JP5284313B2 - Ｇタンパク質共役レセプターリガンドおよび方法 - Google Patents

Description

本出願は、現在係属している、２００２年４月１２日に出願された合衆国仮出願第６０／３７２，６４０号の利益を主張し、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

（発明の分野）
本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターおよびこのレセプターに結合するリガンドの同定に関する。より詳細には、本発明は、このレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニングシステムにおいて、このレセプターを用いる方法に関する。本発明はまた、このレセプターの新規なペプチドリガンド、このペプチドリガンドをコードする核酸、ならびにこのペプチドリガンドを作製および用いる方法に関する。

（発明の背景）
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、ホルモン、神経伝達物質、および局所メディエイタを含む、それらの機能におけるように構造が変動する非常に多様なシグナル伝達分子（このリストは、タンパク質および小ペプチド、ならびにアミノ酸および脂肪酸誘導体を含む）に対する細胞応答を媒介する。

それらに結合するシグナル伝達分子の化学的および機能的多様性にかかわらず、ＤＮＡ配列決定研究からそのアミノ酸配列が知られているすべてのＧタンパク質共役レセプターは、類似の構造を有し、そしてほぼ確実に進化的に関連している。それらは、脂質二重層を通って７回往復する単一のポリペプチド鎖からなる。このレセプターファミリーのメンバーは、それらのアミノ酸配列のみならず、それらが、細胞外リガンドが存在する細胞の内部にメッセージを送信するＧタンパク質とのそれらの機能的相関関係を保存している。

Ｇタンパク質共役レセプターは、すべての細胞の表面膜上に存在する薬物標的の重要なクラスであり、そして、痛みコントロールおよび鎮痛、喘息、炎症、肥満、癌、心臓血管疾患、代謝疾患、ウイルス疾患、免疫調節疾患、胃腸管疾患および中枢神経系疾患を含む、広範な範囲の治療カテゴリーと関連している。ヒトゲノム中には、潜在的な治療有用性をもつ、１，０００を超えるＧＰＣＲがあると推定されている。ＧＰＣＲは、歴史的に価値ある薬物標的であるが、現在まで、既知のリガンドで良く特徴付けられたほんの約２００のＧＰＣＲが存在するに過ぎず、そのうち、ほんの約半分が、市販薬物の現在の標的である。それに対するリガンドが同定されていない残りのＧＰＣＲは、代表的には、「オーファンＧＰＣＲ」と称されている。

特に重要なオーファンＧＰＣＲは、ｈＲＵＰ４レセプターであり、以後本明細書では、ＳＰ９１５５レセプターと称される。このＳＰ９１５５はまた、ｖｃ−３８＿１、ＡＸＯＲ１６およびＧＰ１０３と称されている。このレセプターのアミノ酸配列は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１９３５１（ＷＯ００／１１０１５）、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４０６２５（ＷＯ００／２２１３１）、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３６８７（ＷＯ００／３１２５８）、ＰＣＴ／ＵＳ００／１６８６９（ＷＯ００／７８８０９）、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５６８４（ＷＯ０１／１６３１６）およびＰＣＴ／ＪＰ００／０９４０９（ＷＯ０１／４８１８９）を含むいくつかの国際出願において従前に開示されている。しかし、これらの刊行物は、ＳＰ９１５５レセプターの対するリガンドは開示していない。このＳＰ９１５５レセプターは、ｏｒｅｘｉｎＡ、ｏｒｅｘｉｎＢおよびＮＰＦＦレセプターに相同性のアミノ酸配列を有する。ｏｒｅｘｉｎＡ、ｏｒｅｘｉｎＢレセプターは、肥満のような代謝疾患に関与することが示されている（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら（２０００）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．７１：２５１〜６１；Ｍｏｎｄａｌら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２７３：４５〜４８およびＤｕｎら（２０００）Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．９６：６５〜７０）。ＮＰＦＦレセプターは、痛みコントロールおよび鎮痛に関与することが示されている（Ｌａｋｅら（１９９１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１３２：２９〜３２；Ｋａｖａｌｉｅｒｓら（１９９２）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １３：６０３〜６０７およびＤｏｎｇら（２００１）Ｃｅｌｌ １０６：６１９〜６３２）。従って、ＳＰ９１５５レセプターに対するリガンドの同定は、代謝障害および神経学的障害のために開発する治療において潜在的に有用であり得る。

神経ペプチドは、哺乳動物を含む大部分の生物の神経系におけるシグナル伝達分子として用いられるＧＰＣＲリガンドの１つの治療的に重要なクラスである。例えば、ＲＦアミド神経ペプチドは、心臓興奮（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら（１９７９）、Ａｍ．Ｚｏｏｌｏｇｉｓｔ １９：１６３〜１６７およびＧｒｏｏｍｅら（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．１８６：３０９〜３１８）、筋肉収縮のコントロール（Ｂｏｗｍａｎら（１９９６）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １７：３８１〜３８７およびＦｒａｎｋｓら（１９９４）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １０８：２２９〜２３６）、無脊椎動物における神経調節（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら（１９５５）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １１１：３７９〜３８４およびＣｏｔｔｒｅｌｌら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０４：６３８〜６４０）および脊椎動物における抗オピオイド効果（Ｋａｖａｌｉｅｒら（１９８５）Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｌｏｇｙ ４０：５３３〜５３５およびＹａｎｇら（１９８５）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１９２：３１３〜３２２）を含む多様な機能を有することが示されている。従って、ＲＦ−アミド類が結合するようなＧＰＣＲの同定はまた、潜在的な治療剤を開発することで有用であり得る。

（発明の要旨）
本発明者らは、オーファンＧＰＣＲ ＳＰ９１５５に対するリガンドを同定することによって先行するニーズを指向し、これは、このレセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするための方法を可能にする。さらに、本発明者らはまた、ＳＰ９１５５に対する新規なペプチドリガンド、およびこのＳＰ９１５５リガンドをコードするｃＤＮＡを同定した。

本発明は、ＳＰ９１５５のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を提供し、（ａ）ＳＰ９１５５またはその機能的フラグメントを、既知量の標識されたＳＰ９１５５リガンドの存在下、上記アゴニストまたはアンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触する工程；および（ｂ）このレセプターに特異的に結合したリガンドの量を測定する工程を包含する。この方法では、サンプルは、サンプルの非存在下で測定され得る結合と比較して、このレセプターへの上記リガンドの実質的に減少した結合を測定することによって、アゴニストまたはアンタゴニストを含むと同定される。好ましくは、このリガンドは、配列番号４〜１１または１３〜１８のいずれかのアミノ酸配列を含む。好ましくは、このポリペプチドは、カルボキシ末端でアミド化されている。好ましくは、このレセプターは、配列番号２または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＳＰ９１５５レセプターの供給源は、このレセプターを発現する哺乳動物細胞から単離された膜である。

本発明はまた、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を提供し、（ａ）既知量のＳＰ９１５５リガンドの存在下、このレセプターを発現する細胞を、上記アゴニストまたはアンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触する工程；および（ｂ）この細胞によるカルシウム移動を測定する工程を包含する。この方法では、サンプルは、このサンプルの非存在下で測定され得るカルシウム移動と比較して、実質的に減少したカルシウム移動を測定することによってアンタゴニストを含むと同定され、そしてサンプルは、このサンプルの非存在下で測定され得るカルシウム移動と比較して、実質的に増加したカルシウム移動を測定することによってアゴニストを含むと同定される。好ましくは、細胞によるこのカルシウム移動は、カルシウムを、カルシウム指示薬、例えば、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ペンタアセトキシメチルエステル（Ｆｌｏｕｒ−３−ＡＭ）と接触すること、および次にこの指示薬の蛍光を測定することによって測定される。好ましくは、上記リガンドは、配列番号４〜１１または１３〜１８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドは、カルボキシ末端でアミド化されている。好ましくは、ＳＰ９１５５レセプターは、配列番号２または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。

本発明は、マウスおよびヒトの両方からのＲＦアミド前駆体を提供し、これは、配列番号３および４に、および配列番号１２および１３に、それぞれ提示されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を含む。このヒトおよびマウス前駆体は、各々、いくつかのより小さな、好ましくは抗原性ペプチドである内部ペプチドを含み、これは、好ましくは、配列番号５〜１１および１２〜１８のいずれかに提示されるアミノ酸配列を含む。このヒト前駆体は、脳、心臓および肝臓組織中で発現される。また提供されるのは、配列番号４（ヒト前駆体）および１３（マウス前駆体）から選択されるアミノ酸配列の７つ以上の連続残基を含む、単離された抗原性のポリペプチドである。好適な実施形態では、このポリペプチドは標識されている。このポリペプチドは、非改変または改変（例えば、アミド化）カルボキシ末端を含み得る。本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体分子を含む。

