JP2003511100A - ハイブリッド・マトリックスとハイブリッド・マトリックス混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 不溶性コラーゲン・フィブリルから製造されたマトリックス物質体と、該マトリックス物質体内に配置された（ａ）複数の脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）例えば、血管新生を促進する因子、サイトカイン、増殖因子又はアスコルビン酸のような作用物質とを有する組成物。本発明はまた、動物にポリペプチドをデリバーする方法をも特徴にする。この方法は、（ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の集団と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーとを含有する流体混合物を動物中に導入することを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は米国特許出願第０９／４１３，７１５号（１９９９年１０月５日出願
）と米国特許出願第０９／６６２，０３７号（２０００年９月１４日出願）との
優先権を主張する。 本発明の分野は、医療的に有用な物質を生産し、デリバリーするためにｉｎ
ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで用いられる医療デバイスである。

【０００２】 発明の背景 医療的に有用な物質をデリバーするために用いられる手段は、これらの物質の
効力に顕著に影響を及ぼしうる。多くのこのような物質の標準的な投与経路は経
口、静脈内又は皮下のいずれかである。各々が、投与される物質の治療的有用性
に影響を及ぼしうる固有の限定を有する。なおその上、多くのタンパク質に基づ
く薬物は、これらの処方とデリバリーにおいて考慮しなければならない要因であ
る、短い半減期と低い生体利用能(bioavailability)とを有する。医療的に有用
な物質をデリバーするために、ポータブルのポンプとカテーテルとを含めて、種
々なデバイスが開発されているが、改良されたデリバリーデバイスの顕著な必要
性がまだある。

【０００３】 タンパク質、糖タンパク質、並びに幾つかのペプチド及び非ペプチドホルモン
は、人為的な合成経路によるよりも培養細胞によってより効果的に産生される。
適当な細胞をバイオリアクターによって典型的に培養し、それからの所望の生成
物を、標準的手段によって、例えば経口的に又は静脈内若しくは皮下注射によっ
て患者に投与するために精製する。或いは、細胞を患者に直接移植することがで
き、そこでこれらの細胞が所望の生成物を産生し、デリバーする（例えば、米国
特許第６，０６３，６３０号と第６，０５４，２８８号参照）。この方法は、正
常な細胞フィードバック機構を利用して生成物の生理的に適当なレベルのデリバ
リーを許す可能性を含めて、生成物自体の注入を凌駕する多くの理論的利点を有
するが、付加的な複雑さを持ち込む。これらの１つは移植時における細胞の適当
な環境に関する。インプラントの細胞を、インプラントを構成する細胞種類の天
然のｉｎ ｖｉｖｏ環境に適合する形で組織することが望ましいと考えられる（
例えば、線維芽細胞は主としてコラーゲンから成る細胞外マトリックスの豊かな
ネットワーク中に天然に存在する）。場合によっては、移植された細胞がモニタ
ーされ、もはや必要とされなくなったときには恐らく取り出されうるように、移
植された細胞が患者の身体中の一定の部位に局限されて留まることを保証する必
要性もある。

【０００４】 この目的のために試験されている１つの方法は、細胞が埋封されたコラーゲン
ゲルの固体単一ピース（“コラーゲン・マトリックス”）から成る移植デバイス
を利用する（例えば、Ｂｅｌｌ，米国特許第４，４８５，０９６号と米国特許第
５，９６５，１２５号）。コラーゲンゲルに強度又は他の望ましい特徴を与える
ために、例えばポリテトラフルオロ−エチレン（ＰＴＦＥ）ファイバー（Ｍｏｕ
ｌｌｉｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４：１５４，１９９３；ＷＯ
９４／２４２９８）のような他の物質をコラーゲン・インプラントに含めること
ができる。

【０００５】 発明の概要 コラーゲン・マトリックスにマイクロキャリヤー（即ち、任意の形状の微小球
）を添加し、それによって本明細書で“ハイブリッド・マトリックス”と呼ばれ
るものを形成することによって、コラーゲン・マトリックスの機能が実質的に改
良されうることが発見されている。これは、コラーゲンがゲル化してマトリック
スを形成する前にマイクロキャリヤーと細胞及び可溶性コラーゲンとを混合する
ことによって達成されうる。埋封された細胞の生存率、増殖及び／又は機能を改
良するために、本発明のマトリックスは以下に挙げる作用物質の１種類以上によ
って被覆された又は該作用物質の１種類以上をカプセル封入する固体基質（例え
ば、アガロースビーズ、コラーゲンビーズ、コラーゲン糸、又はコラーゲン若し
くは非コラーゲンファイバー）を含有することができる。

【０００６】 さらに、マイクロキャリヤー及び細胞｛並びに以下に挙げる１種類以上の作用
物質と会合した（例えば、該作用物質と結合した、該作用物質によって被覆され
た又は該作用物質をカプセル封入した）任意の固体基質｝を流体中に懸濁させ、
この懸濁液を体内に例えば注射によって導入することによって、細胞を動物の体
内に導入することができることを出願人は発見している。この懸濁液は、細胞、
マイクロキャリヤー及び、本明細書に述べる作用物質のいずれかによって被覆さ
れた又は該作用物質をカプセル封入する固体基質の他に、可溶性コラーゲンを包
含することができる。これらの成分を一緒に混合して、液体懸濁液として動物の
体内にデリバーする。このデリバリーは、取り付けた針又はカテーテルを備えた
注射器のような注入可能な系を介して行なうことができる。マクロ孔質マイクロ
キャリヤーの使用は細胞付着のための表面積を顕著に高め、マイクロキャリヤー
の孔に付着して、該孔中に移行する細胞を保護することもできる。コラーゲンを
含有する混合物中では、コラーゲン部分が重合して、動物体中のデリバリー部位
においてコラーゲンゲルの固体塊を形成する。このゲルは懸濁した成分（細胞、
マイクロキャリヤー及び任意の固体基質）の周囲にｉｎ ｓｉｔｕ形成される。
このゲルは注入された成分を一定スペース内に保持することを助けることができ
、該一定スペースの寸法は移植された物質の体積とインプラント部位の空間的寸
法と周囲組織の構造とに依存する。コラーゲンの存在は細胞を、移植プロセス中
に生じる剪断応力から保護することができる。さらに、コラーゲンは保護バリヤ
ーを与えることによって、宿主の炎症細胞による移植細胞の可能な破壊の減少を
助けることができる。コラーゲンを含む混合物は“コラーゲン・マトリックス混
合物”（ＣＭＭ）と呼ばれ、ＣＭＭを用いて（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏのいずれかで）形成された固体マトリックスは“コラーゲン・マトリックス
”（ＣＭ）と呼ばれる。

【０００７】 必要な場合には、非ゲル化コラーゲン溶液と固体基質とを添加する前に細胞を
マイクロキャリヤーに接着させる期間、マイクロキャリヤーと細胞とを一緒に培
養することができる；或いは、３乃至４成分を実質的に同時に又は任意の望まし
い順序で混合することができ、必要な場合には、続いて、可溶性コラーゲンをｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでゲル化して、不溶性コラーゲン・フィブリルと細胞とマイクロ
キャリヤーとから成るゲル化混合物を形成することができる。このゲル化混合物
は液体の排除によって徐々に小さく成って、不溶性コラーゲン・フィブリル・ネ
ットワーク中に埋封された、マイクロキャリヤーと細胞の両方｛並びに以下に挙
げる作用物質のいずれかと会合した（例えば、該作用物質と結合した、該作用物
質によって被覆された又は該作用物質をカプセル封入した）任意の固体基質｝を
含有する、固体で、比較的弾性の、移植可能な単位を形成する。マイクロキャリ
ヤーが包含される場合には、生じるＣＭＭは本明細書において“ハイブリッド・
コラーゲン・マトリックス混合物”（ＨＣＭＭ）と呼ばれ、このようなＨＣＭＭ
から製造されるマトリックスは“ハイブリッド・コラーゲン・マトリックス”（
ＨＣＭ）と呼ばれる。コラーゲンを含まない又はコラーゲン代替物（以下参照）
を含む混合物は“マトリックス混合物”と呼ばれる；このような混合物がマイク
ロキャリヤーを含有する場合には、これらは“ハイブリッド・マトリックス混合
物”（“ＨＭＭ”）とも呼ばれる。マイクロキャリヤーがコラーゲン又はコラー
ゲン以外の物質から製造されうることが理解される。

【０００８】 したがって、本発明は、不溶性コラーゲンフィブリルを包含するマトリックス
物質から製造された体と、該体内に配置された、 （ａ）複数の脊椎動物細胞（特に、例えばヒト、チンパンジー、マウス、ラッ
ト、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ
又はネコに由来する細胞のような哺乳動物細胞）と； （ｂ）固体基質と会合した（例えば、該基質に結合した、該基質上を被覆した
又は該基質によってカプセル封入された）１種類以上の作用物質（下記参照）
と； （ｃ）複数のマイクロキャリヤーであって、各々が好ましくは、コラーゲン（
好ましくは、Ｉ型コラーゲン）、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルア
ミド、セルロース、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、ガラス
（例えば、細胞の接着を改良するために例えばコラーゲンのようなゲルによって
被覆されたガラス）及びゼラチン（例えば、多孔質ゼラチン）を包含するリスト
から選択された１種類以上の物質から主として（即ち、その乾燥重量の５０％よ
り多くが）成る前記複数のマイクロキャリヤーと を有する製品(article)、組成物又はデバイスを包含する。一般には、各マイク
ロキャリヤーの乾燥重量の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％（最
も好ましくは、約９０％〜約１００％、例えば少なくとも９５％）はリストされ
た物質の１種類以上である。本質的に精製コラーゲンから成るとして記載されて
いるマイクロキャリヤーの商業的例は、ＩＣＮ Ｃｅｌｌａｇｅｎ^TMＢｅａｄｓ
とＨｙｃｌｏｎｅ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅｓを包含する。マ
イクロキャリヤーは多孔質密度(porous consistency)を有することが好ましいが
、平滑であることもでき、典型的には、直径約０．１〜２ｍｍ（例えば約０．３
〜１ｍｍ）のほぼ球形を有する。もちろん、如何なる特定のロット又は製造から
のマイクロキャリヤーの形状及びサイズも、製造の許容差の範囲内で変化する。

【０００９】 該製品は、動物、例えばヒト患者のような哺乳動物中に移植されるように形作
ることができるか、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、動物から血液を該製品に
分路し、次に再び動物の血管中に戻すための手段を有する体外バイオリアクター
装置において、又は所望の細胞生成物を含有する培地を精製と薬剤の製造とのた
めに回収することができるバイオリアクター若しくは他の容器において細胞生成
物を製造するように設計することができる。

【００１０】 細胞は患者から取り出された１つ以上の細胞に由来することができ、好ましく
は、例えば酵素、ホルモン、サイトカイン、コロニー刺激因子、血管新生因子、
ワクチン抗原、抗体、凝固因子(clotting factor)、調節タンパク質、転写因子
、受容体又は構造タンパク質のような１種類以上のポリペプチド（例えば、医療
的に有用なポリペプチド）をコードする外因性ＤＮＡを含有する、遺伝子操作さ
れた（例えば、トランスフェクトされた）細胞である。このようなポリペプチド
の例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、エリトロポエ
チン（ＥＰＯ）、アルブミン、ヘモグロビン、α−１アンチトリプシン、カルシ
トニン、グルコセレブロシダーゼ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、Ｉ
Ｌ−２受容体、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、インターロイキン、イン
スリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリノトロピン、上皮小
体ホルモン（ＰＴＨ）、レプチン、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦ
Ｎ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γ）、神経成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因
子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、内皮細胞
増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、
内皮細胞刺激血管新生因子（ＥＳＡＦ）、アンギオゲニン、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−
マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）、α−ガラクトシダーゼ、β−グルセラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、イ
ズロネート２−スルファターゼ、グルコサミン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル補酵素Ａ：α−グルコサミニド−Ｎ−ア
セチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、β
−グルクロニダーゼ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥ
ＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄを包含する。或いは、外因性ＤＮＡは
調節配列と、任意に、内因性遺伝子の発現を活性化する他の要素とを含有しうる
（例えば、本明細書に援用される、ＷＯ９４／１２６５０−ＰＣＴ／ＵＳ９３／
１１７０４に記載されているような相同的組換えを用いて）。

【００１１】 一般に、コラーゲン及び／又はマイクロキャリヤーに付着することができ、例
えば医療的に有用な生成物の発現又は本質的な構造的若しくは代謝的機能の遂行
のような、望ましい性質を示す、任意の種類の細胞を本発明のマトリックスに用
いることができる。例は脂肪細胞、星状膠細胞、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞
、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺細胞、グリア細胞、造血細胞、肝細胞
、角化細胞、筋原細胞、神経細胞、造骨細胞、膵臓β細胞、腎細胞、平滑筋細胞
及び横紋筋細胞、並びに上記のいずれかの前駆体を包含する。必要な場合には、
２種類以上(more than one type)の細胞を特定のマトリックスに含めることがで
きる。細胞はクローン集団又は不均一集団として存在することができる。

【００１２】 本発明のマトリックスはコラーゲンを含有する必要はないが、これらがコラー
ゲンを含有することが好ましい。マトリックス物質中のコラーゲンはＩ型である
ことが好ましいが、任意の他の型のコラーゲンであることができる。マトリック
ス物質は任意に２つ以上の型のコラーゲン（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、
Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ及びＸＩ型から選択される）並びに、得
られるマトリックスに望ましい特徴を与える、任意の付加的成分：例えばアガロ
ース、アルギネート、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫
酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸化プロテオグリカン、フィブリ
ン、エラスチン、テナシン、ヘパリン又は例えばセルロース、澱粉、デキストラ
ン若しくはキトサンのような多糖類を包含することができる。その上、コラーゲ
ンの代わりに又はコラーゲンに加えて、下記物質をマトリックスに含めて、これ
らにコラーゲンの性質を与えるか又はこのような性質を強化することができる：
細断された脂肪組織、細断された大網組織、メチルセルロース、アルギネート、
ゼラチン又はフィブリン。上記コラーゲン性(collagenous)又は非コラーゲン性
成分のいずれもヒトソースに又は他の動物若しくは植物ソースに由来することが
できる。動物ソースからであり、恐らく免疫原性である場合には、それが移植さ
れる予定である対象と同じ動物であることが好ましい。これは、デバイス内に配
置されたコラーゲンファイバー又は非コラーゲンファイバーを包含することもで
きる。コラーゲンファイバーはマトリックス物質体中に配置された架橋コラーゲ
ン糸の形態であることができる。非コラーゲンファイバーは例えば、ナイロン、
ダクロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグ
リコール酸ポリマー混合物、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルコポリマー、腸線、
コットン、リネン、ポリエステル又はシルクを包含する物質から製造することが
できる。

【００１３】 多数の細胞をハイブリッド・マトリックス内に含めることができる。例えば、
接種した細胞数及び初期製造体積(the initial production volume)が等しいと
推定するならば、可溶性コラーゲンのみによって製造されたマトリックスの少な
くともほぼ２倍（好ましくは、ほぼ３倍）多い細胞を含有するハイブリッド・マ
トリックスを製造することができる。特定のハイブリッド・マトリックス中に埋
封された細胞によって一定時間内に発現されたポリペプチド（例えば、医療的に
有用なポリペプチド）の総量は、等量の出発物質から製造された標準コラーゲン
・マトリックスによって得られるよりも典型的に顕著に多い（例えば、少なくと
も５０％多い、好ましくは少なくとも１００％多い、より好ましくは少なくとも
２００％多い）。

【００１４】 本発明のハイブリッド・マトリックスは、例えば細胞の増殖及び／又は維持を
増強することによって、マトリックスの機能を改良するために意図された１種類
以上（例えば、少なくとも２、３、４、５，６、８又は１０種類）の作用物質を
も含有する。これらの作用物質は、例えば、血管新生を促進する因子、サイトカ
イン又は増殖因子を包含することができる。特定のハイブリッド・マトリックス
中に用いられる作用物質と、マトリックス中の細胞によって産生されるポリペプ
チド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）とは同じ物質であることができる
が、これらの２つの存在は一般には異なる。作用物質は、同じ混合物に加えられ
る固体基質と会合する（例えば、固体基質に結合する、固体基質上を被覆する又
は固体基質内にカプセル封入される）。この固体基質はマイクロキャリヤー自体
であることができる、又は分離した存在（単数又は複数）（例えば、マトリック
ス中に埋封された、固体基質の多重粒子又は単一ピース）であることができる。
固体基質は、作用物質の結合を促進するための手段として、それに結合したヘパ
リン又はヘパラン硫酸プロテオグリカンを有することができる。このような固体
基質の例は、それに結合したヘパリン又はヘパラン硫酸プロテオグリカンを有す
る又は有さない、主としてアガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標
）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ^TM、Ｈｅｐａｒｉｎ Ｇｅｌ又はＨｅｐａｒｉｎ−アガロ
ース）から成る固体基質である；このような固体基質はアルギン酸カルシウムを
含有することもできる。固体基質がそれから製造されうる他の物質は、コラーゲ
ン、ゼラチン、エチレン−酢酸ビニル、ポリラクチド／グリコール酸コポリマー
、フィブリン、スクロース八硫酸(sucrose octasulfate)、デキストラン、ポリ
エチレングリコール、アルギネート、ポリアクリルアミド、セルロース、ラテッ
クス、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ナイロン、ダクロン、ポリテトラ
フルオロ−エチレン、ポリグルコール酸、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリ塩化ビ
ニルコポリマー、腸線、コットン、リネン、ポリエステル及びシルクを包含する
。固体基質は例えばビーズ、不規則な粒子、シート又は糸のような、多様な物理
的形態であることができる。作用物質が固体基質中にカプセル封入されている場
合には、該作用物質は一定時間にわたって(over time)徐々に放出される。これ
らの固体基質はマイクロキャリヤー並びに作用物質レザバー(reservoir)として
機能することができる。したがって、本発明の特定のマトリックスがマイクロキ
ャリヤーとして機能しうる固体基質を包含する場合は、該マトリックスが上記で
挙げたマイクロキャリヤーのいずれかを含有することは不要である。

【００１５】 マトリックスに用いることができる作用物質の例は、塩基性線維芽細胞増殖因
子（ｂＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥ
ＧＦ−Ｄ、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子、血小板由
来増殖因子（ＰＤＧＦ）、内皮細胞刺激血管新生因子（ＥＳＡＦ）、ロイコトリ
エンＣ₄、プロスタグランジン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、顆
粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アンギオゲニン、トランスフォーミング
増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β
）、アスコルビン酸、上皮増殖因子（ＥＧＦ），オンコスタチンＭ、又はアンギ
オポイエチン１、２、３若しくは４を包含する。

【００１６】 各作用物質のバイオアクティブ濃度は大きく変動する。出発範囲は製造者によ
って与えられ、通常は、例えば、最終点としての細胞増殖度を用いる標準バイオ
アクティビティ・アッセイに基づく。典型的に、作用物質は広範囲な濃度（最低
は販売者によってバイオアクティブとして報告されている濃度であり、最高は報
告された濃度の１０００倍程度である）のいずれにおいても、例えばヘパリン−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズのような基質に結合することができ；こ
れらのビーズはＨＣＭ中に組み込まれて；ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一定時間にわた
る作用物質の放出は適当な検出系（例えば、イムノアッセイ）を用いてモニター
される。これらの放出アッセイのために、マトリックスは、１０％血清を含有す
る増殖培地中に入れられる。マトリックスが検出可能な量の作用物質を放出する
ことが判明したならば、バイオアクティビティ・アッセイが行なわれる。ある範
囲の作用物質濃度を含有するマトリックスを例えば、作用物質に反応して増殖す
ることが知られている細胞（例えば、製造者によって指示されているように、Ｖ
ＥＧＦとｂＦＧＦに対しては内皮細胞、ｂＦＧＦとＰＤＧＦに対しては線維芽細
胞）上の多孔質インサート（３〜８μｍ孔）上に配置して、細胞増殖曲線を測定
することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアクティビティ・アッセイの結果を
評価して、バイオアクティブと見なされない用量と、“有害(toxic)”（即ち、
対照よりも低い細胞数を生じる）であると測定される用量とに注目する。マトリ
ックス当りの作用物質の最適濃度を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオア
クティビティ結果に基づいて、ある範囲の濃度で作用物質を含有するマトリック
スを免疫欠陥のある(immunocompromised)マウスに移植することができる。マト
リックス当りの最適作用物質濃度は典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏで最大時間量に最
大量の治療タンパク質を放出させる濃度である。

