JP5542449B2

JP5542449B2 - 心筋梗塞進展の改変方法

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Publication number: JP5542449B2
Application number: JP2009546553A
Authority: JP
Inventors: ユージーンティーマイケル; シュバユバス; アレクサンダージェイシーヒー; フランシスジースピナル; ルパックムケルジ
Original assignee: Abbott Cardiovascular Systems Inc
Current assignee: Abbott Cardiovascular Systems Inc
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2028-01-18
Also published as: WO2008089452A2; WO2008089452A3; EP2452699A1; EP2109469A2; JP2010516349A; EP2452699B1; US20170258961A9; US20150209473A1; US20090022817A1; US9775930B2; EP2109469B1; US9005672B2; US20150017265A9

Description

（関連出願との相互参照）
本出願は、2007年1月18日に出願され且つ“Modifying Myocardial Infarction Expansion by Composite Material Injection”と題する米国特許仮特許出願第60/855,593号の出願日の権利を主張している2008年1月17日に出願され且つ“Methods of Modifying Myocardial Infarction Expansion”と題する非仮米国特許出願第12/016,180号の出願日の権利を主張する。
心筋梗塞後の処置および組成物。

虚血性心臓疾患は、心筋血流と心筋の代謝要求間の不均衡に典型的に由来する。増進性冠状動脈閉塞による進行性アテローム性動脈硬化症は、冠血流量の低下をもたらす。“アテローム性動脈硬化症”は、平滑筋細胞およびマクロファージのような細胞、脂肪物質、コレステロール、細胞老廃物、カルシウム並びにフィブリンが身体血管の内壁内に蓄積する動脈硬化症の１つのタイプである。“動脈硬化”とは、動脈の肥厚および硬化を称する。血流は、潅流低下、血管けいれんまたは血栓症に至る循環の変化のようなさらなる事象によってさらに減少し得る。

心筋梗塞(MI)は、多くの場合酸素および他の栄養素の供給の突発的欠乏に由来する心臓疾患の１つの形態である。血液供給の欠如は、心筋の特定部分に養分を与える冠状動脈(または心臓に養分供給する他の動脈のどれか)の閉塞の結果である。この事象の原因は、一般に、冠状血管の動脈硬化に帰する。
以前には、MIは、例えば、95％から100％まで、閉塞の遅い進行に基因するものと信じられていた。しかしながら、MIは、例えば、動脈内で血液凝固をもたらすコレステロールプラークの破壊が存在する微細な閉塞の結果でもあり得る。従って、血流は遮断され、下流の細胞損傷が生じる。この損傷は、残りの筋肉が十分量の血液を送り出すのに十分に強いにしても、致死的であり得る不規則なリズムを生じ得る。心臓組織に対するこの発作の結果として、瘢痕組織が自然に生じる傾向を有する。

閉塞動脈を再開放するための、機械的および治療薬適用手法のような種々の手法が知られている。機械的手法の例としては、ステント植込み術によるバルーン血管形成があり、一方、治療薬適用法の例としては、ウロキナーゼのような血栓溶解剤の投与がある。しかしながら、そのような手法は、心臓に対する実際の組織損傷を治療するものではない。ACEインヒビターおよびベータブロッカーのような他の全身薬は、MI後の心臓負荷を低減するのに有効であり得るが、重度MIを発症する集団の有意の割合が、最終的には、心不全を発症する。

心不全に進行する重要な要素は、左心室(LV)内で不均質な応力と歪み分布をもたらす梗塞領域と健常組織間での不整合な機械力による心臓のリモデリングである。MIが一旦生じると、心臓のリモデリングが始まる。リモデリング事象の主たる要素としては、筋細胞死、浮腫および炎症；その後の、線維芽細胞浸潤およびコラーゲン付着；最終的には、細胞外マトリックス(ECM)付着による瘢痕形成がある。瘢痕の主要因は、非収縮性であり且つ脈動毎に心臓に歪みを引起すコラーゲンである。非収縮性は、低駆出率(EF)および局所壁運動不能または障害(akinetic or diskinetic local wall motion)において見られるように、貧弱な心臓性能を生じる。低FEは、心室内で高い残留血量をもたらし、さらなる壁ストレスの原因となり、瘢痕拡大および薄層化による最終的な梗塞拡大並びに境界域細胞アポトーシスに至る。さらに、遠隔領域が収縮送出しを損なう高めのストレスの結果として肥厚化し、一方、梗塞領域は、成人の成熟筋細胞は再生されないので、有意の薄層化を示す。筋細胞損減は、最終的に心筋症の進行に至り得る壁薄層化および室拡張の主要病因的因子である。他の領域においては、遠隔領域が、左心室の全体的拡張を生じる肥大化(肥厚)を示す。これは、リモデリングカスケードの最終結果である。また、これらの変化は、血圧上昇並びに収縮および拡張性能の悪化をもたらす生理的変化とも相関している。

心筋梗塞進展速度の減衰を生じさせるに十分な生体スカッフォールドを心筋梗塞後領域内に形成させ得る。上記生体スカッフォールドは、心筋梗塞後領域内に、２成分系の各成分を混合することによって形成させ得る。
上記生体スカッフォールドは、異なる２成分ゲル化系のゲル成分混合物から形成させることができる。ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、少なくとも２種の異なる２成分ゲル化系の少なくとも２種の異なる成分(混合時にはゲル化しない)を混合して第１の混合物を調製し且つ少なくとも２種の異なる２成分ゲル化系の少なくとも２種の異なる成分(第１混合物を構成する成分以外で且つ混合時にはゲル化しない)を混合して第２の混合物を調製することによって形成させることができる。細胞タイプまたは成長因子のような治療薬を、第１混合物または第２混合物のいずれかに添加することができる。その後、第１混合物を第２混合物と同時に注入して、梗塞領域内にその治療のための生体スカッフォールドを形成させることができる。第１混合物と第２混合物は、限定するものではないが、二本シリンジ、二本針左心室注入装置、二本針経血管壁注入装置等であり得る二重管腔伝達装置によって同時注入することができる。

ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、少なくとも２種の異なるゲル化成分(混合時にはゲル化しない)を混合して第１の混合物を調製することによって形成させることができる。細胞タイプまたは成長因子のような治療薬を、第１混合物に添加することができる。その後、第１混合物を第２のゲル化成分と同時に注入して、梗塞領域上または内にその治療のための生体スカッフォールドを形成させることができる。第１混合物と上記ゲル化成分は、限定するものではないが、二本シリンジ、二本針左心室注入装置、二本針経血管壁注入装置等であり得る二重管腔伝達装置によって同時注入することができる。

動脈内でのプラークの蓄積が梗塞発症を一旦誘発させたときの心臓損傷の進行を例示している。試験群における左心室後壁厚を示している。試験群における左心室拡張終期容量を示している。試験群における左心室駆出率の相対変化を示している。心筋梗塞領域内に配置した放射線不透過性マーカーの系列変化を示している。試験群における左心室容量を示している。試験群における左心室駆出率を示している。試験群の遠隔領域における左心室壁応力を示している。心筋梗塞領域における左心室壁応力を示している。

試験群における間質マトリックスメタロペプチダーゼ(MMP)活性を示す。試験群の組織領域への心筋血流を示す。試験群における心筋梗塞領域の割合を示す。試験群における局所心筋硬直を示す。試験群におけるヘマトキシリンおよびエオシンに対して染色した組織切片を示す。ヌクレアファストレッドで対比染色したアルシアンブルー切片の顕微鏡写真を示す。好中球の組織化学染色を示す。マクロファージの免疫組織化学染色を示す。試験群における各左心室領域内の%コラーゲンの左心室心筋形態学的測定値を示す。

試験群における全厚左心室切片中の毛細血管密度を示す。試験群における可溶性コラーゲンの量を示す。試験群におけるヒドロキシプロリンの量を示す。試験群におけるMMP‐9の左心室MMPプロフィールを示す。試験群におけるMMP‐2の左心室MMPプロフィールを示す。試験群におけるMMP‐2のプロフィールを示す。二重穿孔伝達装置の１つの実施態様を示す。二重穿孔伝達装置の別の実施態様を示す。二重穿孔伝達装置の第２の別の実施態様を示す。

図１A〜１Bは、プラークの蓄積が梗塞発症を一旦誘発させたときの心臓損傷の進行を例示している。図１Aは、閉塞および血流制限が、例えば、血栓または塞栓により生じ得る部位１０を示している。図１Bは、血液により心臓の下部領域左側に運ばれる酸素および栄養素流の欠乏に由来し得る左心室に対する結果としての損傷領域２０を示している。損傷領域２０は、おそらくは、リモデリングに、最終的には瘢痕形成に達しており、機能していない領域を生じている。
２成分から形成され左心室に現場適用した生体スカッフォールドは、心筋梗塞後組織損傷を処置するのに使用することができる。１つの実施態様においては、生体スカッフォールドは、ゼラチン系から形成されたゲルである。“生体スカッフォールド”および“２成分ゲル化系”および“２成分ゲル系”および“ゲル化系”および“複合材料”は、以下互換的に使用する。２成分ゲル化系の例としては、限定するものではないが、アルギネート構築物系、フィブリン糊およびフィブリン糊様系、自己集合性ペプチド、並びにこれらの組合せがある。該２成分ゲル化系の各成分は、二重管腔伝達装置によって梗塞領域に同時注入し得る。二重管腔伝達装置の例としては、限定するものではないが、二本シリンジ、２本針左心室注入装置、２本針経血管壁注入装置等がある。

ある実施態様においては、少なくとも１種の細胞タイプを、上記２成分ゲル化系の少なくとも１種の成分と一緒に梗塞領域に同時注入し得る。ある実施態様においては、上記細胞は、上記各２成分を梗塞領域に同時注入する前に、上記２成分ゲル化系の少なくとも１種の成分と混合し得る。細胞タイプの例としては、限定するものではないが、局在性心臓前駆細胞、間葉幹細胞、骨髄由来単核細胞、脂肪幹細胞、胚幹細胞、臍帯血由来幹細胞、平滑筋細胞および骨格筋芽細胞がある。