本発明はまた、前駆体ポリペプチド（配列番号４または配列番号１３）をコードする単離された核酸を提供し、これは、好ましくは、配列番号３または配列番号１２にそれぞれ提示されるヌクレオチド配列を含む。また提供されるのは、抗原性ポリペプチド、好ましくは、配列番号４（ヒト前駆体）および１３（マウス前駆体）から選択されるアミノ酸配列の７つ以上の連続残基を含む抗原性ポリペプチドをコードする単離された核酸である。好ましくは、この核酸は、配列番号３または配列番号１２に提示されるヌクレオチド配列からの２１以上の連続するヌクレオチドを含む。

本発明は、本発明の核酸を含む組換えベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。

マウスＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号１９および２０）およびその任意の機能的フラグメントは、配列番号２０に提示されるアミノ酸配列からの７つ以上の連続する残基を含むペプチド、およびこのペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号１９に提示されるヌクレオチド配列からの２１以上の連続するヌクレオチドを含む核酸）とともに、本発明のさらなる部分である。

本発明は、本発明のポリペプチドを作製する方法をさらに提供し、本発明のベクターを含む宿主細胞を、このベクター中に存在する核酸が発現される条件下で培養する工程を包含する。好ましくは、このポリペプチドはこの培養から単離される。本発明はまた、配列番号４および１３から選択されるアミノ酸配列の７つ以上の連続する残基を含む抗原性ペプチドを、このペプチドを認識する抗体分子と結合する方法を提供し、このペプチドを、この抗体分子と接触する工程を包含する。

本発明はまた、ＳＰ９１５５レセプターによって媒介される被験体における医療状態を処置または予防する方法を提供し、この被験体に、本発明のポリペプチドを認識する抗体分子を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む組成物を、投与する工程を包含する。この方法は、痛みまたは肥満のような医療状態を処置するために用いられ得る。

本発明のＲＦアミドペプチドは、とりわけ、ヒトＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号１および２；ＷＯ００／１１０１５、ＷＯ００／２２１３１、ＷＯ００／３１２５６、ＷＯ００／７８８０９、ＷＯ０１／１６３１６およびＷＯ０１／４８１８９もまた参照のこと）またはマウスＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号１９および２０）のようなＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を結合およびその活性を調節するために有用であり得る。このヒトＳＰ９１５５レセプターは、脳、心臓、腎臓および結腸組織中で発現される。本発明のＲＦアミドはまた、ヒトおよびマウス前駆体または任意のそのサブ配列を認識する抗体分子の生成のための抗原性ペプチドとして用いられ得る。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＳＰ９１５５レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって：
（ａ）標識した既知量のＳＰ９１５５レセプターリガンドの存在下で、該アゴニストまたはアンタゴニストの存在について試験するサンプルと、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントとを接触する工程；および
（ｂ）該レセプターに特異的に結合した該リガンドの量を測定する工程、
を包含し、該サンプルは、該レセプターへの該標識リガンドの結合の、該サンプルの非存在下で測定される結合と比較しての実質的な減少を測定することによりアンタゴニストまたはアゴニストを含むことが同定される、方法。
（項目２）
前記標識リガンドが、配列番号４〜１１および１３〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むカルボキシ末端アミド化ポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記レセプターが、配列番号２または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記レセプターの供給源が、該レセプターを含む哺乳動物細胞から単離された膜を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
ＳＰ９１５５レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって：
（ａ）既知量のＳＰ９１５５レセプターリガンドの存在下で、該アゴニストまたはアンタゴニストの存在について試験するサンプルと、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントを発現する細胞とを接触する工程；および
（ｂ）該細胞によるカルシウム移動を測定する工程、
を包含し、該サンプルは、該サンプルの非存在下で測定される移動と比較しての実質的なカルシウム移動の減少を測定することによりアンタゴニストを含むことが同定され、そして該サンプルの非存在下で測定される移動と比較しての実質的なカルシウム移動の増加を測定することによりアゴニストを含むことが同定される、方法。
（項目６）
前記標識リガンドが、配列番号４〜１１および１３〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むカルボキシ末端アミド化ポリペプチドである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記レセプターが、配列番号２または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記カルシウム移動が、カルシウムとカルシウム指示薬を接触させ、次いで、該指示薬の蛍光を測定することにより測定される、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記カルシウム指示薬が、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ペンタアセトキシメチルエステルである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ポリペプチドを生成する方法であって、配列番号４または配列番号１３由来の７以上の連続するアミノ酸を含む抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えベクターを含む宿主細胞を、該核酸が発現される条件下で培養する工程を包含する、方法。
（項目１１）
前記ポリペプチドが、前記培養物から単離される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
配列番号４および配列番号１３から選択されるアミノ酸の７以上の連続する残基を含む抗原性ペプチドと、該ペプチドに特異的に結合する抗体分子との間の複合体を形成する方法であって、該ペプチドと該抗体分子を接触させる工程を包含する、方法。
（項目１３）
被験体におけるＳＰ９１５５レセプターにより媒介される医学的状態を処置または予防するための方法であって、薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、該薬学的組成物は、配列番号４または配列番号１３由来の７以上の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、方法。
（項目１４）
前記医学的状態が、疼痛および肥満から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
配列番号４および配列番号１３から選択されるアミノ酸配列のうちの７以上の連続する残基を含む、単離された抗原性ポリペプチド。
（項目１６）
配列番号４〜１１および１３〜１８から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１７）
カルボキシ末端がアミド化された、項目１５に記載の単離された抗原性ポリペプチド。
（項目１８）
項目１５に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその機能的フラグメント。
（項目１９）
項目１５に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
（項目２０）
配列番号４〜１１および１３〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
配列番号３および１２から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目２０に記載の核酸。
（項目２２）
項目１９に記載の核酸を含む、組み換えベクター。
（項目２３）
項目２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目２４）
項目１５に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目２５）
項目１８に記載の抗体分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。

（発明の詳細な説明）
（アッセイ）
本発明は、ＳＰ９１５５レセプターのそのリガンドへの結合によって媒介される、代謝障害（例えば、糖尿病）またはＣＮＳ状態（例えば、痛み）のような種々の医療状態の処置および管理において有用であり得る、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントのアゴニストおよびアンタゴニスト発見のためのアッセイを含む。

詳細には、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメント、および本発明のＲＦ−アミドペプチドリガンドが、このようなスクリーニング方法において採用され得る。本質的に、これらの方法は、ＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２または配列番号２０）またはその機能的フラグメントを、ＳＰ９１５５リガンド（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８のいずれか、またはその任意のサブ配列）およびＳＰ９１５５レセプターアゴニストまたはアンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触することを包含する。

「サンプル」または「候補物質」は、例えば、ＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２または配列番号２０）またはその機能的フラグメントとアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力に対する試験またはアッセイで評価される組成物をいう。サンプルは、小分子、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、亜原子粒子および照射（例えば、αペプチド、βペプチド、γ照射、Ｘ線）および抗体分子を含み得る。

アンタゴニストおよびアゴニストは、ＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２または配列番号２０）またはその機能的フラグメントの、ＲＦアミドペプチド（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８のいずれか、またはその任意のサブ配列）のようなリガンドに結合する能力を調節し得るか、および／またはＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントが細胞内シグナル（例えば、Ｇタンパク質結合、カルシウム移動）を生成する能力を調節し得る。

スクリーニングシステムの２つの基礎的タイプ、標識リガンド結合アッセイおよび「機能的」アッセイが好ましい。結合アッセイにおける使用のための標識リガンドは、ＳＰ９１５５レセプターリガンド（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８のいずれか、またはその任意のサブ配列）または公知のＳＰ９１５５レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを、検出可能な標識（例えば、^１２５Ｉまたは^３Ｈ）で標識することによって得られ得る。代表的には、本発明のＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２または配列番号２０）の所定量を、増加する量の標識リガンド（例えば、^３Ｈ−ｐ５２）と接触し、そして洗浄によって非結合標識リガンドを除去した後、結合した標識リガンドの量を測定する。標識リガンドの量が増加するにつれ、最終的に、すべてのレセプター結合部位が占領または飽和される点に到達する。標識リガンドの特異的レセプター結合は、非標識リガンドの大過剰によってなくなる。

好ましくは、標識リガンドのレセプターの非特異的結合が最小であるアッセイシステムが用いられる。非特異的結合は、代表的には標識リガンドの総結合の５０％より少なく、好ましくは１５％より少なく、そしてより好ましくは１０％より少ない。

用語「ＳＰ９１５５レセプターリガンド」は、本発明のＲＦアミド、例えば、表１（例えば、配列番号４〜１１または１３〜１８のいずれか）に提示されるような、またはその任意のアナログを含む。この用語はまた、配列番号４から、または配列番号１３からの７以上の連続するアミノ酸を含む任意のアミノ酸を含む（以下に論議される）。好ましくは、これらペプチドは、カルボキシ末端がアミド化されている。

