de reactores que contienen glucosa isomerasa inmovilizada. La solución recuperada de los reactores, tiene un contenido de fructosa de aproximadamente 42% y se refina con carbón activado para producir un jarabe de menos de 70% de sólidos (Inglett, 1981). Mediante el uso de cromatografía de intercambio iónico se puede separar la fructosa de la glucosa para purificarla. De la cromatografía se recupera un jarabe de fructosa al 90% que permite enriquecer los jarabes obtenidos de isomerización (JMAF-42) para producir JMAF-55 y jarabes de otros grados. Un JMAF-55, contiene 55% de fructosa, 40% de glucosa y 5% de oligosacáridos en un jarabe de 77% de sólidos totales. El HFCS 90%, contiene 90% de fructosa, 7% de glucosa, y3% de sacáridos superiores en un jarabe que contiene 80% de sólidos totales (Inglett, 1981).

El jarabe de maíz tiene mayor poder edulcorante que la sacarosa, es hipocalórico y actualmente se produce a un menor costo en relación al azúcar de caña, por lo cual, es ampliamente usado como aditivo en la industria de alimentos en sectores como: pastelería y confitería, postres congelados, frutas enlatadas, mermeladas, aderezos para ensaladas, sustitutos de mieles, vinos, yoghurt y muy especialmente, en bebidas refrescantes (Trejo -Estrada, 1998).

Otro tipo de jarabes, los glucosados, son soluciones de glucosa a alta concentración obtenidos por la hidrólisis enzimática del almidón de maíz. La tecnología de la glucoamilasa aplicada al proceso de conversión del almidón tiene grandes beneficios económicos resultado de las altas concentraciones de almidón que pueden ser usados en el proceso, lo cual requiere menos energía en pasos subsecuentes de evaporación y por lo tanto se pueden tener altas producciones de glucosa junto con un producto de gran pureza. Hoy en día encuentra múltiples usos principalmente en la industria biotecnológica (Inglett, 1981).

El sector azucarero está sufriendo una decadencia por la competencia de los JMAF sobre su producto. Estados Unidos de América es el mayor productor mundial de JMAF, con alrededor de 18 millones en 1996, este valor supera su mercado interno de aproximadamente 9.7 millones de toneladas anuales, originando un gran excedente para exportación.

Los jarabes de sacarosa o las mieles derivadas del procesamiento de la caña permiten la obtención de azúcares invertidos por la aplicación de invertasas (microbianas o vegetales) o por el tratamiento con ácidos fuertes. Dichos tratamientos permiten la generación de jarabes cuyo contenido de glucosa y fructosa es equimolar, y que pueden por hidrólisis parcial dejar una proporción de sacarosa sin hidrolizar. Por otra parte, el almidón obtenido de maíz u otros sustratos amiláceos pueden ser tratados con ácidos diluidos en combinación con amilasas y glucoamilasas o solamente por tratamiento enzimático. Dichos tratamientos permiten que el almidón pueda transformarse en glucosa. La glucosa así obtenida puede posteriormente tratarse con glucosa isomerasa para la obtención de jarabes que contienen glucosa y fructosa. Por métodos químicos y enzimáticos se puede obtener a partir de almidón un jarabe que contiene 42-45% de fructosa, 55-57% de glucosa, y una pequeña proporción de oligodextrinas, maltosa y maltotriosa. Los métodos existentes para transformar jarabes invertidos de caña (50% glucosa y 50% fructosa) o jarabes de maíz grado 42 (55% glucosa y 42% fructosa) en jarabes con contenido superior a 54% de fructosa, o contenido superior a 70% de glucosa, se basan en sistemas de cromatografía, métodos de cristalización diferencial de monosacáridos, y métodos biotecnológicos de catabolismo diferencial. Ejemplos de dichos métodos son las patentes de Heady (1981 y 1982), y de Ramos Lazcano et al (1993), cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia. Los métodos cromatográficos dependen de la utilización de sistemas de intercambio iónico que se utilizan industrialmente para la generación de jarabes líquidos de fructosa grado 90 (fructosa 90%). El nivel de refinación del jarabe para someterlo a intercambio iónico es muy alto, ya que las sales presentes en mieles intermedias y finales de caña saturan las resinas e impiden la separación de monosacáridos (patentes, Leiser et al 1982; Pansolli, et. al. 1984; Dhingra et al 1993). La cristalización selectiva de glucosa a partir de jarabes invertidos de caña de azúcar que opera a nivel industrial, genera como licor madre de cristalización un jarabe enriquecido en fructosa. Dicho proceso requiere de una infraestructura de cristalización industrial a vacío con un preciso control de temperatura. Las temperaturas a las que opera pueden provocar la destrucción de azúcares y el oscurecimiento de los jarabes (Cordovés 1988). Otros métodos, dependen de la cristalización selectiva de sales inestables de fructosa por la aplicación de tierras alcalinas tales como Mg(OH)2 y Ca(OH)2. Dicho procedimiento es muy costoso debido a la necesidad de aplicar frío para la formación rápida de fructosatos. La recuperación de los azúcares libres requiere de procesamiento químico para la remoción de los cationes divalentes, y de procesos de clarificación y refinación. Los métodos biológicos existentes radican en la utilización de microorganismos que catalizan la biosíntesis de polisacáridos tales como levan, pululan o dextranas (Heady, 1983;Fan, 1988; Paul et al, 1989) a partir de medios de fermentación basados en jarabes de azúcar invertido. La recuperación de la fructosa o glucosa a partir de los medios de fermentación incluye la aplicación de solventes que permiten la precipitación de los polisacáridos, y la hidrólisis química o enzimática de los polisacáridos recuperados. Los sobrenadantes de fermentación residuales del tratamiento para precipitación, contienen altas concentraciones de solventes y bajas concentraciones de monosacáridos residuales (glucosa o fructosa, según el caso). La patente norteamericana No. 4,797,360 de Doelle involucra la fermentación de jarabes puros de sacarosa utilizando una cepa de Zymomonas mobilis que tiene la capacidad de consumir selectivamente la glucosa y producir alcohol en jarabes diluidos. Dicho procedimiento depende de la utilización de materias primas con pureza muy elevada, en soluciones diluidas como base del medio de fermentación.