【００１７】 固体基質に結合して又は固体基質内にカプセル封入されてマトリックス物質体
中に存在する上記作用物質の代わりに（又は該作用物質に加えて）、ハイブリッ
ド・マトリックスは、ポリペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）を
発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の第１集団の他に、１種類以
上（例えば、少なくとも２、３、４、６、８若しくは１０種類）の作用物質を発
現し、分泌する培養脊椎動物細胞の第２集団を含有することができる。第２集団
の培養脊椎動物細胞は作用物質を発現するように遺伝子操作される（以下に述べ
るように）ことができる、又は遺伝子操作を利用せずに、作用物質を産生する細
胞であることができる。後者の場合に、細胞がポリペプチドを構成的に産生しな
いか、又は非常に低い量でポリペプチドを産生するならば、細胞を遺伝子活性化
によって作用物質を産生するように、又は作用物質をより多量に産生するように
誘導することができる。本発明のマトリックスは、上記作用物質の他の例を発現
し、分泌する培養脊椎動物細胞の他の集団を含有することができる。該作用物質
産生集団の培養脊椎動物細胞は、例えば、脂肪細胞、星状膠細胞、心筋細胞、軟
骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺細胞、グリア細胞、
造血細胞、肝細胞、角化細胞、筋原細胞、神経細胞、造骨細胞、膵臓β細胞、腎
細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、及び上記のいずれかの前駆体であることができ
る。細胞は好ましくはヒト細胞であるが、任意の脊椎動物（例えば、非ヒト霊長
類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、
モルモット又はハムスターのような哺乳動物）の細胞であることもできる。作用
物質を産生する細胞をマトリックス中に含める場合に、この作用物質が細胞から
分泌されたときにその作用物質の一部を結合するために、マトリックスは任意に
固体基質を包含することもできる。これはハイブリッド・マトリックスからの作
用物質の放出速度を制御する手段を提供する。

【００１８】 好ましい１実施態様では、本発明のハイブリッド・マトリックスは例えば（ａ
）ポリペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）を産生する細胞として
、（ｂ）作用物質を産生する細胞として、（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方として、
又は（ｄ）ポリペプチドも作用物質も産生しない集団として、角化細胞を含有す
る。角化細胞が加えられるハイブリッド・マトリックスは好ましくは、上記ポリ
ペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）及び／又は作用物質を産生す
る細胞として線維芽細胞を含有するハイブリッド・マトリックスである。角化細
胞と線維芽細胞とは同じ個体から得ることができ、１種類以上の角化細胞分化因
子（例えば、１．５〜２ｍＭの濃度のカルシウムイオン、ＴＧＦ−β又は角化細
胞分化因子−１（ＫＤＦ−１））をハイブリッド・マトリックスに加えることが
できる。

【００１９】 同様な方法で、本発明のハイブリッド・マトリックスは内皮細胞を、好ましく
は、ポリペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）を産生する線維芽細
胞に加えて、及び線維芽細胞と角化細胞の両方に加えてさえも、含有することが
できる。内皮細胞と線維芽細胞とは同じ個体から得ることができる。１種類以上
の内皮細胞分化因子（例えば、１０ｎｇ〜１０μｇのＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ）を
ハイブリッド・マトリックスに加えて、マトリックス内での内皮細胞管(endothe
lial tube)の形成を誘導することができる。該分化因子は形成中のマトリックス
に直接加えることも、マトリックス増殖培地に加えることも、これらの両方に加
えることもできる。

【００２０】 本発明のハイブリッド・マトリックスは一般に下記工程： （ａ）複数の脊椎動物細胞；（ｂ）複数のマイクロキャリヤー、該マイクロキ
ャリヤーの各々は好ましくは、コラーゲン、ポリスチレン、デキストラン、ポリ
アクリルアミド、セルロース、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホ
ン及びガラスから成るリストから選択された１種類以上の物質から主として成る
；（ｃ）可溶性コラーゲンを含む溶液；及び（ｄ）固体基質と会合した（例えば
、固体基質に結合した、又は固体基質内にカプセル封入された）上記作用物質の
１種類以上を包含する混合物を形成する工程と； 該混合物中の可溶性コラーゲンに、細胞とマイクロキャリヤーとが埋封される
不溶性コラーゲン・フィブリルのゲルを形成させる工程と； 液体の排除によって該ゲルが小さくなるようにさせる条件に該ゲルを暴露させ
、それによって製品体(the body of the article)を形成する工程と を包含する方法によって製造される。ゲル化は典型的に、比較的酸性のコラーゲ
ン溶液のｐＨを例えば濃厚な緩衝化培養培地の添加によって５より大に高めるこ
とによって誘発され、このときにコラーゲンは不溶性フィブリルを形成する。こ
の工程が型内で行なわれる場合には、ゲルは型の内部の形状になる。一般に、ゲ
ルの収縮は混合物中の細胞によって行なわれ、細胞はフィブリルに付着して、ゲ
ルを成形された形状（例えば、型が円筒形の形状であるペトリ皿である場合には
、ディスク）のより小さいバージョンに収縮させる。マトリックスは製造直後に
用いることができる、又はマトリックス中に存在する細胞数を増加させるように
若しくはそれらの機能を改良するように培養することができる、又は０℃未満の
温度あたりで冷凍保存することができる。さらに、これらのマトリックスは例え
ば約４℃の比較的高い温度の冷蔵庫内で一時的に貯蔵することもできる。

【００２１】 上記作用物質の１種類以上を含有するようなハイブリッド・マトリックスを製
造するために、関連作用物質（上記固体基質のいずれかに結合した又はその内部
にカプセル封入された）を混合物に、上記に列挙した他の成分と共に加える。作
用物質と固体基質とを該混合物に一緒に又は、別々に任意の順序で加えることが
できる。付加的に又は代替的に、混合物は、上記作用物質の１種類以上を分泌す
る培養脊椎動物細胞の第２（及び任意に、第３、第４、第５、第６又はそれ以上
）の集団を含有することができる。該混合物はさらに、作用物質に結合する１種
類以上の物質（例えば、ヘパリン又はヘパラン硫酸）を包含する上記固体基質の
１種類以上をも含有することもできる。角化細胞を含有するハイブリッド・マト
リックスを製造するために、収縮工程前の混合物に角化細胞を加えることができ
る、又はゲルが収縮した後の組成物体に角化細胞を加えることができる。

【００２２】 本発明の任意のハイブリッド・マトリックスの製造において、約０．１８ｃｍ
（例えば、約０．１ｃｍ〜約０．３ｃｍ、好ましくは約０．１５ｃｍ〜約０．２
１ｃｍ）の深さまで混合物を充填した平底型内でゲルを形成することができる。
例えば、ｒ²／Ｖが約１．８（例えば、１．５〜２．０）になるように、内径（
ｒ）を有する平底円筒型において体積（Ｖ）を有する混合物を用いて、ゲルを形
成することができる。本発明は、特定の深さの混合物及び／又は特定の比率のｒ ² ／Ｖの使用から得られ、従って特徴的な厚さを有するハイブリッド・マトリッ
クスを包含する。例えば約２．６５ｃｍの半径を有する円筒型において４ｍｌの
体積を用いて、又は２．６５ｃｍ以外である（即ち、２．６５ｃｍよりも大きい
又は小さい）半径の型においてそれに比例して使用混合物の体積を変化させて、
ゲルを形成することができる。

【００２３】 問題のポリペプチドを分泌する細胞を含有するハイブリッド・マトリックスを
用意して、例えば皮下、腹腔内、大網内、腎臓下嚢(sub-renal capsular)、鼠径
、筋肉内又はくも膜下部位のような、選択された部位において患者に該製品を移
植することを包含する治療方法によって、例えば上記で列挙したようなポリペプ
チド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）を患者にデリバーすることができ
る。ポリペプチドが、創傷治癒を促進するポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ又は
ＩＧＦ−Ｉ）である場合には、前から存在する創傷部位にマトリックスを移植す
ることができる。上記で考察したように、細胞は患者から取り出された１つ以上
の細胞に由来することができ、これらをポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ
によってｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクトすることが好ましい。或いは、これ
らは、ポリペプチドを自然に分泌する又は望ましい代謝機能を果たす細胞（例え
ば、肝細胞又は膵臓β細胞）であることができる。これらの細胞を遺伝子活性化
によってポリペプチドを分泌するように、又はより多量のポリペプチドを分泌す
るように、又は望ましい代謝機能を果たすように誘導することができる。ポリペ
プチドを患者にデリバーするための適当なハイブリッド・マトリックスは上記ハ
イブリッド・マトリックスのいずれかでありうる。

【００２４】 他の実施態様では、ハイブリッド・マトリックス中の細胞によって分泌される
ポリペプチドが血液と混合するように、患者の血液の一部を上記装置に通してシ
ャントすることによって、該ポリペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプチ
ド）を患者に投与することができる。一般に、当業者(those in that field)に
知られたこのような任意の装置を、本発明のマトリックスに順応するように改造
する(adapt)ことができる。例えば、本発明のマトリックスを囲む透過−選択性(
perm-selective)膜を含有するデバイス中にシャントされた血液は、該マトリッ
クスの治療生成物の血液へのデリバリーを生じる。人工膵臓に類似したデバイス
（Ｓｕｌｌｉｖａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７１８−７２１，１９９１）
をこの目的のために用いることができる。再び、本明細書に述べたハイブリッド
・マトリックスのいずれもこのようなデバイスに用いることができる。

【００２５】 本発明の任意のハイブリッド・マトリックスのさらに他の使用は、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで所望のポリペプチド（例えば、本明細書に列挙した任意のポリペプチド
）を生産するための手段としてである。この方法は、マトリックス中の細胞がポ
リペプチドを発現し、分泌するような条件下にハイブリッド・マトリックスを置
く工程と；該マトリックスを液体と接触させて、細胞が該液体中にポリペプチド
を分泌するようにする工程と；例えば、特定のポリペプチドのために適当な標準
精製方法によって、該液体から該ポリペプチドを獲得する工程とを包含する。１
実施態様では、マトリックスは表面に固定されて、該液体によって浸される；或
いは、マトリックスは該液体中で自由に浮遊する。ハイブリッド・マトリックス
中に埋封された細胞は小スペース内で高レベルで機能する。その上、発現された
ポリペプチドの精製における第１工程（培地からの細胞の取り出し）は、細胞培
養の最も標準的な方法によるよりも、マトリックスによる方がかなり効率的であ
る。

【００２６】 本発明はまた、（ａ）一般にポリペプチドを発現する培養脊椎動物細胞（例え
ば、上記で列挙した任意の哺乳動物細胞）の集団と；（ｂ）例えば上記で列挙し
たような、複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）血管新生を促進する因子とサイ
トカインと増殖因子とアスコルビン酸とから成る群から選択された少なくとも１
種類の作用物質であって、コラーゲン溶液中に懸濁した固体基質に会合している
（例えば、該固体基質に結合している、又は該基質上を被覆している、又は該基
質内にカプセル封入されている）前記少なくとも１種類の作用物質とを含有する
流体混合物をも包含する。

【００２７】 細胞は、マトリックスへの使用に関して上述した細胞のいずれかであることが
でき、同じポリペプチドを発現するように同様に遺伝子操作されることができる
。

【００２８】 本発明の流体混合物はコラーゲンを含有する必要はないが、これらがコラーゲ
ンを含有することが好ましい。混合物中のコラーゲンは本明細書に列挙した種類
のいずれか又はこれらの種類のいずれかの組み合わせであることができる。混合
物中には、５を超えるｐＨにおいて該混合物をゲル化させるために充分なコラー
ゲンが存在する。これらの流体混合物はまた、上記に列挙した付加的成分のいず
れかを含有することもできる。コラーゲンの代わりに又はコラーゲンに加えて、
混合物から作られたマトリックスにコラーゲンの性質を与えるために又はこのよ
うな性質を強化するために下記物質を混合物中に含めることができる：細断され
た脂肪組織、細断された大網組織、メチルセルロース、アルギネート、ゼラチン
、及びフィブリン。

【００２９】 マイクロキャリヤーは、本発明の混合物内に高濃度の細胞が含有されることを
可能にする。例えば、移植された混合物がｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド・マトリ
ックスを形成するように可溶性コラーゲンを用いる場合には、このようなハイブ
リッド・マトリックスはｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されたハイブリッド・マトリッ
クス（上記参照）の利点を有する。

【００３０】 本発明のマトリックスはまた、例えば、細胞の増殖及び／又は維持を増強する
ことによって、混合物から作られるマトリックスの機能を改良するように意図さ
れた上記作用物質の１種類以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、８又
は１０種類）を含有することもできる。さらに、これらの作用物質をマトリック
スに関して述べた形態のいずれかで、例えば、溶液中で遊離した又は固体基質上
を被覆した形態で混合物に加えることができる。

【００３１】 本発明の混合物に用いるための各作用物質のバイオアクティブ濃度を測定する
方法は、マトリックスに関して上述した方法と本質的に同じである。しかし、さ
らに、上記ｉｎ ｖｉｖｏ測定を行なう前に、ハイブリッド・マトリックスがｉ
ｎ ｓｉｔｕ形成されるように、混合物をマウス中に導入することができる。

【００３２】 前記作用物質自体を混合物に加える代わりに（又はこの作用物質の他に）、混
合物はポリペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプチド）を発現する培養脊
椎動物細胞の第１集団に加えて、本発明のマトリックスに関して上述した培養脊
椎動物細胞の任意の第２集団を含有することができる。

【００３３】 好ましい１実施態様では、本発明の混合物は、マトリックス中の角化細胞と同
じように得られ、同じ役割りを果たし、同じように機能することができる角化細
胞を含有する。さらに、混合物は上記で列挙した同じ角化細胞分化因子を含有す
ることができる。その上、マトリックスに関して述べたように、本発明の混合物
は内皮細胞と、任意に、上記内皮細胞分化因子を含有することができる。

【００３４】 本発明の混合物は一般に、水溶液中で、（ａ）上記細胞のいずれかの集団と；
（ｂ）複数の上記マイクロキャリヤーのいずれかとを一緒にすることによって製
造される。好ましくは、可溶性コラーゲン又は上記で列挙した代替物の１種類以
上がさらに混合物に加えられる。

【００３５】 上記作用物質の１種類以上を含有するような混合物を製造するためには、関連
作用物質（上記固体基質のいずれかに結合した、又はこれの内部にカプセル封入
された）を上記で列挙した他の成分と共に、混合物に加える。作用物質と固体基
質とを混合物に一緒に加えることも、別々に、任意の順序で加えることもできる
。付加的に又は代替的に、上記作用物質の１種類以上を分泌する培養脊椎動物細
胞の第２（及び任意に、第３、第４、第５、第６又はそれ以上の）集団をさらに
混合物に加えることもできる。その上、作用物質に結合する１種類以上の物質（
例えば、ヘパリン又はヘパラン硫酸）を包含する上記固体基質の１種類以上を混
合物に加えることができる。角化細胞も混合物に加えることができる。

【００３６】 例えば上記に列挙したようなポリペプチド（例えば、医療的に有用なポリペプ
チド）を、細胞（例えば、問題のポリペプチドを分泌する細胞）を含有する本発
明の上記混合物のいずれかを用意して、例えば皮下、腹腔内、大網内、腎臓下嚢
、鼠径、筋肉内又はくも膜下部位のような、選択された部位において患者に該混
合物を導入することを包含する治療方法によって、患者にデリバーすることがで
きる。細胞によって産生されるポリペプチドが、創傷治癒を促進するポリペプチ
ド（例えば、ＰＤＧＦ又はＩＧＦ−１）である場合には、前から存在する創傷部
位に混合物を導入することができる。患者への混合物の導入は、液体懸濁液のた
めに適当な任意の手段：例えば、ピペット、カテーテル又は任意に注射針若しく
はカテーテルによってキャップされた皮下注射器によって行なわれることができ
る。本発明は、動物中への該混合物の導入が、混合物の成分（例えば、培養脊椎
動物細胞、マイクロキャリヤー及びコラーゲン）からの混合物形成と実質的に同
時に生じる方法を包含する。上記で考察したように、細胞は患者から取り出され
た１つ以上の細胞に由来することができ、好ましくはポリペプチドをコードする
外因性ＤＮＡによってｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクトされる。或いは、これ
らの細胞は、自然にポリペプチドを分泌する又は所望の代謝機能を果たす細胞（
例えば、肝細胞若しくは膵臓β細胞）であることができる。該細胞はポリペプチ
ドを分泌するように、より多量のポリペプチドを分泌するように、又は所望の代
謝機能を果たすように、遺伝子活性化によって誘導されることができる。患者に
ポリペプチドをデリバーするための適当な液体混合物は（ａ）上述した液体混合
物のいずれか；又は（ｂ）マイクロキャリヤーを含まないこと以外は上述した液
体混合物のいずれかでありうる。

【００３７】 本発明はまた、本発明の上記液体混合物のいずれかを含有する容器をも包含す
る。この容器は例えば、ガラス又はプラスチックの皮下注射器、ボトル、試験管
、フラスコ又はバイアルであることができる。これはまた、例えば血液バッグの
ようなプラスチック・バッグであることもできる。該容器は、例えば、本発明の
混合物を製造又は小売販売の現場から使用現場、例えば病院又は医師若しくは獣
医の診療所まで輸送するために用いることができる。混合物を患者に導入する前
のゲル化は、例えば、容器の中身を約８℃未満の温度に維持することによって、
阻止することができる。他のタイプの容器、例えばバイアル若しくはボトルを用
いる場合には、実質的なゲル化が生じる前に混合物を患者に導入するために適し
た装置（例えば、皮下注射器又は血液バッグ）に混合物を移すことができる。本
発明のこのような容器は、輸送用物質（例えば、輸送用コンテナ）と共に、キッ
トに含めることができる。

【００３８】 本発明はまた、（ａ）（ｉ）ポリペプチドを発現する培養脊椎動物細胞（例え
ば、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞）の集団と、（ｉｉ）
複数のマイクロキャリヤーとを含有する第１容器と；（ｂ）コラーゲン溶液を含
有する第２容器と；（ｃ）液体培地を含有する第３容器とを含有する輸送用コン
テナを包含するキットを特徴とする。

