JP5612636B2 - エリートイベントａ２７０４−１２、ならびに生物サンプル中の該イベントを同定するための方法およびキット - Google Patents

Description

本発明は、生物サンプル内で、特異的形質転換イベントＡ２７０４−１２に加え、遺伝子組換えダイズ植物体、植物素材、および該イベントを含有する種子、の存在を同定するための方法およびキットに関する。本発明のダイズ植物体は、交雑（weed pressure）非存在下で非形質転換ダイズ系と同等の農業生産力、遺伝的安定性および各種遺伝的背景に対する適合性と除草剤耐性表現型とを兼ね備える。

背景技術
植物におけるトランスジーンの表現型発現は、遺伝子自体の構造と植物ゲノム内のその配置の両方によって判定される。それと同時に、ゲノム内のさまざまな配置にある（外来ＤＮＡ内の）トランスジーンの存在が、植物の表現型全体にさまざまな方法で影響を与える。遺伝子操作によって、植物の商業的に興味深い形質を農業生産もしくは工業生産へ導入するのに成功するには、各種ファクターが関与してくるので長期にわたるプロセスをたどらねばならない。遺伝子操作による形質転換植物の実際の形質転換と再生は、圃場試験における広範囲な遺伝学的特性、育種および評価など、一連の選択ステップのはじめのステップにすぎず、最終段階にいたるまで、エリートイベントを選択することはできない。

Ｎｏｖｅｌ Ｆｏｏｄ／Ｆｅｅｄ、ＧＭＯおよび非ＧＭＯ製品の分離、独自仕様の素材の同定に関する検討内容を考慮すると、エリートイベントの明確な同定がますます重要になってきている。理想的には、該同定法は、実験室の設備を大々的に整える必要のない、迅速で単純な方法でなくてはならない。さらに、この方法により、専門家の解釈がなくてもエリートイベントを明確に判定できるいっぽうで、必要に応じて専門家の精査に耐えうる成果も生み出さねばならない。

Ａ２７０４−１２を、フォスフィノスリシンに対する耐性をコードする合成ｐａｔ遺伝子を有するプラスミドによるダイズの形質転換によって、除草剤のＬｉｂｅｒｔｙ（登録商標）に対し耐性のあるダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．）を開発する際に、エリートイベントとして選択し、Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｌｉｎｋ（登録商標）ダイズとして市販することができる。生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するための迅速で簡単な方法で使用するためのツールについて、本明細書に記載する。

発明の要約
本発明は、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するための方法であって、Ａ２７０４−１２の５’および／または３’の隣接配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づいた方法に関する。

さらに具体的には、本発明は、一つがＡ２７０４−１２の５’または３’の隣接領域を認識し、他が外来ＤＮＡ内の配列を認識するような少なくとも二つのプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、好ましくは１００〜５００bpの間のＤＮＡフラグメントを得る、生物サンプル中に存在する核酸配列を増幅することを含む方法に関する。プライマーは、Ａ２７０４−１２（配列番号１、位置１〜位置２０９）の５’隣接領域内またはＡ２７０４−１２（配列番号２、位置５６９〜位置１０００の相補体）の３’の隣接領域内の配列と、外来ＤＮＡ（配列番号１、位置２１０〜７２０、または配列番号２、位置１〜５６８の相補体）内の配列をそれぞれ認識することができる。５’隣接領域を認識するプライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、外来ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーは、本明細書記載の配列番号８のヌクレオチド配列を含むことができる。

さらに詳細には、本発明は、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を特定するための方法であって、約１８５bpのＤＮＡフラグメントを得るため、配列番号４および配列番号８のヌクレオチド配列をそれぞれ有する二つのプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、生物サンプル内に存在する核酸配列を増幅することを含む方法に関する。

本発明はさらに、生物サンプル中のＡ２７０４−１２の特異的同定法の開発に使用可能な、本明細書記載のＡ２７０４−１２の特異的隣接配列に関する。とりわけ、本発明は、本明細書にさらに記載している特異的プライマーおよびプローブの開発に使用可能なＡ２７０４−１２の５’および／または３’隣接領域に関する。本発明はさらに、該特異的プライマーまたはプローブの使用に基づいた、生物サンプル中のＡ２７０４−１２の存在の同定法に関する。プライマーは、配列番号１、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列または配列番号２、ヌクレオチド５６９〜ヌクレオチド１０００のヌクレオチド配列の相補体から選択された１７〜約２００の連続的ヌクレオチドのヌクレオチド配列を、配列番号１、ヌクレオチド２１０〜ヌクレオチド７２０のヌクレオチド配列の相補体、または配列番号２、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド５６９のヌクレオチド配列から選択された１７〜約２００の連続的ヌクレオチドのヌクレオチドからなるプライマーと組み合わせてなりうる。プライマーは、極端の３’末端に配置されたこれらのヌクレオチド配列も含み、さらに無関係の配列または記載しているヌクレオチド配列由来の配列、ミスマッチを含むことができる。

本発明はさらに、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するためのキットであって、Ａ２７０４−１２の５’または３’隣接領域を特異的に認識する少なくとも一つのプライマーまたはプローブを含むキットに関する。

本発明のキットは、Ａ２７０４−１２の５’または３’隣接領域を特異的に認識するプライマーに加えて、ＰＣＲ同定プロトコルで使用するための、Ａ２７０４−１２の外来ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第二のプライマーも含みうる。好ましくは、本発明のキットは、二つの特異的プライマーを含んでおり、そのうちの一つがＡ２７０４−１２の５’隣接領域内の配列を認識し、他が外来ＤＮＡ内の配列を認識する。特に、５’隣接領域を認識するプライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、トランスジーンを認識するプライマーは配列番号８のヌクレオチド配列または本明細書記載の他の任意のプライマーを含んでいてもよい。

本発明はさらに、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するためのキットであって、本明細書記載のＡ２７０４−１２ＰＣＲ同定プロトコルで使用するための配列番号４および配列番号８のヌクレオチド配列を有するプローブを含む前記キットに関する。

本発明は、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するためのキットであって、Ａ２７０４−１２の特異的領域との８０〜１００％の配列同一性を有する配列に一致する（か、もしくは相補的な）配列を有する特異的プローブを含むキットにも関する。好ましくは、プローブの配列はＡ２７０４−１２の５’または３’隣接領域の部分を含む特異的領域に対応する。最も好ましくは、該特異的プローブが配列番号１のヌクレオチド１６０〜２６０の配列または配列番号２のヌクレオチド５２０〜６２０の配列に対する８０〜１００％の配列同一性を有する配列を有する（か、もしくは相補的である）。

本発明に包含される方法とキットは、以下のような各種目的に使用できるがこれらに限定されない。すなわち、植物、植物素材、または植物素材を含むか植物素材に由来する（未加工または加工済みの）食料品もしくは飼料製品などの製品におけるＡ２７０４−１２の存在の有無の同定である。さらに本発明の方法とキットは、トランスジーン素材と非トランスジーン素材とを分別することを目的としたトランスジーン植物素材の同定に使用することができる。さらにまたはその代わりに、本発明の方法とキットは、Ａ２７０４−１２を含む植物素材の品質（すなわち、純粋な素材の割合）を判定するのに使用することができる。

本発明はさらに、Ａ２７０４−１２の５’および／または３’隣接領域に加えて、Ａ２７０４−１２の５’および／または３’隣接配列から産生された特異的プライマーおよびプローブにも関する。

本発明は、エリートイベントＡ２７０４−１２を含むダイズ植物体、その部分、細胞、種子および子孫植物にも関する。該植物、その部分、種子および子孫植物は本明細書記載の方法を使用して同定することができる。