ある種の用途においては、上記２成分ゲル化系は、フィブリン糊を含む。フィブリン糊は、２つの主要成分、即ち、フィブリノーゲンとトロンビンからなる。フィブリノーゲンは、その内生状態においては、約340キロダルトン(kDa)の血漿糖タンパク質である。フィブリノーゲンは、6本の対ポリペプチド鎖、即ち、アルファ、ベータおよびガンマ鎖からなる対称形ダイマーである。アルファおよびベータ鎖上には、小ペプチド配列、いわゆるフィブリノーゲンがそれ自体によってポリマーを自然形成するのを阻止するフィブリノペプチドが存在する。ある実施態様においては、フィブリノーゲンをタンパク質によって変性する。トロンビンは、凝固タンパク質である。等容量で混合したとき、トロンビンは、フィブリノーゲンを、酵素作用により、トロンビン濃度によって決まる速度でフィブリンに転換させる。その結果は、梗塞領域で混合したときゲル化する生体適合性ゲルである。フィブリン糊は、約5〜約60秒でゲル化を受け得る。フィブリン糊様系の例としては、限定するものではないが、Tisseel^TM (Baxter社)、Beriplast P^TM (Aventis Behring社)、Biocol^R (LFB社、フランス)、Crosseal^TM (Omrix Biopharmaceuticals社)、Hemaseel HMN^R (Haemacure社)、Bolheal (Kaketsuken Pharma、日本)およびCoStasis^R (Angiotech Pharmaceuticals社)がある。

ある種の用途においては、上記２成分ゲル化系は、自己集合性ペプチドを含む。自己集合性ペプチドは、一般に、交互の疎水性および親水性アミノ酸鎖の繰返し配列を含む。親水性アミノ酸は、一般に電荷担持性であり、アニオン性、カチオン性または双方であり得る。カチオン性アミノ酸の例は、リシンおよびアルギニンである。アニオン性アミノ酸の例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。疎水性アミノ酸の例は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはフェニルアラニンである。自己集合性ペプチドは、長さで8〜40個のアミノ酸の範囲であり得、生理的pHおよびオスモル濃度の条件下においてナノ寸法繊維に集合し得る。十分な濃度および時間経過においては、これらの繊維は、巨視的にはゲルとして見える相互連結した構造に集合し得る。自己集合性ペプチドは、典型的には、数分から数時間でゲル化に達する。自己集合性ペプチドの例としては、限定するものではないが、以下のものがある：AcN‐RARADADARARADADA‐CNH₂ (RAD 16‐II) (式中、Rはアルギニンであり、Aはアラニンであり、Dはアスパラギン酸であり、Acは、アセチル化を示す)；VKVKVKVKV‐PP‐TKVKVKVKV‐NH₂ (MAX‐1) (式中、Vはバリンであり、Kはリシンであり、Pはプロリンである)；およびAcN‐AEAEAKAKAEAEAKAK‐CNH₂ (式中、Aはアラニンであり、Kはリシンであり、Eはグルタミン酸である) (EAK1‐II)。自己集合性ペプチドは、細胞接着、細胞移動および増殖によって示されるように、良好な細胞適合性を示す。

ある種の用途においては、上記２成分ゲル化系は、アルギネート構築物系である。１つの成分は、アルギネートとタンパク質成分を含み得るアルギネート接合体(またはアルギネート単独)であり得る。第２成分は、塩であり得る。アルギネート接合体の例としては、限定するものではないが、アルギネート‐コラーゲン、アルギネート‐ラミニン、アルギネート‐エラスチン、アルギネート‐コラーゲン‐ラミニン、およびアルギネート-ヒアルロン酸があり、これらにおいて、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン-ラミニンまたはヒアルロン酸は、アルギネートに共有結合している(或いは結合していない)。アルギネート構築物をゲル化させるのに使用し得る塩の例としては、限定するものではないが、塩化カルシウム(CaCl₂)、塩化バリウム(BaCl₂)または塩化ストロンチウム(SrCl₂)がある。各成分、例えば、アルギネート‐コラーゲンと塩化カルシウムを混合したとき、得られるゲルは、ほぼ1キロパスカルの貯蔵弾性率を有する。

１つの実施態様においては、アルギネート構築物は、アルギネート‐ゼラチンである。ゼラチンの分子量は、およそ5kDa〜100kDaの範囲内にあり得る。比較的低分子量のゼラチンが、低分子量の方が高めの分子量のヒドロゲルよりも可溶性であり且つ低粘度を有する点で、加工上の利点を提供する。ゼラチンのもう１つの利点は、ゼラチンが分子当り1〜4個のRGD(アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸ペプチド配列)部位を含有することである。RGDは、一般的な細胞接着リガンドであり、生体スカッフォールドを形成させる梗塞領域内での細胞の保持性を増強するであろう。RGD部位によって保持された細胞は、生体スカッフォールド成分と一緒に同時注入された或いは系の成分の全体に亘って分散させた細胞であり得る。

ゼラチンは、ブタゼラチンまたは組換えヒトゼラチンであり得る。ブタゼラチンは、ブタの皮膚から抽出した加水分解タイプ１コラーゲンである。１つの実施態様においては、ブタゼラチンの分子量は、およそ20kDaである。ヒトゼラチンは、ヒト遺伝子物質を使用して細菌によって産生させる。ヒト組換えゼラチンは、ブタゼラチンと等価であるが、ヒト対象者の梗塞領域に注入したときの免疫応答の可能性を低減させ得る。
アルギネートは、海草に由来する線状多糖類であり、交互のブロックおよび交互の個々の残基の双方内に存在するマンヌロン酸(M)およびグルロン酸(G)を含有する。アルギネートは細胞保持のためのRGD基を有していないので、アルギネートのカルボキシル基の幾つかを有用な細胞接着リガンド、例えば、コラーゲン、ラミニン、エラスチンおよびECMマトリックスの他のペプチドフラグメントをグラフトさせる部位として使用して、アルギネート接合体を形成させることは可能である。

アルギネート‐ゼラチン接合体は、限定するものではないがRGD部位と免疫適合性とのようなアルギネートの特性とゼラチンの特性を併せ持つので、有益である。アルギネートの特性としては、迅速でほぼ即時のゲル化および炎症刺激作用がある。アルギネート-ゼラチン接合体は、約1％〜30％、とりわけ約10％〜20％のゼラチン(ブタまたはヒト組換えのいずれか)と約80％〜90％のアルギネートから調製し得る。比較的低割合のアルギネート‐ゼラチン接合体を使用して、純粋アルギネートと組合せたときのゲル化能力を保持する；何故ならば、ゲル化を起すアルギネートのアルギネートカルボキシル基をアルギネート‐ゼラチン接合体中にしっかり結合させ得るからである。
２成分ゲル化系は、限定するものではないが、孔サイズ、貯蔵弾性率およびゲル化時間のような互いに対して異なる特性を示す。上記ゲル化系は、篩い媒体として挙動し、従って、小孔を含む。“孔サイズ”は、ゲル内の小さい空腔を説明する。“貯蔵弾性率”は、ゲル化時の材料の強度または剛性を説明する。貯蔵弾性率は、流量計測器により測定し得る。“ゲル化時間”は、ゲル化速度、即ち、粘性係数の低下を説明する。アルギネート構築物は、約1秒以内でゲル化し得、一方、フィブリン糊は、約5秒〜約60秒でゲル化し得る。自己集合性ペプチドは、典型的には数分〜数時間でゲル化する。

細胞を上記２成分ゲル化系と同時注入するかまたは上記２成分を混合する前の１成分と混合する実施態様においては、上記ゲル化系は、細胞に関連する互いに対して異なる特性を示し得る。そのような特性としては、限定するものではないが、細胞形態、細胞生存性、カプセル化効率および/または細胞濃度がある。“形態”とは、細胞の物理的構造を称する。hMSCの場合、その自然形態は、平坦化したスピンドル状形態である。“細胞生存性”は、細胞がゲル注入後に生きたままでいる時間量である。“カプセル化効率”は、ゲル内に内包される懸濁液中の初期細胞数の割合を称する。“細胞濃度”は、形成されたゲルの容量で割ったカプセル化効率である。
カプセル化効率に影響を与える特性は、上記２つの成分の粘度(η)の違いである。ゲル化系の２つの成分間の粘度差が大きい場合、カプセル化効率は、細胞が高粘度成分中に存在するときのみ高い。しかしながら、各個々の成分の粘度をゲル化速度に影響を及ぼすことなく低下させた場合、カプセル化効率は、劇的に上昇する。カテーテル系伝達方式においては、低粘度成分は、成功裏の伝達のためには極めて有効である。２つの成分(伝達前では溶液中に存在する)の成功裏の適用は、個々の成分の低粘度に依存し得る。

変性ゲル化系
ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、異なるゲル化系のゲル成分の混合物から形成させることができる。例えば、生体スカッフォールドは、少なくとも２種の異なる２成分ゲル化系の少なくとも２種の異なる成分(標準のカテーテルラボ(cath lab)処理条件下での混合時にはゲル化しない)を混合して第１の混合物を調製し、そして、少なくとも２種の異なる２成分ゲル化系の少なくとも２種の異なる成分(第１混合物を構成する成分以外で且つ標準のカテーテルラボ処理条件下での混合時にはゲル化しない)を混合して第２の混合物を調製することによって形成させることができる。“ゲル”とは、２つの異なる成分または２つの異なる混合物を混合したときに形成される半剛体コロイド状物質を称する。細胞タイプまたは成長因子のような治療薬を、第１混合物または第２混合物のいずれかに添加し得る。その後、第１混合物を第２混合物と一緒に同時注入して梗塞領域内にその治療のための生体スカッフォールドを形成させることができる。ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、少なくとも２種の異なるゲル化成分(標準のカテーテルラボ処理条件下での混合時にはゲル化しない)を混合して第１の混合物を調製することによって形成させ得る。細胞タイプまたは成長因子のような治療薬を、上記第１混合物に添加することができる。その後、第１混合物をゲル化成分と一緒に同時注入して梗塞領域上にその治療のための生体スカッフォールドを形成させることができる。ある実施態様においては、治療薬は、治療薬を第１混合物またはゲル化成分中に最初に相互分散させることなしに、第１混合物またはゲル化成分と一緒に同時注入させてもよい。