原則的に、本発明の結合アッセイは、本発明の可溶性レセプター（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系から標準的な方法による産生および再折り畳み後）を用いて実施され得、そして得られるレセプター−標識リガンド複合体は、例えば、このレセプターに対する抗体を用いて沈殿され得る。次いで、この沈殿は、洗浄され得、そして結合した標識リガンドの量が測定され得る。

しかし、好ましくは、本発明のＳＰ９１５５レセプターをコードする核酸は、適切な宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ）中に形質転換またはトランスフェクトされ、それによって、このレセプターは、細胞の膜中に取り込まれるようになる。次いで、膜フラクションが細胞から単離され、そしてアッセイのためのレセプターの供給源として用いられ得る。好ましくは、標識リガンドの非トランスフェクト宿主細胞からの膜フラクションへの特異的結合は無視し得る。

本発明の結合アッセイは、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントのアゴニストおよびアンタゴニストの両方を同定するために用いられ得る。なぜなら、一般に、両者は、標識リガンドのレセプターへの結合を調節するからである。

基礎的な結合アッセイでは、ＳＰ９１５５レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、（ａ）ＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２、配列番号２０またはその機能的フラグメント）を、既知量のＳＰ９１５５レセプターリガンド（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８のいずれか、またはその任意の部分配列）の存在下、サンプルと接触する工程；および（ｂ）このレセプターに特異的に結合したリガンドの量を測定する工程を包含する。

サンプルは、サンプルの非存在下で測定され得るレセプターへのリガンドの結合と比較して、実質的に減少したレセプターへのリガンドの結合を測定することによってアゴニストまたはアンタゴニストを含むと同定され得る。

本発明の１つの実施形態では、先行する方法は、別のコントロール実験であるさらなる工程：（ｃ）ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントを、既知量の標識リガンドの存在下、ＳＰ９１５５レセプターアゴニストまたはアンタゴニストであることが知られる化合物と接触する工程；および（ｄ）このレセプターに結合した標識リガンドもの量を測定する工程を包含する。

細胞または機能的アッセイもまた、サンプルがＳＰ９１５５レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを含むか否かを決定するために用いられ得る。これらのアッセイでは、サンプルが、ＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２または配列番号２０）によって媒介される細胞パラメータを調節する能力が評価され；このようなパラメータは、制限されないで、公開された方法を用いる、レセプターを経由して活性化される細胞内のセカンドメッセンジャー経路、細胞増殖速度における変化、ホルモンの分泌、カルシウムの移動などを含む。このような方法の例は、フォルスコリンで刺激される細胞内ｃＡＭＰ産生のレセプター媒介阻害に対するリガンドの影響（Ｐａｒｋｅｒら、（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３４：１７９〜１８９）、レセプター刺激されるＣａ^２＋移動および細胞分裂効果（Ｓｅｔｈｉら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：１６７４〜１６７９）、およびイノシトールリン酸産生およびＭＡＰキナーゼ誘導（Ｗａｎｇら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：６７１１〜１７）の測定を包含する。好ましい実施形態では、ＳＰ９１５５レセプターを発現する細胞中のカルシウム移動が、例えば、Ｚｈａｎｇら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１１）：８６０８〜８６１５に記載されるような、蛍光定量イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイを用いて決定される。一般に、このＦＬＩＰＲアッセイは：（ａ）ＳＰ９１５５レセプター（例えば、配列番号２、配列番号２０またはその機能的フラグメント）を発現する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞）を、既知量のＳＰ９１５５レセプターリガンド（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８のいずれか、またはその任意の部分配列）の存在下、サンプルと接触する工程；および（ｂ）この細胞によるカルシウム移動を測定する工程を包含する。

カルシウム移動は、細胞を、Ｆｌｕｏｒ−３−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ペンタアセトキシメチルエステルのようなカルシウム指示薬に曝すことによって測定され得る。Ｃａ^２＋の存在下、この指示薬は蛍光を発する。この蛍光は、例えば、蛍光定量イメージングプレートリーダーで細胞を分析することにより検出され得る。

サンプルは、サンプルの非存在下で測定され得るカルシウム移動と比較して、実質的に減少したカルシウム移動を測定することによりアンタゴニストを含むとして同定され得、そしてサンプルは、サンプルの非存在下で測定され得るカルシウム移動と比較して、実質的に増加したカルシウム移動を測定することによりアゴニストを含むとして同定され得る。

（分子生物学）
本発明のポリペプチドおよび核酸のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、以下の表１に要約されるような配列表に見られる。

代表的には、前駆体は、例えば、インビボで、プロテアーゼ（例えば、フリンプロテアーゼまたはプロホルモンコンバターゼ）によって、認識部位で切断され、カルボキシ末端Ａｒｇ−Ｐｈｅ（ＲＦ）モチーフを含むＲＦアミドペプチドを生じる。このカルボキシ末端は、次いで、細胞内アミダーゼによってアミド化され、Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ_２（ＲＦアミド）モチーフを生成する。配列番号４〜１１および１３〜１８のいずれかのアミノ酸配列をもつペプチドは、遊離の非改変カルボキシ末端または、好ましくは、アミド化されたカルボキシ末端を含み得る。

「＊」によってマークされる配列番号５〜１１の行中の括弧内の数字は、それらペプチドが由来したヒト前駆体（配列番号４）の部分を示す。同様に、「＊」によってマークされる配列番号１４〜１８の行中の括弧内の数字は、それらペプチドが由来したマウス前記体（配列番号１３）の部分を示す。「‡」によってマークされる括弧の数字は、示されたペプチドをコードする対応ヒトまたはマウス前駆体遺伝子のヌクレオチドを示す。

配列番号３および１２に提示されるヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチドであるが、対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸もまた、本発明の範囲内である。配列番号３および１２のアンチセンス鎖またはその任意のサブ配列を含む核酸もまた、本発明の範囲内にある。

いくつかのコード単一ヌクレオチド多形（ｃＳＮＰ）が、ヒトＳＰ９１５５遺伝子中で同定されている。各ｃＳＮＰ（すなわち、ｇ１５４ａ−Ｇ５２Ｓ；ｔ１８１ｇ−Ｆ６１Ｖ；ｔ２０６ｇ−Ｖ６９Ｇ；ｇ２０８ｔ−Ｖ７０Ｌ；ｔ４４７ｇ−Ｈ１４９Ｑ；ｇ７４８ｔ−Ｇ２５０Ｃ；ｔ１０３１ｃ−Ｌ３４４Ｓ；ｃ１１１１ｔ−Ｒ３７１Ｗ；ｇ１１６２ａ−Ｇ３８８Ｒおよびｃ１２２８ｔ−Ｌ４１０Ｆ）は配列表に提示されている。さらに、いくつかのｃＳＮＰがヒト前駆体で同定されている。配列表に提示されている各ｃＳＮＰは、以下の表２に要約される。

本発明によれば、当該技術内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法が採用され得る。このような技法は、文献中に詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書では、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。

本発明の目的には、用語「ＲＦアミド」または「ＲＦアミドペプチド」または「ＲＦアミドポリペプチド」は、本発明の任意のペプチド（例えば、表１を参照のこと）、またはその任意の形態にあるアナログを含む。例えば、この用語は、アミド化カルボキシ末端をもつペプチドおよび非改変カルボキシ末端をもつペプチドを含む。

用語「ＳＰ９１５５」または「ＳＰ９１５５レセプター」は、ヒトレセプター（例えば、配列番号１および２）およびマウスレセプター（例えば、配列番号１９および２０）を含む。

用語「被験体」または「患者」は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、イヌ、ネコ、ウシ、チンパンジー、ゴリラ）そして最も好ましくはヒトをいう。

本発明は、本発明のＲＦアミドペプチドの組換えバージョンを含む。用語「組換え」は、天然には連続しておらず、そして互いに融合している２つ以上の核酸またはタンパク質を記載し得る。この用語はまた、人為的に改変されている（例えば、翻訳後改変または変異）核酸またはタンパク質に言及し得る。例えば、野生型コドンは、同時に、核酸配列認識部位を導入または除去しながら、同じアミノ酸残基をコードする余分のコドンまたは保存的置換で置き換えられ得る。同様に、所望の機能をコードする核酸セグメントは、天然には一緒に見出されない所望に組み合わせをコードする単一の遺伝子実体を生成するために融合され得る。制限酵素認識部位は、しばしば、このような人工的操作の標的であるが、その他の部位特異的な標的、例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列、またはその他の有用な特徴が設計によって取り込まれ得る。以下に説明されるように、検出または精製のためのエピトープタグをコードする配列もまた取り込まれ得る。

「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような、核酸中の一連の２つ以上のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）である。