En contraste, en la presente invención no se requiere de equipamiento sofisticado de cristalización o de sistemas de enfriamiento, ni de métodos cromatográficos para la separación de los monosacáridos. En esta invención se utilizan cepas seleccionadas de levaduras capaces de crecer en soluciones concentradas de azúcar Invertido, levaduras capaces de crecer y fermentar en medios con alta concentración de productos de caramelización tales como mieles intermedias y finales de Ingenio. Después de una dilución de la miel o jarabe invertido, la inoculación con estas levaduras permite la depuración selectiva de glucosa o fructosa, y el enriquecimiento del jarabe con respecto al monosacárido correspondiente. La invención aquí descrita permite además la recuperación del etanol producido en la fermentación, y la recuperación de levaduras útiles para la generación de biomasa forrajera o fermentativa.

El presente trabajo constituye una aportación para establecer una base biotecnológica que permita la producción de jarabes de azúcar de caña, competitivos en el mercado de los azúcares líquidos.

El procedimiento consiste en la conversión de las mieles de ingenio o melazas (definidas como el efluente final obtenido en la preparación de azúcar por cristalización repetida del cual la sacarosa cristalina no puede obtenerse de forma simple), mieles intermedias, jarabes de sacarosa refinada, y mezclas de los anteriores con jarabes de maíz, para la producción de jarabes edulcorantes enriquecidos en monosacáridos. Los productos, originados a partir de azúcar de caña, se obtienen por tratamiento enzimático, microbiológico y químico, y permiten la generación de azúcares líquidos estables y de alto poder edulcorante.

Para tal fin se utilizan levaduras osmotolerantes que son aquellas levaduras capaces de crecer a bajos valores de actividad de agua (aw) o a altas concentraciones de sólidos (sal o azúcar), acidez alta, y alta proporción carbón/nitrógeno (Jermini et. al., 1987; Restaino et al, 1983; Tilburi, 1976; Walker y Ayres, 1970). El término osmofílico primero fue usado por von Richter pero este puede ser engañoso ya que la presión osmótica no es un factor fisiológico de estas levaduras ( unitis et al., 1976; Jermini et. al., 1987b). Varios autores han propuesto definiciones de osmotolerancia; la mayoría basados en la habilidad para crecer a una concentración particular de azúcar o aw. En el tratado de Kreger-van Rij la osmotolerancia es probada por la habilidad de los microorganismos para crecer en agar con 50% (w/w) de glucosa. Sin embargo, las levaduras capaces de crecer en glucosa al 50 % (w/w) (aw 0.909 a 30 °C) han sido definidas como "osmotolerantes" y aquellas capaces de crecer en fructosa a 60% (w/w) (aw 0.837 a 30 °C) han sido llamadas "altamente osmotolerantes" (Jermini y Schmidt, 1987a). En el presente trabajo se usará el término osmotolerante para referirnos a las levaduras que son capaces de crecer en medios líquidos y sólidos con concentraciones superiores a 40% de azúcares.