【００３９】 コラーゲン溶液中には、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の容器の中身を混合するこ
とによって形成される混合物をゲル化させるために充分なコラーゲンが存在する
。コラーゲン溶液は酸性ｐＨであることができ、培地はアルカリ性ｐＨであるこ
とができる。動物に導入すべき混合物はキットから、（ａ）第２容器と第３容器
との中身を一緒にして、コラーゲン／培地溶液を形成して；（ｂ）このコラーゲ
ン／培地溶液を第１容器の中身と一緒にして、混合物を形成することによって製
造される。工程（ｂ）と該液体混合物の対象中への導入とは、該コラーゲン／培
地溶液が形成された直後に、即ち、混合物がもはや液体でなくなる点までコラー
ゲンがゲル化する前に、行なわれるべきである。第２容器中のコラーゲン溶液の
酸性ｐＨ（約ｐＨ２．０〜約ｐＨ４．０の範囲内）は、貯蔵中のコラーゲンのゲ
ル化を阻止する。したがって、酸性コラーゲン溶液がアルカリ性培地によって約
７．２〜約７．８、好ましくは約７．４〜約７．８のｐＨに中和される後まで、
固体マトリックスを形成する混合物のゲル化は生じない。或いは、第２容器中の
コラーゲン溶液は、混合して、動物に導入する直前までこのコラーゲン溶液を１
０℃未満の温度に（例えば、約３℃〜８℃の温度に）維持してゲル化を阻止する
ことによって、約７．２〜約７．８、好ましくは約７．４〜約７．８のｐＨであ
ることができる。いずれの場合にも、混合物の形成後に、該混合物は直ちに、即
ち、該混合物が移植部位に容易に移されることができる点を超えて重合が進行す
る前に、動物に導入される。該キットは好ましくはパッケージング材料と、本発
明の方法に従って使用するための指示(instructions)とを包含する。

【００４０】 或いは、該キットは２つの容器を含有する輸送用コンテナを包含することがで
き、（ａ）第１容器は（ｉ）ポリペプチドを発現する培養脊椎動物細胞（例えば
、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞）の集団と、（ｉｉ）複
数のマイクロキャリヤーとを含有し；（ｂ）第２容器はコラーゲン溶液を含有す
る。

【００４１】 コラーゲン溶液中には、（ａ）と（ｂ）の容器の中身を混合して形成される混
合物をゲル化させるために充分なコラーゲンが存在する。コラーゲン溶液は酸性
ｐＨであることができる。この場合に、混合物の形成の直前に、コラーゲン溶液
のｐＨをアルカリ性溶液、例えば約０．０１Ｎ〜約１．０Ｎの濃度のＮａＯＨ溶
液を用いて、約７．２〜約７．８、好ましくは約７．４〜約７．８に調節するこ
とができる。該キットは任意に（１）このようなアルカリ性溶液を含有する第３
容器及び／又は（２）例えばｐＨ紙、ディップスティック若しくは染料含有溶液
のようなｐＨインジケーターを包含することができる。或いは、第２容器中のコ
ラーゲン溶液はｐＨインジケーター染料を包含することができる。

【００４２】 他の実施態様では、第２容器中のコラーゲン溶液は約７．２〜約７．８、好ま
しくは約７．４〜約７．８のｐＨであり、混合物の形成の直前まで第２容器の中
身を約８℃未満に維持することによってゲル化は阻止される。この場合にも、ゲ
ル化を阻止するために混合物が８℃未満に維持されない限り、一般に混合物の形
成後、直ちに動物中に混合物が導入される。

【００４３】 各場合に、キットは好ましくは適当なパッケージング材料と、使用のための指
示を詳述したラベル及び／又はインサートとを包含する。パッケージング材料は
、例えば、混合物成分を小売商人に又は使用現場、例えば病院若しくは医師の診
療所に輸送するために適したコンテナを包含することができる。適当な輸送用コ
ンテナは、例えば、プラスチック（若しくは他の合成ポリマー）、スチロフォー
ム、厚紙、木材又は金属のボックスを包含する。紙又はプラスチック（若しくは
他の合成ポリマー）のバッグ、エンベロープ又はブリスターパックも輸送用コン
テナとして用いることができる。輸送用コンテナはさらに、例えばプラスチック
（例えば、ポリスチレン）ファイバー若しくはチップ、バブルラップ、若しくは
細断ペーパー、又は容器を保持するのに適合したスロットを有する成形プラスチ
ックのような衝撃保護材料を包含することもでき、断熱される(thermally insul
ated)ことができる。

【００４４】 このようなキットに用いる容器は、ガラス又はプラスチックの皮下注射器、ボ
トル、試験管、フラスコ又はバイアルであることができる。これらはまた、血液
バッグに類似したプラスチック・バッグであることもできる。これらは、１種類
以上の成分を一定温度、例えば約８℃未満の温度に維持するために、断熱された
コンテナに入れて供給されうる。

【００４５】 これらのキットでは、コラーゲンは本明細書に列挙した種類のいずれかであり
うる。その上、このコラーゲンを本明細書に述べた任意の代替物質によって代え
ることも、補充することもできる。培養脊椎動物細胞は、例えば、列挙した培養
脊椎動物細胞のいずれかであることができ、本明細書に述べた方法のいずれかに
よって誘導された(derived)及び／又は遺伝子操作されたものでありうる。細胞
によって発現されるポリペプチドとマイクロキャリヤーとは、例えば、上記に列
挙したもののいずれかでありうる。上記非コラーゲン・ファイバーは任意の１つ
以上の容器に存在することができる。

【００４６】 該キットはさらに、いずれかの容器中に１種類以上（例えば、２、３、４、５
、６、７、８、９又は１０種類）の作用物質、例えば、血管新生を促進する因子
、サイトカイン、増殖因子又はアスコルビン酸を含有することができる。作用物
質は、例えば、本明細書に列挙した作用物質のいずれかでありうる。作用物質が
任意に会合する固体基質の例は、上述したものである。１種類以上（例えば、２
、３、４、５、６、７、８、９又は１０種類）の作用物質、例えば、上述したよ
うな、血管新生を促進する因子、サイトカイン又は増殖因子を分泌する培養脊椎
動物細胞の第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９又は第１０集団も
該キットの容器中に任意に存在する。

【００４７】 キットが培養脊椎動物細胞の集団の１つとして線維芽細胞を含有する場合には
、キットの容器はさらに、上述したように、内皮細胞及び／又は角化細胞並びに
任意に角化細胞分化因子（例えば、１．５〜２ｍＭの濃度のカルシウムイオン）
を含有することができる。線維芽細胞と内皮細胞及び／又は角化細胞は、例えば
、同じ個体から得られたものであることができる。

【００４８】 本発明はさらに、混合物を患者に導入するための装置を特徴とする。この装置
は少なくとも２個（例えば、２、３、４、５又は６個）の容器を包含し、これら
の容器の各々はデリバリー手段と流体連通する出口を有する。該装置は（ａ）コ
ラーゲンが本明細書に列挙したコラーゲンのいずれかでありうるコラーゲン水溶
液と、（ｂ）本明細書に開示したポリペプチドのいずれかを発現する培養脊椎動
物細胞（例えば、任意のこのようなポリペプチドを発現するように遺伝子操作さ
れた細胞）の集団と、（ｃ）上記に列挙したマイクロキャリヤーのいずれかの複
数とを含有することができる。（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の１つ以上が各容器内
に含有されうる。コラーゲン溶液中には、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の容器の中
身を混合することによって形成される混合物をゲル化させるために充分なコラー
ゲンが存在する。容器の１つ以上がそれと関連してピストンを有することができ
、該ピストンは２端部：該容器の内部中に挿入されるのに適合した第１端部と、
該容器の内部から伸びるのに適合した第２端部とを有する。該デリバリー手段は
注射針又はカテーテル又は他の管であることができ、これらは（ａ）該容器の出
口と流体連通するのに適合した２つ以上の入口と、（ｂ）出口とを有する。或い
は、デリバリー手段は、該容器の各々の出口と流体連絡したコネクターと、混合
室と、注射針、カテーテル又は他の管と流体連通した出口とを有するアダプター
・ピースであることができる；該コネクターは、１個のみの容器の出口とそれぞ
れ流体連通した、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５又は６つ）の入口を
含有することができる。該装置はさらに、少なくとも２つの容器を物理的に接合
させる１つ以上のコネクション(connections)を包含することができる。さらに
、各ピストンの第２端部はプレッシャー・プレートに連結することができる。該
装置はまた、任意の他の細胞集団、コラーゲンの代替物、非コラーゲン・ファイ
バー、又は本明細書に列挙した作用物質を包含することもできる。

【００４９】 本明細書で用いる限り、“固体基質”は、この固体基質内に含有される又はこ
の固体基質に結合する物質（例えば、血管新生を促進する因子）のためのレザバ
ー(reservoir)若しくはデポー(depot)として作用する物体（単数又は複数）（例
えば、粒子若しくは糸として形成された）である。該物質は固体基質からその環
境中へ徐々に放出される。固体基質がビーズの形状である場合には、これらのビ
ーズは一般にほぼ球形の形状であり、約０．００５〜２．０ｍｍの直径を有する
。固体基質が糸の形状である場合には、これらの糸は一般に直径において約０．
０１〜１．０ｍｍである。ゲル形成前に、これらの糸は織られることも、網細工
に折り畳まれることも、小ピース（約５〜１０ｍｍ）にカットされることもでき
る。糸が折り畳まれる場合に、それらの長さは、例えば、関連するハイブリッド
・マトリックスの製造に用いられる型の直径の約１倍〜３倍（例えば、約２倍）
であるべきである。本明細書で用いる限り、“固体基質”はセル(cell)ではない
。

【００５０】 他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発
明が属する分野における通常の熟練した人によって一般的に理解される意味と同
じ意味を有する。衝突が生じた場合には(in case of conflict)、定義を含めた
本明細書が支配する(control)。好ましい方法と材料とを以下に述べるが、本明
細書に述べるものと類似した又は同等である、他の方法及び材料も本発明の実施
又は試験に使用可能である。本明細書に述べる材料、方法及び実施例は例証であ
るにすぎず、限定であるとは意図されない。本明細書に挙げた全ての刊行物、特
許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体において、本明細書に援用され
る。

【００５１】 本発明の他の特徴及び利点は、特許請求の範囲及び以下に提供する詳細な説明
から明らかになる。

【００５２】 以下に記載する実施例は本発明の幾つかの実施態様を例示する。これらの実施
例は例示の目的のみのためであり、限定であることを意味しない。

【００５３】実施例Ｉ ヘパリン−セファロース・ハイブリッド・コラーゲン・マトリックス（ＨＳＨＣ
Ｍ）の一般的説明 ＨＳＨＣＭは、濃縮Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）と、コ
ラーゲン（例えば、ラット尾Ｉ型又は適当な代替物、例えばヒト胎盤Ｉ若しくは
ＩＩＩ型コラーゲン）と、マイクロキャリヤー（例えば、上述したようなコラー
ゲン・マクロ孔質マイクロキャリヤー若しくは多孔質ゼラチン・マイクロキャリ
ヤー）と、被覆されない又は、血管新生因子、サイトカイン、又は増殖因子［例
えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧ
Ｆ）若しくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）］によって被覆されたヘパリン−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズと、治療タンパク質を発現する細胞とを
一緒に混合することによって製造される。他の実施態様では、問題の治療タンパ
ク質を発現する１つの細胞株と血管新生因子、サイトカイン又は増殖因子を発現
する他の細胞株とを含む、多重細胞株をマトリックスに混入する。治療タンパク
質と血管新生因子若しくは増殖因子との両方を発現する単一細胞株を用いること
も可能である。この実施態様では、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）
ビーズ成分は、被覆されないことも、組み入れた細胞株によって発現される増殖
因子と同じ若しくは異なる増殖因子によって被覆されることも可能である、又は
ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ成分は完全に省略されること
もできる。

【００５４】 マイクロキャリヤー調製 マトリックス製造のためのコラーゲン・マイクロキャリヤーの調製は次の通り
である。コラーゲン・マイクロキャリヤー（Ｃｅｌｌｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ ｃａｔ．＃ＹＢ００−００１５ＵＷ）を、製造者から提供された各オリジ
ナルボトル（〜１０ｍｌ／ボトル）から５０ｍｌ円錐管（１管／ボトル）中に移
した。マイクロキャリヤーを管中で沈降させ、貯蔵緩衝溶液を吸引除去した。マ
イクロキャリヤー洗浄培地（１％ウシ血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシ
ンとを含むＤＭＥＭ）を目盛り付き管上の５０ｍｌ標識まで加え、マイクロキャ
リヤーを沈降させ、培地を吸引除去した。このシリーズの洗浄工程を全体で４回
洗浄のために繰り返した。２５ｍｌプラスチック・ピペットを用いて、マイクロ
キャリヤーを２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコに移し、マイクロキャリヤー
量を２５０ｍｌフラスコ当り１００ｍｌに制限した。マイクロキャリヤー洗浄培
地を２５０ｍｌ標識まで加えて、フラスコにキャップをして、３７℃の組織培養
インキュベーター中に２〜３時間入れた。フラスコをインキュベーターから取り
出して、マイクロキャリヤーを沈降させて、洗浄培地を吸引除去した。インキュ
ベーション工程と洗浄工程とのこのシリーズを全体で３回洗浄のために繰り返し
た。

【００５５】 ゼラチン・マイクロキャリヤーの調製は次のように行った。１ｇの乾燥Ｃｕｌ
ｔｉｓｐｈｅｒｅ−ＧＬ^TMゼラチン・マイクロキャリヤー（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃ
ａｔａｌｏｇ＃ＤＧ−１００１−００）を、カルシウムもマグネシウムも含まな
いリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）５０ｍｌを含有する１００ｍｌガラスボト
ルに入れた。このゼラチン・マイクロキャリヤーを室温において少なくとも１時
間水和させた。これらを１２１℃における１５分間の加圧滅菌によって殺菌した
。このゼラチン・マイクロキャリヤーをマトリックスに用いるために、ＰＢＳを
除去し、ＤＭＥＭ＋１％ウシ血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（５０
ｍｌ／洗浄）中で３回洗浄することによって、コンディショニングした(conditi
oned)。このゼラチン・マイクロキャリヤーを洗浄間で穏やかに旋回させて、沈
降させた。コンディショニング済みゼラチン・マイクロキャリヤーは使用前に４
℃において貯蔵することができる。

【００５６】 ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ調製 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）アガロース・ビーズに結合したヘパリンは、
ヘパリンに結合する、例えばｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦのような、増殖因
子が付着するための固体サポートを与える。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）は
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって製造された高度に架橋したアガロ
ース樹脂であり、製造者の登録商標である。異なるタイプのサポート・マトリッ
クス（例えば、ポリマー）に結合したヘパリンをヘパリン−アガロース・ビーズ
の代わりに用いることができる。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃１
７−０９９８−０３）を洗浄当りビーズ量の５倍のｄＨ₂Ｏ中で３回洗浄した。
ｄＨ₂Ｏの添加後、これらのビーズを穏やかに旋回させ、各洗浄工程間で５００
ｘｇにおいて遠心分離した。これらを１２１℃における２０分間の加圧滅菌によ
って殺菌した。これらのビーズを、１：１のビーズ対ＰＢＳスラリーのｐＨが７
．２〜７．４の範囲内になるまでＰＢＳ中で徹底的に洗浄することによって、ｐ
Ｈ７．２〜７．４において平衡させた。これらのビーズをＰＢＳとの１：１スラ
リー中で４℃において貯蔵した。

【００５７】 血管新生因子と増殖因子とをヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビー
ズに次のように結合させた。平衡化ビーズを適当なサイズの滅菌管（例えば、１
．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ又は１５ｍｌ円錐管）中に入れて、５００ｘｇにお
いて４分間遠心分離した。これらをＰＢＳ中で２回洗浄し、各洗浄間で遠心分離
工程を行なった。血管新生因子又は増殖因子（例えば、ｂＦＧＦの場合には５０
μｇ／ｍｌにおいて）を、１：１ビーズ対ＰＢＳスラリーを得るために充填ビー
ズ量に等しいＰＢＳ量中のビーズに加えた、この結合は室温において１時間回転
させながら（例えば、Ｎｕｔａｔｏｒ^TMプラットフォーム上で）行なわれた。何
らかの未結合増殖因子を含有するＰＢＳをビーズから吸引によって取り出し、こ
れらのビーズを、充填ビーズ量に等しい量のＰＢＳ中で１回洗浄した。ＰＢＳを
除去し、マトリックス形成までビーズを氷上に置いた。

【００５８】 ＨＳＨＣＭ調製 ＨＳＨＣＭの調製に用いた種々な成分を表１と２に列挙する。これらの表はコ
ラーゲン・マイクロキャリヤー（表１）及びゼラチン・マイクロキャリヤー（表
２）を用いたＨＳＨＣＭの製造を説明する。各表は生産培地１ｍｌ当りの各成分
の量と、例としての１０ｘ４ｍｌのＨＳＨＣＭの製造のために必要な量を記載す
る（以下にマトリックスに関して記載する量と濃度とは、それぞれ、収縮前の量
と濃度を意味する）。マトリックスの“プレ−ミックス”は１０Ｘ ＤＭＥＭと
、７．５％ＮａＨＣＯ₃と、１Ｍ ＨＥＰＥＳと、ペニシリン−ストレプトマイ
シンと、Ｌ−グルタミンと、ｄＨ₂Ｏとから成る。このプレ−ミックスは一般に
、コラーゲン、細胞及び血管新生因子被覆ビーズを混合する１〜２時間前に調製
して、４℃に維持した。ＨＳＨＣＭ中に埋封されるべき細胞はトリプシン処理に
よって回収して、細胞数を測定した。必要な細胞数（マトリックス当りの細胞数
に製造されるマトリックスの総数を乗じたもの）を１５００ｒｐｍ（５００ｘｇ
）において室温で７分間遠心分離した。細胞ペレットを、表１と２に示したよう
なＨＳＨＣＭ生産培地の総量の１０％に等しい量の増殖培地中に再懸濁させた。
マトリックス１ｍｌ当りの細胞密度は適当に変えることができる（例えば、０．
１〜１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌマトリックス）。細胞懸濁液を総生産培地量の１０
％である量で加えたので、この懸濁液の１ｍｌ当りの細胞数は、所望の細胞密度
／ｍｌマトリックスよりも１０倍大きかった（例えば、１〜１００ｘ１０⁶細胞
／ｍｌマトリックス）。適当な量のマイクロキャリヤーを円錐管に入れ、細胞懸
濁液をこのマイクロキャリヤーに加えた。１０ｍｌプラスチック・ピペットを用
いて、細胞とマイクロキャリヤーとを一緒に混合し、生産培地に混入する前に約
１０〜１５分間室温に放置した(set aside)。このプレ−ミックスを氷上に置き
、コラーゲン（例えば、ラット尾コラーゲン（ＲＴＣ））の溶液を該急冷プレ−
ミックスに加えて、１０ｍｌプラスチック・ピペットを用いて完全に混合した。
次に、表１又は２に指示した量の１Ｎ ＮａＯＨの添加によって、生産培地のｐ
Ｈを約７．８に調節した。細胞／マイクロキャリヤー混合物を該中和生産培地に
加えて、１０ｍｌプラスチック・ピペットを用いて混合した。ヘパリン−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズの充填量に等しい量の増殖培地をビーズに加え
て、ビーズを生産培地に移して、１０ｍｌプラスチック・ピペットを用いて混合
した。この最終ＨＳＨＣＭ生産培地のある量を適当なサイズのペトリ皿に加えた
。例えば、一般に４ｍｌのＨＳＨＣＭ生産培地が６０ｍｍペトリ皿に、１０ｍｌ
が１００ｍｍペトリ皿に、３０ｍｌが１５０ｍｍペトリ皿に加えられる。生産培
地量の皿表面積に対する比率を変えて、ＨＳＨＣＭの厚さを調節することができ
る。ＨＳＨＣＭ生産培地を含有する皿を、３７℃の温度、９５〜９８％の湿度及
び５％のＣＯ₂レベルを有するインキュベーターに移した。１時間後に、皿をイ
ンキュベーターから取り出して、検査した。ＨＳＨＣＭ生産培地がゲル化してい
たならば、このＨＳＨＣＭに５ｍｌの増殖培地を添加によって供給した。さもな
ければ、皿をインキュベーターにさらに１時間又は重合が完了するまで戻して、
重合が完了した時点でこのＨＳＨＣＭに５ｍｌの増殖培地を添加によって供給し
た。この増殖培地には、ＨＳＨＣＭのヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標
）ビーズを被覆するために用いた同じ増殖因子又は血管新生因子 １０〜１００
ｎｇ／ｍｌを補充した。