本発明は、表１に提示されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号３または１２）のいずかの核酸フラグメントを含む。核酸「フラグメント」は、例えば、配列番号３および１２のいずれかからの、少なくとも約１２、１５、１８または２１（例えば、２２、２３または２４）、一般に少なくとも約２５（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４）、好ましくは少なくとも約３５（例えば、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４）、より好ましくは少なくとも約４５（例えば、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３または５４）、そして最も好ましくは少なくとも約５５またはそれ以上の連続するヌクレオチド（例えば、５６、５７、５８、５９、６０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００または１２００）を含む。

短い核酸配列（例えば、約１０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）はまた、「オリゴヌクレオチド」と称され得る。オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして用いられ得る。本明細書で用いられる、ＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を意味し得る。ＰＣＲの説明には、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７を参照のこと。オリゴヌクレオチドおよび核酸フラグメントは、例えば、^３２Ｐ−ヌクレオチド、^３Ｈ−ヌクレオチド、^１４Ｃ−ヌクレオチド、^３５Ｓ−ヌクレオチド、またはビオチンのような標識が共有結合されたヌクレオチドの取り込みによって標識され得る。１つの実施形態では、標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いられ得る。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド（１つまたはその両方賀も標識され得る）は、ＰＣＲプライマーとして、遺伝子の完全長またフラグメントをクローニングするためであるか、または核酸の存在を検出するためのいずれかで用いられ得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成機上で調製される。

「タンパク質配列」、「ペプチド配列」または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド中の一連の２つ以上のアミノ酸を意味し得る。

「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連続するストリングを含む。本発明の好適なペプチドは、表１に提示されるもの、およびその改変体（例えば、カルボキシ末端アミデート化改変体）およびそのフラグメントを含む。このようなフラグメントは、配列番号４および１３のいずれかからの、好ましくは少なくとも約４、５、６または７（例えば、８、９、１０または１１）、好ましくは少なくとも約１２（例えば、１３、１４、１５，１６、１７、１８または１９）、より好ましくは少なくとも約２０（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）、そして最も好ましくは少なくとも約３０（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２４または１３６）またはそれ以上の連続するアミノ酸残基を含む。以下に論議されるように、このようなペプチドは、ＲＦアミドペプチド前駆体ペプチド（例えば、配列番号４および１３）またはその任意のフラグメントを認識する抗体分子を生成するための抗原として有用であり得る。

本発明のポリペプチドは、インタクトなペプチドのタンパク質分解切断によるか、化学的合成によるか、または組換えＤＮＡ技術の適用により生成され得、そしてタンパク質分解切断部位によって輪郭を描かれるポリペプチドに制限されない。これらペプチドは、単独であるか、それらをより免疫原性にするためにキャリア分子に架橋もしくは結合されるかいずれかで、抗体およびそのフラグメントの産生を惹起するための抗原として有用である。これら抗体は、例えば、免疫アフィニィー精製のためのイムノアッセイなどで用いられ得る。

用語「単離された核酸」または「単離されたポリペプチド」は、細胞中または組換えＤＮＡ発現系中で通常見出されるその他の成分から部分的または完全に分離されている、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子または混合ポリマーのような核酸、またはポリペプチドをそれぞれ言及し得る。これらの成分は、制限されないで、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分、および隣接ゲノム配列を含む。従って、この用語は、その天然に存在する環境から取り除かれている核酸を含み得、そして組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、および化学的に合成されたアナログもしくは外来系によって生物学的に合成されたアナログを含み得る。

単離された核酸またはポリペプチドは、好ましくは、本質的に分子の均一な組成物であるが、ある程度の不均一性を含み得る。

用語「実質的に純粋」は、起源生物または組換えＤＮＡ発現系に由来するその他の汚染するタンパク質、核酸、およびその他の生物学的成分がないＲＦアミドペプチド、核酸またはその他の物質をいい得る。純度は、標準的方法によってアッセイされ得、そして代表的には、少なくとも約５０％を超え、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、約１００％）純度を超える。純度評価は、質量ベースまたは分子ベースでなされ得る。

本発明はさらに、表１に提示されるタンパク質および核酸に同一性または類似性を保有するアミノ酸または核酸配列をそれぞれ有するタンパク質および核酸を包含する。配列「同一性」は、比較されている２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸間の正確な一致をいう。配列「類似性」または「相同性」は、比較されている２つのポリペプチドのアミノ酸間の正確な一致に加え、非同一の生化学的に関連するアミノ酸間の一致の両方をいう。生化学的に関連するアミノ酸は、類似の性質を共有し、そして相互交換可能である。相互交換可能であり得る類似の性質をもつアミノ酸は、当該分野で周知である。例えば、相互交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；相互交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含み；相互交換可能であり得る酸性アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、そして相互交換可能であり得る塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンを含む。

配列「同一性」および「類似性」は、公知の方法によって容易に算出され得、制限されないで、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｅｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ、Ｈら（１９８８）、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３に記載のようなものを含む。同一性を算出する好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、制限されないで、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７）、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給源から公に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた同一性を決定するために用いられ得る。
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータ以下を含む：
１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３
比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５〜１０９１９からのＢＬＯＳＳＵＭ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長さペナルティー：４
これらのパラメータを用いる有用なプログラムは、「ギャップ」プログラムとして、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから、公に入手可能である。前記のパラメータは、ペプチド比較のためのデフォールトパラメーターである（エンドギャップについてペナルティーなし）。
ギャッププログラムを用いる、ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメータは以下を含む：
１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長さペナルティー：３
本発明は、表１に記載されるポリペプチド（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８）をコードする核酸（例えば、配列番号３および１２）およびそれにハイブリダイズする核酸を含む。好ましくは、これら核酸は、低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件で、そして最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下でその他の核酸分子にアニールし得るとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡのような別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述を参照のこと）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。代表的には、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアルデヒドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳであり得る。代表的な、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが、５×または６×ＳＳＣで４０％ホルムアミド中で実施されるのを除き、低ストリンジェンシー条件に類似している。高ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションが、５×または６×ＳＳＣで５０％ホルムアミド中で実施され得、そして、必要に応じて、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）で実施され得るのを除き、低ストリンジェンシー条件に類似している。代表的には、ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。ハイブリダイズする核酸の適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である、核酸の長さ、および相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きい程、核酸がハイブリダイズし得るストリンジェンシーは高くなる。代表的な、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチに亘り少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドに亘り少なくとも約６５％、より好ましくは約２０ヌクレオチドまたはそれ以上に亘り約７５％〜約９５％またはそれ以上の同一性が存在するときに起こる。長さが１００ヌクレオチドより長いハイブリッドには、融点温度を算出するための等式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションには、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてこのオリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、１１．７〜１１．８を参照のこと）。

２つのポリペプチドをコードする２つの核酸が実質的に同一であるというさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。代表的には、例えば、２つのペプチドが、主に、保存的置換によって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドに実質的に同一であると見なされる。

本発明にまた含まれるのは、表１の参照ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に、少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、そして最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるヌクレオチド配列を含む核酸、およびアミノ酸配列を含むポリペプチドである。表１の参照アミノ酸配列（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８）に、少なくとも約７０％類似または同一、好ましくは少なくとも約８０％類似または同一、より好ましくは少なくとも約９０％類似または同一、そして最も好ましくは少なくとも約９５％類似または同一である（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）アミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本発明に含まれる。さらに、本発明は、表１に提示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号４〜１１および１３〜１８）に、少なくとも約７０％類似または同一、好ましくは少なくとも約８０％類似または同一、より好ましくは少なくとも約９０％類似または同一、そして最も好ましくは少なくとも約９５％類似または同一である（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。

いくつかの物理的改変体は、本発明のＲＦアミドペプチドのアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列相同性を有している。本発明では、アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、残基一致を最適化することにより、そして必要であれば、必要に応じてギャップを導入することにより決定され得る。相同性アミノ酸配列は、各個々の配列における、代表的には、天然の対立遺伝子、多形および種間変動を含むことが意図される。代表的な相同性タンパク質またはペプチドは、ＲＦアミドペプチドのアミノ酸配列と、約２５〜１００％の相同性（ギャップが導入され得る場合）から、約５０〜１００％の相同性（保存的置換が含められる場合）を有する。観察された相同性は、代表的には、少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約８０％またはそれ以上である。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍ、（１９７０）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら、Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ、Ｓｔｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｓ、ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、１９８３、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＭＡ；およびＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩを参照のこと。

ＲＦアミドペプチドおよびそのフラグメントをコードする核酸は、標準的な方法によって調製され得る。例えば、ＤＮＡは、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５）のホルホルアミダイト固相支持体法、Ｙｏｏらの方法（１９８９）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８）、またはその他の周知の方法を用いて化学的に合成され得る。これは、以下に記載のように合成オリゴヌクレオチドのペアを含む一連のオリゴヌクレオチドカセットを連続的に連結することによりなされ得る。