ある実施態様においては、アルギネート構築物系は、第１成分としてのアルギネート‐ゼラチン溶液および第２成分としての塩化カルシウム溶液を含み得る。ある実施態様においては、ヒト間葉幹細胞(hMSC)をゲル化系の１つの成分中に懸濁させる。hMSCは、自己再生並びに骨、軟骨、筋肉、腱および脂肪への分化の双方の能力を有するものと考えられている。また、hMSCは、メセンゲネシス(mesengenesis)と称する段階的成熟過程により、種々の成熟細胞タイプも生じさせる。hMSCの自然形態は、細長で且つスピンドル形状である。ゼラチンは、細胞接着、即ち、hMSC接着のためのRGD部位を提供する。アルギネート構築物系は、急速なゲル化速度を示す。混合したとき、アルギネート‐ゼラチンと塩化カルシウムは、ゲル化して１秒未満で生体スカッフォールドを形成する。得られるゲルは、ほぼ1キロパスカルの貯蔵弾性率を有する。適用においては、細胞生存性は、少なくとも12日間までが観察されている。カプセル化効率は、ほぼ99％である。しかしながら、アルギネート構築物系の小孔サイズは、約2nm〜約500nmであり、hMSC細胞の丸型形態により経時的に観察したとき、低い細胞拡散性をもたらし得る。“細胞拡散性”とは、自然発生の細胞形態を称する。アルギネート構築物系の利点としては、限定するものではないが、損傷心筋の前向きのリモデリングをもたらす増強された免疫応答(制御された異物応答)およびその小孔サイズによって隠蔽されている免疫保護性、この増強された免疫応答から封入された細胞(宿主免疫応答から保護された)、瞬時のゲル化速度、注入するときのニードルへの実質的または完全な非付着性、並びに長期の細胞生存性がある。さらにまた、アルギネート構築物系は、ゆっくり分解する(生体内で少なくとも8週間)。

フィブリン糊は、第１成分としてのフィブリノーゲン(タンパク質成分によって修飾したまたは修飾していない)および第２成分としてのトロンビンを含み得る。ある実施態様においては、ヒト間葉幹細胞(hMSC)を上記ゲル化系の１つの成分中に懸濁させる。フィブリン糊系は、迅速なゲル化速度を示すが、アルギネート構築物系ほどには速くない。混合したとき、フィブリノーゲンとトロンビンは、約5秒〜約10秒でゲル化して生体スカッフォールドを形成する。得られるゲルは、アルギネート構築物系の貯蔵弾性率よりも高い約3キロパスカルの貯蔵弾性率を有する。高い貯蔵弾性率は、梗塞領域での機械的強化性を改善し得る。適用においては、細胞生存性は、少なくとも12日間までが観察されている。フィブリン糊系の孔サイズは、約1.5ミクロン〜約2.5ミクロンであり、hMSC細胞の高い細胞拡散性をもたらし得る。即ち、hMSC細胞は、アルギネート構築物系単独において観察される形態と比較したとき、その内生状態に対してより自然である細長で且つ星状の形態を有することを観察している。フィブリン糊の利点は、限定するものではないが、材料強度、血管形成の促進、良好な細胞適合性(細胞増殖との適合性)、良好な細胞形態性(細長で星状)およびフィブリノーゲン中での高細胞増殖性がある。フィブリン系ゲルの１つのさらなる特徴は、このゲルが生体内で2週間以内に分解することである。

ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、少なくとも２種のゲル化系の各成分を混合することによって形成させる。例えば、第１の２成分ゲルの第１成分と第２の２成分ゲルの第１成分とを混合して第１混合物を調製し得る。第１の２成分ゲルの第２成分と第２の２成分ゲルの第２成分とを混合して第２混合物を調製し得る。細胞は、上記の第１混合物または第２混合物のいずれか中に懸濁させ得る。２つの混合物を混合したとき、両ゲル化系の少なくとも幾つかの有利な特性を含む生体スカッフォールドを具現化し得る。ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、少なくとも２種の異なるゲル化成分を混合して第１混合物を調製することによって形成させ得る。この第１混合物をゲル化塩と混合したとき、個々の成分の少なくとも幾つかの有利な特性を含む生体スカッフォールドを具現化し得る。多くの種々の組合せのゲル化成分を種々の比率で一緒に混合して、個々のゲル化系の種々の有利な特性を際立たせ得ることを認識すべきである。さらにまた、個々の成分の濃度は、単独であれまたは組合せであれ、粘度およびカプセル化効率のような生体スカッフォールドのある種の特性に影響を及ぼし得る。
ある実施態様においては、上記生体スカッフォールドは、アルギネートおよびフィブリン糊複合材料から、下記のようにして形成させる。

変性フィブリノーゲンとトロンビンを含むフィブリン糊キットTisseel^TMを、Baxter社から入手した。フィブリノーゲンを指示されているようにして再構成し、その後、その元の濃度の半分に水で希釈した。希釈フィブリノーゲン溶液を0.5%アルギネート‐コラーゲン溶液と1：1比で混合して第１混合物を調製した。hMSCを、トロンビン溶液(40mMのCaCl₂を含有する)中に2.96×10⁷細胞/mLの濃度で懸濁させた。200マイクロリットルの第１混合物を、上記トロンビンと1：1比で混合した。得られたゲルのカプセル化効率を、91.39±6.78%と測定した。懸濁液成分の粘度は、約7cpで測定した。

変性フィブリノーゲンとトロンビンを含むフィブリン糊キットTisseel^TMを、Baxter社から入手した。フィブリノーゲンを、指示されているようにして再構成し、その後、その元の濃度の半分に水で希釈した。希釈フィブリノーゲン溶液を、0.5％アルギネート‐コラーゲン溶液と1：1比で混合して第１混合物を調製した。hMSCを、第１混合物中に5.51×10⁷細胞/mLの濃度で懸濁させた。第１混合物を、トロンビンと2％CaCl₂溶液を含む第２混合物と1：1比で混合した。得られたゲルのカプセル化効率を、99.42±0.12%と測定した。懸濁液成分の粘度は、約6cpで測定した。

１つの実施態様においては、生体スカッフォールドは、２種以上のゲル化系の各成分を混合することによって形成させることができる。フィブリノーゲン、フィブロネクチン、第XIII因子およびプラスミノーゲンの混合物を含み、Baxter社から入手したTisseel^TMキットは、アプロチニン溶液に溶解させ得る。その後、混合物をゼラチングラフト化アルギネートと混合して第１混合物を調製する。第２混合物を、トロンビン(フィブリン糊系の)と塩化カルシウムを混合することによって調製する。混ぜ合せた混合物の貯蔵弾性率は、およそ0.05キロパスカル〜150キロパスカル、とりわけ、1キロパスカル〜5キロパスカルの範囲であり得る。混ぜ合せた混合物の粘度は、およそ1cp〜40cpであり得る。ある実施態様においては、hMSCを、個々の成分或いは第１または第２混合物に添加し得る。

ある実施態様においては、生体スカッフォールドは、アルギネート‐ゼラチンをヒアルロン酸ナトリウムと混合することによって形成させ、塩化カルシウムによってゲル化させることができる。上記ヒアルロン酸塩を鎖の絡み合いによって固定させ、CD44レセプター、例えば、ヒト間葉幹細胞を担持する幹細胞用の結合リガンドを提供する。適切な配合物は、1％〜50%のヒアルロン酸ナトリウム0.5%〜1%溶液(Genzyme Biosurgery社、マサチューセッツ州)と混合した50%〜99%のアルギネート‐ゼラチン0.5%〜1.0%溶液を含み得る。混合物は、等容量の0.5%〜1.5%塩化カルシウム二水和物を添加することによってゲル化させ得る。

もう１つの実施態様においては、生体スカッフォールドは、再構成凍結乾燥ペプチド(緩衝液による)をアルギネートと混合することによって形成させ、塩化カルシウムによってゲル化させることができる。ペプチドの例としては、RAD 16‐II、MAX‐1およびEAK16‐IIのような自己集合性ペプチドがある。これらのペプチドは、中性pHでの生理的またはそれより高めのオスモル濃度条件に暴露させたときにゲル化する。しかしながら、ゲル化速度は、比較的遅く、数分〜数時間の範囲である。これらのペプチドの単なるスカッフォールドとしての導入は、その遅いゲル化故に、最良でも挿入構造しかもたらさない。アルギネートの添加により、急速なゲル化速度が得られ、それによってペプチドの組織中への散逸を阻止する。

ある実施態様においては、自己集合性ペプチド(SAP)成分を成長因子と混合して第１混合物を調製することができる。自己集合性ペプチドの例としては、RAD 16‐II、MAX‐1およびEAK16‐IIがある。成長因子の例としては、限定するものではないが、血管内皮成長因子(VEGF)、線維芽細胞成長因子(FGF、例えば、ベータ‐FGF)、Del 1、低酸素誘導因子(HIF 1‐アルファ)、単球走化性タンパク質(MCP‐1)、ニコチン、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子1 (IGF‐1)、形質転換成長因子(TGFアルファ)、肝細胞成長因子(HGF)、エストロゲン類、ホリスタチン、プロリフェリン、プロスタグランジンE1およびE2、腫瘍壊死因子(TNF‐アルファ)、インターロイキン8 (II‐8)、造血成長因子、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G‐CSF)および血小板由来内皮成長因子(PD‐ECGF)の各イソ型がある。該第１混合物は、アルギネート構築物系、フィブリン糊またはポリマー系あるいはこれらの任意の組合せのような２成分ゲル化系の成分と混合し得る。ある実施態様においては、ヒト間葉幹細胞を上記系に添加し得る。