Debido a que las levaduras osmotolerantes compiten pobremente con otros microorganismos en ambientes no selectivos, los parámetros antes mencionados llegan a ser importantes favoreciendo el crecimiento de estas levaduras. Las levaduras osmotolerantes son los principales organismos contaminantes en alimentos como: miel, jarabe de maple, caña de azúcar, jarabes de fruta, dulces, mermeladas, gelatinas, concentrados de jugos de fruta, frutas secas y jarabes de chocolate. La contaminación de estos productos puede originarse de materia prima altamente contaminada, saneamiento inadecuado durante su preparación o producción debido a la dificultad de limpieza del equipo, empaque inapropiado y mal manejo durante él almacenamiento, e infestación por insectos durante las fases de producción. El producto contaminado usualmente se pone turbio con un fuerte aroma alcohólico. Si el producto es envasado en un contenedor sellado herméticamente, el empaque se empieza a inflar debido a la producción de dióxido de carbono. El crecimiento de levaduras osmotolerantes puede reducir el contenido de sólidos y alterar la solubilidad de solutos que causa que la actividad de agua (aw) de los alimentos aumente (Restaino et al, 1983). La actividad de agua (aw) de un sustrato define la cantidad de agua disponible, y por lo tanto tiene gran influencia en el crecimiento microbiano. El crecimiento máximo no tiene lugar a una aw de 1.00 sino a un punto óptimo menor, dependiendo de la cepa específica. En general, bajando el valor de actividad de agua de un medio creciendo bajo condiciones óptimas resulta en una disminución en la velocidad de crecimiento. Cuando éste llega a cero, los microorganismos mueren o sobreviven en estado latente (Jermini y Schmidt 1987a). La tolerancia de algunas cepas de levaduras a altas concentraciones de azucares es una gran ventaja que se aprovecha en esta invención. Dicha característica permite que los microorganismos puedan proliferar y catabolizar azúcares a concentraciones elevadas, y permite que sin mayor dilución, jarabes azucarados puedan ser fermentados por cultivos de levaduras osmotolerantes. Y que la depuración microbiana se lleve a cabo con mieles poco diluidas a intervalos de entre 35 y 60 °Bx Esta propiedad permite que las mieles depuradas puedan entonces concentrarse a bajo costo hasta niveles de 70 a 75° Bx. La utilización de levaduras convencionales, no osmotolerantes requeriría de mayores diluciones de las mieles, lo que causaría mayores costos de concentración de las mieles depuradas. Microorganismos de este tipo son por tanto ideales en el procesamiento biológico de jarabes y mieles diluidas.

Otra importante característica de las levaduras como grupo microbiano consiste en la capacidad de algunas cepas para catabolizar en forma diferencial glucosa o fructosa. Las levaduras glucofílicas son levaduras que, en presencia de concentraciones equimolares de glucosa y fructosa, consumen rápidamente la glucosa, mientras que las levaduras fructofílicas consumen más rápido la fructosa. En estudios realizados por Ribereau-Gayon et al. (1975), la mayoría de las levaduras encontradas en fermentaciones alcohólicas son del tipo glucofílico. Ciolfi et al. (1983) encontraron que Turolopsis (Candida) stellata, una levadura común en mostos es una cepa fructofílica. Esta cepa consume el 90% de fructosa presente en un medio y solo metaboliza el 5% de la glucosa. Las especies cerevisiae suelen ser glucofílicas, y cuando han consumido alrededor del 50% de la glucosa inicial, 75-80% del azúcar residual es fructosa. Sin embargo, en general se observa que en fermentaciones espontáneas, se consume una mezcla equlmolar de glucosa y fructosa (Delfini - Fórmica 2001 ).

Las cepas de levadura que además de ser tolerantes a altas concentraciones de sólidos sean capaces de asimilar diferencialmente la glucosa de la fructosa o viceversa, constituyen microorganismos muy interesantes para la depuración biológica de soluciones de azúcares invertidos orientada a la producción de jarabes enriquecidos en uno u otro monosacárido.

La capacidad de depuración biológica se puede manifestar en un medio a base de melazas, en el cual un cultivo de una cepa seleccionada de levadura puede catabolizar de forma preferencial la glucosa o la fructosa, dependiendo de la cepa, lo que dejara libre en el medio fructosa o glucosa respectivamente. Procesos posteriores de extracción con etanol y clarificación con tierra de diatomáceas y carbón activado pueden permitir que los jarabes edulcorantes obtenidos estén enriquecidos en fructosa o en glucosa.