当然、遺伝子コードの縮重に起因して、多くの異なるヌクレオチド配列が、本発明のＲＦアミドペプチドをコードし得る。そのコドンは、原核系または真核系における最適な発現について選択され得る。このような縮重改変体もまた、当然、本発明により包含される。さらに、本発明のＲＦアミドペプチドをコードする核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの反転により容易に改変され得る。このような変更は、野生型ペプチドと共通の免疫原性活性または抗原活性を有する抗原をコードする新規のＤＮＡ配列を生じ得る。これらの改変された配列は、野生型または変異ペプチドを生成するため、あるいは、組み換えＤＮＡ系における発現を増強するために使用され得る。

本発明の核酸は、転写（例えば、プロモーター；上述）、翻訳（例えば、Ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１９８６７−１９８７０またはＫｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ１１５：８８７−９０３）、および／またはＤＮＡ複製（例えば、複製起点（例えば、ｏｒｉ））を制御するＤＮＡセグメントに作動可能に連結され得る。

核酸は、その配列が、コードする配列からＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）（次いで、ＲＮＡスプライシングを受け得（イントロンを含む場合）、そして必要に応じて、コード配列によりコードされるタンパク質に変換される）への、ＲＮＡポリメラーゼ媒介転写を指示する場合、転写および／または翻訳制御配列「の制御下にある」、「と機能的に関連している」「と作動可能に連結されている」、または「と作動可能に関連している」。

用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ、またはＤＮＡ配列の情報を具現化する（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化させることによってタンパク質を生成する）ことを意味し得る。あるいは、遺伝子は、インビトロで発現され得；その遺伝子を含むＤＮＡは、組み換えＲＮＡポリメラーゼにより転写され得、そして、必要に応じて、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により翻訳される。ＤＮＡ配列は、細胞中でもしくは細胞により発現されるかまたはインビトロで発現され、「発現産物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成する。発現産物自体もまた、「発現される」と言及され得る。

本発明の核酸を挿入し得るベクターとしては、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み型ＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノムへの核酸の導入を容易にし得る他のビヒクルが挙げられ得る。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、類似の機能を発揮し、当該分野で公知であるかまたは公知となる全ての他の形態のベクターが、本明細書中での使用に適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。

ＲＦアミドペプチドをコードするＤＮＡまたはＳＰ９１５５レセプターもしくはその機能的フラグメントコードするＤＮＡの、ベクターへの挿入は、ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が、適合する制限部位を含む場合、容易に達成される。そうでない場合、ＤＮＡおよび／またはベクターの両方の末端を、制限エンドヌクレアーゼ切断により生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングを消化して平滑末端にすることによって改変するか、または適切なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ）で一本鎖末端を充填することにより同じ結果を達成する必要があり得る。あるいは、所望の部位は、例えば、その末端にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲートすることにより生成され得る。このようなリンカーは、所望の制限部位を定義する特定のオリゴヌクレオチドを含み得る。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって作成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）を参照のこと。切断されたベクターおよびＤＮＡフラグメントはまた、ホモポリマーテーリングにより必要とされる場合、改変され得る。

本発明において使用される組み換え発現ベクターは、代表的に、ＲＦアミドペプチドもしくはＳＰ９１５５またはそれらの機能的フラグメントをコードする核酸を含む自律複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり、通常、適合する宿主細胞における核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子制御エレメントに作動可能に連結される。遺伝子制御エレメントとしては、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系が挙げられ得、代表的には、転写プロモーター、および転写の開始を制御する選択的プロモーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列が挙げられる。遺伝子発現を制御するのに使用され得るプロモーターとしては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７）、λＰＬプロモーター系（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ（１９８０）２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｎｇｅｒら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）、メタロプロテイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）が挙げられるがこれらに限定されない（「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｓｉｃｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４もまた参照のこと）；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、またはアルカリホスファターゼプロモーター）もまた、本発明の核酸に作動可能に連結され得る。発現ベクターはまた、宿主細胞から独立してベクターの複製を可能にする複製機起点を含み得る。

用語「宿主細胞」は、細胞による物質の精製（例えば、細胞による、遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、ベクター、タンパク質、または酵素の発現または複製により）のために、任意の方法で選択、修飾、トランスフェクト、形質転換、増殖、または使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を意味し得る。好ましい宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５、またはＨＢ１０１））および真核生物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞）が挙げられる。

用語「形質転換」は、細胞への核酸（例えば、配列番号３もしくは１２、それらのフラグメント、または配列番号４〜１１および１３〜１８もしくはその任意のフラグメントをコードする核酸）の導入をいう。導入遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受け取る宿主細胞は、「形質転換」されており、そして「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり、その宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞が挙げられる。

本発明のＲＦアミドペプチドをコードする核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて、従来法により実施され得る。原核生物系においてはＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が最も頻繁に用いられるが、多くの他の細菌（例えば、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓの種々の株）が当該分野で公知であり、同様に使用される。ＲＦアミドペプチドもしくはＳＰ９１５５レセプターまたはそれらの機能的フラグメントをコードする核酸を発現するために適した宿主細胞としては、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方を含む。高等真核生物としては、動物細胞（例えば、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類細胞）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方）から構築された組織培養細胞株を含む。

原核生物宿主−ベクター系としては、多くの異なる種に対する広範な種々のベクターが挙げられる。ＤＮＡ増幅のための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２または多くのその誘導体（例えば、ｐＵＣ１８または１９）である。ＲＦアミドペプチドを発現するのに使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮシリーズ）；λｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはハイブリッドプロモーター（例えば、ｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６を参照のこと。本発明のペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号、および同第５，８６９，３２０号ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２０３５−２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら，（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈら，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３６；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：２５９に開示されるようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において高レベルで発現され得る。

高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明のＲＦアミドペプチドの組み換え生成について使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞（昆虫バキュロウイルス発現系を含む）が使用されるが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は慣用的な手順となっている。有用な細胞株の例としては、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ラット胎仔腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。このような細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および／または転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源由来のプロモーターを含むプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら，（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、およびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。

本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに第２のポリペプチドおよびポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）を含む融合物を含む。本発明の融合物は、表１に示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそれらの部分配列もしくはフラグメントのいずれかを含み得る。本発明の融合ポリペプチドは、従来法により（例えば、上記のような発現ベクターへの本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの挿入により）構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易にするタグを含み得る。このようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、細胞結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能な標識またはタグ（例えば、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３Ｈ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６８Ｇａ、^１８Ｆ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１３ｍＩｎ、^７６Ｂｒ、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、および^６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドを標識するのに使用され得る。このような融合物を構築および使用する方法は、従来法であり、当該分野で周知である。

ポリペプチド中に生じる改変（例えば、翻訳後修飾）は、しばしば、それがどのように生成されるかによる。宿主においてクローニング遺伝子を発現することにより作成されるポリペプチドについては、例えば、その改変の性質および程度は、大部分は、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配列中に存在する改変シグナルにより決定される。例えば、周知のように、グリコシル化は、しばしば、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）においては生じない。従って、グリコシル化が望まれる場合、ポリペプチドは、宿主（一般的には、真核生物細胞）において発現され得る。昆虫細胞は、哺乳動物細胞と同様に、しばしば、翻訳後修飾を有し得る。この理由から、昆虫細胞発現系は、ネイティブのグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効果的に発現するために開発される。あるいは、脱グリコシル化酵素が、真核生物発現系において生成される間に付着した炭水化物を除去するのに使用され得る。

また、他の改変としては、ポリペプチドのカルボキシ末端へのアミドまたは脂肪エステルの付加が挙げられ得る。本発明はまた、非天然アミノ酸残基またはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン残基）のような改変を含むＲＦアミドペプチドのアナログを含む。他の潜在的な改変としては、スルホン酸化、ビオチニル化、または他の部分（特に、リン酸基と類する分子形状を有する部分）の付加が挙げられる。

本発明のペプチドはまた、環化され得る。詳細には、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端残基または本発明のペプチドの２つの中間残基が融合されて環化ペプチドが生成され得る。好ましくは、環化は、そのペプチドのカルボキシ末端がフリーになるように環化され得る。ペプチドはまた、アミノ末端がフリーになるように環化され得る。ペプチドを環化する方法は従来法であり、当該分野で周知である；例えば、Ｇｕｒｒａｔｈら，（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１０：９１１−９２１を参照のこと。

本発明のＲＦアミドペプチドは、被験体内でのそのペプチドの半減期を増加させるポリマーに結合され得る。好ましいポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストラン、およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。

所定のポリペプチドにおいて、同じタイプの改変が、いくつかの部位において同じ程度でまたは異なる程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの改変を含み得る。