詳細な説明
植物ゲノム内への組換えＤＮＡ分子の組込みは、通常、細胞もしくは組織の形質転換の結果（または、別の遺伝子操作の結果）として発生する。特定の部位の組込みは、「無作為」の組込みによるか、または既定の配置による（標的とする組込みのプロセスを使用する場合）。

組換えＤＮＡまたは「形質転換ＤＮＡ」による植物細胞または組織の形質転換の結果として植物ゲノムに導入された、該形質転換ＤＮＡを起源とするＤＮＡを、本明細書では以後一つ以上の「トランスジーン」を含む「外来ＤＮＡ」と表す。本発明に関する「植物ＤＮＡ」は、形質転換された植物を起源とするＤＮＡを表す。植物ＤＮＡは、通常、対応する野生型植物内の同じ遺伝子座に存在することが見出されるであろう。外来ＤＮＡは、植物ゲノム内の組換えＤＮＡ分子の組込み部位における配置と構成によって特徴付けることができる。植物ゲノム内の組換えＤＮＡが挿入された部位は、「挿入部位」または「標的部位」とも表される。組換えＤＮＡの植物ゲノムへの挿入は、「標的部位欠失」として表される、植物ＤＮＡの欠失に関連付けられる。本明細書で使用されている「隣接領域」または「隣接配列」という用語は、すぐ上流で外来ＤＮＡと隣接しているか、またはすぐ下流で外来ＤＮＡと隣接して配置されている、植物ゲノムの少なくとも２０bp、好ましくは少なくとも５０bp、５０００bpまでの配列を表す。外来ＤＮＡの無作為組込みをもたらす形質転換手順の結果、隣接領域の異なる形質転換細胞が得られるが、隣接領域は各形質転換細胞ごとに特徴があり、固有である。組換えＤＮＡを従来の交配を通じて植物に導入しても、植物ゲノム内のその挿入部位またはその隣接領域は概して変化しない。本明細書で使用されているような、「挿入領域」は、植物ゲノム内の外来ＤＮＡの上流および／または下流隣接領域を含む配列によって包含される、少なくとも４０bp、好ましくは少なくとも１００bp、１００００bpまでの領域に一致する領域を表す。種の中での突然変異によるわずかな相違を考慮して、同種の植物に交配すると、形質転換によって獲得する植物内の外来ＤＮＡの上流および下流の隣接領域を含む配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、もっとも好ましくは１００％の配列同一性が挿入領域により保持される。

イベントは、遺伝子工学の結果として、対象となる遺伝子の少なくとも一つのコピーを含むトランスジーンを担持する（人工）遺伝子座として定義される。イベントの代表的対立遺伝子の状態は、外来ＤＮＡが存在するか、しないかである。イベントはトランスジーンの発現によって、表現型の上で特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝子構造（the genetic makeup）の部分である。分子レベルでは、イベントは、トランスジーンの上流および／または下流の隣接配列、分子マーカーの配置、および／またはトランスジーンの分子構造より、（例えば、サザンブロット法によって決定された）制限酵素地図により特徴付けられる。通常、少なくとも一つの対象となる遺伝子を含む形質転換ＤＮＡによる植物の形質転換の結果、それぞれ特有の多数のイベントが産生される。

本明細書で使用されているようなイベントは、同じ形質転換ＤＮＡによる形質転換によって、またはトランスジーンの発現と安定性および、トランスジーンを含む植物の最適な農学的に有用な形質とのその適合性に基づいて、該形質転換によって獲得される植物との戻し交配によって獲得されるイベントから選択されるイベントである。したがって、エリートイベントの選択基準は、下記のうちの一つもしくはそれ以上、好ましくは二つ以上、有利にはすべてである。
ａ）外来ＤＮＡの存在は、農業生産力や商業的価値に関連する特性など、他の所望の植物特性を損なわないこと、
ｂ）イベントが、安定的に遺伝し、同一性制御に適したツールを開発できる、よく明確にされた分子構造によって特徴付けられること、
ｃ）イベントを輸送する植物が、通常の農業で使用する際にさらされる環境条件の範囲で、商業的に容認しうるレベルで、イベントの異型接合（もしくは半接合）および同型接合の両条件下で、対象となる遺伝子が、正しく、適切で安定した空間的および時間的表現型発現を呈すること。

外来ＤＮＡが、営利目的の、所望の遺伝的背景に容易に遺伝子移入可能な、植物ゲノム内の一つの位置と関連していることが好ましい。

エリートイベントとしてのイベントの状態は、関連する各種遺伝子背景におけるエリートイベントの遺伝子移入、および例えば、上記ａ）、ｂ）およびｃ）の選択基準のうち一つ、二つまたはすべてとの適合性を観察することによって確認される。

したがって、「エリートイベント」は、上記基準に適合する、外来ＤＮＡを含む遺伝子座を表す。植物、植物素材もしくは種子などの子孫は、そのゲノム中に一つ以上のエリートイベントを含むことができる。

エリートイベント、または該植物、エリートイベントを含む植物、もしくはエリートイベントを含む植物素材を有する製品を同定するために開発されたツールは、外来ＤＮＡ、分子マーカーまたは外来ＤＮＡの隣接領域の配列を含む遺伝子領域の特異的制限酵素地図など、エリートイベントの特異的ゲノム特性に基づいている。

外来ＤＮＡの隣接領域の一方もしくは両方を配列決定すると、分子生物学的技法によってサンプルの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）中のこの配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブを開発できる。例えば、（植物、植物素材もしくは植物素材を含む製品のサンプルなどの）生物サンプルにおけるエリートイベントを同定するためのＰＣＲ法を開発できる。該ＰＣＲは、一つはエリートイベントの５’または３’隣接領域内の配列を認識し、他は外来ＤＮＡ内の配列を認識する、少なくとも二つの特異的「プライマー」に基づいている。プライマーは、好ましくは最適化ＰＣＲ条件下で、エリートイベントとエリートイベントの外来ＤＮＡの５’または３’隣接領域内の配列をそれぞれ「特異的に認識する」１５〜３５のヌクレオチド配列を有しており、特異的フラグメント（「組込みフラグメント」または識別アンプコン）が、エリートイベントを含む核酸サンプルから増幅される。つまり、植物ゲノムや外来ＤＮＡ内の他の配列ではなく、標的とする組込みフラグメントだけを最適化ＰＣＲ条件下で増幅する。

本発明に好適なＰＣＲプライマーは、下記であってもよい。
−３’末端に５’隣接配列（配列番号１、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２０９）から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約２１０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド（５隣接配列を認識するプライマー）；または
−３’末端に３’隣接配列（配列番号２、ヌクレオチド５６９〜１０００の相補体）から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約４５０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド（３’隣接配列を認識するプライマー）；または
−３’末端に挿入ＤＮＡ配列（配列番号１、ヌクレオチド２１０〜ヌクレオチド７２０の相補体）から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約５１０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド（外来ＤＮＡを認識するプライマー）；または
−挿入ＤＮＡ配列（配列番号２、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド５６９）から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約５７０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド。