El proceso que se describe a continuación provee el procedimiento para la obtención de jarabes glucosados y fructosados a partir de melazas, mieles intermedias, jarabes de sacarosa refinada, y las mezclas de los anteriores con jarabes de maíz. En una primera etapa del proceso se deben hidrolizar o invertir los sustratos (la melaza, miel intermedia y jarabes de sacarosa refinada) vía enzimática, utilizando la enzima invertasa; o mediante hidrólisis ácida, utilizando HCI, para lo cual la melaza se ajusta a 30°Bx, constituyendo el medio de cultivo que se usará para generar un preinoculo, y se esteriliza en autoclave (para asegurar que durante la fermentación solo se desarrollará la cepa de interés). Las cepas a evaluarse se inoculan en este medio, se incuban a 30°C en agitación durante 72 horas para generar biomasa (inoculo), que se utilizará para fermentar las melazas, mieles intermedias, jarabes de sacarosa refinada, y las mezclas con jarabes de maíz. Las células (biomasa) se recuperan centrifugando el medio de cultivo a 8 000 rpm durante 5 min, el sobrenadante se desecha. Las células se inoculan en los diferentes sustratos invertidos (melazas, mieles intermedias, jarabes de sacarosa refinada, o mezclas de los anteriores con jarabes de maíz, pudiéndose utilizar sustratos tales como mieles de abeja, néctares y jugos de frutas y vegetales), que han sido previamente diluidos a concentraciones de entre 35 y 60°Bx. Los cultivos se incuban a 30°C en agitación o en forma estática. Después de la incubación, 3 partes de etanol se mezclan con una parte del mosto fermentado, se agitan vigorosamente para extraer los azúcares residuales (mayoritariamente monosacáridos). Se separa entonces la fase líquida que contiene el etanol con los azúcares extraídos, de las gomas y sales, insolubles, que precipitan y son separados por centrifugación.

Después de un proceso de destilación simple, se obtiene un concentrado rico en azúcares. Dicho concentrado puede entonces clarificarse mediante el uso de tierras diatomáceas y lo carbón activado, con el objeto de obtener jarabes claros que contienen alta concentración de fructosa o glucosa. El contenido de azúcares y la composición de los mismos en los jarabes obtenidos se analizan por Cromatografía Líquida (HPLC) acoplada a detección por índice de refracción.

Evaluación de la capacidad de las cepas de levaduras para asimilar fructosa o glucosa en melazas.

Entre las cepas de levaduras utilizadas en este proceso se encuentran: MPIIa (Saccharomyces cerevísiaé) (N RL registro en tramite), LG {Issatchenkia oríentalis) (NRRL registro en tramite), MD (Zygosaccharomyces rouxii) (NRRL registro en tramite) y ML (Candida etchellsii) (NRRL registro en tramite). Las cepas de levadura se analizaron para determinar su capacidad de asimilar más rápidamente la glucosa o fructosa en sustratos de fermentación a base de melazas (mieles finales) y mieles B (mieles intermedias), obtenidas de Ingenios azucareros. Para la evaluación de asimilación de monosacáridos, se realizaron fermentaciones. Primero se generó un preinoculo como se indicó previamente. Las células se inocularon en matraces con la miel invertida (previamente pasteurizada) ajustada a 45°Bx. Se incubaron en forma estática o agitada y se analizó el consumo de glucosa y fructosa a las 48 y 72 horas de cultivo por HPLC. La técnica de análisis se realizó como sigue: Análisis en HPLC De cada muestra se tomaron 100 µ? y se diluyeron en 9.9 mi de fase móvil (fosfato dibásico de sodio), la solución se homogeneiza por agitación y se hace pasar por cartuchos de extracción en fase sólida de fase reversa C18. Los primeros 4 mi eluidos se desechan y se colecta el resto. La muestra colectada se filtra con membranas de nylon de 0.2 pm de tamaño de poro, y el filtrado se colecta en viales para inyección directa al cromatografo liquido de alta resolución (HPLC por sus siglas en inglés). El equipo usado fue un cromatografo de líquidos de alta resolución (HPLC) marca Hewlett- Packard serie 1100. Se utilizó una columna para análisis de carbohidratos Aminex HPX-87. Las condiciones de los análisis fueron las siguientes: Fase móvil: Na2HP04 10mM; flujo: 0.6 ml/min; volumen de inyección: 20 µ?; temperatura de columna: 80 °C; tiempo de análisis: 20 minutos, detector: índice de Refracción (IR) En la tabla 1 se presentan los porcentajes de fructosa residual de la fermentación de las cepas glucofílicas en miel final parcialmente invertida a 45°Bx, a las 48 y 72 horas de cultivo. En dichas pruebas, la miel fue fermentada en forma aireada (por agitación orbital a 200 RPM) y no aireada (cultivo estático).