本発明のＲＦアミドペプチドのアナログは、化学合成により、または部位特異的変異誘発（Ｇｉｌｌｍａｎら，（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：８１；Ｒｏｂｅｒｔｓら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１またはＩｎｎｉｓ（編），１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）もしくはポリメラーゼ連鎖反応法ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉら，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ２３９：４８７（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら（１９９１）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１）により例示される）により調製され、そのペプチドをコードする核酸が改変される。

なお他のアナログは、反応性側鎖を通じた架橋タンパク質におけるそれらの有用性のために、当該分野で公知の薬剤の使用によって調製される。架橋剤との好ましい誘導体化部位は、遊離アミノ基またはカルボキシル基、炭水化物基、およびシステイン残基である。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、全てのこのような改変（特に、宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することにより合成されるポリペプチドに存在する改変）を含む。

（タンパク質の精製）
代表的に、本発明のペプチドは、培養物中（例えば、培養ブロスのような液体培養物）で増殖される宿主細胞中でポリペプチドをコードする核酸を発現させることにより生成され得る。例えば、核酸は、宿主細胞中に存在するベクター（例えば、プラスミド）の一部であり得る。発現後、本発明のペプチドは、培養細胞から単離され得る。本発明のペプチドは、標準的な方法（塩またはアルコール沈殿、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、上記のような精製タグペプチドと合わせて使用される）、調製ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、カチオンおよびアニオン交換ならびに分画クロマトグラフィー、ならびに逆流分布を含むがこれらに限定されない）によって精製され得る。このような精製方法は当該分野で周知であり、例えば、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに開示されている。

精製工程の後に、以下に記載されるようなレセプター結合活性についてのアッセイが実施され得る。特に、ＲＦアミドペプチドが細胞供給源または組織供給源から単離される場合、アッセイ系に、１つ以上のタンパク質分解酵素インヒビター（例えば、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペファブロックＳＣ、ペプスタチン、ロイペプチン、キモスタチン、およびＥＤＴＡ）を含むことが好ましい。

（抗体分子）
本発明のＲＦアミドペプチドの抗原性（すなわち、免疫原性）フラグメントは、本発明の範囲内である（ＳＰ９１５５またはその機能的フラグメントに結合するものもしないものも）。抗原性ペプチドは、ＲＦアミドペプチド前駆体またはその任意のフラグメントを認識する抗体分子を調製するのに有用であり得る。

必ずしもそうとは限らないが、ＲＦアミドペプチドが、免疫学的に適合する宿主における抗体産生を誘導する抗原として使用される場合、小さい抗原性のフラグメントは、好ましくは最初に、架橋もしくは濃縮することによって、または免疫原性キャリア分子（すなわち、宿主動物において独立して免疫応答を誘発する特性を有する高分子（例えば、ジフテリア毒素またはテタヌス））と連結することによって、より大きな免疫原性を与えられる。小さいポリペプチドフラグメントは時々、ハプテン（抗体に特異的に結合し得るが、抗体産生を誘発し得ない分子（すなわち、それらは免疫原性ではない））として作用するため、キャリア分子への架橋または結合は、必要となり得る。このようなフラグメントの、免疫原性キャリア分子への結合は、「キャリア効果」として一般的に知られている効果を通して、それらにより大きな免疫原性を与える。

キャリア分子としては、例えば、タンパク質および天然または合成ポリマー化合物（例えば、ポリペプチド、多糖、リポ多糖など）が挙げられる。タンパク質キャリア分子は特に好ましくは、キーホールリンペットヘモシアニンおよび哺乳動物血清タンパク質（例えば、ヒトもしくはウシガンマグロブリン、ヒト、ウシ、もしくはウサギ血清アルブミン、またはそのようなタンパク質のメチル化物もしくは他の誘導体が挙げられる）。他のタンパク質キャリアは、当業者に明らかである。好ましくは、タンパク質キャリアは、そのフラグメントに対する抗体が誘発される宿主動物に対して外来性である。

キャリア分子に対する共有結合カップリングは、当該分野で周知の方法を用いて達成され得；その正確な選択は、使用されるキャリア分子の性質により決定される。免疫原性キャリア分子がタンパク質である場合、本発明のフラグメントは、例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒド）を用いて連結され得る。

これらのカップリング剤もまた、別個のキャリア分子を使用せずにフラグメントをそれらに架橋するために使用され得る。このような凝集素への架橋もまた、免疫原性を増加させ得る。免疫原性はまた、単独でまたはカップリングもしくは凝集と組み合わせて、公知のアジュバントの使用により増加され得る。

動物のワクチン接種のためのアジュバントとしては、アジュバント６５（ピーナツ油、モノオレイン酸マンニド、およびモノステアリン酸アルミニウムを含む）；フロイント完全または不完全アジュバント；ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、シロレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール）；ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、およびカルボポール）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、およびタフトシン）；油エマルジョンが挙げられるがこれらに限定されない。ポリペプチドはまた、リポソームまたは他のマイクロキャリアへの組み込み後に投与され得る。

アジュバントに関する情報および免疫アッセイの種々の局面は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによるシリーズに開示されている。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を網羅する他の有用な参考文献としては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６９，Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９６２，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＷｉｌｌｉａｎｍｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１．１９６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋが挙げられる。

本発明の抗ＲＦアミドペプチド「抗体分子」としては、抗ＲＦアミドペプチド抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二特異的抗体、および抗イディオタイプ抗体）およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメントまたは機能的フラグメント）（例えば、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト／マウスキメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。

本発明の抗ＲＦアミドペプチド抗体分子は、好ましくは、本発明のヒトまたはマウスＲＦアミドペプチドを認識する；しかし、本発明は、異なる種、好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）由来のＲＦアミドペプチドを認識する抗体分子を含む。本発明はまた、本発明のＲＦアミドペプチドおよび１つ以上の抗体分子を含む複合体を含む。このような複合体は、単に、その同族ペプチドと抗体分子を接触させることにより生成され得る。

種々の方法が、本発明の抗体分子を生成するのに使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，８７７，３９７号；同第６，２５５，４５８号；同第６，０２３，０１０号、および同第５，８７４，２９９号において開示されるのと類似の方法により生成される。モノクローナル、完全ヒト抗ＲＦアミドペプチド抗体を生成するハイブリドーマ細胞は次いで、当該分野で一般的に公知の方法により生成され得る。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら，（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６およびＨａｇｉｗａｒａら，（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２およびＣｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）が挙げられるがこれらに限定されない。ここでも、ハイブリドーマ細胞が抗ＲＦアミドペプチド抗体を発現しているか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡが使用され得る。

本発明の抗ＲＦアミドペプチド抗体分子はまた、組み換え生成され得る（例えば、上記のようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系）。この実施形態において、本発明の抗体分子（例えば、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ）をコードする核酸は、ペットベース（ｐｅｔ−ｂａｓｅｄ）プラスミドに挿入され得、そしてＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系において発現され得る。当該分野で公知の組み換え抗体を作成するためのいくつかの方法が存在する。抗体の組み換え生成方法の１つの例は、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。

用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質の抗体の集団から得られる抗体を含む（すなわち、その集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異体を除いて、同一である）。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に指向する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され得、本質的に他の免疫グロブリンに汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な集団の抗体である抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の精製を必要とするよう解釈されない。上述のように、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されるハイブリドーマ方法により作成され得る。

用語「ポリクローナル抗体」は、１つ以上の他の、非同一の抗体の存在下で生成された抗体を含む。一般的には、ポリクローナル抗体は、非同一の抗体を生成するいくつかの他のＢリンパ球の存在下でＢリンパ球から生成される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫した動物から直接得られる。

「二特異的抗体」は、異なる抗原に結合する２種の異なる抗原結合領域を含む。二得的抗体、およびその抗体を作成および使用する方法は、従来法であり、当該分野で周知である。

抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプは、別の抗体分子の抗原結合領域または可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対する抗体である。Ｊｅｒｎｅら（Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．，（１９７４）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５ｃ：３７３およびＪｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．，（１９８２）ＥＭＢＯ １：２３４）により開示されるように、所定の抗原（例えば、ＲＦアミドペプチド）についてのパラトープ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫は、一群の抗抗体を生成し、その内のいくつかは、抗原と、パラトープに対する相補的構造を共有する。抗イディオタイプ抗体の部分集団による免疫は、最初の抗原に対して反応性の抗体の部分集団または免疫細胞サブセットを生成する。

用語「完全ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。同様に、「マウス抗体」は、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいい、「ニワトリ抗体」は、ニワトリ免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。

「ヒト／マウスキメラ抗体」は、ヒト定常領域に融合されたマウス可変領域（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）を含む抗体をいう。