１つの実施態様においては、自己集合性ペプチドはRAD 16‐IIであり、成長因子はPDGFまたはその誘導体であり、混合して第１混合物を調製する。PDGFが心臓微小血管内皮細胞の心筋細胞との通信を介在することは証明されており、PDGFの適用により、損傷内皮PDGF調節血管形成を再生させ、梗塞領域内で虚血後新血管形成を増進させるものと予測する。RAD 16‐IIと混合したとき、PDGFは、弱い分子相互作用によりRAD 16‐IIに結合する。ある用途においては、PDGFは、梗塞領域に適用したときにRAD 16‐IIと混合した場合、およそ14日間生存したままである。しかしながら、自己集合性ペプチドの遅い速度、即ち、数分間乃至数時間により、ペプチドが梗塞領域においてナノファイバー生体スカッフォールドを形成し得る前に、有意の漏出、逆流および散逸が生じるものと予測する。
ある実施態様においては、上記第１混合物(RAD 16‐IIとPDGFを含む)は、フィブリン糊のいずれか１つの成分またはアルギネート構築物と混合することができる。フィブリン糊とアルギネート構築物双方の速い速度は、SAP-PDGF構築物の遅い速度と対抗し得る。従って、梗塞領域における漏出および散逸は、SAP‐PDGF構築物をフィブリン糊のいずれか１つの成分またはアルギネート構築物と混合することによって低減し得るものと予測する。

アルギネートおよびフィブリン糊のような複合材料を使用しての以下の試験の結果は、生体スカッフォールドを使用して、MI後リモデリングを被っている組織を有する対象者の梗塞進展を如何にして減衰させたかを例証している。とりわけ、下記の結果は、アルギネートおよびフィブリン糊のような複合材料の、種付け細胞および/または成長因子なしでの注入がMI後期間中のLV形状およびポンプ機能の変化に影響を与えていることを実証している。

試験１
詳細には、以下の試験においては、MIを、成豚において外科的に誘発させた。各ブタは、ヒトにおけるMI後リモデリングを理解するための承認されたモデルであり、従って、本明細書において開示する治療がヒトにも当てはまることに留意されたい。有意のLVリモデリングが1ヶ月に亘って生じ、LV性能の局所的および全体的双方の異常を伴うことは、以前に証明されている。従って、本明細書において開示する試験によって、このブタモデルにおけるMI領域での生体スカッフォールド形成のLV全体および局所の形状および機能に関しての効果を検証した。さらに、本試験により、MI後４週間までのLV心筋リモデリングの生化学/組織学指数に対するこれらの変化の関係を検証した。

本試験は、生体スカッフォールドの各成分の注入のような心筋介入を妥当であるとみなし得る妥当なMI後期間を模倣した。初期創傷治癒期および成熟瘢痕形成の開始は、MI後のほぼ7日目に起る。創傷治癒は、損傷で始まり瘢痕形成で終わる過程である。創傷治癒は、３段階(期)、即ち、炎症、増殖およびリモデリングに分類し得るが、これらの段階は、ある程度オーバーラップする。炎症期においては、フィブリンが付着し、将来の細胞浸潤のための道程として作用する。好中球が出現し、あらゆる微生物を攻撃する。マクロファージが後に続き、細胞残屑を浄化し、サイトカインを放出して増殖期のための線維芽細胞を引付け刺激する。2〜3日後、炎症期は終了する。増殖期においては、線維芽細胞が出現し、結合組織、即ち、新たな血管形成を支えるコラーゲンを放出する。線維芽細胞および肉芽組織合成がこの期において起る。この段階は、ピーク線維芽細胞数に達するのに1〜2週間を要し、さらに2〜3週間続く。また、収縮がこの段階において始まり、線維芽細胞は筋線維芽細胞に分化する。この分化は数週間続き得るが、創傷後の5〜10日でピークである。リモデリング期は、平衡に達するコラーゲンの付着および分解に特徴を有する。この段階において、コラーゲンタイプIIIは、コラーゲンタイプIに転換する。

初期MI後創傷治癒応答の妨害または干渉が有害なLVリモデリングと関連していることは認識されている。従って、本試験においては、複合体注入をMI後の7日目に行って、MI急性期周辺の交絡(confounding)影響を回避した。さらに、複合体注入は、増殖期の任意の時期に実施し得るものと想定した。典型的には、注入は、例えば、創傷後の7〜28日目、創傷後の7〜14日目または創傷後の7〜10日目において行い得る。
LV局所形状を評価する目的で、放射線不透過性マーカーを初期手術時に配置し、梗塞進展の連続評価を可能にした。LV全体形状の連続変化を評価する目的で、心エコー検査を行い、その後、LV形状の心室撮影評価をMI後の28日目において行った。MI後の28日目に、完全な血行力学的な生化学および組織学評価を実施した。

用語
本試験の目的において、上記組織に注入する生体スカッフォールド成分は、フィブリン糊およびアルギネートを含み、明細書においては複合体注入物と称し、表および図面においてはFib‐Algと称する。
注入手順の交絡効果が複合体注入の結果に加えて結果に影響を与えているかどうかに対処するために、複合体注入と同じ形で実施した生理食塩水注入をプロトコールにおいて実施した。本試験の目的においては、この群は、生理食塩水注入群と称する。
正常との参照比較を可能にするため、MIを被ってなく或いは注入に供していない年齢整合対照をプロトコールに含ませた。これらの測定値は、血行力学値、血液値および生化学/組織学結果における参照対照値として機能させた。

MI誘発
永久の冠動脈結紮を、サウスカロライナ州オレンジバーグのHambone Farmsから入手した成豚(例えば、ヨークシャー種、n = 21、25kg)において行い、後方外側MIを誘発させた。手術日に、各ブタを、ニュージャージー州のESI‐Elkins‐Sinn社から入手した200mgのベンゾジアザパムPOを使用して鎮静化し、特注のスリング(つり綱)に入れた。経胸壁心エコー検査(例えば、3 MHzトランスデューサー；Sonos 5500、Agilent Technologies社)を行って、LV拡張終期容量、駆出率および壁厚のベースライン測定値を得た。各ブタにイソフルラン(例えば、3%/1.5L/分)および亜酸化窒素(例えば、0.5L/分)を誘導し、挿管した。無菌左開胸を行い、点検口(例えば、Access Technologies社から入手した7F)と連結させたカテーテルを胸大動脈に入れ、点検口を皮下ポケットに入れた。次に、4個のステンレススチールマーカー(例えば、ビーズ：カリフォルニア州サニーベールのVNUS Medical Systems社)を、OM1とOM2間の中央および回旋動脈の下2cmに位置する心筋上に縫合した。各マーカーは、正確に1cmのマーカー間距離で配置し(現場較正した器具を使用して)、各マーカーが正確な四辺形アレーを形成するようにした。正確に1cm離れて配置した2個の追加のマーカーを胸壁上に縫合して内部較正として機能させた。次に、静脈内リドカインボーラス(例えば、1%、3mg/kg)を投与し、MIを、最初の２つの鈍縁枝、即ち、回旋冠状動脈からの起点のOM1とOM2を直接結紮することによって誘発させた(例えば、4.0プロリン)。切開部は、各層内で閉じた。動物は、全て、National Institute of Health "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council、ワシントン、1996年)に従って処置し養育をした。

MI後測定および心筋注入
MI後の7日目に、各ブタを前項に記載したようにして鎮静化し、LV心エコー検査を行った。大動脈血圧値および血液サンプルを留置点検口から収集した。LV心エコー検査および血圧測定値を使用し、局所ピーク円周方向壁応力を、通常の方法を使用して算出した。血液サンプルを冷却EDTAチューブ内に集め、遠心分離し、血漿をデカンテーションし、−70℃で保存した。その後、放射線不透過性マーカーを、通常の方法を使用して、可視化し、デジタル化した。要するに、蛍光透視像を直交図から記録し、デジタル化し(例えば、30フレーム/秒；ATI社、All‐in‐Wonder Radeon、カナダ国オンタリオ州ソーンヒル)、ECCにゲート処理して、拡張終期フレームを同定する。相応する直交フレームからのマーカー座標を統合して拡張終期マーカー領域を判定する。拡張終期マーカー領域は、５つの連続心周期からコンピュータ処理した。

上記の測定に続いて、各ブタを、複合材料または生理食塩水による心筋注入を受けるように交互方式で割振った。処置プロトコールへの割振り後、各ブタを手術室に戻し、前項に記載したようにしてイソフルランで麻酔した。リドカイン(例えば、3mg/kg)と塩化マグネシウム(例えば、30mg/mL)との静脈内ボーラスを伝達し、その後、リドカイン(例えば、30mL/時)の連続輸注を行った。当初の開胸部位を再切開し、胸部空間を洗浄し、MI領域を可視化した。放射線不透過性マーカーを参照のフレームとして使用して、プラスチックラミネート(例えば、0.25mm)の滅菌注入ガイドをMI領域上に縫合した。
上記注入ガイドは、鈍縁OM1とOM2に囲まれたMI領域を包囲しており、MIの境界領域内に延びていた。上記注入ガイドは、正確に0.5cmの間隔の穿孔を有する有孔グリッドを含んでおり、従って、2×2cmの領域に亘って25個の穿孔を含んでいた。従って、この注入ガイドの設置は、正確な囲い込み領域およびパターン内での25の注入物を伝達する手段を提供していた。