Tabla 1. Concentración de fructosa en mieles depuradas or ce as lucofílicas Los resultados de la fermentación de un medio formulado a base de melaza parcialmente invertida, se presentan en la Tabla 1. Dicho medio contenía una concentración de 45.5% de fructosa. Los resultados demuestran que con la cepa MPIIa, por un proceso de fermentación agitada, a las 72 horas de cultivo, se obtuvo una concentración de 59.2% de fructosa y de 54.7% utilizando un proceso de fermentación estática. Utilizando el mismo medio, con la cepa LG, a las 48 horas de cultivo se obtuvo el 56.7% de fructosa por fermentación agitada, mientras que por fermentación estática se obtuvo el 52%. Si el tiempo de cultivo se incrementa a 72 horas, solo se logra incrementar un 0.5% la concentración de fructosa. En general, se observaron mayores tasas de catabolismo de azúcares en las fermentaciones aireadas.

En la tabla 2 se presenta el porcentaje de glucosa residual de la fermentación de las cepas fructofílicas en un medio a base de miel final invertida a 45°Bx. La miel final fue diluida a la concentración de sólidos referida, y posteriormente fermentada tanto en forma agitada como estática. Las muestras para análisis se tomaron a las 48 y 72 horas de cultivo.

Tabla 2. Concentración de glucosa en mieles depuradas por cepas fructofílicas Los resultados de la Tabla 2 indican que con la utilización de la cepa MD se puede alcanzar, a partir de una miel invertida con 54.5% de glucosa, una concentración de hasta 95% de glucosa (en base al total de azucares), concentración que se obtuvo de una fermentación agitada a las 72 horas efe cultivo y de 67% en fermentación estática. A partir del mismo sustrato con la cepa ML en una fermentación agitada a las 48 horas de cultivo se alcanzó una concentración de 88% de glucosa. Los mejores resultados en fermentación estática se obtuvieron a las 72 horas de cultivo donde se pueden registrar concentraciones de hasta el 91% de la glucosa, partiendo del medio a base de melaza parcialmente invertida.

Evaluación del consumo de monosacárídos por la cepa glucofílica MPIIa y la cepa fructofílica ML en miel B invertida a dos concentraciones de sólidos solubles.

Se realizaron pruebas con MPIIa cepa glucofílica, y ML cepa fructofílica para determinar la concentración de sólidos adecuada para realizar las fermentaciones. MPIIa y ML se inocularon en miel B invertida ajustada a 2 concentraciones diferentes, 41 y 56°Bx. La concentración de monosacárídos se determinó a las 24, 48 y 72 horas de fermentación estática.

En la tabla 3 se presentan los resultados del porcentaje de fructosa residual durante la fermentación en miel B invertida con la cepa glucofílica MPIIa, analizada por HPLC. Los resultados indican que la depuración de miel invertida a 41°Bx por la utilización de la cepa MPIIa permite obtener hasta 63% de la fructosa, partiendo de un sustrato que contenía inicialmente 40% de fructosa. Mientras que a 56 °Bx el contenido de este monosacárido se mantiene casi igual al porcentaje inicial.

Tabla 3. Concentración de fructosa en miel B invertida depurada por la cepa MPIIa a dos diferentes concentraciones En la tabla 4 se presentan los porcentajes de glucosa residual durante la fermentación con la cepa fructofílica ML. En miel B invertida y ajustada a 41°Bx el proceso de depuración permite obtener hasta 91% de glucosa a las 48 horas de cultivo, partiendo de un sustrato que contiene inicialmente 60% de glucosa. En miel B ajustada a 56°Bx se alcanza hasta 80% a las 72 horas de cultivo. En fermentaciones realizadas con esta cepa, el consumo de glucosa a 56°Bx ocurre a menor tasa que en un sustrato ajustado a 41 °Bx.