【００５９】

【表１】

【００６０】

【表２】

【００６１】 ＨＳＨＣＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ維持と評価 下記プロトコールを用いて、１日目にマトリックスに供給し、次に週に２〜３
回供給することによって、ＨＳＨＣＭを培養状態に(in culture)維持した： １．培養培地を注意深く吸引する； ２．各マトリックスに用いた皿のサイズを考慮しながら、必要量の適当な増殖
培地を加える。この培地にはアスコルビン酸２−リン酸及び／又はＴＧＦ−β（
例えば、１０〜５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２−リン酸及び／又は１〜１０ｎ
ｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β）を補充することができる。マトリックスに供給するため
に用いられる増殖培地量は通常、各皿サイズに加えられうる最大量であり、例え
ば、１０ｍｌ／６０ｍｍ皿、２０〜３０ｍｌ／１００ｍｍ皿及び１００〜１５０
ｍｌ／１５０ｍｍ皿である。

【００６２】 マトリックス直径サイズと細胞数／マトリックスは次のように決定した： ＨＳＨＣＭの直径は下記方法を用いて測定することができる： １．測定すべきマトリックスを含有するペトリ皿を暗色バックグランドに置か
れたメートル法定規の上部に載せる。 ２．望み通りに：例えば、最初の２週間は毎日、最初の２週間後は１日おきに
及び実験期間の細胞定量日に、直径（ｃｍ）を記録する。

【００６３】 Ｃ．細胞をＨＳＨＣＭから次のように回収して、定量することができる： １．ハイブリッド・コラーゲン・マトリックスの酵素消化 ａ．ＰＢＳ中のコラゲナーゼＩＡ（ＨＳＨＣＭに対して１．０ｍｇ／ｍｌ；ア
スコルビン酸２−リン酸及び／又はＴＧＦ−βを補充したＨＳＨＣＭに対して２
．０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製する。 ｂ．コラゲナーゼ溶液を１５ｍｌ円錐形遠心管中に、１〜５ｘ１０⁶細胞を接
種したマトリックスに対しては１ｍｌの量で、マトリックス当り５ｘ１０⁶細胞
より多くを接種したマトリックスに対しては５ｍｌの量で分配する。計測すべき
マトリックスと同じだけ多くのコラゲナーゼ管を用意する。 ｃ．フラット・ピンセットを用いて、各マトリックスをその皿から取り出し、
吸収性ペーパータオル（細胞を計数後に廃棄する場合には）又は滅菌吸収性パッ
ドを用いて、該マトリックスから過剰な流体を注意深く吸い取る。 ｄ．各マトリックスを個々のコラゲナーゼ含有管に入れ、しっかりとキャップ
をして、組織培養インキュベーターに入れて４０ｒｐｍにセットされたオービタ
ル・シェーカー上に固定する。 ｅ．マトリックスを約１時間又は消化が完了するまでインキュベートする。消
化を促進するために、５分間間隔でピペッティングすることによってマトリック
スを分解する。

【００６４】 ２．細胞計数 ａ．遠心管の側面のグラデーションを用いて、各消化済み細胞懸濁液の総量を
測定する。 ｂ．細胞生存率を測定するために、０．１ｍｌの細胞懸濁液を取り出して、１
．５ｍｌマイクロ遠心管中の０．１ｍｌの０．０８％トリパンブルーに加える。
管を軽くタッピングすることによって混合する。 ｃ．血球計を用いて生存細胞と死亡細胞を計数する。必要な場合には、細胞懸
濁液をＰＢＳ中でさらに希釈してから、トリパンブルーを添加する。工程２ａで
測定した総量を考慮しながら、細胞の総数を計算する。

【００６５】実施例ＩＩ この実施例は実施例Ｉに述べたように調製されたＨＳＨＣＭのｉｎ ｖｉｖｏ
移植を説明する。非被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ又は
ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ充填ビーズ；１０μｇ総ｂＦＧＦ／マトリックス）に
よって被覆されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを表１に記
載したように調製した。各４ｍｌマトリックスを、ＨＦ７４３Ｂ１−３５の５ｘ
１０⁶細胞、プラスミドｐＸＦ８．１９８（図１）を含有し、ｈＦＶＩＩＩを２
０，０００〜３０，０００ｍＵ／２４ｈ／１０⁶細胞のレベルで発現するヒト包
皮線維芽細胞クローンによって形成した。本発明のマトリックス及び混合物への
使用に適した細胞を用意し、トランスフェクトするためのさらに詳細な方法は、
その全体において本明細書に援用されるＷＯ９３／０９２２２（ＰＣＴ／ＵＳ９
２／０９６２７）に提供されている。ＨＳＨＣＭを移植前に２日間培養状態に維
持した。マトリックスの皮下移植のために、Ｒａｇ−２マウス（１２９Ｓ６／Ｓ
ｖＥｖＴａｃ−［ＫＯ］Ｒａｇ２，Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）を次のように
麻酔し、準備した。マウスにＡｖｅｒｔｉｎ^TM（２％ｗ／ｖ２，２，２−トリブ
ロモエタノールと２％ｖ／ｖ２−メチル，２−ブタノールの溶液を０．０１７５
ｍｌ／ｇ体重の用量で腹腔内注入した。麻酔したマウスを横臥状態(in lateral
recumbency)に置き、移植部位の毛を剃り、アルコールとＢｅｔａｄｉｎｅ^TM（
０．７５％ヨウ素溶液）とによって消毒した。肋骨よりも下方及び尾側の、動物
の左わき腹の皮膚層に２ｃｍの切開を設け、皮膚層と外斜筋層との間の筋膜を除
去し、該切開を滅菌鈍はさみによって拡大した。ＨＳＨＣＭを１０ｍｌのＰＢＳ
中で２回洗浄して、移植のために準備した。滅菌スプーン状スパチュラを用いて
、各マトリックスを四半分に折り畳んで、切り開いた(cleared)皮膚スペースに
滅菌スパチュラを用いて挿入した。この切開を創傷クリップを用いて閉じた。

【００６６】 メトキシフルラン（Ｐｉｔｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ）を含有する大きいビーカー
中にマウスを軽度な麻酔が達成されるまで入れた後に、眼窩後方出血によって血
液を回収した。２種類のマウスモノクローナル抗体に基づくｈＦＶＩＩＩ ＥＬ
ＩＳＡを用いて、血漿ｈＦＶＩＩＩを測定した［Ｈｏｒｎｓｅｙ等（１９９２）
，Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．２（３）：２２３−２２９］。この目的のために
わきに取って置いたＨＳＨＣＭからの回収細胞を消化し、計数することによって
、推定細胞数／マトリックスを測定した。非被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ビーズを含有するＨＳＨＣＭは平均２．８ｘ１０⁶細胞／マトリックスを有し、
ｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを含有するＨＳＨＣＭは平均
３．１ｘ１０⁶細胞／マトリックス（ｎ＝３マトリックス／条件）を有した。移
植日の各マトリックス種類からのｈＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ生産は、非被
覆ビーズ含有ＨＳＨＣＭとｂＦＧＦ被覆ビーズ含有ＨＳＨＣＭから、それぞれ、
７１，１６５ｍＵ／２４ｈと８５，６５７ｍＵ／２４ｈであった（ｎ＝３マトリ
ックス／条件）。図２に示すように、ｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅビーズを含有するＨＳＨＣＭは、増殖因子を含まないＨＳＨＣＭに比較して、
宿主マウス中に検出されるｈＦＶＩＩＩのかなり高い血漿レベルを生じた（ｎ＝
１０マウス／条件）。０日目には検出可能なｈＦＶＩＩＩが存在せず、１４日目
にはピーク血漿レベルが生じた。

【００６７】 下記実施例はＲａｇ−２マウス中へのＨＳＨＣＭ（実施例Ｉに述べたように調
製）の皮下移植を含む付加的な研究を述べ、上記で紹介したＨＦ７４３−Ｂ１−
３５ｈＦＶＩＩＩ分泌細胞クローンを用いる。

【００６８】実施例ＩＩＩ 非被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ又はｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅビーズ（５０μｇ／ｍｌ充填ビーズ、１０μｇ総ｂＦＧＦ／マト
リックス）と、コラーゲン・マイクロキャリヤー又はゼラチン・マイクロキャリ
ヤーとを含有するＨＳＨＣＭを、それぞれ、表１と２に記載するように調製した
。移植日における平均細胞数／マトリックスとｈＦＶＩＩＩ製造／マトリックス
（ｎ＝３マトリックス／条件）を表３に列挙する。

【００６９】

【表３】

【００７０】 この実験に皮下（ＳＣ）細胞対照を含め、これを次のように用意した。ＨＣＭ
の調製に関すると同じ方法でトリプシン処理によって細胞を回収した。トリプシ
ン処理細胞を計数し、５００ｘｇにおいて遠心分離し、Ｈａｎｋ’ｓ緩衝化塩類
溶液（カルシウムとマグネシウムとを含まず）中に再懸濁させ、遠心分離し、回
収後のオリジナル細胞数に基づいて１００ｘ１０⁶細胞／ｍｌになるような量の
ＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞／ＰＢＳスラリー中の細胞を計数し、懸濁液中の
細胞密度を５０ｘ１０⁶細胞／ｍｌ ＰＢＳに調節した。各注入のために、全体
で０．１５ｍｌの細胞スラリーを１ｃｃＧｌａｓｓｐａｋ^TM注射器中に吸引し、
この注射器に２２Ｇ／１インチ針でキャップした。この細胞スラリーをマウスの
左側に、肋骨よりも下方及び尾側でＳＣ注入した。針の空隙容積を考慮して、全
体で０．１ｍｌ、又は５ｘ１０⁶細胞を各対照動物に注入した（ｎ＝５マウス／
条件）。

【００７１】 図３は、ゼラチン・マイクロキャリヤーとｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとを含有するＨＳＨＣＭが、マウスに移植されたと
きに、他方の条件に比べてかなり高いレベルのｈＦＶＩＩＩを生じた（ｎ＝１０
マウス／条件）ことを示す。発現パターンは実施例ＩＩで観察された発現パター
ンに類似しており、７日目までは検出可能なｈＦＶＩＩＩは存在せず、１４日目
に最高の発現が生じた。移植後１日目以後の任意の時点においてＳＣ細胞注入を
受けたマウスの血漿中には検出可能なｈＦＶＩＩＩは存在しなかった。

【００７２】実施例ＩＶ １２．５、２５又は５０μｇ／ｍｌ充填ビーズにおいてｂＦＧＦによって被覆
されない又は被覆されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを含
有するＨＳＨＣＭを、コラーゲン・マイクロキャリヤー処方（表１）を用いて調
製した。被覆ビーズの混入後のｂＦＧＦ総量／マトリックスは、それぞれ、約２
、４及び１０μｇであると推定された。移植日の平均細胞数／マトリックスとｈ
ＦＶＩＩＩ産生／マトリックスと（ｎ＝３マトリックス／条件）を表４に要約す
る。

【００７３】

【表４】

【００７４】 図４は、ｈＦＶＩＩＩの血漿レベルが１０μｇのｂＦＧＦを含有するマトリッ
クスの移植後は、４μｇ及び２μｇのｂＦＧＦを含有するマトリックスに比べて
、かなり高い（ｎ＝５マウス／条件）ことを実証する。発現パターンは実施例Ｉ
ＩとＩＩＩで観察された発現パターンに類似した。

【００７５】実施例Ｖ ｂＦＧＦによって被覆されない若しくは被覆された、ＶＥＧＦによって被覆さ
れた、又はｂＦＧＦとＶＥＧＦの両方によって被覆されたのいずれかであるヘパ
リン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを含有するＨＳＨＣＭを、ゼラチン・マイクロ
キャリヤー処方（表２）に従って調製した。両方の増殖因子によって被覆された
ビーズを含有するＨＳＨＣＭのセットに関しては、以前の実験と一致したビーズ
量を維持するために、各マトリックスは０．１ｍｌのｂＦＧＦ被覆ビーズと０．
１ｍｌのＶＥＧＦ被覆ビーズとを受容した。この条件に対する各増殖因子の被覆
濃度は１００μｇ／ｍｌ充填ビーズであり、ＨＳＨＣＭ当り全体で約１０μｇの
各増殖因子を生じた。ＨＳＨＣＭ＋ｂＦＧＦ＋ＶＥＧＦでは、それぞれ約１０μ
ｇのｂＦＧＦとＶＥＧＦとが存在した。移植日の平均細胞数／マトリックスとｈ
ＦＶＩＩＩ産生／マトリックスと（ｎ＝３マトリックス／条件）を表５に要約す
る。

【００７６】

【表５】

【００７７】 ＨＳＨＣＭからのｈＦＶＩＩＩの皮下デリバリーを、マウスモデルにおいてｈ
ＦＶＩＩＩのデリバリーのために上首尾だと実証されている他の移植方法と比較
するために、大網内（ＩＯ）移植対照を含めた。ＩＯ対照は次のように調製した
。ＨＣＭの調製に関すると同じ方法でトリプシン処理によって細胞を回収した。
トリプシン処理細胞を計数し、５００ｘｇにおいて遠心分離し、Ｈａｎｋ’ｓ緩
衝化塩類溶液（カルシウムとマグネシウムとを含まず）中に再懸濁させ、再遠心
分離し、回収後のオリジナル細胞数に基づいて１５ｘ１０⁶細胞／ｍｌになるよ
うな量のＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞／ＰＢＳスラリー中の細胞を計数し、５
ｘ１０⁶細胞に等しい細胞懸濁液量を滅菌１．５ｍｌマイクロ遠心管中に分配し
て、ミクロ遠心機で５００ｘｇにおいて４分間遠心分離した。細胞ペレットとＰ
ＢＳとを含有する管を氷上に置き、各細胞ペレットをＲａｇ−２マウスの大網陥
凹(omental recess)中に次の方法で移植した。細胞を移植する前に、マウスを１
．２５％Ａｖｅｒｔｉｎ^TMによって麻酔して、横臥状態に置いた。肋骨と後膝と
の間の左側腹部をアルコール・パッドで拭いて、Ｂｅｔａｄｉｎｅ^TMによって用
意した(prepped)。小さい（０．５ｃｍ〜１．０ｃｍ）切開を肋骨より後方で、
背骨に対して腹側に設けた。脾臓を露出して、徐々に体外に出した。頭部及び正
中方向で(upon the cranial and medial aspect)脾臓の軸に沿って、脾臓の門表
面(hilar surface)に隣接した薄膜内に細胞を挿入した。脾臓を腹腔内に戻し、
切開を閉じた。

【００７８】 図５は、血漿ｈＦＶＩＩＩレベルがｂＦＧＦとＶＥＧＦとの組み合わせを含有
するＨＳＨＣＭからは、１４日目と２１日目に他の条件に比べて、かなり高いこ
とを実証する（ｎ＝５マウス／条件）。細胞ＩＯの注入は１日目にかなり高い血
漿ｈＦＶＩＩＩレベルを生じたが、次の時点（７日目）までにＩＯ対照に観察さ
れたレベルは、増殖因子を含有するＨＳＨＣＭインプラントによって得られたレ
ベル未満に低下した（ｎ＝５マウス／条件）。

【００７９】実施例ＶＩ ２種類の線維芽細胞クローン：ｈＦＶＩＩＩを発現するＨＦ７４３Ｂ１−３５
と、プラスミドｐＸＶＥＧＦ−１（図６）を含有して、ＶＥＧＦを発現するＨＦ
８１１−Ｍ１５との組み合わせを含有するＨＳＨＣＭ［Ｋｏｃｋ等，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４６：１３０９〜１３１２，１９８９］を、移植のために調製した。Ｈ
Ｆ８１１−Ｍ１５クローンは移植の時点において平均８５ｎｇのＶＥＧＦ／２４
ｈ／１０⁶細胞を産生していた。これらのマトリックスはコラーゲン・マイクロ
キャリヤー処方（表１）に従って調製した。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登
録商標）ビーズ成分は被覆しなかった。一方及び他方のクローンを５ｘ１０⁶細
胞／マトリックスで用いて、２セットのＨＳＨＣＭを調製した。追加の２セット
を一定数のＨＦ７４３Ｂ１−３５細胞（５ｘ１０⁶）と、追加の１ｘ１０⁶又は２
．５ｘ１０⁶のＨＦ８１１−Ｍ１５細胞とを用いて調製した。表６は種々な条件
と、各条件に対するｈＦＶＩＩＩとＶＥＧＦとのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生レベルを
要約する（ｎ＝５マトリックス／条件）。

【００８０】

【表６】

【００８１】 各ＨＳＨＣＭ条件に対する一定時間にわたる血漿ｈＦＶＩＩＩレベルを図７に
要約する。２．５ｘ１０⁶ＨＦ８１１−Ｍ１５細胞を含有するＨＳＨＣＭのセッ
トは最高のｈＦＶＩＩＩ血漿レベルを生じた、この血漿レベルは１４日目にピー
クになり、４２日目まで低下し、この時点ではｈＦＶＩＩＩは検出不能であった
。１ｘ１０⁶ＨＦ８１１−Ｍ１５細胞を含有するＨＳＨＣＭは、２．５ｘ１０⁶Ｈ
Ｆ８１１−Ｍ１５細胞を含有するＨＳＨＣＭの該セットよりもやや低いが、ＶＥ
ＧＦ産生細胞を含まないＨＳＨＣＭよりもやや高いｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを
生じ、このことは、ＶＥＧＦがインプラントによるｈＦＶＩＩＩのデリバリーに
用量依存性効果を及ぼすことを実証した。

【００８２】 血漿サンプル中のＶＥＧＦ量をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＶＥＧ
Ｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ）によって測定した。結果を表７に要約す
る。２．５ｘ１０⁶又は５ｘ１０⁶ＨＦ８１１−Ｍ１５細胞によって作製したＨＳ
ＨＣＭを移植されたマウスからの血漿中では、１４日目から２８日目までに検出
可能なＶＥＧＦの低下が生じた。ＨＦ８１１−Ｍ１５細胞なしで又は１ｘ１０⁶
ＨＦ８１１−Ｍ１５細胞を用いて作製したＨＳＨＣＭを移植された動物の血漿中
では、ＶＥＧＦレベルは検出不能であった。アッセイのために１日目と７日目の
血漿サンプルは利用不能であったが、データは、ＶＥＧＦレベルが移植時から１
４日目までのある時点でピークに達したことを示唆する。

【００８３】

【表７】

【００８４】実施例ＶＩＩ 本発明のマトリックスの製造に用いられる混合物の体積は、０．１８ｃｍの液
柱高さ（即ち、深さ）に基づく。６０ｍｍ皿（半径２．６５ｃｍ）中の混合物の
４ｍｌ量がこのサイズの皿では最高の細胞生存率とタンパク質発現を生じること
が発見された。式：Ｖ＝πｒ²ｈ［式中、Ｖ＝混合物の体積、ｒ＝皿の半径、ｈ
＝液柱高さ（即ち、皿中の混合物の深さ）］に基づくと、４ｍｌの最適体積＝π
（２．６５ｃｍ）²ｈであるので、最適深さ＝０．１８ｃｍ及び最適ｒ²／Ｖ比率
＝１．８になる。次の表（表８）は、０．１８ｃｍ高さがそれから誘導された６
０ｍｍサイズを含めて、種々な皿サイズに対する最適体積を示す。