使用する複合注入物は、異なる２成分ゲル系の各成分から製造した。第１成分は、
“Sealer Protein Concentrate”(Baxter Tisseel^TM キット；フィブリノーゲン、フィブロネクチン、第XIII因子、プラスミノーゲンの混合物)のアプロチニン溶液中に溶解し次いでゼラチングラフト化アルギネートと混合した混合物であった。第２成分は、Baxter社から入手したトロンビンと塩化カルシウム溶液からなっていた。各成分は、滅菌条件下に調製した。フィブリン/アルギネート混合物とトロンビン/塩化カルシウム混合物を、26ゲージ針と連結した2本バレル型注入装置のような注入装置上に装着した別々の1mLシリンジに引込んだ。この装置は、100μLの両物質を注入針内で且つ注入部位においてのみ生じる混合によって同時に注入する手段を提供していた。正確に200μLの注入液を、心筋中に、25の注入部位の各々において0.5cmの注入深度で注入し、結果として、5mLの総容量を心筋壁中に注入した。複合材料は注入時に直ちに重合し、従って、注入液の逆流はなかった。生理食塩水注入においては、同じシリンジ装置および注入プロトコールに従った。注入後、グリッドを取出し、胸部空間を閉じ、抜気した。
その後、LV心エコー検査、マーカー測定および採血を、MI後の14日目、21日目および28日目(即ち、それぞれ、注入後の7日目、14日目、21日目)において繰返した。

MI後28日での心筋機能測定
最終の連続試験の後、各ブタを、最初に、50μgの静脈内投与スフェンタニル(ESI‐Elkins‐Sinn社、ニュージャージー州)を使用して麻酔し、挿管した。麻酔は、処置全体に亘って、0.5%イソフルランと60mg/時の静脈内投与モルヒネ(ESI社)を給送することによって維持した。400mL/時の静脈内乳酸加リンガー溶液をプロトコール全体に亘って維持した。この麻酔プロトコールは、深い麻酔レベルと安定な血行動態プロフィールをもたらした。
多内腔熱希釈カテーテル(例えば、カリフォルニア州アービンのBaxter Healthcare社から入手した7.5F)を、右外頸静脈を介して肺動脈内に配置した。サイドアームを有する8F導入器を、右頸動脈内に、血圧測定およびその後の心室撮影用カテーテルの設置のために置いた。胸骨切開を行い、血管結紮糸を下大静脈の周りに置き一過性の大静脈閉塞を発症させた。

前以って較正したマイクロチップ型トランスデューサー(例えば、テキサス州ヒューストンのMillar Instruments社から入手した7.5F)を小先端刺傷からLV内に入れた。LVの後外側面全体を注意深く露出させ、圧電性結晶(例えば、オンタリオ州のSonometrics社から入手した2mm)を放射線不透過性四辺形アレーの中心部分内に置いた。この結晶アレーから、LV寸法および壁厚を100Hzのサンプリング周波数で記録し、デジタル化した。4mmの膜を含む微小透析プローブを、結晶対間の中央心筋領域内に挿入した。上記微少透析プローブを精密輸液ポンプおよびコントローラー装置に連結した。2.5μL/分の流量を確立し、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)類に対する蛍光基質を含有する等浸透圧透析溶液を、60μMの濃度で輸注した。透析液を微量蛍光検出器(例えば、ワシントン州ベルビューのFlAlab Instruments社)に通し、上記溶液を280/360nmの励起/発光波長に供し、出力を、FlAlabバージョン5を使用してデジタル化した。デジタル化蛍光出力は、間質心筋MMP活性に直接比例している。

計測終了時に、特定の発光スペクトルを有する蛍光ミクロスフィア(例えば、オレゴン州ユージーンのMolecular Probes社から入手した3X10⁶)をLV内に注入した。参照大動脈血液サンプルを、注入前5秒で開始し注入後の120秒間続けた7mL/分の速度で同時採取した。定常状態の血行動態値および微小透析MMP測定値は、60分間で得られた。定常状態血行動態値は、全身および肺動脈圧、心拍出量およびLV圧を含んでいた。定常状態測定後、LV事前負荷を、下大静脈の連続閉塞および開放に変え、LV圧および寸法の等時測定値を記録した。デジタル化圧力‐寸法データから、MI領域の局所心筋硬直をコンピュータ処理した。
その後、LV容量および駆出率を、心室撮影法により測定した。6Fピグテールカテーテルを頸動脈導入器によってLV内に入れ、放射線不透過性染料溶液を含む圧力注入装置と連結した。非イオン性造影剤(30cc)をLVに注入し、不透明化像を30度右前斜位にて60フレーム/秒で撮影した。
参照対照値を得る目的においては、5頭の年齢および体重適合ブタを同一方式で計測し、１連全部のLV心筋機能測定を行った。

心筋サンプリングおよび調製
最終群の測定の後、大血管を交差クランプで締め、心臓を取出した。LVを迅速に分離し、氷冷生理食塩水中に入れた。全層環状リング(例えば、1cm)を調製し、切片化を、マーカー四辺形アレーの中心部分を参照のフレームとして使用して実施した。この切片は、テトラゾリウム染色および面積測定法を使用してのMIサイズのコンピュータ処理において使用した。その後、この心筋リングは、水酸化カリウム消化および蛍光定量法による血流測定用に加工した。残りのLVは、MI領域、境界領域(MIを取巻く2cmの領域として定義した)および遠隔領域に分類した。これらの心筋切片は、生化学分析用に急速冷凍し、或いはその後の組織染色のためにホルマリン中に入れた。

心筋生化学および免疫化学測定
各領域からのほぼ0.25gの重さのLV心筋サンプルを凍結乾燥して、総コラーゲン含有量を測定するためのヒドロキシプロリン測定のための塩酸消化に供した。並行サンプルにおいては、心筋を均質化し、遠心分離し、上清を、ピクロシリウス(picrosirius)法を使用しての可溶性コラーゲンの生化学測定に供した。相対的MMP‐2およびMMP‐9レベルは、基質ザイモグラフィーによって測定した。要するに、LV心筋抽出物(10μgタンパク質)を電気泳動に供し、その後、ゼラチン(例えば、Invitrogen社から入手したNovex 10%ザイモグラムゲル、0.1%ゼラチン)ザイモグラフィーを行った。サイズ分画MMPタンパク質分解領域を、Media Cybernetics社から入手したGel Pro Analyzerを使用してのデンシトメトリーによって定量した。

血漿MMP測定
MMP‐2およびMMP‐9の血漿測定は、カリフォルニア州ヘラクレスのBio‐Rad Laborarories社からの酵素連結マルチプレックスサスペンジョンアレーおよびフローサイトメトリー検出法(Luminex社)を使用して実施した。この方法は、15%未満のアッセイ間変動係数でもって、MMP‐2においては25pg/mL未満での、MMP‐9においては7pg/mL未満での感度を与えていた。MMP‐2およびMMP‐9の較正用標準を使用して、このアッセイ法における高直線性を得た(0.99、p<0.001)。全ての血漿サンプルを正副二通りで測定した。

心筋組織
5μmのLV切片をピクロシリウスレッドで染色し、MI、境界および遠隔領域における相対的コラーゲンパーセント領域を、前述したようなコンピュータ支援形態計測法を使用して測定した。さらに、LV切片をレクチンGSA‐B4で染色し、コンピュータ形態測定法を使用して毛細血管内皮を同定し、毛細血管密度を算出した。
パラフィン埋込み切片に対しての免疫組織化学試験を、マクロファージ(MAC‐3、CL8943A、Cedarlane社、1：200)およびリンパ球(CD4、CL012A、Cedarlane社、1：200；GEA4023‐1、Genex社、1：250)に対する特異的一次抗体を使用して実施した。レシチンおよび一次抗血清結合部位の可視化は、Vector Labs社から入手した3',3'‐ジアミノベンジジン‐過酸化水素基質を使用して行った。各切片を倒立顕微鏡において画像化し、画像を、通常の方法を使用してデジタル化した。陰性対照を全ての染色プロトコールにおいて使用し、非免疫抗血清による置換を含んでいた。また、ヘマトキシリンおよびエオシンによる、さらにまた、ヌクレアファストレッドによって対比染色したアルシアンブルーによる一般的な組織染色を行って、遠隔、境界およびMI領域における相対的組織構造も検証した。

データ解析
本試験において集めた全てのデータは、盲検方式で得られ、試験終了まで暗号化されたままであった。心エコー検査、マーカーおよび心室撮影測定における観測者は、試験プロトコールの全体を通して処理業務に対して目隠しされていた。LV形状および機能の連続測定値は、二元分散配置(ANOVA)モデルを使用して比較した。一点測定値は、治療群および対照群間で、一元ANOVAを使用して比較した。ANOVAの後、一対比較を、比較数に対して補正した対応のないt検定を使用して行った。さらに、ベースライン値およびMI後7日目の値との比較は、それぞれの個々の値からのパーセント変化を計算しこれらの計算値をt検定に供したときに行った。生化学および形態計測試験においては、参照対照値との比較は、二元ANOVAを使用して行い、治療効果は集団および領域であった。全ての統計解析を、テキサス州カレッジ・ステーションのStation社から入手したSTATA^R統計ソフトウェアパッケージを使用して行った。P<0.05の値を統計的に有意であるとみなした。

結果
死亡率および最終サンプルサイズ
試験に加えた21頭のブタ全てが初期の計測およびMI誘発に生き残った。初期MI誘発後の24時間において、血漿トロポニン値は、参照対照値よりも5倍を超えて高く(25.6±3.2 U/mL、p<0.05)、Fib/Alg群に無作為化した値(29.3±5.2U/mL)と生理食塩水群へ無作為化した値(23.2±4.0U/mL)間に差異はなかった。MI後の7日目において、複合体注入(Fib‐Alg)群に振り分けた11頭のブタのうち、2頭のブタが、注入処置中に、術中難治性心室細動を発症した。生理食塩水注入群に振り分けた10頭のブタのうち、MI処置後の7日において難治性不整脈を発症したブタはいなかった。Fib‐Alg群のさらなる1頭がMI後14日目に難治性心室頻拍を発症した。生理食塩水注入群の1頭のブタは、心室頻拍をMI後28日目に発症したが、LV機能および血行動態測定値において成功裏に心変換した。従って、MI後28日プロトコールを終了した本試験における最終サンプルサイズは、Fib‐Alg群において8頭、生理食塩水群において9頭であった。