Tabla 4. Concentración de glucosa en miel B depurada por la cepa ML a dos diferentes concentraciones Evaluación del consumo de monosacáridos por la cepa glucofílica MPIIa en mezclas de miel final invertida con jarabes de sacarosa invertida y jarabe fructosado de maíz grado 42. Se realizaron mezclas de miel B invertida (M) con jarabe de sacarosa invertido (S) con las siguientes proporciones: 40:60, 20:80 y 60:40. Por otra parte, se hicieron mezclas de jarabe fructosado de maíz grado 42 (J) que contenían 5, 10 y 20% de miel B invertida (M). Todas las formulaciones se probaron como sustratos de fermentación a tres diferentes concentraciones de sólidos solubles: 35, 42 y 50 °Bx. Se generó un inoculo de la cepa MPIIa como se indicó previamente. El pellet de células de MPIIa obtenido a partir de la centrifugación de 50g de medio de cultivo (aproximadamente 109 células viables) se utilizó para inocular 100g de cada una de las mezclas de M:S y M:J. Se fermentaron en forma estática durante 7 días. El contenido de monosacáridos se analizó a las 72 y 96 horas de cultivo, y a los 7 días por HPLC. En la tabla 5 se presentan los resultados del análisis de fructosa residual de la fermentación por MPIIa en mezclas de Miel B invertida con jarabe de Sacarosa invertido.

Tabla 5. Depuración de mezclas de miel B y jarabe de sacarosa invertido (M:S) por la cepa glucofílica PIIa En los medios que contienen a formulación de 40:60 miel B invertida: sacarosa invertida, la concentración de fructosa inicial es de aproximadamente 48% del total de azucares. Los resultados indican que durante la fermentación de dichos medios, en concentraciones de 35 °Bx la fructosa residual presente a las 72 horas de cultivo (54.3%>) se mantiene en el mismo nivel a las 96 horas (54.7%), y a los 7 días de cultivo alcanza 57.6%. En dicho experimento, la concentración total de fructosa a los 7 días de cultivo es de más de 90% con respecto a la presente en el medio no inoculado, es decir, solo se ha consumido menos de 10% de la fructosa inicial, mientras que se ha consumido más del 40% de la glucosa presente al inicio de la fermentación. En contraste, cuando se emplea un medio con esa formulación, pero a una concentración de 50° Bx la concentración de fructosa que se alcanza a las 72 horas de cultivo (50.8%) se mantiene sin cambio si la fermentación se prolonga por 96 horas o incluso 7 días de cultivo (49.2 y 49.9% respectivamente). En un medio con proporciones 20:80 de miel B invertida: sacarosa invertida, y a una concentración de 35 °Bx , se obtiene la mayor concentración de fructosa (58%) a las 96 horas de fermentación. Con la proporción 60:40, con una menor concentración de fructosa en comparación con las otras formulaciones, la fermentación permite alcanzar niveles de solo 52% de fructosa a las 72 horas de cultivo, por lo que resulta la de menor rendimiento.

En la tabla 6 se presentan los resultados del análisis de fructosa residual de la fermentación por MPIIa en mezclas de Miel B invertida con jarabe de fructosa grado 42.

Tabla 6. Depuración de mezclas de miel B y jarabe de fructosa de maíz grado 42 (M:J) por la cepa glucofílica MPIIa Los resultados indican que con 10 y 20% de miel se puede obtener durante la fermentación hasta un 52% de concentración final de fructosa a 35 °Bx, concentración que se registra a los 7 días de fermentación. Obteniendo mejores resultados con 20 % de miel B a 35°Bx desde las 72 horas de fermentación. En general, ajustando la mezcla de miel B (5, 10 o 20% ) con jarabe fructosado de maíz 42 a 35°Bx se puede generar por fermentación un jarabe con una concentración final de 50% de fructosa.

Obtención de subproductos de fermentación Una vez terminado el proceso de fermentación, es posible recuperar dos subproductos de alto valor agregado, a partir del medio de fermentación. Por una parte, y utilizando métodos simples de filtración o centrifugación, se puede recuperar entre 3 y 5% del peso total del mosto como biomasa de levadura, la cual se ha reportado como útil en la elaboración de alimentos balanceados en la industria pecuaria. El otro subproducto de valor importante es el etanol, que alcanza concentraciones de entre 3 y 9.0 % w/w en el mosto final de fermentación, dependiendo de la cepa y de la composición del sustrato de cultivo. Dicho subproducto puede separarse por destilación simple a temperaturas de entre 60 y 75 °C y analizar su calidad por cromatografía de gases.

Evaluación de la osmotolerancia de las cepas Las cepas MD, LG y MPIIa se cultivaron en placas con medios sólidos con la siguiente composición: medio basal para 1000g: extracto de malta, 3 g ; extracto de levadura, 5 g, glucosa, 10 g; agar, 20 g. Se adicionó glucosa para aumentar la concentración a 10, 20 y 40% para evaluar la tolerancia a azúcares, y para determinar la capacidad de tolerar altas concentraciones de sales se adicionó NaCI a concentraciones de 0, 0.5, 1M y 2 .