プライマーは、当然のことながら上記の１７の連続したヌクレオチドより長く、例えば、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ntの長さまたはそれ以上の長さになってもよい。プライマーは、隣接配列と外来ＤＮＡ配列の上記ヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列だけで構成されていてもよい。ただし、５’末端（すなわち、３’に位置する１７の連続したヌクレオチドの外部）におけるプライマーのヌクレオチド配列は、あまり重要ではない。したがって、プライマーの５’配列は、隣接配列または外来ＤＮＡから適宜選択されたヌクレオチド配列で構成されうるが、複数（例えば、１、２、５、１０のミスマッチ）を含んでいてもよい。プライマーの５’配列は、例えば、制限酵素認識部位を表しているヌクレオチド配列など、隣接配列または外来ＤＮＡとは関係のないヌクレオチド配列だけで構成されていてもよい。ミスマッチを有するそのような関係のない配列または隣接ＤＮＡ配列は、１００のヌクレオチドを超えないことが好ましく、５０または２５をも超えないことがさらに好ましい。

さらに、好適なプライマーは、（配列番号１中のヌクレオチド２０９〜２１０および配列番号２中のヌクレオチド５６８〜５６９に位置する）植物ＤＮＡ由来の配列と外来ＤＮＡ配列との間の結合領域に広がる３’末端におけるヌクレオチド配列を含むか、またはヌクレオチド配列で構成されていてもよいが、だたし上記３’末端に位置する１７の連続したヌクレオチドが、外来ＤＮＡまたは配列番号１もしくは２中の植物由来配列に由来するとは限らない。

したがって、本発明に好適なＰＣＲプライマーは、下記であってもよい。
−３’末端に配列番号１、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１５から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約２１０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド；または
−３’末端に配列番号２、ヌクレオチド５５４〜ヌクレオチド１０００の相補体から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約４５０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド；または
−３’末端における配列番号１、ヌクレオチド１９５〜ヌクレオチド７２０の相補体から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約５１０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド；または
−配列番号２、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド５８４から選択された少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、１７nt〜約５７０ntの長さにわたるオリゴヌクレオチド。

適正に選択されたＰＣＲプライマー対は、相互に相補的な配列も含んでいてはならないことも、当業者には直ちに明らかとなるであろう。

本発明の目的に関しては、「配列番号Ｘで表示されるヌクレオチド配列の相補体」は、Ｃｈａｒｇａｆｆの規則（Ａ⇔Ｔ；Ｇ⇔Ｃ）に従って相補的ヌクレオチドを介してヌクレオチドを置換し、５’から３’の方向、すなわち表示ヌクレオチド配列と反対方向に配列を読み取ることで、表示ヌクレオチド配列に由来しうるヌクレオチド配列である。

好適なプライマーの例は、配列番号３、配列番号４、配列番号５（５’隣接配列を認識するプライマー）、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１（５’隣接配列を認識するプライマーとともに使用するための外来ＤＮＡを認識するプライマー）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５（３’隣接配列を認識するプライマーとともに使用するための外来ＤＮＡを認識するプライマー）、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９（３’隣接配列を認識するプライマー）のオリゴヌクレオチド配列である。

好適なオリゴヌクレオチドプライマーのその他の例は、それぞれの３’末端に、以下の配列を含むか、該配列で構成される。
ａ．５’隣接配列を認識するプライマー
− 配列番号１、ヌクレオチド２３〜ヌクレオチド４２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６８〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６９〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６９〜ヌクレオチド８８のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド１３４〜ヌクレオチド１５３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド２２〜ヌクレオチド４２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３０〜ヌクレオチド４９のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６７〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７０〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７０〜ヌクレオチド８８のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７６〜ヌクレオチド９５のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７８〜ヌクレオチド９７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド１３３〜ヌクレオチド１５２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド２１〜ヌクレオチド４２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３１〜ヌクレオチド４９のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３４〜ヌクレオチド６３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６６〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６８〜ヌクレオチド８８のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７３〜ヌクレオチド９２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７５〜ヌクレオチド９５のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７７〜ヌクレオチド９７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７７〜ヌクレオチド９５のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド１３４〜ヌクレオチド１５２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド１５４〜ヌクレオチド１７３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド２２〜ヌクレオチド４３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３３〜ヌクレオチド５３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３５〜ヌクレオチド５３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド６７〜ヌクレオチド８８のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７２〜ヌクレオチド９２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７４〜ヌクレオチド９２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７６〜ヌクレオチド９７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７８〜ヌクレオチド９５のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド１３５〜ヌクレオチド１５２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド１５４〜ヌクレオチド１７１のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３２〜ヌクレオチド５３のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３６〜ヌクレオチド５７のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７１〜ヌクレオチド９２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７４〜ヌクレオチド９５のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド７５〜ヌクレオチド９２のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３２〜ヌクレオチド５１のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３１〜ヌクレオチド５１のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３３〜ヌクレオチド５１のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３０〜ヌクレオチド５１のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド３４〜ヌクレオチド５１のヌクレオチド配列
− 配列番号１、ヌクレオチド２０５〜ヌクレオチド２２６のヌクレオチド配列

ｂ．５’隣接配列を認識するプライマーとともに使用するための外来ＤＮＡを認識するプライマー
− 配列番号１、ヌクレオチド２０１〜ヌクレオチド２２０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド２３９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６１〜ヌクレオチド３８０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６６〜ヌクレオチド３８５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２０１〜ヌクレオチド２１９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド２３８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２１〜ヌクレオチド２３９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５８〜ヌクレオチド３７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５９〜ヌクレオチド３７８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６１〜ヌクレオチド３７９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６６〜ヌクレオチド３８４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６８〜ヌクレオチド３８７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４９６〜ヌクレオチド５１５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５６〜ヌクレオチド６７５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２０１〜ヌクレオチド２１８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド２３７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２１〜ヌクレオチド２３８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド２４０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２１〜ヌクレオチド２４０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５１〜ヌクレオチド２７０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５２〜ヌクレオチド２７１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５３〜ヌクレオチド２７２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５９〜ヌクレオチド３７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６１〜ヌクレオチド３７８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５８〜ヌクレオチド３７８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５９〜ヌクレオチド３７９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６１〜ヌクレオチド３８２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６６〜ヌクレオチド３８３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６８〜ヌクレオチド３８６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６６〜ヌクレオチド３８６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７５〜ヌクレオチド３９３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７５〜ヌクレオチド３９４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４９６〜ヌクレオチド５１４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４９８〜ヌクレオチド５１５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６２〜ヌクレオチド５８１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６０８〜ヌクレオチド６２７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５１〜ヌクレオチド６７０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５５〜ヌクレオチド６７４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５６〜ヌクレオチド６７４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５６〜ヌクレオチド６７６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６６９〜ヌクレオチド６７８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５２〜ヌクレオチド２７０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５３〜ヌクレオチド２７１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５１〜ヌクレオチド２７１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５２〜ヌクレオチド２７２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２６７〜ヌクレオチド２８６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５９〜ヌクレオチド３７６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５８〜ヌクレオチド３７９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６２〜ヌクレオチド３７９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３５９〜ヌクレオチド３８０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６８〜ヌクレオチド３８５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６８〜ヌクレオチド３８８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７５〜ヌクレオチド３９２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７６〜ヌクレオチド３９３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７６〜ヌクレオチド３９４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７６〜ヌクレオチド３９５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４０〜ヌクレオチド４５９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４２〜ヌクレオチド４６１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４９６〜ヌクレオチド５１３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５６〜ヌクレオチド５７５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５８〜ヌクレオチド５７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６１〜ヌクレオチド５８０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６３〜ヌクレオチド５８２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６２〜ヌクレオチド５８２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６０８〜ヌクレオチド６２８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６３７〜ヌクレオチド６５６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６４４〜ヌクレオチド６６３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５１〜ヌクレオチド６６９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５１〜ヌクレオチド６７１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５６〜ヌクレオチド６７３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５５〜ヌクレオチド６７５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５９〜ヌクレオチド６７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５９〜ヌクレオチド６７９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２０１〜ヌクレオチド２２２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２０４〜ヌクレオチド２２５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２３〜ヌクレオチド２４０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２３〜ヌクレオチド２４１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド２４１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２１〜ヌクレオチド２４１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５３〜ヌクレオチド２７０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５１〜ヌクレオチド２７２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５２〜ヌクレオチド２７３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２５３〜ヌクレオチド２７４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２６８〜ヌクレオチド２８９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７７〜ヌクレオチド３９４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７５〜ヌクレオチド３９５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４０〜ヌクレオチド４５８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４２〜ヌクレオチド４６０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４０〜ヌクレオチド４６０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４２〜ヌクレオチド４６２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４９２〜ヌクレオチド５１３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５０３〜ヌクレオチド５２２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５６〜ヌクレオチド５７４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５６〜ヌクレオチド５７６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６２〜ヌクレオチド５７９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６３〜ヌクレオチド５８１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６３〜ヌクレオチド５８３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６２〜ヌクレオチド５８３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６０８〜ヌクレオチド６２５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６０８〜ヌクレオチド６２９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６４４〜ヌクレオチド６６２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５１〜ヌクレオチド６６８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５１〜ヌクレオチド６７２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５５〜ヌクレオチド６７６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５５〜ヌクレオチド６７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５９〜ヌクレオチド６８０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６５７〜ヌクレオチド６８８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２３〜ヌクレオチド２４２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２６７〜ヌクレオチド２８８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３６８〜ヌクレオチド３８９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７５〜ヌクレオチド３９６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３７６〜ヌクレオチド３９７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４０〜ヌクレオチド４５７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４２〜ヌクレオチド４５９のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド４４２〜ヌクレオチド４６３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５３４〜ヌクレオチド５５３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５８〜ヌクレオチド５７５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５６〜ヌクレオチド５７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６３〜ヌクレオチド５８０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５６３〜ヌクレオチド５８４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６４４〜ヌクレオチド６６１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６４５〜ヌクレオチド６６２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６４４〜ヌクレオチド６６５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド６４５〜ヌクレオチド６６６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド３２５〜ヌクレオチド３４２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５０３〜ヌクレオチド５２０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５３４〜ヌクレオチド５５４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド２２１〜ヌクレオチド２４２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド５２２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５３４〜ヌクレオチド５５１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５３４〜ヌクレオチド５５５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５３６〜ヌクレオチド５５７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５１〜ヌクレオチド５７０のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５１〜ヌクレオチド５７１のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号１、ヌクレオチド５５１〜ヌクレオチド５７２のヌクレオチド配列の相補体