連続測定
連続LV心エコー検査測定値は、下記の表１に示している。

表１心筋梗塞(MI)後の心エコー検査由来のパラメーターの連続変化：MI後7日目での生理食塩水またはフィブリン‐アルギネート注入の効果

MI後の時間依存性の形で、LV収縮期後壁厚は減少しており、隔壁厚は増大していた。しかしながら、Fib‐Alg群においては、LV後壁厚はベースライン値と同様であり、MI後14日目の生理食塩水群よりも比較的高かった。
ベースライン値およびMI後7日目の値からの変化として算出したLV後壁厚は、それぞれ、図２Aおよび２Bに示している。LV後壁厚は両群において低下しているが、MI後4日目での生理食塩水群と比較したときは、Fib‐Alg群において高かった。LV拡張終期容量は、両群において、時間依存性の形で増大していた；しかしながら、LV拡張終期容量は、Fib‐Alg群の方で低い傾向を有していた。
LV拡張終期容量を個々のベースライン値およびMI後7日目の値からの変化として算出し、それぞれ、図３Aおよび３Bに示している。LV拡張終期容量が低めである傾向は、それぞれの7日目の値と比較したときに、Fib‐Alg群において観察されたが、このことは、統計的有意性に達していなかった。LV駆出率はMI後の両群において低下していたものの、LV駆出率は、MI後28日目のFib‐Alg群において高い傾向を有していた。

LV駆出率における個々のベースライン値またはMI後7日目の値からの関数としての相対的変化を、それぞれ、図４Aおよび４Bに示している。この分析により、MI後28日目までのLV駆出率の落込みはFib‐Alg群においてはあまり目立っていないことが明らかになった。
MI領域に存在させた放射線不透過性マーカーの連続変化を、図５A、５Bおよび５Cに示している。図５Aは拡張終期マーカー領域を示しており、図５Bは拡張終期マーカー領域をベースライン値からの関数として示している。拡張終期マーカー領域は、生理食塩水群においては、時間依存性の形で増大しているが、この増大は、Fib‐Alg群においては鈍い。図５CにMI後7日目の値の関数として示しているように、梗塞進展を指標し得るマーカー拡張度合は、生理食塩水群と比較したとき、Fib‐Alg群の方で有意に低かった。従って、MI後7日目におけるFib‐Algの心筋注入は、MI後28日まで増進的に生じている梗塞進展の度合を低下させていた。

MI後28日での最終試験
MI後28日プロトコールの終了時に、形状および機能のさらなるLV心筋測定を行った。これらの測定は、完全な計測および外科的処理によって実施した。ソノマイクロメトリー結晶の配置中に、Fib/Alg群の2頭のブタおよび生理食塩水群の1頭のブタが難治性心室細動を発症した。従って、下記の表２の血行動態値は、それぞれ、6頭および8頭のサンプルサイズにおいてである。

表２心筋梗塞(MI)後28日目での血行動態パラメーター：MI後7日目での生理食塩水またはフィブリン‐アルギネート(Fib‐Alg)注入の効果

静止環境心拍は、生理食塩水群と比較したとき、Fib‐Alg群において高かった。平均動脈圧は、MI後群において僅かに低かったが、血行動態安定性を指標し得る対照からは有意に違っていなかった。心拍出量は、生理食塩水群において僅かに低く、体重に対して指数化したとき、参照対照から低下していた。心係数は、Fib‐Alg群においては、対照値から変わっていなかった。
LV形状は、心室撮影法のより評価した。各群において個々のデータ値および平均値として示したLV容量および駆出率を図６Aおよび６Bに示している。LV心エコー測定値と同様に、図６Aに示すとおり、LV拡張終期容量は、両MI群において有意に増大しており、Fib‐Alg群において低い傾向を有していた。図６Bに示すように、LV駆出率は、両MI群において低下しており、Fib‐Alg群において高い傾向を有していた。しかしながら、これらのグローバルな容量および機能指数は、両群において同様なままであった。
組合せたLV心エコー検査測定値と大動脈圧測定値を使用して、遠隔領域およびMI領域におけるLV放射状壁応力を算出し、それぞれ、図７Aおよび７Bに示している。局所放射状壁応力は、両MI後群のMI領域において存在しているが、生理食塩水群において最高のようであった。

生体内微少透析を行って、MI領域内の間質MMP活性を測定した。結果を図８Aおよび８Bに示している。MMP活性は、参照対照値と比較したとき、生理食塩水において高い傾向を有していた。しかしながら、このことは、統計的有意性に達していなかった。対照的に、MMP間質活性は、対照値およびMIのみの値と比較したとき、Fib‐Alg群において低かった。
遠隔領域(LADによって機能する領域)に対して標準化した心筋血流は、図９に示すように、生理食塩水群およびFib‐Alg群双方のMI領域において低下していた。テトラゾリウム染色に基づく算出MIサイズは、26±7%であり、ペリメーターまたは重量分析法により標準化したとき、群間で同様なMIサイズが明らかになった。結果は、図１０Aおよび１０Bに示している。
LV局所心筋硬直を、MIの中央部分に置き且つ一過性下大静脈閉塞による局所圧力‐寸法関係を構成するソノマイクロメトリー結晶から算出した。この分析の結果を図１１に示している。局所心筋硬直は、両MI後群のMI領域内で有意に増大していた。局所硬直定数はFib‐Alg群において高かったが、このことは、統計的有意性に達していなかった(p=0.19)。

LV心筋構造
ヘマトキシリンおよびエオシンに対して染色した典型的な組織切片を、図１２に示している。高い度合の炎症応答および明白な新血管形成を、Fib‐Alg群の境界およびMI領域において観察することができた。強い炎症応答は、注入複合材料の非晶質密集様領域の周りにより一層局所的に分布しているFib‐Alg群のMI領域において容易に認めることができた。
図１３は、ヌクレアファストレッドで対比染色したアルシアンブルー組織切片の典型的な顕微鏡写真である。強いブルー染色は、おそらくプロテオグリカンおよび他のグリコサミノグリカン類を反映しており、両群の境界およびMI領域内で容易に観察することができた。
図１４Aは、ミエロペルオキシダーゼ染色法を使用しての好中球に対する典型的な組織染色を示している。好中球染色の相対的強度は、両群において、境界領域内で増大し、MI領域内ではさらに増大していた。しかしながら、ミエロペルオキシダーゼの度合は、Fib‐Alg群のこれら領域の双方において増大しているようであった。
マクロファージに対する免疫組織化学染色を、図１４Bに示している。マクロファージ陽性領域は、両群の境界およびMI領域内で観察されたが、マクロファージ陽性細胞数は、Fib‐Alg群において増大しているようであった。

各LV領域内の%コラーゲンの参照対照値との比較で示すLV心筋の形態学的測定値を図１５Aおよび１５Bに示している。各動物における値を各群の平均値と一緒にプロットしている。相対的コラーゲン容量画分は、両MI群において、境界およびMI領域内で増大していた。しかしながら、相対的コラーゲン容量画分は、Fib‐Alg群においては、境界領域において増大し、MI領域においては減少していた。
レクチン陽性血管によって測定するような毛細血管密度を全層LV切片において測定し、結果を図１６に示している。MI領域内の毛細血管密度は、参照対照値と比較して、両MI後群において低下していた。生理食塩水群においては、毛細血管密度は、それぞれの遠隔領域値と比較したとき、境界およびMI領域内で低下していた。極めて対照的に、毛細血管密度は、Fib‐Alg群においては、境界領域内では対照と同様であり、それぞれの遠隔領域と異なっていなかった。

LV心筋生化学
可溶性コラーゲン、即ち、緩衝化塩溶液および均質化によって抽出し得るコラーゲンは、図１７Aに示すように、両群のMI領域内で増大していた。このことは、分解に対してより不安定である新たに合成され不完全なコラーゲン架橋を反映している。しかしながら、可溶性コラーゲン含有量は、Fib‐Alg群におけるMI領域内では減少しており、この領域内でのより高度に架橋した線維状コラーゲンを示している。酸消化心筋サンプルのヒドロキシプロリン測定によって測定されるような総コラーゲン含有量は、図１７Bに示しているように、遠隔領域からMI領域に漸次的な形で増大している。これらの結果は、MI後線維化反応と一致しており、MI群間に有意差はない。

ザイモグラフィーによって測定するようなMMP‐9およびMMP‐2におけるLV MMPプロフィールを、それぞれ、図１８Aおよび１８Bに示している。MMP‐9レベルは、両群におけるMI領域において有意に増大していた。MMP‐9の相対的レベルはFib‐Alg群において高いようであったが、これらのレベルは、統計的有意性には達していない。従って、組織分析によって観察された強い炎症応答は、相対的MMP‐9レベル、即ち、好中球の一次タンパク質分解生成物の有意の増加とは関連していなかった。相対的MMP‐2レベルは、両MI群のMI領域において有意に上昇していたが、それぞれの生理食塩水群値と比較したとき、Fib‐Alg群において有意に且つ実質的に低かった。このことは、MMP‐2の活性形を反映している低分子量形のMMP‐2 (68kDa)においては最も注目すべきことである。LV MMP‐2値および対照に対して標準化したMMP‐2値を、図１９Aおよび１９Bに示している。