En la tabla 7 se presentan los resultados del crecimiento de UFC de las cepas MD, LG y MPIIa en medios con alta concentración de azúcares.

Tabla 7. Tolerancia de las cepas a diferentes concentraciones de glucosa Los resultados presentados indican que la cepa MD tolera bien desde 10 hasta 40% de azúcares por lo que se trata de una levadura osmotolerante. Las cepas LG y MPIIa son osmofílicas puesto que pueden crecer en presencia tanto de altas como de bajas concentraciones de sólidos. Aunque presentan mejor crecimiento a altas concentraciones.

En la tabla 8 se presentan los resultados del crecimiento de UFC de las tres cepas en medios con NaCI.

Tabla 8. Tolerancia de las cepas a NaCI En cuanto a la tolerancia a sales, las cepas MPIIa y MD son tolerantes puesto que presentan mejor crecimiento a concentraciones altas de sal. La cepa LG presenta un óptimo crecimiento a 0.5M de NaCI, viéndose afectado su crecimiento a concentraciones mayores a 0.5M o sin la presencia de NaCI.

Artículo I. Contribuciones de la presente invención en el estado de la técnica Las contribuciones de la presente invención se basan en la utilización de cepas de levaduras que tienen como características esenciales tolerar altas concentraciones de sólidos (azucares y sales) y la capacidad de asimilar mayoritariamente glucosa MPIIa (Saccharomyces cerevisiae) y LG {Issatchenkia oríentalis) para la obtención de jarabes ricos en fructosa (52-60%) y cepas que consumen mayoritariamente fructosa MD (Zygosaccharomyces rouxii) y ML (Candida etchellsif), para la obtención de jarabes ricos en glucosa (60-90%) por depuración de mieles industriales y mezclas de mieles industriales invertidas con jarabes fructosados y jarabes de sacarosa invertida. Trabajos relacionados en cierta medida con esta invención se encontraron en la patente 4,356,262 en donde se describe un proceso para la producción de jarabes de fructosa a partir de sacarosa y mezclas de sacarosa con azúcar invertido y diversas fuentes con alto contenido de sacarosa como melazas de varios grados de pureza. La concentración de los sustratos va de 30 a 50% (w/v) y las reacciones se llevan a cabo a temperaturas de 24 a 32C. Esta invención se basa en la adición de la enzima fructosiltransferasa obtenida de Pullularia pullulans al sustrato, utilizando después levaduras del genero Saccharomyces de las especies cerevisiae y bailii para convertir la glucosa por fermentación a alcohol dejando los polímeros de fructosa intactos y adicionando posteriormente la enzima invertasa para hidrolizar los polímeros de fructosa. Obteniendo un jarabe con un contenido de 66-75% de fructosa y 34-25% de glucosa. En esta invención se trabaja únicamente con levaduras del genero Saccharomyces para la producción de jarabes, mientras que en la presente invención se trabajo con 4 cepas: Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientales, Zygosaccharomyces rouxii y Candida etchellsii. En el proceso descrito en la presente invención no se necesitan separar los azucares del sustrato como en otros procesos, siendo un método simple y no costoso.

No se han encontrado reportes de la utilización de cepas de levaduras osmotolerantes o de la capacidad fructofílica o glucofílica de las cepas en procesos como el que aquí se describe. La tolerancia de las cepas a concentraciones de azucares en los sustratos utilizados para fermentaciones tienen un rango de 45 a 60 °Bx. Mientras que en la patente no. 4356262/1982 utilizaron como sustrato jarabe de sacarosa 40% y melazas, mezclando mieles finales 10% y jugo de caña 90% a una concentración final de 35% w/w. Las 4 cepas utilizadas en esta invención tienen tolerancia a NaCI 1M, no se encontraron reportes de tolerancia a sales en trabajos relacionados. Como producto final del proceso de fermentación de las melazas con las cepas de lavaduras se obtienen jarabes fructosados (52-60%) y glucosados (60-90%). Como subproducto se obtienen alcohol y biomasa de levadura. Que tienen aplicación en el área de alimentos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de levadura en donde la cepa es de la especie Saccharomyces cerevisiae (NRRL registro en tramite) que es tolerante a concentraciones de NaCI de hasta 1M y a concentraciones de azúcar de hasta 40%, capaz de asimilar la glucosa selectivamente a partir de mieles o jarabes invertidos provenientes de sustratos seleccionados del tipo de mieles finales o melazas de Ingenio, mieles intermedias de Ingenio, jarabe de sacarosa refinada y mezclas de las anteriores con jarabe de maíz para la obtención de jarabes enriquecidos en fructosa.