ｃ．３’隣接配列を認識するプライマーとともに使用するための外来ＤＮＡ配列を認識するプライマー
− 配列番号２、ヌクレオチド９５５〜ヌクレオチド９７４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５５〜ヌクレオチド９７３のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５５〜ヌクレオチド９７２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５８〜ヌクレオチド９７５のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５８〜ヌクレオチド９７７のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９１７〜ヌクレオチド９３４のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９４７〜ヌクレオチド９６８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５１〜ヌクレオチド９６８のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５１〜ヌクレオチド９７２のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５８〜ヌクレオチド９７６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５５〜ヌクレオチド９７６のヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号２、ヌクレオチド９５８〜ヌクレオチド９７９のヌクレオチド配列の相補体

ｄ．３’隣接配列を認識するプライマー
− 配列番号２、ヌクレオチド１５１〜ヌクレオチド１７０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５２〜ヌクレオチド１７１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６〜ヌクレオチド２５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１４８〜ヌクレオチド１６７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５１〜ヌクレオチド１７１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５２〜ヌクレオチド１７０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５３〜ヌクレオチド１７１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド５〜ヌクレオチド２５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド７〜ヌクレオチド２５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６７〜ヌクレオチド８６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド８９〜ヌクレオチド１０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１３４〜ヌクレオチド１５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１４７〜ヌクレオチド１６７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５０〜ヌクレオチド１７１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５３〜ヌクレオチド１７０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５４〜ヌクレオチド１７１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６８〜ヌクレオチド１８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６９〜ヌクレオチド１８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１７１〜ヌクレオチド１９０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９７〜ヌクレオチド２１６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３６〜ヌクレオチド２５５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８０〜ヌクレオチド２９９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド４〜ヌクレオチド２５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド８〜ヌクレオチド２５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６３〜ヌクレオチド８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６６〜ヌクレオチド８６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６８〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９０〜ヌクレオチド１０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９３〜ヌクレオチド１１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９４〜ヌクレオチド１１３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９６〜ヌクレオチド１１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１０１〜ヌクレオチド１２０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１３４〜ヌクレオチド１５４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１４６〜ヌクレオチド１６７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１５０〜ヌクレオチド１６７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１７０〜ヌクレオチド１９０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１７２〜ヌクレオチド１９０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８６〜ヌクレオチド２０５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８９〜ヌクレオチド２０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９０〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９１〜ヌクレオチド２１０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９５〜ヌクレオチド２１４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９６〜ヌクレオチド２１６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９６〜ヌクレオチド２１４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９８〜ヌクレオチド２１６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９９〜ヌクレオチド２１６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２０８〜ヌクレオチド２２７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３４〜ヌクレオチド２５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３５〜ヌクレオチド２５５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２７９〜ヌクレオチド２９９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８１〜ヌクレオチド２９９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８５〜ヌクレオチド３０４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２９６〜ヌクレオチド３１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド３９６〜ヌクレオチド４１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６４〜ヌクレオチド８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６５〜ヌクレオチド８６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６７〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド７５〜ヌクレオチド９２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９１〜ヌクレオチド１０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９２〜ヌクレオチド１１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９３〜ヌクレオチド１１３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９４〜ヌクレオチド１１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９５〜ヌクレオチド１１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９５〜ヌクレオチド１１３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９７〜ヌクレオチド１１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１２０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１３２〜ヌクレオチド１５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１３３〜ヌクレオチド１５４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６３〜ヌクレオチド１８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６５〜ヌクレオチド１８４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６７〜ヌクレオチド１８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６９〜ヌクレオチド１９０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１７３〜ヌクレオチド１９０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８７〜ヌクレオチド２０５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８９〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９０〜ヌクレオチド２１０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９０〜ヌクレオチド２０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９１〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９２〜ヌクレオチド２１０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９４〜ヌクレオチド２１４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９７〜ヌクレオチド２１４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３３〜ヌクレオチド２５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３４〜ヌクレオチド２５５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３５〜ヌクレオチド２５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８２〜ヌクレオチド２９９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２９５〜ヌクレオチド３１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２９７〜ヌクレオチド３１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド３９７〜ヌクレオチド４１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６５〜ヌクレオチド８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド６６〜ヌクレオチド８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド７５〜ヌクレオチド９６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９１〜ヌクレオチド１１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９２〜ヌクレオチド１１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９４〜ヌクレオチド１１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９５〜ヌクレオチド１１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９８〜ヌクレオチド１１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド９９〜ヌクレオチド１２０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６２〜ヌクレオチド１８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６４〜ヌクレオチド１８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６４〜ヌクレオチド１８４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６４〜ヌクレオチド１８４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２０５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８７〜ヌクレオチド２０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８８〜ヌクレオチド２０５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８８〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１８９〜ヌクレオチド２１０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９１〜ヌクレオチド２０８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９２〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１９３〜ヌクレオチド２１４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２０５〜ヌクレオチド２１２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３２〜ヌクレオチド２５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３６〜ヌクレオチド２５３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４２〜ヌクレオチド２６１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２７８〜ヌクレオチド２９９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８３〜ヌクレオチド３０４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３０４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２９４〜ヌクレオチド３１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２９８〜ヌクレオチド３１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド３３２〜ヌクレオチド３４９のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド３９８〜ヌクレオチド４１５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６１〜ヌクレオチド１８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６３〜ヌクレオチド１８４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６５〜ヌクレオチド１８２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１６６〜ヌクレオチド１８７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４１〜ヌクレオチド２６１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４３〜ヌクレオチド２６１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４４〜ヌクレオチド２６１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４０〜ヌクレオチド２６１のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１２６〜ヌクレオチド１４５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２０８〜ヌクレオチド２２５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド１２４〜ヌクレオチド１４５のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド７５〜ヌクレオチド９４のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３１〜ヌクレオチド２５０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４３〜ヌクレオチド２６２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３０〜ヌクレオチド２５０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３２〜ヌクレオチド２５０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４２〜ヌクレオチド２６２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４４〜ヌクレオチド２６２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２２９〜ヌクレオチド２５０のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４１〜ヌクレオチド２６２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２４５〜ヌクレオチド２６２のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３０６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８８〜ヌクレオチド３０６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３０〜ヌクレオチド２４７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８５〜ヌクレオチド３０６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８９〜ヌクレオチド３０６のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８２〜ヌクレオチド３０３のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８８〜ヌクレオチド３０７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３０７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８９〜ヌクレオチド３０７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２８６〜ヌクレオチド３０７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２９０〜ヌクレオチド３０７のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２２９〜ヌクレオチド２４８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３０〜ヌクレオチド２４８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２２７〜ヌクレオチド２４８のヌクレオチド配列
− 配列番号２、ヌクレオチド２３１〜ヌクレオチド２４８のヌクレオチド配列