血漿MMPプロフィール
多希釈系列にもかかわらず、血漿MMP‐9レベルは、当該MI後期間に収集した血漿サンプルにおいては検出できなかった。MMP‐2についての血漿レベルは、生理食塩水群における全てのMI後時点において、対照値よりも高かった。しかしながら、Fib‐Alg群においては、血漿MMP‐2レベルは、MI後7日目以降、対照と異なっていなかった。さらに、血漿MMP‐2レベルは、Fib‐Alg群においては、幾つかのMI後時点において生理食塩水群値からは低下していた。

要約
本試験の重要な知見は、３つの広範囲の分野、即ち、(1) LV機能および血行動態、(2) 心筋構造、および(3) 心筋生化学に要約し得る。

LV機能および血行動態
この分野における主な知見は、MI領域へのFib‐Alg注入が、参照ビヒクルMI値と比較したとき、LV後壁厚の時間依存性増大を生じていたことであった。Fib‐Alg群においては、MI進展の速度は有意に減衰されており、LV形状および機能の全体的指数は、Fib‐Alg注入によって改善されているようであった。とりわけ、LV短縮率の相対的落込みは低下し、LVポンプ機能の尺度である心係数は上昇していた。梗塞進展過程の有意の減衰の可能性あるメカニズムは、次の項で説明するような線維状コラーゲンマトリックスの改善された保存である。LVポンプ機能の改善の根拠は、局所壁応力パターンおよび体血管抵抗がFib‐Alg群においては低い傾向を有していたので、おそらくLV負荷の変化に基づいていた。局所および全体的LV形状に対するこれらの好ましい効果は、全て、初期MIサイズまたは血流パターンの差異によるものではなかった。

LV心筋構造
画像化試験からのより卓越した特徴の１つは、Fib‐Alg注入後のLV後壁厚の増大であった。組織学的レベルにおいては、明白で強い炎症応答が、組織化学法および免疫組織化学法の両方法によって観察された。とりわけ、MI領域内において好中球浸潤物の増加が、MI後の1ヶ月において、Fib‐Alg注入によって観察され、このことは、高いマクロファージ数と関連していた。しかしながら、興味あることに、このことは、生体内微小透析によって評価されるようなタンパク質分解活性の上昇とは関連していなかった。事実、MMPタンパク質分解活性は、Fib‐Alg群におけるMI領域内では低下していた。MI領域内の総可溶性コラーゲンは、Fib‐Alg注入によって低減していたのに対し、コラーゲンの総生化学含有量は、MI群間で同様であった。このことは、コラーゲンのより高い架橋がFib‐Alg群において生じて、心筋硬直化を改善し且つ境界領域のテザリング(tethering)の改善に有利に作用することを示唆している。事実、相対的心筋硬直はFib‐Alg群において高いようであったし、形態計測による相対的%コラーゲンは、Fib‐Alg群の境界領域内で増加していた。従って、Fib‐Alg群において観察された炎症応答の増強は、コラーゲン分解の増進を生じさせてなく、むしろ、MIおよび境界領域内でのコラーゲンの成熟および瘢痕形成を容易にしているようであった。

LV心筋生化学
MMP‐9の相対的レベルは、MI群において同様形で増大していた。この場合も、このことは、高めの炎症応答がFib‐Alg群において観察されたという事実により、幾分驚くべき知見である。さらにまた、心筋MMP‐2レベル、即ち、心筋において見出され且つ心筋リモデリング中に活性化される遍在性MMPは、Fib‐Alg MI領域において減少していた。総合すれば、このことは、生体内微小透析測定値と一致するタンパク質分解活性の正味の低減をもたらしている。Fib‐Alg群におけるMMP‐2レベルの相対的低減のさらなる確認は、MI後期間における循環性MMP‐2レベルの相対的低減である。

総体的結論
Fib‐Alg複合材料の当該MI後期間内での注入は、梗塞進展を減衰させており、局所的および全体的LV機能に対して好ましい効果を与えていた。Fib‐Alg注入が梗塞進展の促進を改変させるメカニズムは、成熟瘢痕形成に有利に作用していたMIおよび境界領域内において細胞浸潤物およびコラーゲン組成を変えることによっていた。

伝達装置
ゲル化系の各変性または混合成分を伝達するのに使用し得る装置としては、限定するものではないが、２本針左心室注入装置、２本針経血管壁注入装置および２本シリンジがある。最低に侵襲性(即ち、経皮または内視鏡による)の注入装置の使用を可能にする方法としては、大腿動脈または剣状突起下(sub-xiphoid)による利用法がある。“剣状突起”または“剣状突起法”は、胸骨(breastboneまたはsternum)の下端に結合した先の尖った軟骨、即ち、胸骨の最小で最低の区域である。両方法は、当業者にとって既知である。

図２０は、本発明の組成物を伝達するのに使用することのできる２本シリンジ装置の１つの実施態様を例示している。２本シリンジ４００は、互いに近接し且つ近接端部４５５、遠位端部４６０および中央領域４６５においてそれぞれプレート４４０、４４５および４５０によって連結させた第１バレル４１０と第２バレル４２０を含み得る。ある実施態様においては、バレル４１０と４２０は、３本よりも少ないプレートで連結し得る。各バレル４１０と４２０は、それぞれ、プランジャー４１５およびプランジャー４２５を含む。バレル４１０と４２０は、遠位端部において、それぞれ、物質を押出すためのニードル４３０および４３５として終端している。ある実施態様においては、バレル４１０と４２０は、物質を押出すためのカニューレ突起として終端し得る。バレル４１０と４２０は、互いに十分に近接近していて、各々それぞれのバレル内の物質を互いに混合して処置領域、例えば、心筋梗塞後領域中に生体スカッフォールドを形成することがきるようでなければならない。２本シリンジ４００は、本発明において説明する調合物と最低の反応性であるか或いは完全に非反応性である任意の金属またはプラスチックから構築し得る。ある実施態様においては、２本シリンジ４００は、遠位端部４６５に接続させた予備混合用チャンバーを含む。
ある種の用途においては、第１バレル４１０は、変性２成分ゲル化系の第１混合物を含み得；第２バレル４２０は、前記で説明した実施態様のいずれかに従う変性２成分ゲル化系の第２混合物を含み得る。得られるゲルの治療量は、約25μL〜約200μL、好ましくは約50μLである。２本シリンジ４００は、例えば、開胸手術処置中に使用し得る。

図２１A〜２１Bは、本発明の組成物を伝達するのに使用することのできる２本針注入装置の１つの実施態様を例示している。伝達アッセンブリ５００は、伝達管腔、ガイドワイヤー管腔および/または他の管腔をハウジングし得る管腔５１０を含む。管腔５１０は、この例においては、伝達アッセンブリ５００の遠位部分５０５と近接端部５１５間で延びている。
１つの実施態様においては、伝達アッセンブリ５００は、伝達管腔５３０内に可動的に配置した第１ニードル５２０を含む。伝達管腔５３０は、例えば、適切な材料(例えば、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリウレタン等)のポリマーチューブである。第１ニードル５２０は、例えば、伝達アッセンブリの長さを延ばしているステンレススチールハイポチューブである。第１ニードル５２０は、例えば、0.08インチ(0.20センチメートル)の内径を有する管腔である。伸縮自在のニードルカテーテルの１つの例においては、第１ニードル５２０は、遠位部分５０５から近接部分５１５までで約40インチ(約1.6メートル)程度のニードル長を有する。また、管腔５１０は、この例においては、カテーテル長(遠位部分５０５から近接部分５１５まで)に沿って共直線的に延びている補助管腔５４０も含む。補助管腔５４０は、例えば、適切な材料(例えば、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリウレタン等)のポリマーチューブである。遠位部分５０５において、補助管腔５４０は、第２ニードル５５０の伝達端部で終端しており、ニードル５２０の伝達端部と共直線的に整列させている。補助管腔５４０は、第２ニードル５５０の伝達端部に、紫外線硬化性接着剤のような放射線硬化性接着剤によって終端させ得る。第２ニードル５５０は、例えば、主ニードル５２０の端部に、例えば、ハンダ(接合部５５５として示している)により共直線的に接合させているステンレススチールハイポチューブである。第２ニードル５５０は、約0.08インチ(0.20センチメートル)程度の長さを有する。図２１Bは、伝達アッセンブリ５００の線A〜A'での断面正面図を示している。図２１Bは、共直線配列における主ニードル５２０と第２ニードル５５０を示している。

図２１Aに関しては、近接端部５１５において、補助管腔５４０は、補助サイドアーム４６０に終端している。補助サイドアーム５６０は、主ニードル５２０と共直線的に延びている部分を含む。補助サイドアーム５６０は、例えば、主ニードル５２０にハンダ付けし得る(接合部５６５として示している)ステンレススチールハイポチューブ材料である。補助サイドアーム５６０は、１つの例においては、約1.2インチ(3センチメートル)程度の共直線長さを有する。
主ニードル５２０の近接端部は、物質伝達装置に適合させるためのアダプター570を含む。アダプター５７０は、例えば、成形した雌ルアーハウジングである。同様に、補助サイドアーム５６０の近接端部は、物質伝達装置に適合させるためのアダプター５８０(例えば、雌ルアーハウジング)を含む。
図２１A〜２１Bに関連して上述した設計構造は、本発明の変性２成分ゲル組成物を導入するのに適している。例えば、ゲルは、変性２成分ゲル化系の第１混合物と変性２成分ゲル化系の第２混合物との組合せ(混合、接触等)によって形成させ得る。典型的には、第１混合物を、1立方センチメートルシリンジにより、アダプター５７０において主ニードル５２０から導入し得る。同時に或いは前後まもなく、第２混合物を、1立方センチメートルシリンジにより、アダプター５８０において導入し得る。第１および第２成分が伝達アッセンブリ５００の出口(梗塞領域)において混ざったとき、各材料は、組合わさって(混合、接触して)、生体内分解性ゲルを形成する。