「ヒト化」抗ＲＦアミドペプチド抗体もまた、本発明の範囲内である。非ヒト（例えば、マウスまたはニワトリ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリンである。大部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ニワトリ、ラット、またはウサギ）の相補性決定領域由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基はまた、対応する非ヒト残基で置換されている。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的には、ｓＦｖポリペプチドはさらに、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、ｓＦｖが、抗原結合について所望の構造を形成するのを可能にする。単鎖抗体の生成について記載される技術（米国特許第５，４７６，７８６号；同第５，１３２，４０５号；同第４，９４６，７７８号）は、抗ＲＦアミドペプチド特異的単鎖抗体を生成するのに適合され得る。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。

「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド架橋により連結された可変重鎖（Ｖ_Ｈ）および／または可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）を有する分子を含む。

本発明の範囲内の抗体フラグメントはまた、例えば、ペプシンによるＩｇＧの酵素的切断によって生成され得るＦ（ａｂ）_２フラグメントを含む。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンによるＦ（ａｂ）_２の還元により生成され得る。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によりＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１鎖に結合されたＶ_Ｌ−Ｃ_Ｌ鎖である。Ｆ（ａｂ）_２フラグメントは、２つのジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）_２分子のＦａｂ部分は、Ｆｃ領域の部分を含み、その間にジスルフィド架橋が位置する。

Ｆｖフラグメントは、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈ領域である。

それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。少なくとも５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、が存在し、これらのうちのいくつかはさらに、サブクラス（イソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類され得る。

本発明の抗ＲＦアミドペプチド抗体分子はまた、キメラ部分に連結され得る。その化学的部分は、とりわけ、ポリマー、放射性核種、または細胞障害性因子であり得る。好ましくは、化学的部分は、被験体の体内での抗体分子の半減期を増加させるポリマーである。適切なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストラン、およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第６，１３３，４２６号（本明細書に参考として援用される）に記載されている、ペグ化抗ＩＬ８抗体を生成するための方法は、本発明のＰＥＧ化ＲＦアミドペプチド抗体の生成に適用され得る。Ｌｅｅら，（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、ＰＥＧ結合単鎖抗体を開示する。Ｗｅｎら，（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））に結合されたＰＥＧと抗体を結合する方法を開示する。

本発明の抗体分子はまた、放射性同位元素標識（例えば、^９９ＴＣ、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^１３１Ｉ、^１１Ｃ、^１５Ｏ、^１３Ｎ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^２２６Ｒａ、^６０Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^５７Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ、^１０９Ｐｄ、^２３４Ｔｈ、および^４０Ｋ）および非放射性同位元素標識（例えば、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^５２Ｔｒ、^５６Ｆｅ）と結合され得る。

本発明の抗体はまた、蛍光標識または化学発光標識（フルオロフォア（例えば、希土類キレート）、フルオロセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリシン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシルウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、および安定なフリーラジカルが挙げられる）と結合され得る。

抗体分子はまた、例えば、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエンドトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アルビンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、キュルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ミトゲリン、レスチリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンのような細胞障害性因子と結合され得る。

本発明の抗体分子を種々の部分に結合するための当該分野で公知の任意の方法が用いられ得、これらとしては、Ｈｕｎｔｅｒら，（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら，（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら，（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７により記載される方法が挙げられる。

抗体を結合体化するための方法は従来法であり、当該分野で周知である。

（薬学的組成物）
本発明のＲＦアミドペプチドおよび抗体分子は、被験体に、好ましくは薬学的組成物中で、好ましくは治療目的で投与され得る。好ましくは、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。ＲＦアミドペプチドおよび抗体分子は、ＳＰ９１５５レセプターの活性を刺激またはブロックし、それによって、このレセプターにより引き起こされるかまたは媒介される任意の医学的状態を処置するために、治療的に（例えば、薬学的組成物中で）使用され得る。本発明のＲＦアミドペプチドの、ＳＰ９１５５レセプターへの結合をブロックすることにより、このペプチドが有するレセプターに対する効果がブロックされ得る。上記のように、ＳＰ９１５５レセプターは、代謝障害（例えば、肥満）および機構（例えば、疼痛および鎮痛）に関連する。

薬学的に受容可能なキャリアは従来的であり、当該分野で周知である。例としては、生理学的に適合する水性および非水性キャリア、安定化剤、抗酸化剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤、緩衝剤、血清タンパク質、等張剤、および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、キャリアは、被験体の体内への注射に適している。一般的には、このような薬物の非経口投与に有用な組成物が周知である：例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０）。

本発明の薬学的組成物中で用いられ得る適切な水性および非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびに注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用により、分散物の場合は、適切な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。

本発明の薬学的組成物は、第２の薬学的組成物または物質と組み合わせて投与され得る。好ましい実施形態において、第２の組成物は、抗肥満薬または鎮痛剤である。組み合わせ治療が使用される場合、両方の組成物は、同時送達のために単一の組成物に処方されるか、または２つ以上の組成物に別々に処方され得る（例えば、キット）。

抗肥満薬は、シブトラミン、フェンテルミン、またはオルリスタントを含み得る。

鎮痛剤は、アスピリン、アセトミノフェン、コデイン、モルヒネ、アポノルフィン、ノルモルヒネ、エトルフィン、ブプレノルフィン、ヒドロコドン、ラセモルファン、レボルファノール、ブトルファンド、メタドン、デメロール、イブプロフェン、またはオキシコドンが挙げられ得る。

本発明の薬学的組成物はまた、本明細書中に記載されるアッセイを用いて同定される他のタイプの物質（有機低分子および阻害性リガンドアナログ）を含み得る。

この処方物は、都合良くは、単一の投薬形態で存在し、そして薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。

治療適用に関係する投薬レジメンは、治療物質の作用を変更し得る種々の要因（例えば、患者の状態、体重、性別、および食事、任意の感染の重篤度、投与時間、ならびに他の臨床的要因）を考慮して、医師により決定され得る。

しばしば、処置投薬は、安全性および有効性を最適化するため、低レベルから上げられる。投薬量は、小さい分子サイズおよび投与後に半減期（クリアランス時間）が減少する可能性を考慮して調節され得る。

本発明の組成物の「有効量」は、ＳＰ９１５５レセプターまたはその機能的フラグメントにより引き起こされるかまたは媒介される医学的状態を特徴付ける周知のパラメータの１つ以上を改善する。

このような物質の治療的投与の代表的なプロトコルは、当該分野で周知である。本発明の薬学的組成物は、例えば、非経口経路（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、腫瘍注射、または吸入により）または非非経口経路（例えば、経口投与、肺投与、または局所投与）により投与され得る。

組成物は、当該分野で公知の医学的デバイスにより投与され得る。例えば、好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、皮下針による注射により投与され得る。

本発明の薬学的組成物はまた、無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイス）により投与され得る。

本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で医薬を分散するための移植可能な微小吸入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；正確な吸入速度で医薬を送達するための医薬吸入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変流の移植可能な吸入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；複数のチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号が挙げられる。

（アンチセンス分子）
本発明はまた、核酸の発現を防止するための、本発明のＲＦアミドペプチド（好ましくは、配列番号４〜１１または１３〜１８のいずれかにより定義されるアミノ酸配列またはその部分配列を有する）をコードする核酸（例えば、ゲノム核酸またはｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。

本発明はさらに、（ａ）その翻訳を防止するための、細胞膜を通って通過し、細胞中で本発明のＲＦアミドペプチドをコードするｍＲＮＡと特異的に結合する、ＳＰ９１５５レセプターの活性を調節するのに有効な量のオリゴヌクレオチド、および（ｂ）細胞膜を通って通過し得る薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。一つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する物質（例えば、リボザイム）に連結される。

（実施例）
以下の実施例は、本発明の例示のみを意図し、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するよう解釈されるべきではない。

（略語）
ＧｅｎＳｃａｎ：遺伝子予測アルゴリズム（Ｂｕｒｇｅら，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８（１）：７８−９４）。

ヒトウイルス転写データベース（ＶＴＳ）：ＧｅｎＳｃａｎを稼働させることで、公的なデータベースにおいて利用可能なヒトゲノムＤＮＡから遺伝子またはエキソンを予測した。ＶＴＳのＤＮＡ版およびタンパク質版の両方を作成した。

（実施例１：ヒトＲＦアミドペプチド前駆体タンパク質の同定）
ＲＦアミドペプチドは、周知の神経ペプチドファミリーのメンバーであり、カルボキシ末端「ＲＦＧ（^Ｋ／_Ｒ）」モチーフを有するプロペプチドから得られる。一般的に、「Ｇ（^Ｋ／_Ｒ）」は、プロテイナーゼ消化およびアミド化シグナルである。タンパク質消化およびアミド化は、プロペプチドがＲＦアミドカルボキシ末端を有する成熟ペプチドにプロセシングされる場合に起こる工程である。