本明細書で使用しているように、「位置Ｘから位置Ｙまでの配列番号Ｚのヌクレオチド配列」は、ヌクレオチドの両末端を含むヌクレオチド配列を示している。

好ましくは、組込みフラグメントは、５０〜５００ヌクレオチド、もっとも好ましくは１００〜３５０ヌクレオチドの長さを有する。特異的プライマーは、エリートイベントおよびエリートイベントの外来ＤＮＡのそれぞれ５’または３’の隣接領域中の配列に対して８０〜１００％一致する配列を有していてもよいが、ただしミスマッチは最適化ＰＣＲ条件下、これらのプライマーでエリートイベントのさらなる特異的な同定を許容する。しかし、許容されるミスマッチの範囲は、実験的に容易に判断でき、当業者にとって公知である。

以下の表は、選択したＰＣＲプライマー対を用いて、期待されるＤＮＡアンプリコン（または組込みフラグメント）のサイズを例示している。

組込みフラグメントの検出は、例えばゲル解析後のサイズ推定を介するなど、さまざまな方法で行われる。組込みフラグメントは、直接配列決定してもよい。増幅ＤＮＡフラグメントを検出するための他の配列特異的方法も、当技術分野で公知である。

プライマー配列とゲノム中のその相対的位置は、エリートイベントにとって固有であるため、組込みフラグメントの増幅は、エリートイベント（の核酸）を含む生物サンプルでのみ行われるであろう。未知のサンプルにおけるＡ２７０４−１２の存在を同定するためにＰＣＲを実施する場合は、対照は、イベントの植物種の「ハウスキーピング遺伝子」中のフラグメントを増幅できる、一組のプライマーを含むことが好ましい。ハウスキーピング遺伝子は、ほとんどの細胞型で発現し、すべての細胞に共通の基本的代謝活性に関与する遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子から増幅されたフラグメントは、増幅された組込みフラグメントより大きいことが好ましい。解析の対象となるサンプルによっては、他の対照を含むこともできる。

標準のＰＣＲプロトコルについては、当技術分野における、"PCR Applications Manual" (Roche Molecular Boichemicals, 2nd Edition, 1999)などに記載されている。特異的プライマーの配列を含むＰＣＲの最適条件が、各エリートイベントごとに「ＰＣＲ同定プロトコル」に特定されている。しかし、ＰＣＲ同定プロトコル中の多数のパラメータは特定の実験室の条件に合わせて調整する必要があり、類似した結果を得られるよう多少改変してもよいと理解される。例えば、ＤＮＡを調製するための別の方法では、例えば、使用するプライマーの量、ポリメラーゼおよびアニーリング条件の調整が必要である。同様に、他のプライマーを選択すると、ＰＣＲ同定プロトコルの他の最適条件に決定するかもしれない。ただし、これらの調整は、当業者にとって明白であり、したがって、上記に引用したマニュアルのような最新のＰＣＲアプリケーションマニュアルに詳細な記載がある。

または、特異的プライマーを、生物サンプル内のＡ２７０４−１２を同定するための「特異的プローブ」として使用可能な組込みフラグメントを増幅するのに用いることができる。核酸内の対応するフラグメントとのプローブのハイブリダイゼーションが可能な条件下で生物サンプルの核酸をプローブと接触させると、核酸／プローブハイブリッドが形成される。このハイブリッドの形成は、（例えば、核酸またはプローブの標識などで）検出可能であるので、このハイブリッドの形成は、Ａ２７０４−１２の存在を示すものである。当技術分野においては、（固相担体上または溶液内における）特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づいた該同定法についての記述がある。特異的プローブは、最適化条件下では、エリートイベントの５’または３’隣接領域にあり、好ましくはそこに隣接した外来ＤＮＡの部分も含む領域（以後「特異的領域」と表す）に特異的にハイブリダイズする配列であることが好ましい。好ましくは、特異的プローブは特異的領域のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、さらに好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、もっとも好ましくは９５〜１００％一致し（または相補的で）、５０〜５００bp、好ましくは１００〜３５０bpの配列を含む。好ましくは、特異的プローブは、エリートイベントの特異的領域に一致する（または相補的な）約１５〜約１００個の隣接ヌクレオチドの配列を含むであろう。

本明細書で使用されている「キット」とは、本発明の方法を実施するための、特に生物サンプル中でエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するための試薬一式を表す。特に、本発明のキットの好ましい実施態様は、上記のように少なくとも一つまたは二つの特異的プライマーを含む。場合によっては、ＰＣＲ同定プロトコル内で、キットにさらに、本明細書記載の他の任意の試薬を含むことができる。また、本発明のもう一つの実施態様によれば、キットは、生物サンプル内のＡ２７０４−１２の存在を同定するため生物サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズする、上記のような特異的プローブを含むことができる。場合によっては、キットにはさらに、特異的プローブを用いて、生物サンプル中のＡ２７０４−１２を同定するための（ハイブリダイジング緩衝液、標識などであるが、限定されない）他の任意の試薬を含むことができる。

本発明のキットは、食料品や飼料製品などの、植物素材または植物素材を含む素材もしくは植物素材由来の素材中のエリートイベントの検出に使用できるだけでなく、（例えば、種子のロットの純度などの）品質管理を目的として、その構成成分を特異的に調整することができる。

本明細書で使用しているように、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する「配列の同一性」は、二つの配列の短いほうの配列中のヌクレオチドの数で除算した、同一ヌクレオチドを有する位置の数を表す。二つのヌクレオチド配列の配置は、２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドのワード長および４のギャップペナルティを用いた、Wilburおよび Lipmann アルゴリズム(Wilbur and Lipmann, 1983, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 80:726)によって実施する。上記のような配列アラインメントなど、配列データのコンピュータ支援解析や解釈は、例えば、IntelligeneticsTM Suite (Intelligenetics Inc., CA)プログラムまたはGenetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center)の配列解析ソフトウェアパッケージを用いると、首尾よく実施できる。