図２２A〜２２Cは、本発明の２成分ゲル組成物を伝達するのに使用することのできる２本針注入装置の別の実施態様を例示している。一般に、カテーテルアッセンブリ６００は、変性２成分ゲル組成物のような物質を血管(生理的管腔)または組織の所望領域にまたは所望領域を通して伝達して心筋梗塞領域を処置するための装置を提供する。カテーテルアッセンブリ６００は、“Directional Needle Injection Drug Delivery Device”と題した共同所有の米国特許出願第6,554,801号に記載されているカテーテルアッセンブリ６００と同様である；該出願は、参考として本明細書に合体させる。
１つの実施態様においては、カテーテルアッセンブリ６００は、近接部分６２０と遠位部分６１０を有する細長のカテーテル本体６５０によって形成されている。ガイドワイヤーカニューレ６７０がカテーテル本体内(近接部分６１０から遠位部分６２０まで)に形成されており、カテーテルアッセンブリ６００に供給し且つガイドワイヤー６８０上で操作するのを可能にしている。バルーン６３０が、カテーテルアッセンブリ６００の遠位部分６１０に組込まれており、カテーテルアッセンブリ６００の膨張カニューレ６６０と流体連通している。

バルーン６３０は、折畳んだ形状から所望の制御された膨張形状に拡張するために選択的に膨張性であるバルーン壁または膜６３５から形成し得る。バルーン６３０は、流体を膨張ポート６６５(近接端部６２０に位置した)からの所定の圧力率で膨張カニューレ６６０に供給するによって選択的に拡張(膨張)させ得る。バルーン壁６３５は、膨張後、折畳み形状または収縮形状に戻すために選択的に収縮可能である。バルーン６３０は、液体を膨張カニューレ６６０に導入することによって拡張(膨張)させ得る。また、治療および/または診断剤を含有する液体を使用してバルーン６３０を膨張させてもよい。１つの実施態様においては、バルーン６３０は、そのような治療および/または診断液体に対して透過性である材料から製造し得る。バルーン６３０を膨張させるためには、流体を、膨張カニューレ６６０中に、所定の圧力、例えば、約101.3〜2,026.5kPa (約1〜20気圧)で供給し得る。具体的な圧力は、バルーン壁６３５の厚さ、バルーン壁６３５を製造する材料、使用する物質のタイプおよび所望する流量のような種々の要因に依存する。

また、カテーテルアッセンブリ６００は、物質を心筋梗塞領域に注入するための少なくとも２つの物質伝達アッセンブリ６０５aおよび６０５b(図示していない；図２２B〜２２C参照)も含む。１つの実施態様においては、物質伝達アッセンブリ６０５aは、中空伝達管腔６２５a内に可動的に配置したニードル６１５aを含む。伝達アッセンブリ６０５bは、中空伝達管腔６２５b内に可動的に配置したニードル６１５ｂを含む(図示していない；図６B〜６C参照)。伝達管腔６２５aおよび伝達管腔６２５bは、各々、遠位部分６１０と近接部分６２０間を延びている。伝達管腔６２５aおよび伝達管腔６２５bは、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリウレタン等のポリマーおよびコポリマーのような任意の適当な材料から製造し得る。伝達管腔６２５aまたは伝達管腔６２５bの近接端部へのニードル６１５aまたは６１５bの挿入方法は、それぞれ、ハブ６３５(近接端部６２０に位置した)によって提供される。伝達管腔６２５aおよび伝達管腔６２５bを使用して、変性２成分ゲル組成物の第１混合物と第２混合物を心筋梗塞後領域に伝達することができる。
図２２Bは、図２２Aの線A〜A'(遠位部分６１０)でのカテーテルアッセンブリ６００の断面を示す。図２２Cは、図２２Aの線B〜B'でのカテーテルアッセンブリ６００の断面を示す。ある実施態様においては、伝達アッセンブリ６０５aおよび６０５bは、互いに近接している。伝達アッセンブリ６０５aおよび６０５bの近接は、心筋梗塞後領域のような処置部位へ伝達したときに、変性２成分ゲル化系の各混合物を早急にゲル化させるのを可能にする。

上記の詳細な説明から、当業者の範囲に属する多くの本発明の変更、改作および修正が存在することは明白である。本発明の範囲は、本明細書において開示する種々の種および実施態様からの要素のあらゆる組合せ、並びに本発明の下位アッセンブリ、アッセンブリおよび方法を包含する。しかしながら、本発明の精神を逸脱しないそのような変形は、全て本発明の範囲内とみなすものとする。

１０損傷部位
２０損傷領域
４００２本シリンジ
４１０、４２０バレル
４１５、４２５プランジャー
４３０、４３５ニードル
４４０、４４５、４５０プレート
４５５近接端部
４６０遠位端部
４６５中央領域
５００伝達アッセンブリ
５０５遠位部分
５１０管腔
５１５近接端部
５２０第１ニードル
５３０伝達管腔
５４０補助管腔
５５０第２ニードル
５５５接合部
５６０補助サイドアーム
５６５接合部
５７０、５８０アダプター
６００カテーテルアッセンブリ
６０５ａ、６０５b 物質伝達アッセンブリ
６１０遠位部分
６１５ａ、６１５b ニードル
６２０近接部分
６２５ａ、６２５b 伝達管腔
６３０バルーン
６３５バルーン壁
６３５ハブ
６５０カテーテル本体
６６０膨張カニューレ
６７０ガイドワイヤーカニューレ
６８０ガイドワイヤー

Claims

生体スカッフォールドを含む心筋梗塞後組織を生体内で形成するのに使用するための、第２の２成分ゲル化系と同時注入される第１の２成分ゲル化系であって、
該生体スカッフォールドが、心筋梗塞後組織の心筋梗塞進展速度の減衰に由来する進展に耐え、かつ、該第１の２成分ゲル化系及び該第２の２成分ゲル化系を含み、
該第２の２成分ゲル化系が、該第１の２成分ゲル化系と異なる貯蔵弾性率を有し、
（ａ）該第１の２成分ゲル化系の第１成分がゼラチングラフト化アルギネートであり、該第２の２成分ゲル化系の第１成分がフィブリノーゲン溶液であり、
（ｂ）該第１の２成分ゲル化系の第２成分が塩化カルシウム溶液であり、該第２の２成分ゲル化系の第２成分がトロンビンである
ことを特徴とする、第１の２成分ゲル化系。
生体スカッフォールドを心筋梗塞後領域内に形成するためのキットを製造するための、第１の２成分ゲル化系と第２の２成分ゲル化系の使用であって、
該第２の２成分ゲル化系が、該第１の２成分ゲル化系と異なる貯蔵弾性率を有し、
（ａ）該第１の２成分ゲル化系の第１成分がゼラチングラフト化アルギネートであり、該第２の２成分ゲル化系の第１成分がフィブリノーゲン溶液であり、
（ｂ）該第１の２成分ゲル化系の第２成分が塩化カルシウム溶液であり、該第２の２成分ゲル化系の第２成分がトロンビンである
ことを特徴とする、使用。
前記生体スカッフォールドを、心筋梗塞後に起こる増殖期中に形成させる、請求項２に記載の使用。
前記生体スカッフォールドを、心筋梗塞発症後の７日目又はそれ以降に形成させる、請求項２に記載の使用。
さらに、前記心筋梗塞後領域の境界領域内に生体スカッフォールドが形成されることを含む、請求項２に記載の使用。
左心室後壁厚の時間依存性増大を生じさせるために生体スカッフォールドを心筋梗塞後領域内に形成するためのキットを製造するための、第１の２成分ゲル化系と第２の２成分ゲル化系の使用であって、
（ａ）該第１の２成分ゲル化系の第１成分がゼラチングラフト化アルギネートであり、該第２の２成分ゲル化系の第１成分がフィブリノーゲン溶液であり、
（ｂ）該第１の２成分ゲル化系の第２成分が塩化カルシウム溶液を含み、該第２の２成分ゲル化系の第２成分がトロンビンである
ことを特徴とする、使用。
前記生体スカッフォールドの形成は、第１の２成分ゲル化系の各成分と第２の２成分ゲル化系の各成分を、前記心筋梗塞後領域に、心筋梗塞発症後の所定の時間内に伝達する工程を含む、請求項６に記載の使用。
前記所定の時間が、７日目又はそれ以降である、請求項７に記載の使用。
さらに、前記心筋梗塞後領域の境界領域内に生体スカッフォールドが形成されることを含む、請求項６に記載の使用。
心筋瘢痕形成の成熟を生じさせるために生体スカッフォールドを心筋梗塞後領域内に形成するためのキットを製造するための、第１の２成分ゲル化系と第２の２成分ゲル化系の使用であって、
（ａ）該第１の２成分ゲル化系の第１成分がゼラチングラフト化アルギネートであり、該第２の２成分ゲル化系の第１成分がフィブリノーゲン溶液であり、
（ｂ）該第１の２成分ゲル化系の第２成分が塩化カルシウム溶液を含み、該第２の２成分ゲル化系の第２成分がトロンビンである
ことを特徴とする、使用。
前記生体スカッフォールドが、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性を低下させる、請求項１０に記載の使用。
前記生体スカッフォールドが、コラーゲンタイプＩを増加させる、請求項１０に記載の使用。
前記生体スカッフォールドが、毛細血管密度を増大させる、請求項１０に記載の使用。
前記生体スカッフォールドが、繊維芽細胞浸潤を増大させる、請求項１０に記載の使用。
前記生体スカッフォールドを、創傷治癒の増殖期中に形成させることを含む、請求項１０に記載の使用。
前記生体スカッフォールドを、心筋梗塞発症後の７日目又はそれ以降に形成させることを含む、請求項１０に記載の使用。
さらに、前記心筋梗塞後領域の境界領域内に生体スカッフォールドが形成されることを含む、請求項１０に記載の使用。