【００８５】

【表８】 約１．８比率が細胞生存率とタンパク質発現のために最適であることが判明した
が、約１．０〜３．０、好ましくは１．５〜約２．０の比率で充分であった。こ
れらは、それぞれ、約０．２１ｃｍ及び約０．１６ｃｍの深さに相当する。

【００８６】実施例ＶＩＩＩ 本発明のＨＳＨＣＭはヒトへの移植のために次のように調製される： 所望の細胞を、典型的には、患者に由来する安定にトランスフェクトされたオ
ートロガス細胞を組織培養皿から回収し、上記方法のいずれかによってＨＳＨＣ
Ｍ生産のために処理した。特定の患者に対する投与量（即ち、マトリックスによ
って産生される治療生成物の生理的有効量）は、大きい若しくは小さいマトリッ
クスの使用、患者への異なる数のマトリックスの移植及び／又は、マトリックス
の構成時に異なる生成物レベル／細胞を発現する細胞の使用によって変化させる
ことができる。患者内で産生される治療生成物量も、治療遺伝子の発現を変える
薬理学的又は生理的シグナルにマトリックス中の細胞を暴露させることによって
変化させることができる。例えば、治療遺伝子がグルココルチコイド反応性プロ
モーターの管理下にある場合には、例えばデキサメタゾンのような薬物への細胞
のｉｎ ｖｉｖｏ暴露（薬物がインプラントに確実に達するようなやり方で患者
に薬物を投与することによる）が治療遺伝子の発現を変化させる。

【００８７】 典型的に、６０ｍｍペトリ皿中に生産され、約１０ｘ１０⁶細胞／マトリック
スを含有する、複数個の小マトリックス（直径 約１〜２ｃｍ）が移植される。
したがって、１０個の小マトリックスを用いて、約１億の細胞を移植することが
できる。かなり高い細胞密度を有するマトリックス（例えば、アスコルビン酸２
−リン酸を混入することによって生産される）の使用は、特定の患者に対して必
要なマトリックス数を少なくする。或いは、より大きいペトリ皿（＞１５０ｍｍ
直径）を型として用いて、より大きいマトリックスを製造することができ、これ
を直接移植するか又は小ピースにカットして移植することができる。

【００８８】 移植する前に、細胞が生存可能にとどまることを可能にする増殖培地又は任意
の他の溶液中でマトリックスを貯蔵するか又は輸送することができる。或いは、
移植する前に洗い流すことができる、適当なフリージング培地中でフリージング
することによって、マトリックスを低温保存することができる。

【００８９】 マトリックスを、非限定的に、皮下、腹腔内、脾臓内、大網内、鼠径、くも膜
下、脳室内及び筋肉内部位、並びにリンパ節内又は脂肪組織内を包含する、多様
な部位に移植することができる。適当な部位に外科的な切開を設けて、マトリッ
クスを挿入し、該切開を閉じる。

【００９０】実施例ＩＸ 本発明のハイブリッド・マトリックス内に保持される細胞を用いるタンパク質
生産への使用に適用可能である、多くの静置及び灌流大規模ｉｎ ｖｉｔｒｏ培
養系が存在する。標的タンパク質の精製前に必要な、供給工程と培地回収工程に
多様な機能レベル(varying levels of facility)を、選択が提供する。幾つかを
以下に述べる。

【００９１】 １．慣用的なペトリ・プレートにおけるＨＳＨＣＭの形成と熟成後（例えば、
１０〜２５日間インキュベーション後）に、多くのこれらのＨＳＨＣＭを滅菌Ｍ
ｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ（２５０〜１００ｍｌ容
量）に無菌下で移すことができる。これらのＨＳＨＣＭを生産して、各マトリッ
クス内の生存細胞密度を最大にするような条件下に維持する。典型的に、これは
、マトリックス体積１ｍｌ毎に５〜２０ｍｌの培地を必要とする。タンパク質生
産培地は、最小限の不定成分（例えば、血清）を含むように処方され、細胞当り
のタンパク質産生の出力を最大にするように意図された添加因子を包含すること
ができる。３０〜７０ｒｐｍにセットされた電磁気撹拌プラットフォーム上の３
７℃±１℃、５％±１％ＣＯ₂加湿インキュベーター(humidified incubator)中
にスピナー・フラスコを入れる。１〜３日間後に、このフラスコをクラス１００
の生物学的安全キャビネットに移し、発現タンパク質を含有する生産培地を、沈
降したマトリックスを乱すことなく、無菌下でくみ出す。等量の新鮮なタンパク
質生産培地を該フラスコに加えて、このフラスコをインキュベーター内の撹拌プ
ラットフォームに戻す。

【００９２】 ２．上記（１）に述べたマトリックスを制御可能な撹拌インペラ・シャフト付
き１〜５Ｌバイオリアクター（例えば、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）中に無菌下で移す
ことができる。このバイオリアクターの制御系によって、生産培地レベルを設定
する。培地の回収と補給とは、汚染を最少にするために、滅菌閉鎖ループ系内で
制御される。

【００９３】 ３．高体積のＨＳＨＣＭ生産のためには、マトリックスを構成成分から形成し
て、組織培養ローラー・ボトル内でゲル化させる。このボトルを、マトリックス
の収縮が自由浮遊構造を生じるまで（３〜５日間）、静止直立状でインキュベー
トする。次に、増殖培地を補給して、ボトルに５％ＣＯ₂を供給して、３７℃イ
ンキュベーター内のローラー装置に入れる。増殖培地は、ＨＳＨＣＭが成熟する
まで（１０〜２５日間総インキュベーション）、２〜３日間毎に補給し、ＨＳＨ
ＣＭが成熟した時点でこのＨＳＨＣＭをタンパク質生産培地に暴露させる。１〜
３日間後に、このボトルをクラス１００の生物学的安全キャビネットに移し、発
現タンパク質を含有する生産培地を、マトリックスを乱すことなく、無菌下でく
み出す。等量の新鮮なタンパク質生産培地を該ボトルに加えて、このボトルをロ
ーラー装置に戻す。

【００９４】 ４．ＨＳＨＣＭの構成成分を密封可能なポートに通して滅菌ガス透過性Ｔｅｆ
ｌｏｎ^TMバッグ中に無菌下で導入することができる。これらの成分はバッグ内で
ゲル化され、その中の形状及び構造を呈する。バッグを３７℃±１℃、５％±１
％ＣＯ₂加湿インキュベーター中でインキュベートする。ＨＳＨＣＭは収縮して
、体積を減じるので、補償するように増殖培地量を調節する。培地の回収と補給
とは、バッグに作りつけた滅菌連結管系を通して遂行される。ポート付き(porte
d)インキュベーターと延長管組織(extended tubing)との使用はサイクル式回収
／供給ポンプ系(cyclic harvest/feed pumping system)の設計を可能にし、これ
は生産ラン中にインキュベーターからバッグを取り出す必要性を回避することが
できる。

【００９５】 ５．ＨＳＨＣＭの構成成分を大容積容量を有するカスタム・デザイン熱成形ト
レイ中に無菌下で導入することができる。最も簡単な構造は、ＣＯ₂組織培養イ
ンキュベーターに用いるために設計された、ガス交換能力を有する無蓋の(open
lidded)長方形トレイであると考えられる。他の設計は、バイオリアクター室に
類似した、制御された供給と培地回収とのために培地レザバーへのポート付きア
クセス(ported access)を有する閉鎖ループ系を包含すると考えられる。

【００９６】実施例Ｘ 注入可能なヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ハイブリッド・コラーゲ
ン・マトリックス混合物（Ｉ−ＨＳＨＣＭＭ）の一般的説明 濃縮ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まず）と、ラット尾Ｉ型コラーゲン（又
は適当な代替物、例えばヒト胎盤Ｉ型及び／又はＩＩＩ型コラーゲン）と、多孔
質マイクロキャリヤー（例えば、コラーゲン・マクロ孔質マイクロキャリヤー又
は多孔質ゼラチン・マイクロキャリヤー）と、血管新生因子又は増殖因子［例え
ば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ
）又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）］によって被覆されない又は被覆された
任意のヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズと、治療タンパク質を
発現する細胞とを一緒に混合することによって、Ｉ−ＨＳＨＣＭＭを調製する。
他の実施態様では、細胞株の組み合わせを該コラーゲン溶液中に混合する、一方
の細胞株は問題の治療タンパク質を発現し、他方の細胞株は血管新生又は増殖因
子を発現する。治療タンパク質と血管新生又は増殖因子との両方を発現する単一
細胞株を用いることも可能である。この実施態様では、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅビーズ成分は、組み込まれた細胞株によって発現される増殖因子と同じ若
しくは異なる増殖因子によって被覆されないことも、被覆されることもできる、
又はこれを全く省略することもできる。本発明の注入可能なマトリックス混合物
は、コラーゲンも、本明細書に開示されたコラーゲン代替物のいずれも含まない
マトリックス混合物を包含する。その上、血管新生因子又は増殖因子のソースを
含まない混合物も本発明に包含される。該混合物がマイクロキャリヤーを欠くこ
とができることも理解されるが、一般に、このような混合物は例えば血管新生因
子、サイトカイン、増殖因子又はアスコルビン酸のような作用物質を包含する。
必要がないとはいえ、このような作用物質は本明細書に述べる固体基質のいずれ
かと会合することができる。これらの固体基質は、細胞が付着するマイクロキャ
リヤーとして及び関連作用物質のレサバーとしても機能することができる。

【００９７】 マイクロキャリヤー調製とヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ調
製 マイクロキャリヤーとヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとを
実施例Ｉに上述したように調製した。混合物の形成前に、無血清ＰＢＳによる３
〜５回の洗浄によって、血清タンパク質を除去した。

【００９８】 Ｉ−ＨＳＨＣＭＭ調製 Ｉ−ＨＳＨＣＭＭの調製に用いる種々な成分を表９に列挙する、表９は、マイ
クロキャリヤーとしてゼラチン・ビーズを用いるＩ−ＨＳＨＣＭＭの調製を説明
する。この表は生産培地の１ｍｌ当りの各成分の量と、例としての１０ｘ１ｍｌ
及び１０ｘ２ｍｌのＩ−ＨＳＨＣＭＭの製造のために必要な量とを記載する。マ
トリックス“プレ−ミックス”はフェノールレッドを含まない４Ｘ ＤＭＥＭと
、７．５％ＮａＨＣＯ₃と、１Ｍ ＨＥＰＥＳと、ペニシリン−ストレプトマイ
シンと、Ｌ−グルタミンと、ｄＨ₂Ｏとから成る。このプレ−ミックスは一般に
、１〜２時間前に調製されて、４℃に維持される。マトリックス成分と共に注入
されるべき細胞を組織培養器から回収して、５００ｘｇにおいて１０分間遠心分
離して、細胞ペレットを得る。この細胞ペレットをＰＢＳ中で１回洗浄し、ＰＢ
Ｓを除去し、ペレットをフェノールレッドを含まない１Ｘ ＤＭＥＭ中に、表９
に指示したＩ−ＨＳＨＣＭＭ生産培地の総量の１０％に等しい量で再懸濁させる
。マトリックス生産培地１ｍｌ当りの細胞密度は適当に変化することができる（
例えば、０．１〜１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌ注入可能なマトリックス）。細胞懸濁
液を総生産培地量の１０％である量で加えるので、この懸濁液の１ｍｌ当りの細
胞数は、マトリックス混合物１ｍｌ当りの所望の細胞密度よりも１０倍大きい筈
である（例えば、１〜１００ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）。適当な量のマイクロキャリ
ヤー（例えば、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅｓ）を円錐形遠心管に入れ、これらのマ
イクロキャリヤーに細胞懸濁液を加える。１０ｍｌガラスピペットを用いて、細
胞とマイクロキャリヤーとを一緒に混合して、生産培地に組み入れる前約１０〜
１５分間、室温に放置する。このプレ−ミックスを氷上に置き、この急冷プレ−
ミックスにコラーゲン溶液（例えば、ラット尾コラーゲン（ＲＴＣ））を加えて
、１０ｍｌガラスピペットを用いて完全に混合する。次に、表９に指示した量の
１Ｎ ＮａＯＨの添加によって、この生産培地を約７．８のｐＨに調節する。細
胞／マイクロキャリヤー混合物を５００ｘｇにおける５分間の遠心分離によって
ペレット化し、上澄み液を吸引し、表９に列挙した、マイクロキャリヤー量に加
えた細胞懸濁液量に等しい最終量になるように、フェノールレッドを含まないＤ
ＭＥＭ量を管に加える。中和生産培地に細胞／マイクロキャリヤー懸濁液を加え
て、１０ｍｌガラスピペットを用いて混合する。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
（登録商標）ビーズの充填量に等しい、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ量
をビーズに加えて、該ビーズを中和生産培地に移して、１０ｍｌガラスピペット
を用いて混合する。完成した生産培地を注入の直前まで氷上に維持し、注入の時
点で適当なサイズの注射器（例えば、１０ｃｃ）に装填する。装填後に、注射器
に針（例えば、１６ゲージ）でキャップして、この注射器を所望の部位（例えば
、皮下）に注入する。

【００９９】

【表９】

【０１００】 ゲル化混合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価 ある量の最終Ｉ−ＨＳＨＣＭＭ生産培地を適当なサイズのペトリ皿に、上述し
たように、注射器から１６Ｇ針を通しての注入によって加える。例として、Ｉ−
ＨＳＨＣＭＭを３５ｍｍペトリ皿に２ｍｌ、６０ｍｍペトリ皿に４ｍｌ、１００
ｍｍペトリ皿に１０ｍｌ及び１５０ｍｍペトリ皿に３０ｍｌ加える。生産培地量
の皿表面積に対する比率を変えて、ゲル化ＨＳＨＣＭの厚さを改変することがで
きる。次に、Ｉ−ＨＳＨＣＭＭ生産培地を含有する皿を、３７℃の温度、９５〜
９８％の湿度及び５％のＣＯ₂レベルを有するインキュベーターに移す。１時間
後に、皿をインキュベーターから取り出して、検査する。Ｉ−ＨＳＨＣＭＭ生産
培地がゲル化していた場合には、フェノールレッドを含まない５ｍｌのＤＭＥＭ
の添加によって、ＨＳＨＣＭに供給する、そうでない場合には、皿をインキュベ
ーターにさらに１時間又は重合が完了するまで戻す。

【０１０１】 ＨＳＨＣＭを所望の時間、培養状態に維持する。マトリックスに供給するため
に用いられる培養培地量は通常、各皿サイズに加えられうる最大量であり、例え
ば、５ｍｌ／３５ｍｍ皿、１０ｍｌ／６０ｍｍ皿、２０〜３０ｍｌ／１００ｍｍ
皿、及び１００〜１５０ｍｌ／１５０ｍｍ皿である。細胞数、細胞生存率／マト
リックス及びポリペプチド生産レベルを上述したように測定する。

【０１０２】実施例ＸＩ この実施例は、実施例Ｘで述べたように調製したＩ−ＨＳＨＣＭＭ液体混合物
のｉｎ ｖｉｖｏ注入を説明する。２ｍｌ注入量のために１００μｇ／ｍｌ充填
ビーズ及び１ｍｌ注入量のために２００μｇ／ｍｌ充填ビーズでｂＦＧＦによっ
て被覆されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを含有するＩ−
ＨＳＨＣＭＭ液体混合物（インプラント当り１０μｇ総ｂＦＧＦがデリバリーさ
れる）を表９に記載するように調製した。各注入量に対して、プラスミドｐＸＦ
８．１９８を含有し（図１）、２０，０００〜３０，０００ｍＵ／２４ｈ／１０ ⁶ 細胞のレベルでｈＦＶＩＩＩを発現するＨＦ７４３Ｂ１−３５、ヒト包皮線維
芽細胞クローンをマイクロキャリヤーと共に組み入れて、全体で５ｘ１０⁶細胞
／注入を得た。この混合物の皮下導入のために、Ｒａｇ−２マウス（１２９Ｓ６
／ＳｖＥｖＴａｃ−［ＫＯ］Ｒａｇ−２，Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）を麻酔
して、上述したように用意した。肋骨よりも下方及び尾側の、動物の左側に局限
されたインプラント部位の毛を剃って、アルコールとＢｅｔａｄｉｎｅ^TMとによ
って消毒した。注入の直前に、完成したＩ−ＨＳＨＣＭＭ液体混合物を１０ｃｃ
注射器に、針の空隙容積を補償するために所望の注入量よりもやや多い量で装填
した。装填済み注射器に１６Ｇ針によってキャップして、Ｉ−ＨＳＨＣＭＭを皮
下部位に直接注入した。注入された溶液は皮膚組織と外斜筋との間の空隙内に拡
散する。軽い圧力を注入部位に加えて、針を皮膚から徐々に引き抜いた。注入さ
れた溶液は注入後に数秒間以内に凝固し始めた。マウスを注入直後に可能な低体
温症を阻止するためにヒートパッド上に置いた。

【０１０３】 血液を採取して、実施例ＩＩに述べたように２種類のマウスモノクローナル抗
体に基づくｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡを用いて、血漿ｈＦＶＩＩＩを測定した。
ゲル化マトリックス当りの推定細胞数を、ペトリ皿に形成され（３５ｍｍペトリ
皿中に２ｍｌ）、この目的のためにわきに置かれていたＨＳＨＣＭから回収され
た細胞を消化し、計数することによって決定した。細胞数と生存率との評価前に
２日間、ＨＳＨＣＭゲルを培養状態に保持し、実施例Ｘに述べたように無血清Ｄ
ＭＥＭ中に維持した。ゲル化ＨＳＨＣＭ（ｎ＝３マトリックス／条件）は３．５
１ｘ１０⁶±０．８ｘ１０⁶細胞／マトリックスの平均値を有した。回収された細
胞の生存率は８４．５±２．４％であった。ゲル化マトリックスからのｈＦＶＩ
ＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ生産は６８，８５１±１９９ｍＵ／２４ｈであった。図
８はＨＳＨＣＭ生産培地をＲａｇ−２マウス中に皮下注入した後の一定時間にわ
たるｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを示す。誤差バーは平均値の標準誤差（ｎ＝５マ
ウス／注入量）を意味する。ピーク発現は注入後１日で生じた。

【０１０４】実施例ＸＩＩ この実施例はｈＦＶＩＩＩを発現するウサギ線維芽細胞の単独（即ち、マイク
ロキャリヤーなし）での又は増殖因子で被覆されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ（登録商標）ビーズと組み合わせた、Ｎｕｄｅマウスへの大網内注入を説明す
る。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズは、実施例Ｘに述べたよ
うに、ｂＦＧＦ（１μｇ／ｍｌ充填ビーズ）又はＶＥＧＦ（２μｇ／ｍｌ充填ビ
ーズ）のいずれかで被覆された。被覆ビーズを１．５ｍｌポリプロピレンマイク
ロ遠心管中に、管当り５０μｌ充填ビーズ量になるように分配した。滅菌吸収ガ
ーゼをはめ込むこと(wicking)によって、過剰なＰＢＳをビーズから除去した。
ＲＦ２６１Ｂ２−１０６、プラスミドｐＸＦ８．１８６（図９）を含有し、ｈＦ
ＶＩＩＩを２０，０００〜２５，０００ｍＵ／２４ｈ／１０⁶細胞のレベルで発
現するウサギ皮膚線維芽細胞クローンの細胞を組織培養フラスコから慣用的方法
によって回収した。トリプシン処理した線維芽細胞を遠心分離して、ペレットを
得て（５００ｘｇ、１０分間）、Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）によっ
て洗浄し、遠心分離し、約１５ｘ１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度になるような量の
ＰＢＳ中に再懸濁させた。５ｘ１０⁶細胞に等しい量を空の１．５ｍｌマイクロ
遠心管又は５０μｌのヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを含有
する管のいずれかに加えて、懸濁液を５００ｘｇにおいて３分間遠心分離した。
ビーズと細胞とを含有する管中の最終量を、ＰＢＳの取り出しによって、１００
μｌに調節した。各条件に対して１２レプリケート(replicate)を用意した。細
胞ペレットと細胞／ビーズスラリーとを含有する管を氷上に置いて、Ａｎｉｍａ
ｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに輸送した。