配列が、少なくとも約７５％、特には少なくとも約８０％、より特には少なくとも約８５％、さらにより特には約９０％、とりわけ特に９５％、さらにとりわけ特には１００％の配列同一性を有する場合には、該配列を「本質的に類似している」として示す。ＲＮＡ配列が本質的に類似しているかまたはＤＮＡ配列と一定の度合いの配列同一性を有していると言われる場合には、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいとみなされることは明白である。

本明細書で使用しているような「プライマー」という用語は、ＰＣＲなどの鋳型依存工程で新生核酸の合成を準備させることのできる任意の核酸を含む。通常、プライマーは、１０〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであるが、これより長い配列も採用可能である。プライマーは二重鎖形態で提供してもよいが、一重鎖形態が好ましい。プローブはプライマーとして使用できるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計されており、増幅工程では使用する必要がない。

特異的プライマーを表すのに本明細書で使用しているような「認識する」という用語は、（ＰＣＲ同定プロトコルの条件など）方法に規定されている条件下で、エリートイベント中の核酸配列に特異的プライマーが特異的にハイブリダイズするので、特異性は陽性対照と陰性対照の存在によって判定されるという事実を表す。

特異的プローブを表すのに本明細書で使用しているような「ハイブリダイズする」という用語は、標準のストリンジェンシー条件下で、エリートイベントの核酸配列中の特異的領域にプローブが結合するという事実を表す。本明細書で使用されているような、標準のストリンジェンシー条件は、本明細書記載のハイブリダイゼーションの条件、またはＳａｍｂｒｏｏｋらによって記述されているような（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY）、例えば、１）フィルター上に植物ゲノムＤＮＡフラグメントを固定する工程、２）５０％のホルムアルデヒド、５Ｘ ＳＳＰＥ、２Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ’ｔ の試薬および０．１％のＳＤＳ中で、４２℃で１〜２時間、または６Ｘ ＳＳＣ、２Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ’ｔ の試薬および０．１％のＳＤＳ中で、６８℃で１〜２時間かけてフィルターをプレハイブリダイズする工程、３）標識を付けたハイブリダイゼーションプローブを添加する工程、４）１６〜２４時間インキュベーションする工程、５）１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、室温で２０分間フィルターを洗浄する工程、６）０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、６８℃でそれぞれ２０分間フィルターを３回洗浄する工程、および７）増感スクリーンを使用して、−７０℃でＸ線フィルムに２４〜４８時間フィルターをさらす工程、を含むことのできる従来のハイブリダイジング条件を表す。

本明細書で使用しているように、生物サンプルは、植物、植物素材、植物素材を含む製品のサンプルである。「植物」という用語は、任意の成熟段階におけるダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）植物の組織に加えて、任意の種子、葉、茎、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物もしくはプロトプラストなど、該植物から採取したもしくは由来する細胞、組織もしくは器官を含むことを目的としているが、これらに限定されない。本明細書で使用しているように、「植物素材」は、植物から獲得もしくは由来する素材を表す。植物素材を含む製品は、直物素材を使用して生産され、植物素材によって汚染されている可能性のある食品、飼料またはその他の製品に関連する。本発明との関連において、該生物サンプルを、サンプル中の核酸の存在を示唆する、Ａ２７０４−１２に特異的な核酸の存在を調べるため試験するということが理解されよう。したがって、本明細書に引用されている、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するための方法は、エリートイベントを含む核酸の植物サンプルにおける同定に関連する。

本明細書で使用しているように、「含む」は、引用されている規定の特徴、整数、工程もしくは構成成分の存在を特定していると解釈するべきであるが、一つ以上の特徴、整数、工程もしくは構成成分、またはその群を除外するものではない。したがって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパクは、実際に引用されている核酸またはアミノ酸よりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでいてもよく、すなわちもっと大きな核酸またはタンパク内に組み込まれていてもよい。機能的または構造的に定義されたＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、別のＤＮＡ配列などを含んでいてもよい。

本発明は、ダイズにおけるエリートイベントＡ２７０４−１２の発生、本イベントを含む植物、これらの植物および植物細胞から獲得した子孫、またはこのイベントに由来する植物素材にも関する。エリートイベントＡ２７０４−１２を含む植物を、実施例１に記載しているように獲得した。

Ａ２７０４−１２を含むダイズ植物または植物素材は、実施例２にＡ２７０４−１２に関して記載しているＰＣＲ同定プロトコルに従って同定することができる。要するに、生物サンプル中に存在するダイズのゲノムＤＮＡを、配列番号４の配列を有するプライマーなどのＡ２７０４−１２の５’または３’隣接配列中の配列を特異的に認識するプライマー、および、配列番号８の配列を有するプライマーなどの外来ＤＮＡ中の配列を認識するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。内在性ダイズ配列の部分を増幅するＤＮＡプライマーを、ＰＣＲ増幅のための陽性対照として使用する。ＰＣＲの増幅時に、素材が期待サイズのフラグメントを産生したなら、その素材には、エリートイベントＡ２７０４−１２を抱えるダイズ植物体由来の植物素材が含まれている。

Ａ２７０４−１２を抱える植物は、本発明に関し、植物が除草剤Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）に耐性のあることを含む、グルフォシネート耐性によって特徴付けられる。Ｌｉｖｅｒｔｙ(商標）に対する耐性は、さまざまな方法で試験することができる。本明細書記載のリーフペイント法は、感受性植物を除草せずに、耐性植物と感受性植物との間を区別する必要がある場合に、もっとも有用である。または、耐性は、Ｌｉｂｅｒｔｙ(商標）スプレイを塗布することによって試験可能である。最適な結果が得られるように、スプレイを塗布する処置は、葉期Ｖ３とＶ４との間に行わねばならない。耐性植物は、少なくとも２００グラムの活性成分／ヘクタール（g.a.i./ha）、好ましくは４００g.a.i./ha、さらに可能であるなら１６００g.a.i./haまで（通常の圃場の割合の４倍）を有する植物にスプレイしても、植物が除草されないという事実によって特徴付けられる。２８〜３４ｏｚ Ｌｉｂｅｒｔｙ(商標）の割合で散布による塗布を実施すべきである。界面活性剤による葉焼けを回避するため、植物の輪生中に直接スプレイを塗布しないように注意を払いながら、平たいファン型のノズルを用いて、１エーカー当たり２０ガロンの容積の水で散布すると最適である。除草効果は、４８時間内に現れ、５〜７日のうちに明らかに目で確認できるようになる。

Ａ２７０４−１２を抱える植物は、ＰＡＴ検定（De Block ら, 1987）によって判定されたようなフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼの細胞中に存在することによってさらに特徴付けられる。

Ａ２７０４−１２を抱える植物は、雑草の圧力がない雑草の管理にＬｉｂｅｒｔｙ(商標）を使用して、米国における市販の多種多様なダイズに比肩しうる農業生産性を有することによっても特徴付けられる。本明細書記載のダイズ植物ゲノムの挿入領域中の外来ＤＮＡの存在が、このイベントを含む植物に、特に興味深い表現型特性および分子特性を付与していることが観察された。さらに具体的には、これらの植物のゲノム中のこの特定領域における外来ＤＮＡの存在により、植物の所望の農業生産力のどの側面も著しく損なうことなく、対象となる遺伝子の安定した表現型の発現を呈示する植物が得られる。