2. Una cepa de levadura en donde la cepa es de la especie Issatchenkia orientalis (NRRL registro en tramite) que es tolerante a concentraciones de NaCI de hasta 1M y a concentraciones de azúcar de hasta 40%, capaz de asimilar la glucosa selectivamente a partir de mieles o jarabes invertidos provenientes de sustratos seleccionados del tipo de mieles finales o melazas de Ingenio, mieles intermedias de Ingenio, jarabe de sacarosa refinada y mezclas de las anteriores con jarabe de maíz para la obtención de jarabes enriquecidos en fructosa.

3. Una cepa de levadura en donde la cepa es de la especie Zygosaccharomyces rouxii (NRRL registro en tramite) que es tolerante a concentraciones de NaCI de hasta 1 y a concentraciones de azúcar de hasta 40%, capaz de asimilar la fructosa selectivamente a partir de mieles o jarabes invertidos provenientes de sustratos seleccionados del tipo de mieles finales o melazas de Ingenio, mieles intermedias de Ingenio, jarabe de sacarosa refinada y mezclas de las anteriores con jarabe de maíz para la obtención de jarabes enriquecidos en glucosa.

4. Una cepa de levadura en donde la cepa es de la especie Candida etchellsii (NRRL registro en tramite) que es tolerante a concentraciones de NaCI de hasta 1 M y a concentraciones de azúcar de hasta 40%, capaz de asimilar la fructosa selectivamente a partir de mieles o jarabes invertidos provenientes de sustratos seleccionados del tipo de mieles finales o melazas de Ingenio, mieles intermedias de Ingenio, jarabe de sacarosa refinada y mezclas de las anteriores con jarabe de maíz para la obtención de jarabes enriquecidos en glucosa.

La utilización de cepas de levadura MPIIa accharomyces cerevisiae) y LG (Issatchenkia orientalis), para la obtención de jarabes ricos en fructosa a partir de mieles intermedias de ingenio invertidas y mezclas de melazas invertidas con jarabes fructosados grado 42 y jarabes de sacarosa invertida.

La utilización de cepas de levadura MD gygosaccharomyces rouxii) y ML (Candida etchellsii), para la obtención de jarabes ricos en glucosa a partir de mieles intermedias de ingenio invertidas y mezclas de melazas invertidas con jarabes fructosados grado 42 y jarabes de sacarosa invertida.

El uso de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, en donde las cepas MPIIa (Saccharomyces cerevisiae), LG (Issatchenkia orientalis), son capaces de asimilar más rápidamente la glucosa en un medio que contiene glucosa y fructosa.

El uso de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, en donde las cepas MD (Zygosaccharomyces rouxii) y ML (Candida etchellsii), son capaces de asimilar más rápidamente la fructosa en un medio que contiene glucosa y fructosa.

El uso de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, en donde las cepas son utilizadas para convertir sustratos con alta concentración de monosacáridos que tienen una concentración de fructosa en base seca de 40 a 50%, en jarabes con concentraciones de fructosa de entre 52 y 60% en base seca. Siendo los sustratos susceptibles de la transformación referida entre otros mieles o jarabes invertidos provenientes de mieles finales o melazas de Ingenio, mieles intermedias de Ingenio, jarabes de sacarosa refinada y las mezclas de las anteriores con jarabes de maíz, así como de jugos y néctares de frutas y legumbres y mieles de abeja.

10. El uso de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, en donde las cepas D (Zygosaccharomyces rouxii) y ML {Candida etchellsii) son utilizadas para convertir sustratos con alta concentración de monosacáridos que tienen una concentración de glucosa en base seca de 40 a 50%, en jarabes con concentraciones de glucosa de entre 60 y 90% en base seca. Los sustratos susceptibles de la transformación referida entre otros mieles o jarabes invertidos provenientes de mieles finales o melazas de Ingenio, mieles intermedias de Ingenio, jarabes de sacarosa refinada y las mezclas de las anteriores con jarabes de maíz, así como de jugos y néctares de frutas y legumbres y mieles de abeja.

1 . Una composición de jarabes fructosados obtenida por fermentación de los mismos por las cepas LG y MPIIa, la separación de la biomasa celular, las destilación del alcohol presente en el mosto y la posterior concentración, clarificación y refinación.

12. Una composición de jarabes glucosados obtenida por fermentación de los mismos por las cepas ML y MD, la separación de la biomasa celular, la destilación del alcohol presente en el mosto y la posterior concentración, clarificación y refinación.