【０１０５】 細胞とビーズとの大網内（ＩＯ）注入のために、Ｎｕｄｅマウス（ＮＩＨ Ｓ
ｗｉｓｓ Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ，Ｔａｃ：Ｎ：ＮＩＨ（Ｓ）−Ｈｆｈ１ １ｎ
ｕ，Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）を麻酔して、実施例ＩＩに述べたように用意
した。動物を横臥状態に置き、肋骨と後膝との間の左側腹部をアルコール・パッ
ドで拭いて、Ｂｅｔａｄｉｎｅ^TMによって用意した。小さい（０．５ｃｍ〜１．
０ｃｍ）切開を肋骨より後方で、背骨に対して腹側に設けた。脾臓を露出して、
徐々に体外に出した。２０−ゲージ・カニューレを用いて、細胞ペレットと細胞
／ビーズスラリーを頭部及び正中方向で脾臓の軸に沿って、脾臓の門表面に隣接
した薄膜内に挿入した。脾臓を腹腔内に戻し、切開を閉じた。

【０１０６】 血液採取及びｈＦＶＩＩＩの測定の方法は実施例ＩＩに述べた通りであった。
図１０は、細胞単独、細胞とｂＦＧＦ（インプラント当り総５０ｎｇ）で被覆し
たヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、及び細胞とＶＥＧＦ（イ
ンプラント当り総１００ｎｇ）で被覆したヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録
商標）ビーズを注入した後の一定時間にわたるｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを示す
。誤差バーは平均値の標準誤差（ｎ＝１２マウス／条件）を意味する。ピーク発
現は１日目に生じた。この細胞／ビーズ／ＶＥＧＦ組み合わせは、他の条件に比
べて、２８日目〜７０日目にかなり高いｈＦＶＩＩＩレベルを生じた。

【０１０７】実施例ＸＩＩＩ この実施例はｈＦＶＩＩＩを発現するウサギ線維芽細胞の単独での又は増殖因
子で被覆されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズと組み合わせ
た、Ｎｕｄｅマウスへの大網内注入を説明する。

【０１０８】 ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズは被覆されないか、又は実
施例Ｉに述べたように、ｂＦＧＦ（１０μｇ／ｍｌ充填ビーズ）若しくはＶＥＧ
Ｆ（２μｇ／ｍｌ充填ビーズ）のいずれかで被覆された。非被覆ビーズ及び増殖
因子被覆ビーズを実施例ＸＩＩに述べたように管中に分配した。ＲＦ３０２Ｂ２
−３８３、プラスミドｐＸＦ８．１８６を含有し、ｈＦＶＩＩＩを２０，０００
〜２５，０００ｍＵ／２４ｈ／１０⁶細胞のレベルで発現するウサギ皮膚線維芽
細胞クローンの細胞を組織培養フラスコから慣用的方法によって回収した。これ
らの細胞を、実施例ＶＩに述べたように、処理して、空のマイクロ遠心管又はヘ
パリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを含有する管中に分配した。大
網内注入、血液採取及びｈＦＶＩＩＩ測定は、実施例ＶＩに述べたように、実施
した。

【０１０９】 図１１は、細胞単独、細胞と非被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標
）ビーズ、細胞とｂＦＧＦ（インプラント当り総５００ｎｇ）で被覆したヘパリ
ン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、及び細胞とＶＥＧＦ（インプラン
ト当り総１００ｎｇ）で被覆したヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビ
ーズを注入した後の一定時間にわたるｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを示す。誤差バ
ーは平均値の標準誤差（ｎ＝１２マウス／条件）を意味する。ピークｈＦＶＩＩ
Ｉ発現は１日目に生じ、このピーク発現は１日目、７日目及び１４日目の全ての
他の条件に比べて、ｂＦＧＦセットではかなり高かった。７日目に、細胞／ビー
ズ／ＶＥＧＦ組み合わせは、細胞単独及び細胞／非被覆ビーズ組み合わせに比べ
て、かなり高いｈＦＶＩＩＩレベルを生じた。

【０１１０】実施例ＸＩＶ この実施例は、ｈＦＶＩＩＩを発現するウサギ線維芽細胞の、マクロ孔質コラ
ーゲン・マイクロキャリヤーと共に又は増殖因子で被覆されたヘパリン−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズと組み合わせたマイクロキャリヤーと共にの、
Ｎｕｄｅマウスへの大網内注入を説明する。

【０１１１】 ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズは被覆されないか、又は実
施例Ｉに述べたように、ｂＦＧＦ（１０μｇ／ｍｌ充填ビーズ）若しくはＶＥＧ
Ｆ（２μｇ／ｍｌ充填ビーズ）で被覆された。マイクロキャリヤーと細胞とは次
のように調製した。マクロ孔質コラーゲン・マイクロキャリヤー（Ｃｅｌｌｅｘ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を実施例Ｉに述べたようにコンディショニングした
(conditioned)。マイクロキャリヤーのスラリー（１：１量のマイクロキャリヤ
ー：コンディショニング培地）を調製し、０．１ｍｌアリコートを１．５ｍｌマ
イクロ遠心管に加えた。これらの管を５００ｘｇにおいて４分間遠心分離して、
吸引し、ＰＢＳによって２回洗浄した。ＰＢＳを取り出し、管を氷上で貯蔵した
。１：１比率（ｖｏｌ／ｖｏｌ）でのＰＢＳ中のヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
（登録商標）ビーズ（非被覆、ｂＦＧＦ被覆又はＶＥＧＦ被覆）のスラリー ０
．１ｍｌをマイクロキャリヤー含有管に加えて、ビーズ／マイクロキャリヤー混
合物を５００ｘｇにおいて４分間遠心分離した。各管からＰＢＳを除去して、ビ
ーズ／マイクロキャリヤー・ペレットを氷上で貯蔵した。ＲＦ３０２Ｂ２−３８
３細胞を実施例ＸＩＩに述べたように処理した。５ｘ１０⁶細胞を含有する細胞
懸濁液量をマイクロキャリヤー単独又はマイクロキャリヤーとヘパリン−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズのいずれかを含有する各管に加え、これらの管
を５００ｘｇにおいて４分間遠心分離した。各管から上澄み液を除去して、１０
μｌのＰＢＳを加えた。管を氷上に置いて、Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに
輸送した。大網内注入、血液採取及びｈＦＶＩＩＩ測定は、実施例ＸＩＩに述べ
たように、実施した。

【０１１２】 図１２は、細胞とマイクロキャリヤー、細胞とマイクロキャリヤーと非被覆ヘ
パリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、細胞とマイクロキャリヤーと
ｂＦＧＦ（インプラント当り総５００ｎｇ）で被覆したビーズ、及び細胞とマイ
クロキャリヤーとＶＥＧＦ（インプラント当り総１００ｎｇ）で被覆したビーズ
を注入した後の一定時間にわたるｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを示す。誤差バーは
平均値の標準誤差（ｎ＝１２マウス／条件）を意味する。ピークｈＦＶＩＩＩ発
現は１日目に生じ、このピーク発現は１日目、７日目及び１４日目の他の条件に
比べて、ｂＦＧＦセットではかなり高かった。

【０１１３】実施例ＸＶ 角化細胞は皮膚の表皮細胞であり、通常はこの組織において線維芽細胞に隣接
する。これらの２つの細胞種類は、適当な栄養素、分化シグナル、及び周囲細胞
外マトリックスの生産と維持に関して相互に依存する。本明細書に述べた、線維
芽細胞を含有する、任意のマトリックス又は注入可能な混合物への角化細胞の添
加は、皮膚において生じると同様に、線維芽細胞に益することができる。角化細
胞と線維芽細胞とは同じ皮膚バイオプシーから単離することができる。角化細胞
は混合物の形成時に線維芽細胞と同時に加えることができる、又は線維芽細胞を
含有する収縮したマトリックス上に角化細胞を接種することができる。マトリッ
クス内又はマトリックス上の角化細胞は、増殖培地処方と培養条件とに依存して
、刺激されて分化する又はしないことができる。例えば、増殖培地中のカルシウ
ムイオン濃度の上昇と、マトリックスの１つの側面の空気への暴露とは、マトリ
ックス内の角化細胞に、皮膚において生じると同様に、層を成させることができ
る（Ｂｅｌｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．１１３：１１３−１１９，１９
９１；Ｐａｒｅｎｔｅａｕ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：２４５−
２５１，１９９１）。ひと度分化したならば、角化細胞は、コラーゲンとグリコ
サミノグリカンとラミニンとから成る基底板を下に置く。これらの基底板成分と
、線維芽細胞によって合成されうるか又は生産培地中に包含されうる細胞外マト
リックスタンパク質とは、例えば、対象中へのマトリックスの移植後又は対象中
に導入された混合物からのマトリックスのｉｎ ｖｉｖｏ形成後の線維芽細胞の
生残に有利である生理的フレームワークを与える。

【０１１４】実施例ＸＶＩ 内皮細胞は血管及び毛細血管の管腔を形成する。血管は単内皮細胞から形成さ
れ、これらが分割及び分化して、連続管を形成する。この分化プロセスは必須環
境因子(essential environmental factors)の存在下で刺激されうる。これらの
因子はコラーゲン、例えば線維芽細胞及び／又は角化細胞のような細胞によって
産生される細胞外マトリックスタンパク質、及び増殖因子（例えば、塩基性線維
芽細胞増殖因子又は血管内皮細胞増殖因子）を包含する。移植されたマトリック
ス、又は対象中への本発明の混合物の導入後にｉｎ ｖｉｖｏ形成されたマトリ
ックスは、内皮細胞がマトリックス生産培地又は混合物に、それぞれ、線維芽細
胞と共に加えられるならば、内皮細胞管形成のために適当な環境を与えることが
できる。角化細胞の添加は、例えば血管内皮細胞増殖因子のような因子の分泌並
びに基底板の生産によって内皮細胞の分化の誘導を助けることができる。マトリ
ックス内の内皮細胞管の形成は、予め存在する内皮細胞管を宿主の成長する血管
と接合させることによって、移植後のマトリックスの血管新生を促進することが
できる（Ｂｌａｃｋ等，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：１３３１−１３４０，１９９８
；Ｂｌａｃｋ等，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５（２）：８１−９
０，１９９９）。内皮細胞はさらに、新血管形成を促進する因子を放出すること
によっても有利でありうる。

【０１１５】実施例ＸＶＩＩ 本発明の混合物はヒトへの導入のために次のように調製される：

【０１１６】 所望の細胞、典型的には、患者に由来する安定にトランスフェクトされたオー
トロガス細胞を組織培養皿から回収して、上記方法のいずれかによってＨＣＭＭ
又はＰＣＨＣＭＭの生産のために処理する。特定の患者に対する投与量（即ち、
マトリックスによって生産される治療生成物の生理的有効量）は、患者に大きい
若しくは小さい体積の混合物を導入することによって及び／又は混合物を作ると
きに細胞当り異なるレベルの生成物を発現する細胞を用いることによって、変化
されうる。患者内で生産される治療生成物の量は、混合物中の細胞を治療遺伝子
の発現を変化させる薬理学的又は生理的シグナルに暴露させることによっても変
化されうる。例えば、治療遺伝子がグルココルチコイド反応性プロモーターの制
御下にある場合には、例えばデキサメタゾンのような薬物への細胞のｉｎ ｖｉ
ｖｏ暴露（薬物が確実にインプラントに達するようなやり方で患者に薬物を投与
することによる）が治療遺伝子の発現を変化させる。他の薬理学的反応性制御要
素(control elements)はＣｌａｃｋｓｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１
２０−１２５，２０００に述べられており、これはその全体において本明細書に
援用される。このような要素は、抗生物質テトラサイクリン若しくはその類似体
（例えば、ドキシサイクリン）、昆虫ステロイド エクジソン若しくはその類似
体、アンチプロゲスチン ミフェプリストン（ＲＵ４８６）及び例えばラパマイ
シンとその類似体（“ラパログス”）のような化学的“ダイメリザー(dimerizer
)”によって調節される要素を包含する。

【０１１７】 該混合物は任意のマイクロキャリヤー、コラーゲン（又は代替物）、作用物質
（任意に固体基質に付着）及び本明細書に述べる作用物質を産生する細胞を含有
しうる。これらはまた、角化細胞及び／又は内皮細胞を任意に含有しうる。本明
細書に挙げた細胞のいずれかを負荷されたマイクロキャリヤーを凍結して、次に
、注入可能な混合物に使用する前に解凍することができる。

【０１１８】 混合物は、非限定的に、皮下、腹腔内、脾臓内、大網内、鼠径、くも膜下、脳
室内及び筋肉内部位、並びにリンパ節内又は脂肪組織内を包含する、多様な部位
に導入することができる。混合物は、例えば、任意に針又はカテーテルによって
キャップされた皮下注射器（プラスチック又はガラス）を用いて導入することが
できる。針又はカテーテルの直径は、懸濁した細胞及びマイクロキャリヤーへの
損傷を最少にするために、マイクロキャリヤーの直径よりも大きい（例えば、０
．５ｍｍよりも大きい）ことが好ましい。適当な内部部位へのデリバリーは腹腔
鏡の使用によって容易にされうる。ある一定の状況下では、外科的切開を設けて
、混合物を挿入し、次に該切開を閉じることが望ましいと考えられる。

【０１１９】 本発明の混合物を同時に形成し、患者（又は任意の他の動物）に導入すること
ができる。この目的のために適当な装置を構成することができる。このような装
置の例を図１３Ａに示す。この装置は２個以上の容器１を含有することができ、
これらの全ては出口２を介してアダプター・ピース４の入口３に接続する。図１
３Ｂはこのようなアダプター・ピース４の横断面図を示す。アダプター・ピース
４の入口３は２個以上の容器からの出口２と、好ましくは液漏れしない形式で(i
n a liquid-tight fashion)、流体連通する。或いは、アダプター・ピース４は
、容器１の全ての出口２と、好ましくは液漏れしない形式で、流体連通する単一
のコネクターを含有しうる。アダプター・ピースはさらに混合室５と出口６とを
含有し、出口６は注射針８のハブ７の単一出口と、好ましくは液漏れしない形式
で、流体連通する。このようにして、容器の中身が（同時にピストン１２を加圧
することによって）容器１の出口２から流出されるときに、これらの中身はアダ
プター・ピース４の混合室５に入り、そこで混合され、得られた混合物はアダプ
ター・ピース４の出口５から流出して、注射針８に入る。次に、混合物は注射針
の針部分１３に圧入され、その後、針が挿入された動物の組織又は体スペース(b
ody space)中に圧入される。これらの容器は固体コネクター９によって相互に物
理的に接合される。これらの容器の中身の同時押出しを容易にするために、ピス
トン１２の頂部に接続する“プレッシャー・プレート”１０が包含される。

【０１２０】 他の実施態様では、アダプター・ピースの代わりに、注射針のハブ区分を、容
器の個々の出口と好ましくは液漏れしない形式で流体連通する別々の入口を有す
るように改造することができる。全ての容器の中身を容器の出口から流出させる
（例えば、容器が注射器である場合に、プランジャーを同時に加圧することによ
って）ときに、これらはハブの適当な入口を介して注射針のハブに入り、ハブ内
に形成された小さい室において混合されてから、装置の針部分に入る。本明細書
で用いる限り、“デリバリー手段”は（ａ）前述したように改造された注射針、
（ｂ）上述したアダプター・ピース４と注射針８、（ｃ）カテーテル、（ｄ）カ
ニューレ、（ｅ）ピペット又は前述したように機能する、適当に改造された、任
意の管状物体であることができる。

【０１２１】 ２つの容器を有する装置では、容器の１つは例えば、栄養培地中の細胞、マイ
クロキャリヤー及び作用物質を含有することができ、他方はコラーゲン溶液を含
有することができる。三容器装置では、１つの容器は例えば、栄養培地中の細胞
、マイクロキャリヤー及び作用物質を含有することができ、第２容器は酸性ｐＨ
のコラーゲン溶液を含有することができ、第３容器は、３容器全ての中身が混合
されたときに約７．２〜約７．８、好ましくは約７．４〜約７．８のｐＨの水性
懸濁液が形成されるように、アルカリ性ｐＨの培地又は希釈剤を含有することが
できる。しかし、本発明のハイブリッド・マトリックス混合物の種々な成分が任
意の都合の良い組み合わせでデバイスの２つ又は３つの容器に分配されうること
が理解される。このような装置を用いる場合に、動物への混合物の導入は混合物
の成分からの混合物の形成直後に行なわれるが、本発明のために、これらの２つ
のイベントは同時に生じるということができる。

【０１２２】 本発明は、本明細書に開示した混合物のいずれかを含有する容器を包含する（
“発明の概要”参照）。このような容器はキット中に輸送用物質（例えば、輸送
用コンテナ）と共に含めることができる。全ての成分を含有する単一容器中で注
入可能な混合物を輸送することの実行可能性を評価した。注入可能なＨＳＨＣＭ
流体混合物に関する２つの研究を行なった。両方の研究に関して、ヘパリン−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ成分を５０μｇ／ｍｌ充填ビーズの濃度で
のｂＦＧＦによって被覆した。表９に略述したように調製した完成生産培地 １
０ｍｌ量を３個の１０ｃｃプラスチック注射器の各々に加え、次に、これらの注
射器にキャップをして、これらを４℃において２４時間貯蔵した。これらの注射
器を４℃環境から取り出して、１６Ｇ針によってキャップして、中身を１００ｍ
ｍペトリ皿に注入した。これらの皿を３７℃の温度、９５％〜９８％の湿度及び
５％のＣＯ₂レベルのインキュベーターに入れた。１時間後に、皿を取り出し、
フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ ２０ｍｌの添加によって供給して、該イ
ンキュベーターに戻した。液体混合物の直径に比べた、凝固マトリックスの直径
の減少（“直径の減少”）、細胞数及び細胞生存率を３７℃における２４時間の
インキュベーション後に評価した。各皿の下に定規を置き、マトリックス直径を
ｃｍで測定し、１００ｍｍ皿の直径から該マトリックス直径を控除することによ
って、“直径の減少”を算出した。次に、この直径の差を１００ｍｍ皿の直径に
よって割って、割合(percentage)として表現した。細胞数と生存率とは上述した
ように評価した。表１０は２種類の貯蔵実験の結果を要約する。実験＃１と＃２
とは、上述したような生産培地１ｍｌ当りに組み入れた細胞数において異なった
（ｎ＝３注射器／研究）。