下記の実施例では、生物サンプル中のエリートイベントＡ２７０４−１２を同定するためのツールの開発について明らかにする。

他に特に記載しない限り、全てのＤＮＡ組換え技術は、Sambrookら(1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NYおよびAusubelら. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第１巻と２巻に記載しているような標準のプロトコルに従って実施する。植物分子を扱うための標準の材料と方法については、BIOS Scientific Publications Ltd (UK) およびBlackwell Scientific Publications, UK によって出版されたR.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載がある。

説明と実施例では、下記の配列を引用する。
配列番号１： Ａ２７０４−１２の５’隣接領域を含むヌクレオチド配列
配列番号２： Ａ２７０４−１２の３’隣接領域を含むヌクレオチド配列
配列番号３： プライマーＨＣＡ１４８
配列番号４： プライマーＤＰＡ０２１
配列番号５： プライマーＫＶＭ１７６
配列番号６： プライマーＫＶＭ１７４
配列番号７： プライマーＫＶＭ１７７
配列番号８： プライマーＤＰＡ０２４
配列番号９： プライマーＭＤＢ３９０
配列番号１０： プライマーＨＣＡ０２３
配列番号１１： プライマーＤＰＡ００７
配列番号１２： プライマーＹＴＰ００７
配列番号１３： プライマーＭＤＢ４５２
配列番号１４： プライマーＨＣＡ０１４
配列番号１５： プライマーＭＤＢ４０２
配列番号１６： プライマーＨＣＡ０７４
配列番号１７： プライマーＳＭＯ０１７
配列番号１８： プライマーＳＭＯ０２７
配列番号１９： プライマーＳＭＯ０３３
配列番号２０： 対照フラグメントの増幅用プライマー１
配列番号２１： 対照フラグメントの増幅用プライマー２

下記の実施例は、本発明を本明細書記載の具体的な実施態様に限定するために意図したものではないが、参照により本明細書に援用される添付図と併せて理解されたい。
引用したヌクレオチド配列とプライマーとの間の関係を示す概略図。黒いバー：外来ＤＮＡ、明るいバー：植物由来ＤＮＡ、バーの下側の数字はヌクレオチドの位置を表し；（ｃ）は、示されているヌクレオチド配列の相補体を表す。 Ａ２７０４−１２用に開発されたＰＣＲ同定プロトコル。ゲルの負荷配列、レーン１：トランスジェニックイベントＡ２７０４−１２を含むダイズ植物由来のＤＮＡサンプル、レーン２：エリートイベントＡ２７０４−１２を含まないトランスジェニックダイズ植物由来のＤＮＡサンプル、レーン３：野生型ダイズ植物由来の対照ＤＮＡサンプル、レーン４：鋳型対照なし、レーン５：分子量マーカー。

実施例
エリートイベントＡ２７０４−１２の隣接領域の同定
Cauliflower Mosaicウィルス由来の構成３５Ｓプロモーターの制御下で、酵素フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｐａｔ遺伝子のコード配列を含むベクターでダイズを形質転換することにより、除草剤耐性ダイズを開発した。

除草剤耐性遺伝子の良好な発現と安定性および最適な農業生産性とのその適合性に基づいて、広範囲にわたる選択手順に従ってエリートイベントＡ２７０４−１２を選択した。

Liuら(1995, Plant J. 8(3):457-463)が記載している熱不斉インターレース（ＴＡＩＬ−）ＰＣＲ法を用いて、Ａ２７０４−１２イベントにおける外来ＤＮＡを隣接する領域の配列を判定した。この方法は、特異的製品と非特異的製品の相対的増幅効率を熱により制御できるように、短いほうの任意の変質プライマーとともに、連続反応で３つの入れ子プライマーを使用する。外来ＤＮＡの境界までアニールするため、アニーリング条件に基づいて特異的プライマーを選択した。１％のアガロースゲル上で、少量（５μl）の未精製の２級および３級のＰＣＲ製品を解析した。３級のＰＣＲ製品は、前段階の増幅に使用し生成した後に、DyeDeoxy Terminatorサイクルキットを用いて、自動シーケンサー上で配列決定した。

１．１．右（５’）隣接領域
ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により獲得した５’隣接領域を含むとして同定されているフラグメントを完全に配列決定した（配列番号１）。ヌクレオチド１〜２０９の間の配列は、植物ＤＮＡに対応しており、ヌクレオチド２１０〜７２０の間の配列は、外来ＤＮＡに対応している。

１．２．左（３’）隣接領域
ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により獲得した３’隣接領域を含むとして同定されているフラグメントを完全に配列決定した（配列番号２）。ヌクレオチド１〜５６８の間の配列は、外来ＤＮＡに対応しており、ヌクレオチド５６９〜１０００の間の配列は、植物ＤＮＡに対応している。

２．ポリメラーゼ連鎖反応の同定プロトコルの開発
２．１．プライマー
エリートイベント中の配列を認識する特異的プライマーを開発した。特に、Ａ２７０４−１２の５’隣接領域中の配列を認識するプライマーを開発した。次に、プライマーが約１８３ヌクレオチドの配列に広がるように、外来ＤＮＡの配列中で第二のプライマーを選択した。下記のプライマーが、Ａ２７０４−１２ＤＮＡ上でのＰＣＲ反応で特に明確で再現可能な結果を示すことを突き止めた。

内在性配列を標的とするプライマーを、ＰＣＲ混合物内に含むことが好ましい。これらのプライマーは、未知のサンプルとＤＮＡの陽性対照での内部対照としての役割を果たす。内在性プライマー対での肯定的結果から、ＰＣＲ製品を生成するのに十分な品質で多量のＤＮＡが、ゲノムＤＮＡの調製液中に存在することが実証される。Glycine maxでハウスキーピング遺伝子を認識するため、内在性プライマーを選択した。

２．２．増幅フラグメント
ＰＣＲ反応における期待増幅フラグメントは下記のとおりである。
プライマー対ＳＯＹ０１−ＳＯＹ０２ ４１３bp（内在性対照）
プライマー対ＤＰＡ０２１−ＤＰＡ０２４ １８５bp（Ａ２７０４−１２エリートイベント）

２．３．テンプレートＤＮＡ
Edwards ら. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991) に従って、葉に穴を開けて、テンプレートＤＮＡを調製した。他の方法で調製したＤＮＡの使用時には、各種量の鋳型を用いてテストを実施した。通常、５０ｎｇのゲノムテンプレートＤＮＡから、最適な結果が得られる。

２．４．割り当てた陽性と陰性対照
偽陽性または偽陰性の誤りを回避するため、ＰＣＲ実施時に、下記の陽性対照と陰性対照を含む必要がある。
−マスター混合対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは、反応にＤＮＡを付加しないＰＣＲである。期待した結果、すなわちＰＣＲ産物が観察されなかったときには、ＰＣＲ混合物は標的ＤＮＡによって汚染されていないことを示している。
−ＤＮＡ陽性対照（トランスジーン配列を含むことが知られているゲノムＤＮＡサンプル）。この陽性対照の増幅に成功したことにより、標的配列の増幅を可能にする条件下でＰＣＲが実施されたことを示している。
−野生型ＤＮＡ対照。これは、提供されたテンプレートＤＮＡが非トランスジーン植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。期待した結果、すなわちトランスジーンＰＣＲ生成物の増幅は認められないが、内在性ＰＣＲ生成物の増幅は認められること、が観察されたときには、ゲノムＤＮＡサンプル中には検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が存在しないことを示している。

２．５．ＰＣＲ条件
最適な結果を、下記の条件下で得た。
−２５μlの反応液のＰＣＲ混合物に、下記が含まれている。
２．５μlのテンプレートＤＮＡ
２．５μl １０Ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼとともに供給）
０．５μl １０ｍＭ ｄＮＴＰ
０．５μl ＤＰＡ０２１（１０pmols／μl）
０．５μl ＤＰＡ０２４（１０pmols／μl）
０．２５μl ＳＯＹ０１（１０pmols／μl）
０．２５μl ＳＯＹ ０２（１０pmols／μl）
０．１μl Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（５ユニット／μl）
水 ２５μlまで
−最適な結果を得るため従った熱循環プロファイルは、下記のとおりである。
９５℃で４分間
続いて、
９５℃で１分間
５７℃で１分間
７２℃で２分間を
５サイクル
続いて、
９２℃で３０秒間
５７℃で３０秒間
７２℃で１分間を
２５サイクル
続いて
７２℃で５分間

２．６．アガロースゲル解析
ＰＣＲの結果を最適に可視化するためには、１０〜２０μlのＰＣＲサンプルを、適切な分子量マーカー（例えば、１００bpラダーＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を用いて１．５％のアガロースゲル（トリスホウ酸塩緩衝液）にアプライする必要があると判断した。

２．７．結果の評価
１）ＤＮＡ陽性対照が、期待ＰＣＲ生成物（トランスジーンフラグメントと内在性フラグメント）を呈示しない場合、２）ＤＮＡ陰性対照が、ＰＣＲ増幅で陰性ではない（フラグメントなし）場合、および３）野生型ＤＮＡ対照が、期待した結果（内在性フラグメントの増幅）を示さない場合は、一回のＰＣＲの実施と単一のＰＣＲ混合物の範囲内でトランスジェニック植物のＤＮＡサンプルから得られたデータは許容不可であると判断した。

上記のようにＡ２７０４−１２に関するＰＣＲ同定プロトコルに従うと、期待サイズのトランスジェニックＰＣＲ生成物と内在性ＰＣＲ生成物の可視量を示すレーンは、ゲノムテンプレートＤＮＡを調製した対応する植物が、Ａ２７０４−１２エリートイベントを継承していることを示している。可視量のトランスジェニックＰＣＲ生成物のいずれも示さないレーンと可視量の内在性ＰＣＲ生成物を示すレーンによって、ゲノムテンプレートＤＮＡを調製した、対応する植物が、エリートイベントを含まないことが示される。可視量の内在性ＰＣＲ生成物とトランスジェニックＰＣＲ生成物を示さないレーンによって、ゲノムＤＮＡの品質および／または量が、ＰＣＲ生成物の生成を可能にしないことが示される。これらの植物は、スコアできない。ゲノムＤＮＡの調製を繰り返し、適切な対照を用いて新たにＰＣＲを実施する必要がある。

２．８．Ａ２７０４−１２を同定するための識別ＰＣＲプロトコルの使用
未知のものをスクリーニングする前に、適切なすべての対照を用いて、試験を実施する必要がある。開発したプロトコルでは、研究所間で異なる構成要素（テンプレートＤＮＡの調製、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ、サーモサイクラーなど）に関して最適化を実施する必要があるであろう。

内在性配列の増幅は、プロトコルで重要な役割を果たす。公知のトランスジェニックゲノムＤＮＡ鋳型内の内在性配列とトランスジェニック配列の両方の等モル量を増幅するＰＣＲおよび熱循環条件を実現しなくてはならない。アガロースゲル電気泳動法で判断されるように同じ臭化エチジウム染色強度で、標的の内在性フラグメントが増幅されないとき、または標的とした配列が増幅されないときは、ＰＣＲ条件の最適化が必要になろう。

一部がＡ２７０４−１２を含む、多くの植物から得られたＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ葉素材を、上記のプロトコルにしたがってテストした。エリートイベントＡ２７０４−１２のサンプルとGlycine max 野生型のサンプルを、それぞれ陽性対照と陰性対照とした。

図２は、多数のダイズ植物サンプルについてのＡ２７０４−１２に関するエリートイベントＰＣＲ同定プロトコルで得た結果を示している（レーン１〜１４）。レーン１内のサンプルは、１８５bpバンドを検出したのでエリートイベントを含んでいることが明らかとなり、レーン２、３および４内のサンプルは、Ａ２７０４−１２を含んでいないことが明らかとなった。レーン２は、別のダイズエリートイベントを含んでおり、レーン３は非トランスジェニックＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ対照を表し、レーン４は、陰性対照（水）のサンプルを表し、そしてレーン５は、分子量マーカー（１００bp）を表している。

３．Ａ２７０４−１２を含む素材を検出するためのプローブとしての、特異的組込みフラグメントの使用
Ａ２７０４−１２の特異的組込みフラグメントを、特異的プライマーＤＰＡ０２１（配列番号４）およびＤＰＡ０２４（配列番号８）を用いたＰＣＲ増幅によって、または化学合成によって獲得し、標識を付する。この組込みフラグメントを、生物サンプル中のＡ２７０４−１２の検出に特異的プローブとして使用する。核酸を、標準の手順に従って、サンプルから抽出する。次に、ハイブリッドの形成を可能にするよう最適化されたハイブリダイゼーション条件下で特異的プローブとこの核酸を接触させる。そして、ハイブリッドの形成の検出は、サンプルにおけるＡ２７０４−１２核酸の存在を示す。場合によっては、サンプル中の核酸を特異的プローブと接触させる前に特異的プライマーを用いて、増幅する。または、組込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触する前に、核酸に標識を付する。場合によっては、サンプルと接触させる前に、特異的プローブを固体担体（フィルター、ストリップまたはビーズなどであるが、それらに限定されない）に付着させる。

Claims (7)

1. ダイズのエリートイベントＡ２７０４−１２を特異的に同定するＤＮＡであって、
   ＤＮＡは、少なくとも二つのプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を利用して、前記エリートイベントを含む核酸サンプルから得られることができる特異なアンプリコンのヌクレオチド配列を含み、
   前記プライマーのうちの一つは、前記エリートイベントの５’隣接領域または３’隣接領域中の配列を特異的に認識し、
   前記プライマーの他のプライマーは、それに隣接している外来ＤＮＡ領域を特異的に認識し、
   前記５’隣接ＤＮＡ領域は、配列番号１、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２０９のヌクレオチド配列を含み、
   前記５’隣接領域に隣接している外来ＤＮＡ領域は、配列番号１、ヌクレオチド２１０〜ヌクレオチド７２０のヌクレオチド配列を含み、
   前記３’隣接ＤＮＡ領域は、配列番号２、ヌクレオチド５６９〜ヌクレオチド１０００のヌクレオチド配列を含み、
   前記３’隣接領域に隣接している外来ＤＮＡ領域は、配列番号２、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド５６８のヌクレオチド配列を含む
   ＤＮＡ。
2. 前記プライマーが、配列番号４の配列を３’末端のその極端に含むプライマーおよび配列番号８の配列を３’末端のその極端に含むプライマーである、請求項１記載のＤＮＡ。
3. 配列番号１、ヌクレオチド位置１３４〜ヌクレオチド位置３１６の配列を含む、ＤＮＡ。
4. 配列番号１、ヌクレオチド１６０〜２６０の配列を含む、ＤＮＡ。
5. 配列番号２、ヌクレオチド５２０〜６２０の配列を含む、ＤＮＡ。
6. 配列番号１の配列を含むＤＮＡ。
7. 配列番号２の配列を含むＤＮＡ。

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