【０１２３】

【表１０】

【０１２４】 或いは、中和したコラーゲン溶液は酸性コラーゲン溶液よりも迅速にゲル化す
るので、オフサイト位置に物質を輸送するために、キット中の注入可能な物質の
成分を分離することが有利でありうる。例えば、キットは３個の容器（例えば、
管、注射器、ボトル又はバイアル）を含有することができ、これらの容器の中身
を患者に導入する直前に（即ち、混合物が注射器、カニューレ又は懸濁液のデリ
バリーに用いられる如何なる手段からも容易に流出しないような程度に、混合物
が凝固する前に）一緒にする。成分を例えば次のように分離することができる：
容器１は細胞＋マイクロキャリヤーと、任意にヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（
登録商標）ビーズとをスラリー状態で含有することができ、容器２は酸性ｐＨ（
約２．０〜約４．０）のコラーゲン溶液を含有することができ、容器３は、血清
を含まず、アルカリ性ｐＨ（約９．０〜約１２．０）である濃縮培地（例えば、
栄養培地又は他の希釈剤）を含有することができる。濃縮培地のｐＨは、培地と
コラーゲン溶液とを一緒にしたときにコラーゲン溶液を生理的ｐＨ（例えば、ｐ
Ｈ７．４）に確実に中和するように選択される。患者に注入する直前に、容器３
の中身（培地）が容器２の中身（コラーゲン溶液）と混合される。一緒にされた
培地＋コラーゲン溶液はこの時点において生理的ｐＨに中和されるが、これは次
に細胞／マイクロキャリヤー／ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビー
ズスラリーに加えられ、徹底的に混合されて、最終混合物を形成する。この最終
混合物は次に、任意に、キットと共に供給される皮下注射器又は他の液体分配装
置を用いて患者に注入される。

【０１２５】 或いは、キットは２つの容器を含有することができ、第１容器は、上述したキ
ットにおける容器１と同じ成分を含有する。第２容器はコラーゲン溶液を含有す
ることができ、この溶液ではコラーゲンが例えば栄養培地中に溶解しており、こ
の溶液は酸性ｐＨである。注入の直前に、アルカリ性溶液（例えば、ＮａＯＨ溶
液）を用いて、コラーゲン溶液のｐＨを約７．２〜約７．８、好ましくは約７．
４〜約７．８に調節する。このようなアルカリ性溶液のアリコートをキットの第
３容器中に任意に含めることができる。

【０１２６】 酸性ｐＨのコラーゲン溶液を供給する代わりに、コラーゲン溶液を他の成分と
混合して、患者に導入する直前まで低温（例えば、８℃未満）に維持する限り、
約７．２〜約７．８、好ましくは約７．４〜約７．８のｐＨのコラーゲン溶液を
供給することができる。

【０１２７】 本発明のキットは、キットの使用に関する指示、例えば容器の中身をどのよう
に一緒にして、得られる混合物を対象にどのように投与するかに関する指示を含
むラベル又はインサートを任意に包含することができる。混合物を低温に維持す
ることは、コラーゲンのゲル化を防止する。

【０１２８】 他の実施態様 本発明のマトリックスと混合物は、ｈＧＨ及びＶＩＩＩ因子のみでなく、ＩＸ
因子、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、アルブミン、ヘモグロビン、α−１アンチ
トリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、低密度リポタンパク質（
ＬＤＬ）受容体、ＩＬ−２受容体、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、イン
ターロイキン、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、インス
リノトロピン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、レプチン、ＩＮＦ（例えば、ＩＦ
Ｎ−α、ＩＦＮ−β、又はＩＦＮ−γ）、神経成長因子、塩基性線維芽細胞増殖
因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、内皮細
胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子
、内皮細胞刺激血管新生因子（ＥＳＡＦ）、アンギオゲニン、組織プラスミノー
ゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球
−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、α−ガラクトシダーゼ
及びＦＳＨをも包含する、広範囲の細胞生成物のデリバリーのために適している
。例えば、混合物中の細胞又はマトリックス中に埋封される細胞は、血糖の上昇
に反応して自然にインスリンを分泌し、それ故、糖尿病患者又は予備糖尿病患者
における不充分なインスリン応答を補足することができる膵臓β細胞であること
ができる。或いは、これらの細胞は、患者の体内で、例えば凝固因子のような、
必要なポリペプチドの高レベルを発現して、分泌するように遺伝子操作された任
意の種類の細胞でありうる。このような構築体は構成的活性化プロモーター又は
適当に生理的若しくは薬理学的に調節されたプロモーターの制御下にあることが
できる。

【０１２９】 混合物又はマトリックスのコラーゲンゲル部分は完全にコラーゲンから成るこ
とができる、又はコラーゲンの代わりに若しくはコラーゲンに加えて他の成分：
例えば、アガロース；アルギネート；例えばヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、デル
マタン硫酸、コンドロイチン硫酸のようなグリコサミノグリカン；硫酸化プロテ
オグリカン；フィブロネクチン；ラミニン；エラスチン；フィブリン；テナシン
；細断脂肪組織；細断大網組織；メチルセルロース；又はゼラチンを含有するこ
とができる。このような成分（特に、動物組織の細胞外マトリックス中で見出さ
れる成分）は、本発明のハイブリッド・マトリックス及び本発明の混合物のｉｎ
ｖｉｖｏ凝固によって得られるマトリックスの構造的安定性に寄与する、及び
／又はマトリックス中の細胞及びマトリックス移植部位における宿主組織に付加
的な付着能力を与える。これらは、動物中に導入する前又はｉｎ ｖｉｔｒｏゲ
ル化前のマトリックス混合物中に混合される。

【０１３０】 本発明の混合物は好ましくはコラーゲン（又は上記に列挙した１種類以上の代
替物）を含有するが、本発明がコラーゲン（又は上記代替物のいずれも）を欠い
た混合物をも包含することが理解される。このような場合（即ち、マトリックス
物質が用いられない場合）には、注入された溶液が凝固して、動物中に離散した
塊状物を形成することはない。注入された物質が移植部位から分散する程度は、
この部位の構造的特徴に依存する。マイクロキャリヤー結合細胞の分散が状況に
よっては好ましいと考えられる。

【０１３１】 他の可能な添加物は、細胞の維持を最適化する又は宿主組織との有利な相互作
用（例えば、血管新生）を促進するために有用であるサイトカイン及び／又は増
殖因子を包含し、このような因子はｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、内皮細胞増殖因子、Ｐ
ＤＧＦ、内皮細胞刺激血管新生因子（ＥＳＡＦ）、ロイコトリエンＣ₄、プロス
タグランジン（例えば、ＰＧＥ₁、ＰＧＥ₂）、ＩＧＦ−１、ＧＣＳＦ、アンギオ
ゲニン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、アスコルビン酸、ＥＧＦ、オンコスタチンＭ
、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄを包
含する。これらの添加物は、それらをゲル化前若しくは動物中への導入前のコラ
ーゲン溶液と混合することによって、又はマイクロキャリヤーの隙間中にそれら
を導入することによって、又はマトリックスを浸す培地中にそれらを含めること
によって、マトリックスに組み入れることができる。これらはまた、マトリック
ス又は混合物中に含まれる別々の固体基質（例えば、ヘパリン被覆アガロース（
登録商標）ビーズ若しくはＰＬＧＡマイクロカプセル）に結合させる又はこのよ
うな固体基質内にカプセル封入させることができる。或いは、所望の生成物を発
現するように細胞を遺伝子操作することができる。例えば、血管新生因子をコー
ドするＤＮＡと二次治療タンパク質をコードするＤＮＡとによって、又は適当な
発現制御配列(expression control sequences)に結合した両方の種類のタンパク
質をコードする単一ＤＮＡ構築体によって、マトリックスの細胞を同時トランス
フェクトする(cotransfected)ことができる。

【０１３２】 アスコルビン酸は、プロコラーゲンの適当な翻訳後修飾を促進することによっ
て、線維芽細胞による成熟コラーゲンの生産を促進する。マトリックス又は混合
物内に埋封された線維芽細胞によるコラーゲンの生産は、動物における細胞生残
を増強しうる生理的構造(physiological architecture)を与えるのみでなく、マ
トリックスの物理的強度を高める。

【０１３３】 マトリックス又は混合物に用いられるコラーゲンは任意の適当な型（例えば、
Ｉ型〜ＸＩ型）であっても、任意の２種類以上の混合物であってもよい。ファイ
バーがマトリックスの一体部分になって、マトリックスの頑丈さと取り扱い便利
さとに寄与するように、コラーゲンのゲル化前にファイバーを型に入れることが
できる。ファイバーを加える場合に、ファイバーは主としてコラーゲン（例えば
、腸線）から又は例えばナイロン、ダクロン、ポリテトラフルオロエチレン（Ｇ
ｏｒｅ−Ｔｅｘ^TM若しくはＴｅｆｌｏｎ^TM）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポ
リグリコール酸混合物（Ｖｉｃｒｙｌ^TM）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルコポ
リマー、セルロース（例えば、コットン若しくはリネン）、ポリエステル、レー
ヨン又はシルクのような非コラーゲン物質から製造される。マトリックス中のフ
ァイバーはメッシュ若しくはクロスに織ることも、個別の糸として用いることも
できる。

【０１３４】 上記実施例に述べたＩ型コラーゲン・マイクロキャリヤーの代わりに、他の型
のコラーゲン、ポリスチレン、デキストラン（例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ^TM、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）、ポリアクリルアミド、セルロース、アルギン酸カルシウム、
ラテックス、ポリスルホン、ガラス（例えば、細胞接着を促進するコラーゲンの
ような物質によって被覆）、ゼラチン又はコラーゲンと上記のいずれかとの組み
合わせから主として成るマイクロキャリヤーを用いることができる。このような
マイクロキャリヤーは商業的に入手可能である、又は標準方法によって製造して
から、本発明のマトリックス若しくは混合物に用いるために殺菌することができ
る。他の実施態様も特許請求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はｈＦＶＩＩＩ発現プラスミドｐＸＦ８．１９８のマップである。

【図２】 図２は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ又は非被覆ヘパリン
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとを含有するヘパリン−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅハイブリッド・コラーゲン・マトリックス（ＨＳＨＣＭ）を移植されたマ
ウスからの血漿中のヒトＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）のレベルを示す線グラフ
である。

【図３】 図３は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と、２種類のマイクロキャリヤーのいず
れかと、ｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ又は非
被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとを含有するＨＳＨＣＭ
を移植されたマウスからの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフである
。

【図４】 図４は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と、種々な濃度のｂＦＧＦによって被覆
されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとを含有するＨＳＨＣ
Ｍを移植されたマウスからの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフであ
る。

【図５】 図５は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と、ｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、又は血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）被覆ヘパ
リン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、又はｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとＶＥＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（登録商標）ビーズとの混合物のいずれかとを含有するＨＳＨＣＭを移植さ
れたマウスからの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフである。

【図６】 図６はｐＸＶＥＧＦ．１プラスミドを示す線図である。

【図７】 図７は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞の第１集団を単独で又はＶＥＧＦを産生
する細胞の第２集団と共に含有するＨＳＨＣＭを移植されたマウスからの血漿中
のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフである。

【図８】 図８は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と、ｂＦＧＦ被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（登録商標）ビーズとを含有するＩ−ＨＳＨＣＭＭの１ｍｌ又は２ｍｌ
のいずれかを皮下注入されたマウスの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グ
ラフである。

【図９】 図９はｈＦＶＩＩＩ発現プラスミドｐＸＦ８．１８６のマップである。

【図１０】 図１０は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞、又はｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と
ｂＦＧＦ（５０ｎｇ）被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、
又はｈＦＶＩＩＩを産生する細胞とＶＥＧＦ（１００ｎｇ）被覆ヘパリン−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズのいずれかを大網内注入されたマウスの血漿
中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフである。

【図１１】 図１１は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞、又はｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と
ｂＦＧＦ（５００ｎｇ）被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ
、又はｈＦＶＩＩＩを産生する細胞とＶＥＧＦ（１００ｎｇ）被覆ヘパリン−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズのいずれかを大網内注入されたマウスの血
漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフである。

【図１２】 図１２は、ｈＦＶＩＩＩを産生する細胞と、マイクロキャリヤー、又はマイク
ロキャリヤーとヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ、又はマイク
ロキャリヤーとｂＦＧＦ（５００ｎｇ）被覆ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登
録商標）ビーズ、又はマイクロキャリヤーとＶＥＧＦ（１００ｎｇ）被覆ヘパリ
ン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズのいずれかとを大網内注入されたマ
ウスの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す線グラフである。

【図１３】 図１３Ａは、本発明の混合物を同時に形成し、それを対象にデリバリーするた
めに用いることができる装置の線図である。 図１３Ｂは、図１３Ａに示した装置のアダプター・ピース４成分の横断面図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/12 Ａ６１Ｋ 35/12 ４Ｃ０８７ 38/00 39/00 38/16 47/26 38/21 47/32 38/22 47/34 38/24 47/36 38/27 47/38 38/28 47/42 38/43 Ａ６１Ｐ 17/02 38/46 Ａ６１Ｋ 37/02 39/00 37/48 47/26 37/24 47/32 37/36 47/34 37/04 47/36 37/26 47/38 37/66 Ｈ 47/42 37/38 Ａ６１Ｐ 17/02 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アバロス−コイル，デボラ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01701， フラミンガム，ヘイスティングズ・ストリ ート ８エイ Ｆターム(参考） 4C076 AA95 BB16 BB32 CC19 CC24 CC30 CC35 DD68 EE19 EE20 EE23 EE30 EE31 EE36 EE41 EE42 EE43 4C081 AB11 AB18 BB06 CA021 CA031 CA041 CA051 CA081 CA101 CA161 CA171 CA181 CA231 CD011 CD021 CD061 CD121 CD151 CD20 CD26 CD27 CD29 CD31 CD32 CD33 CD34 CE02 CE04 DA04 DA11 4C084 AA02 AA16 BA44 DA01 DA12 DA22 DA23 DA24 DB22 DB26 DB31 DB34 DB53 DB54 DB55 DB56 DC22 MA41 MA66 MA67 NA12 ZC02 4C085 AA03 AA13 BB17 BB22 BB24 EE05 GG04 GG10 4C086 BA18 DA01 MA03 MA05 MA66 MA67 NA12 ZC12 ZC28 4C087 AA01 BB65 MA05 MA41 MA66 MA67 NA12

Claims (113)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性コラーゲン・フィブリルを含むマトリックス物質体を
   含む組成物であって、該マトリックス物質体内に、 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の集
   団と； （ｂ）複数のマイクロキャリヤーと； （ｃ）マトリックス物質体中に埋封された固体基質に結合した作用物質であっ
   て、血管新生を促進する因子、サイトカイン、増殖因子及びアスコルビン酸から
   成る群から選択された前記作用物質と が埋封されている前記組成物。
2. 【請求項２】 固体基質が（ａ）ヘパリン又は（ｂ）ヘパラン硫酸プロテオ
   グリカンを含む、請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 固体基質がアガロースを、これと結合したヘパリン又はヘパ
   ラン硫酸プロテオグリカンと共に含む、請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 固体基質がさらにアルギン酸カルシウムを含む、請求項３記
   載の組成物。
5. 【請求項５】 固体基質がさらにアルギン酸カルシウムを含む、請求項１記
   載の組成物。
6. 【請求項６】 固体基質がコラーゲン、ゼラチン、エチレン−酢酸ビニル、
   ポリラクチド／グリコール酸コポリマー、フィブリン、スクロース八硫酸、デキ
   ストラン、ポリエチレングリコール、アルギネート、ポリアクリルアミド、セル
   ロース、ラテックス及びポリヒドロキシエチルメタクリレートから成る群から選
   択された物質を含む、請求項１記載の組成物。
7. 【請求項７】 ヘパリン又はヘパラン硫酸プロテオグリカンが基質に結合し
   ている、請求項６記載の組成物。
8. 【請求項８】 組成物が、血管新生を促進する因子、サイトカイン及び増殖
   因子から成る群から選択された第２作用物質を含む、請求項１記載の組成物。
9. 【請求項９】 固体基質がビーズの形状である、請求項１記載の組成物。
10. 【請求項１０】 固体基質が糸の形状である、請求項１記載の組成物。
11. 【請求項１１】 作用物質が塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である
    、請求項１記載の組成物。
12. 【請求項１２】 作用物質が酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、内皮細
    胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、内皮細胞刺激血管新生因子（Ｅ
    ＳＡＦ）、ロイコトリエンＣ₄、プロスタグランジン、インスリン様増殖因子−
    １（ＩＧＦ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アンギオゲニン、
    トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖
    因子−β（ＴＧＦ−β）、アスコルビン酸、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及びオンコ
    スタチンＭから成る群から選択される、請求項１記載の組成物。
13. 【請求項１３】 作用物質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ
    −Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄから成る群から選択される
    、請求項１記載の組成物。
14. 【請求項１４】 作用物質がアンギオポイエチン１、２、３又は４である、
    請求項１記載の組成物。
15. 【請求項１５】 作用物質を分泌する細胞をさらに含む、請求項１記載の組
    成物。
16. 【請求項１６】 培養脊椎動物細胞が、脂肪細胞、星状膠細胞、心筋細胞、
    軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺細胞、グリア細胞
    、造血細胞、肝細胞、角化細胞、筋原細胞、神経細胞、造骨細胞、膵臓β細胞、
    腎細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、及び上記のいずれかの前駆体から成る群から
    選択される、請求項１記載の組成物。
17. 【請求項１７】 培養脊椎動物細胞がヒト細胞である、請求項１記載の組成
    物。
18. 【請求項１８】 ポリペプチドが、酵素、ホルモン、サイトカイン、コロニ
    ー刺激因子、ワクチン抗原、抗体、凝固因子、調節タンパク質、転写因子、受容
    体及び構造タンパク質から成る群から選択される、請求項１記載の組成物。
19. 【請求項１９】 ポリペプチドがＶＩＩＩ因子である、請求項１記載の組成
    物。
20. 【請求項２０】 ポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項１記載の
    組成物。
21. 【請求項２１】 ポリペプチドがＩＸ因子である、請求項１記載の組成物。
22. 【請求項２２】 ポリペプチドがエリトロポエチンである、請求項１記載の
    組成物。
23. 【請求項２３】 ポリペプチドがＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、
    ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄから成る群から選択される、請求項１記載の組成
    物。
24. 【請求項２４】 ポリペプチドがインスリノトロピンである、請求項１記載
    の組成物。
25. 【請求項２５】 ポリペプチドがα−１アンチトリプシン、カルシトニン、
    グルコセレブロシダーゼ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＩＬ−２受
    容体、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、インターロイキン、インスリン、
    インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、レプ
    チン、神経成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ（ａ
    ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（
    ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、内皮細胞刺激血管新生因子（ＥＳ
    ＡＦ）、アンギオゲニン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、顆粒
    球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激
    因子（ＧＭ−ＣＳＦ）から成る群から選択される、請求項１記載の組成物。
26. 【請求項２６】 微小球がＩ型コラーゲンのビーズである、請求項１記載の
    組成物。
27. 【請求項２７】 マイクロキャリヤーが多孔質である、請求項２６記載の組
    成物。
28. 【請求項２８】 マイクロキャリヤーが多孔質ゼラチンである、請求項１記
    載の組成物。
29. 【請求項２９】 マイクロキャリヤーの大部分がほぼ球形を有し、約０．１
    〜約２ｍｍの直径を有する、請求項１記載の組成物。
30. 【請求項３０】 マトリックス物質がさらに、第２型のコラーゲン、アガロ
    ース、アルギネート、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫
    酸、デルマタン硫酸、硫酸化プロテオグリカン、フィブリン、エラスチン及びテ
    ネイシンから成る群から選択された基質を含む、請求項１記載の組成物。
31. 【請求項３１】 マトリックス物質体内に分散された非コラーゲンファイバ
    ーをさらに含む、請求項１記載の組成物。
32. 【請求項３２】 非コラーゲンファイバーがナイロン、ダクロン、ポリテト
    ラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマ
    ー、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、腸線、コットン、リネン、ポリエステル及
    びシルクから成る群から選択された物質を含む、請求項３１記載の組成物。
33. 【請求項３３】 患者に移植されるように形作られた、請求項１記載の組成
    物。
34. 【請求項３４】 培養脊椎動物細胞が患者から取り出された１種類以上の細
    胞に由来する、請求項３３記載の組成物。
35. 【請求項３５】 培養脊椎動物細胞がクローン集団から成る、請求項３４記
    載の組成物。
36. 【請求項３６】 複数のマイクロキャリヤーの各々が、コラーゲン、ポリス
    チレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、セルロース、アルギン酸カルシウ
    ム、ラテックス、ポリスルホン及びガラスから成る群から選択された１種類以上
    の物質から主として成る、請求項１記載の組成物。
37. 【請求項３７】 培養脊椎動物細胞が線維芽細胞である、請求項１記載の組
    成物。
38. 【請求項３８】 マイクロキャリヤーがほぼ球形を有する、請求項１記載の
    組成物。
39. 【請求項３９】 角化細胞をさらに含む、請求項３７記載の組成物。
40. 【請求項４０】 角化細胞と線維芽細胞とが同じ個体から得られる、請求項
    ３９記載の組成物。
41. 【請求項４１】 １つ以上の角化細胞分化因子をさらに含む、請求項３９記
    載の組成物。
42. 【請求項４２】 角化細胞分化因子が１．５〜２ｍＭの濃度でカルシウムイ
    オンを含む、請求項４１記載の組成物。
43. 【請求項４３】 内皮細胞をさらに含む、請求項１記載の組成物。
44. 【請求項４４】 内皮細胞をさらに含む、請求項３７記載の組成物。
45. 【請求項４５】 内皮細胞と線維芽細胞とが同じ個体から得られる、請求項
    ４４記載の組成物。
46. 【請求項４６】 ポリペプチドが、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、
    インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、
    卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、α−ガラクトシダーゼ、β−グルセラミダーゼ、
    α−イズロニダーゼ、イズロン酸２−スルファターゼ、グルコサミン−Ｎ−スル
    ファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル補酵素Ａ：α−グ
    ルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−
    ６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６
    −スルファターゼ、及びβ−グルクロニダーゼから成る群から選択される、請求
    項１記載の組成物。
47. 【請求項４７】 マトリックス物質がさらに、ヘパリン、セルロース、澱粉
    及びデキストランから成る群から選択された物質を含む、請求項１記載の組成物
    。
48. 【請求項４８】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）可溶性コ
    ラーゲンを含む溶液と；（ｄ）固体基質に結合した作用物質であって、血管新生
    を促進する因子、サイトカイン、増殖因子及びアスコルビン酸から成る群から選
    択される前記作用物質とを含む混合物を形成する工程と； 混合物中の可溶性コラーゲンをゲル形成に有効な条件にさらす工程と； 該ゲルを収縮させる培養条件に該ゲルを暴露させて、それによって組成物体を
    形成する工程とを含む、組成物の製造方法。
49. 【請求項４９】 該溶液が可溶性コラーゲンの酸性水溶液であり、この溶液
    のｐＨを高めることによって、該ゲル化が達成される、請求項４８記載の方法。
50. 【請求項５０】 収縮工程の前に、該ゲルが型の形状になるように、ゲル化
    が型の中で行なわれる、請求項４８記載の方法。
51. 【請求項５１】 培養脊椎動物細胞をマイクロキャリヤーの存在下で培養し
    てから、該溶液と混合する、請求項４８記載の方法。
52. 【請求項５２】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与する
    方法であって、組成物中の培養脊椎動物細胞がポリペプチドを分泌する、請求項
    ３３記載の組成物を用意し；該組成物を患者に移植することを含む前記方法。
53. 【請求項５３】 培養脊椎動物細胞が患者から取り出された１種類以上の細
    胞に由来し、ポリペプチドを発現し、分泌するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子
    操作されている、請求項５２記載の方法。
54. 【請求項５４】 移植が患者の皮下部位において行なわれる、請求項５２記
    載の方法。
55. 【請求項５５】 移植が、患者の腹腔内、腎臓下嚢、鼠径、筋肉内、脳室内
    、大網内又はくも膜下部位において行なわれる、請求項５２記載の方法。
56. 【請求項５６】 ポリペプチドが、創傷治癒を促進するポリペプチドであり
    、移植が患者の既存創傷部位において行なわれる、請求項５２記載の方法。
57. 【請求項５７】 約０．１８ｍｍの深さまで該混合物を充填した平底型にお
    いて、ゲルが形成される、請求項４８記載の方法。
58. 【請求項５８】 請求項５７記載の方法によって製造された組成物。
59. 【請求項５９】 該ゲルが内径（ｒ）を有する平底円筒型において形成され
    ；該混合物が体積（Ｖ）を有し；ｒがｃｍで表現され、Ｖがｍｌで表現されると
    きに、ｒ²／Ｖが約１．８である、請求項４８記載の方法。
60. 【請求項６０】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）可溶性コ
    ラーゲンを含む溶液とを含む混合物を形成する工程と； 混合物中の可溶性コラーゲンをゲル形成に有効な条件にさらす工程と； 該ゲルを収縮させる培養条件に該ゲルを暴露させて、それによって組成物体を
    形成する工程と； 該ゲルが収縮した後に該組成物体に角化細胞を添加する工程と を含む、請求項３９記載の組成物の製造方法。
61. 【請求項６１】 不溶性コラーゲン・フィブリルを含むマトリックス物質体
    を含む組成物であって、該マトリックス物質体中に（ａ）ポリペプチドを発現す
    るように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の第１集団と；（ｂ）血管新生を促
    進する因子と、サイトカインと、増殖因子とから成る群から選択された作用物質
    を分泌する培養脊椎動物細胞の第２集団と；（ｃ）複数のマイクロキャリヤーと
    が埋封されている前記組成物。
62. 【請求項６２】 第２集団の培養脊椎動物細胞が作用物質を発現するように
    遺伝子操作されている、請求項６１記載の組成物。
63. 【請求項６３】 血管新生を促進する因子と、サイトカインと、増殖因子と
    から成る群から選択された第２作用物質を発現し、分泌する培養脊椎動物の第３
    集団をさらに含む、請求項６１記載の組成物。
64. 【請求項６４】 患者中に移植されるような形状である、請求項６１記載の
    組成物。
65. 【請求項６５】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培
    養脊椎動物細胞の第１集団と；（ｂ）血管新生を促進する因子と、サイトカイン
    と、増殖因子とから成る群から選択された作用物質を発現し、分泌する培養脊椎
    動物細胞の第２集団と；（ｃ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｄ）可溶性コラ
    ーゲンを含む溶液とを含む混合物を形成する工程と； 混合物中の可溶性コラーゲンをゲル形成に有効な条件にさらす工程と； 該ゲルを収縮させる培養条件に該ゲルを暴露させて、それによって組成物体を
    形成する工程と を含む、請求項６１記載の組成物の製造方法。
66. 【請求項６６】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与する
    方法であって、 組成物中の第１集団の培養脊椎動物細胞が該ポリペプチドを分泌する、請求項
    ６４記載の組成物を用意して；該組成物を患者中に移植することを含む前記方法
    。
67. 【請求項６７】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）可溶性コ
    ラーゲンを含む溶液とを含む混合物を形成する工程と； 該混合物中の該可溶性コラーゲンをゲル形成に有効な条件にさらす工程と； 該ゲルを収縮させる培養条件に該ゲルを暴露させて、それによって組成物体を
    形成する工程であって、約０．１８ｃｍの深さまで混合物が充填された平底型に
    おいて該ゲルが形成される前記工程と を含む、組成物の製造方法。
68. 【請求項６８】 請求項６７記載の方法によって製造された組成物。
69. 【請求項６９】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）可溶性コ
    ラーゲンを含む溶液とを含む混合物を形成する工程と； 該混合物中の該可溶性コラーゲンをゲル形成に有効な条件にさらす工程と； 該ゲルを収縮させる培養条件に該ゲルを暴露させて、それによって組成物体を
    形成する工程を含む、組成物の製造方法であって、 該ゲルが内径（ｒ）を有する平底円筒型において形成され；該混合物が体積（
    Ｖ）を有し；ｒがｃｍで表現され、Ｖがｍｌで表現されるときに、ｒ²／Ｖが約
    １．８である前記方法。
70. 【請求項７０】 不溶性コラーゲン・フィブリルを含むマトリックス物質体
    を含む組成物であって、該マトリックス物質体中に（ａ）ポリペプチドを発現す
    るように遺伝子操作された複数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数の角化細胞と
    ；（ｃ）複数のマイクロキャリヤーとが埋封されている前記組成物。
71. 【請求項７１】 角化細胞と線維芽細胞とが同じ個体から得られる、請求項
    ７０記載の組成物。
72. 【請求項７２】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の線維芽細胞と；（ｂ）複数の角化細胞と；（ｃ）複数のマイクロキャリヤー
    と；（ｄ）可溶性コラーゲンを含む溶液とを含む混合物を形成する工程と； 該混合物中の該可溶性コラーゲンをゲル形成に有効な条件にさらす工程と； 該ゲルを収縮させる培養条件に該ゲルを暴露させて、それによって組成物体を
    形成する工程と を含む、請求項７０記載の組成物の製造方法。
73. 【請求項７３】 不溶性コラーゲン・フィブリルを含むマトリックス物質体
    を含む組成物であって、該マトリックス物質体中に（ａ）ポリペプチドを発現す
    るように遺伝子操作された複数の培養線維芽細胞と；（ｂ）複数の内皮細胞と；
    （ｃ）複数のマイクロキャリヤーとが埋封されている前記組成物。
74. 【請求項７４】 内皮細胞と線維芽細胞とが同じ個体から得られる、請求項
    ７３記載の組成物。
75. 【請求項７５】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）血管新生
    を促進する因子とサイトカインと増殖因子とアスコルビン酸とから成る群から選
    択された少なくとも１種類の作用物質とをコラーゲン水溶液中に懸濁させて含む
    混合物であって、該少なくとも１種類の作用物質が該コラーゲン溶液中に懸濁し
    た固体基質に結合しており、該混合物を５を超えるｐＨにおいてゲル化させるた
    めに充分なコラーゲンが該混合物中に存在する前記混合物。
76. 【請求項７６】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された複
    数の培養脊椎動物細胞と；（ｂ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｃ）血管新生
    を促進する因子とサイトカインと増殖因子とアスコルビン酸とから成る群から選
    択された少なくとも１種類の作用物質と；（ｄ）可溶性コラーゲンを含む溶液と
    を一緒にすることを含む、混合物の製造方法であって、該混合物を５を超えるｐ
    Ｈにおいてゲル化させるために充分なコラーゲンが該混合物中に存在する前記方
    法。
77. 【請求項７７】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培
    養脊椎動物細胞の第１集団と、（ｂ）血管新生を促進する因子とサイトカインと
    増殖因子とから成る群から選択された作用物質を分泌する培養脊椎動物細胞の第
    ２集団と、（ｃ）複数のマイクロキャリヤーとをコラーゲン水溶液中に懸濁させ
    て含む混合物であって、該混合物を５を超えるｐＨにおいてゲル化させるために
    充分なコラーゲンが該混合物中に存在する前記混合物。
78. 【請求項７８】 （ａ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培
    養脊椎動物細胞の第１集団と；（ｂ）血管新生を促進する因子と、サイトカイン
    と、増殖因子とから成る群から選択された作用物質を発現し、分泌する培養脊椎
    動物細胞の第２集団と；（ｃ）複数のマイクロキャリヤーと；（ｄ）可溶性コラ
    ーゲンを含む溶液とを一緒にすることを含む、請求項７７記載の混合物の製造方
    法であって、該混合物を５を超えるｐＨにおいてゲル化させるために充分なコラ
    ーゲンが該混合物中に存在する前記方法。
79. 【請求項７９】 該作用物質に結合する物質を含む固体基質を該混合物中に
    含めることをさらに含む、請求項７８記載の方法。
80. 【請求項８０】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与する
    方法であって、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細
    胞の集団と、複数のマイクロキャリヤーと、マトリックス物質体中に埋封された
    固体基質に結合した少なくとも１種類の作用物質であって、血管新生を促進する
    因子とサイトカインと増殖因子とアスコルビン酸とから成る群から選択された前
    記少なくとも１種類の作用物質と、コラーゲンとを含む組成物を用意し；該組成
    物を患者に導入することを含む前記方法。
81. 【請求項８１】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与する
    方法であって、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細
    胞の第１集団と、血管新生を促進する因子とサイトカインと増殖因子とから成る
    群から選択された作用物質を分泌する培養脊椎動物細胞の第２集団と、複数のマ
    イクロキャリヤーと、コラーゲンとを含む組成物を用意し；該組成物を患者に導
    入することを含む前記方法。
82. 【請求項８２】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与する
    方法であって、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細
    胞の集団と、複数のマイクロキャリヤーとを水溶液中に懸濁させて含む流体混合
    物を用意し；該流体混合物を患者に導入することを含む前記方法。
83. 【請求項８３】 該混合物が可溶性コラーゲンをさらに含む、請求項８２記
    載の方法。
84. 【請求項８４】 該混合物が、細断された脂肪組織、細断された大網組織、
    メチルセルロース、アルギネート、ゼラチン及びフィブリンから成る群から選択
    された物質をさらに含む、請求項８２記載の方法。
85. 【請求項８５】 患者への該混合物の導入が皮下注射器によって行なわれる
    、請求項８２記載の方法。
86. 【請求項８６】 該注射器が注射針又はカテーテルによってキャップされる
    、請求項８５記載の方法。
87. 【請求項８７】 患者への導入がカテーテルによって行なわれる、請求項８
    ２記載の方法。
88. 【請求項８８】 患者への導入がピペットによって行なわれる、請求項８２
    記載の方法。
89. 【請求項８９】 培養脊椎動物細胞とマイクロキャリヤーと可溶性コラーゲ
    ンとを一緒にして、混合物を形成することが、患者への該混合物の導入と同時に
    生じる、請求項８３記載の方法。
90. 【請求項９０】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与する
    方法であって、コラーゲンの水溶液と、該水溶液中に懸濁した、該ポリペプチド
    を発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の集団と、複数のマイクロ
    キャリヤーとを含む流体混合物を用意して；該流体混合物を患者中に導入するこ
    とを含む前記方法。
91. 【請求項９１】 （ａ）（ｉ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作さ
    れた培養脊椎動物細胞の集団と、（ｉｉ）複数のマイクロキャリヤーとを含む第
    １容器と；（ｂ）コラーゲン溶液を含む第２容器と；（ｃ）培地を含む第３容器
    とを含有する輸送用コンテナを含むキット。
92. 【請求項９２】 該コラーゲン溶液が酸性ｐＨであり、該培地がアルカリ性
    ｐＨである、請求項９１記載のキット。
93. 【請求項９３】 該コラーゲン溶液が８℃未満の温度である、請求項９１記
    載のキット。
94. 【請求項９４】 請求項９１記載のキットを用いて混合物を製造する方法で
    あって、 （ａ）第２容器と第３容器との中身を一緒にして、希薄なコラーゲン溶液を形
    成する工程と； （ｂ）該希薄なコラーゲン溶液を第１容器の中身と一緒にして、混合物を形成
    する工程と を含む前記方法。
95. 【請求項９５】 該混合物が凝固する前に、該混合物を患者に導入する工程
    をさらに含む、請求項９４記載の方法。
96. 【請求項９６】 （ａ）（ｉ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操作さ
    れた培養脊椎動物細胞の集団と、（ｉｉ）複数のマイクロキャリヤーとを含む第
    １容器と；（ｂ）コラーゲン溶液を含む第２容器とを含有する輸送用コンテナを
    含むキット。
97. 【請求項９７】 該コラーゲン溶液が酸性ｐＨである、請求項９６記載のキ
    ット。
98. 【請求項９８】 該コラーゲン溶液が約８℃未満の温度である、請求項９６
    記載のキット。
99. 【請求項９９】 アルカリ性ｐＨの溶液を含む第３容器をさらに含む、請求
    項９６記載のキット。
100. 【請求項１００】 請求項９６記載のキットを用いて混合物を製造する方
     法であって、第１容器と第２容器との中身を一緒にして、混合物を形成する工程
     を含む前記方法。
101. 【請求項１０１】 該混合物が凝固する前に、該混合物を患者に導入する工
     程をさらに含む、請求項１００記載の方法。
102. 【請求項１０２】 コラーゲンの水溶液と、該水溶液中に懸濁した、（ａ）
     ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の集団と、（
     ｂ）複数のマイクロキャリヤーとを含む容器を含有する輸送用コンテナを含むキ
     ットであって、該水溶液が約８℃未満の温度である前記キット。
103. 【請求項１０３】 ポリペプチドを必要とする患者にポリペプチドを投与す
     る方法であって、コラーゲン水溶液中に懸濁した、該ポリペプチドを発現するよ
     うに遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の集団を含む流体混合物を用意して；該
     流体混合物を患者中に導入することを含み、該混合物中に該混合物を５．０を超
     えるｐＨにおいてゲル化させるために充分なコラーゲンが存在する前記方法。
104. 【請求項１０４】 少なくとも２つの容器を含み、該容器の各々がデリバリ
     ー手段と流体連通する出口を有する、患者に混合物を導入するための装置であっ
     て、（ａ）コラーゲン水溶液と、（ｂ）ポリペプチドを発現するように遺伝子操
     作された培養脊椎動物細胞の集団と、（ｃ）複数のマイクロキャリヤーとを含む
     前記装置。
105. 【請求項１０５】 各容器が（ａ），（ｂ）及び（ｃ）の１つ以上を含有す
     る、請求項１０４記載の装置。
106. 【請求項１０６】 １つ以上の容器がそれと関連してピストンを有し、該ピ
     ストンが２端部、該容器の内部中に挿入されるのに適合した第１端部と、該容器
     の内部から伸びるのに適合した第２端部とを有する、請求項１０４記載の装置。
107. 【請求項１０７】 該デリバリー手段が注射針であり、該注射針が（ａ）該
     容器の出口と流体連通するのに適合した１つ以上の入口と、（ｂ）出口とを有す
     る、請求項１０４記載の装置。
108. 【請求項１０８】 該デリバリー手段が、該容器の各々の出口と流体連絡し
     たコネクターと、混合室と、注射針と流体連通した出口とを有するアダプター・
     ピースを含む、請求項１０４記載の装置。
109. 【請求項１０９】 該コネクターが少なくとも２つの入口を有し、該少なく
     とも２つの入口の各々が該容器の１つのみの出口と流体連通する、請求項１０８
     記載の装置。
110. 【請求項１１０】 該少なくとも２つの容器を物理的に接合させる１つ以上
     のコネクションをさらに含む、請求項１０４記載の装置。
111. 【請求項１１１】 各ピストンの第２端部がプレッシャー・プレートに連結
     している、請求項１０６記載の装置。
112. 【請求項１１２】 コラーゲン水溶液中に懸濁した、（ａ）ポリペプチドを
     発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の集団と；（ｂ）複数のマイ
     クロキャリヤーと；（ｃ）固体基質に結合した作用物質であって、血管新生を促
     進する因子とサイトカインと増殖因子とアスコルビン酸とから成る群から選択さ
     れた前記作用物質とを含む混合物を含む容器であって、５を超えるｐＨにおいて
     該混合物をゲル化させるために充分なコラーゲンが混合物中に存在する前記容器
     。
113. 【請求項１１３】 コラーゲン水溶液中に懸濁した、（ａ）ポリペプチドを
     発現するように遺伝子操作された培養脊椎動物細胞の第１集団と；（ｂ）血管新
     生を促進する因子とサイトカインと増殖因子とから成る群から選択された作用物
     質を分泌する培養脊椎動物細胞の第２集団と；（ｃ）複数のマイクロキャリヤー
     とを含む混合物を含む容器であって、５を超えるｐＨにおいて該混合物をゲル化
     させるために充分なコラーゲンが混合物中に存在する前記容器。