ほとんどのＲＦアミドペプチド前駆体は、１つ以上のＲＦＧ（^Ｋ／_Ｒ）モチーフを有するので、ＶＴＳタンパク質データベースを、１つ以上のＲＦＧＲモチーフを有するペプチドについて検索した。本発明者らは、ＶＴＳ１６４４０７が、２つのＲＦＧ（^Ｋ／_Ｒ）モチーフを有するエキソンを含むことが見出されたことを同定した。さらなる分析により、このエキソンが始めに開始コドンを含み、そして最後に終止コドンを含むことが明らかになった。ＰＳＯＲＴ（タンパク質細胞内局在化予測のためのフリーソフトウェア；Ｎａｋａｉら，（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４（１）：３４−３６）を用いたエキソンの分析により、このエキソンが、リーダーペプチドを有し、膜貫通ドメインを有さないことが予測された。このことは、そのエキソンが分泌タンパク質をコードすることを示唆していた。このエキソンが、「ＲＦアミドペプチド前駆体」と称され得る。

一般的に、ＲＦアミドペプチド前駆体もまた、分泌され得るので、この遺伝子をコードするｃＤＮＡを単離した。ゲノムエキソンとｃＤＮＡクローンとの間に１つのヌクレオチド差があることを同定した。この差は、多型を表し得る。そのヌクレオチド配列、および対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３および４に示す。

（実施例２：ヒトＲＦアミドペプチド前駆体遺伝子のマウスホモログの同定）
ヒトＲＦアミドペプチド前駆体遺伝子のマウスホモログを、公的な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースをＢＬＡＳＴにより検索して同定した（クエリーとしてヒトＲＦアミドペプチド前駆体遺伝子を用いた）。この検索において、マウスＥＳＴ ＢＦ１６７７１４を、ヒトＲＦアミドペプチド前駆体に対して相同であると同定した。さらに、公的なマウスゲノムＤＮＡデータベースを、クエリーとしてヒトＲＦアミドペプチド前駆体遺伝子を用いて検索した。第２検索においても、マウスホモログを同定し、これは、配列アラインメントによって、第１検索において同定したマウスホモログと同一であることを決定した。全長ＲＦアミドペプチド前駆体遺伝子を、同定したクローンから推定した。

推定マウスＲＦアミドペプチド前駆体ＤＮＡ配列に基づき、マウスＲＦアミドペプチド前駆体のｃＤＮＡをクローニングした。そのヌクレオチド配列および対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２および１３において示す。

（実施例３：ヒトおよびマウスのＲＦアミドペプチド前駆体遺伝子の両方から得られた可能性のある機能的ペプチド）
本発明者らは、ＲＦＧ（^Ｋ／_Ｒ）がカルボキシ末端にあるとの仮定に基づき、以下の可能性のある機能的ＲＦアミドペプチドを推定した。

ヒトＲＦアミドペプチド前駆体から得たペプチドは、以下の通りである：
Ｈｕｍａｎ Ｐ５１：ＥＨＡＧＣＲＦＲＦ−アミド（配列番号５）
Ｈｕｍａｎ Ｐ２４２：ＧＬＱＴＳＧＲＥＨＡＧＣＲＦＲＦ−アミド（配列番号６）
Ｈｕｍａｎ Ｐ５５２：ＡＳＱＰＱＡＬＬＶＩＡＲＧＬＱＴＳＧＲＥＨＡＧＣＲＦＲＦ−アミド（配列番号７）
Ｈｕｍａｎ Ｐ５２：ＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号８）
Ｈｕｍａｎ Ｐ５１３：ＫＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号９）
Ｈｕｍａｎ Ｐ５１７：ＫＫＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号１０）
Ｈｕｍａｎ Ｐ５１８：ＴＳＧＰＬＧＮＬＡＥＥＬＮＧＹＳＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号１１）。

マウスＲＦアミドペプチド前駆体から得たペプチドは、以下の通りである：
マウスＰ５１：ＥＨＴＧＦＲＬ−アミド（配列番号１４）
マウスＰ５２：ＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号１５）
マウスＰ５１３：ＫＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号１６）
マウスＰ５１７：ＲＫＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号１７）
マウスＰ５１８：ＡＳＧＰＬＧＴＬＡＥＥＬＳＳＹＳＲＲＫＧＧＦＳＦＲＦ−アミド（配列番号１８）。

（実施例４：アッセイ）
（ａ．細胞内Ｃａ^２＋濃度の測定）
以下の実験において、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイを用いて、ヒトＰ５１８、Ｐ５１７、Ｐ５２、Ｐ５１３、およびＰ５１がヒトＳＰ９１５５レセプターに対するリガンドであることを決定した。以下に議論されるように、サンプルがこのレセプターに対するアゴニストであるかアンタゴニストであるかを決定することについて、このアッセイを適合させ得る。

ＨＥＫ２９３細胞（１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させた）を、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて、ＳＰ９１５５レセプターｃＤＮＡを含む発現ベクターまたはＳＰ９１５５レセプターｃＤＮＡを欠く発現ベクターでトランスフェクトした。次の日に、細胞を培養プレート上でトリプシン処理し、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋を欠くＰＢＳで洗浄した。次いで、この細胞を、１００μｌの培地あたり３５，０００細胞の密度で、９６ウェルプレート（ポリ−Ｄ−リジンでプレコーティングしておいた）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に播種した。トランスフェクションから３日後、細胞から培地を除去し、４μＭのＦｌｕｏ−３、ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、および２５０ｍＭ プロベネシドを含む１００μｌのハンクス平衡塩溶液を添加し、その後３７℃、５％ ＣＯ_２下で１時間インキュベートした。次いで、この細胞を、１５０μｌの洗浄緩衝液（ハンクスＢＳＳ、４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、および２５０ｍＭ プロベネシド含有）で三回洗浄した。最後の洗浄の後に、１００μｌの洗浄緩衝液を追加し、そして各々のペプチドを含む４０μｌの洗浄緩衝液を添加した後にＣａ^２＋フラックスを測定した。ＦＬＩＰＲ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を、Ｃａ^２＋フラックスの測定に使用した。

これらのアッセイにおいて得られたデータを、以下の表３に示す。

^１試験した各ペプチドはカルボキシ末端がアミド化されていた。
^２値は、平均±標準偏差で表す；ｎ＝５。

ＦＬＩＰＲアッセイはまた、アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてサンプルをスクリーニングするのにも使用され得る。これらのアッセイにおいて、試験細胞を、ペプチドリガンド（または任意の他のＳＰ９１５５レセプターリガンド）およびサンプルと同時に接触させ得る。ネガティブコントロール実験は、試験細胞をリガンドおよびブランク（例えば、水、またはアゴニストまたはアンタゴニストでないことが既知の任意の他の物質）を接触させることを含み得る。ポジティブコントロール実験は、試験細胞と、リガンドおよびＳＰ９１５５レセプター／リガンド結合をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることが既知の物質を接触させることを含み得る。

サンプルは、サンプルを含まないで実施された同一の実験の程度と比較して、リガンド／レセプター結合により引き起こされるＣａ^２＋移動の程度を減少させる（すなわち、ＦＩＬＰＲシグナルを減少させる）能力に対するアンタゴニストを含むことが同定され得る。逆に、サンプルは、サンプルを含まないで実施された同一の実験の程度と比較して、リガンド／レセプター結合により引き起こされるＣａ^２＋移動の程度を増加させる能力に対するアゴニスト（すなわち、ＦＩＬＰＲシグナルを増加させる）を含むことが同定され得る。
（ｂ．放射リガンド結合アッセイ）
この実施例において、放射リガンド結合アッセイを用いて、ヒトＰ５１８がヒトＳＰ９１５５についてのリガンドであることを決定する。以下で議論されるように、サンプルがこのレセプターに対するアゴニストであるかアンタゴニストであるかを決定することについて、このアッセイを適合させ得る。

培養細胞中で発現された場合に、^３Ｈ標識Ｐ５１８に結合するＳＰ９１５５レセプターの能力を試験するため、放射リガンド結合アッセイを実施する。ＳＰ９１５５のＯＲＦを、発現ベクターｐＣＲ３．１中にクローニングする（ｐＣＲ３．１−ＳＰ９１５５）。ＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＲ３．１−ＳＰ９１５５またはｐＣＲ３．１のみでトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、通常の成長培地ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭまたはＤＭＥＭ−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ／５％ ＦＣＳのいずれかで置き換える。細胞を１日以上増殖し、次いで、結合アッセイにおいて使用するため膜を調製する。非標識Ｐ５１８（１μＭ）を、非特異的結合を決定するため使用する。トランスフェクションから合計３日後、トランスフェクション細胞から膜を調製し、^３Ｈ−Ｐ５１８への特異的結合を観察する。

飽和結合について、２４μｇの膜を含有する１５０μｌの結合アッセイ緩衝液（３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％無脂肪酸ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、氷上で維持する）を、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ冷Ｐ５１８（１μＭ）を含有する結合アッセイ緩衝液５０μｌと混合する。^３Ｈ−Ｐ５１８／エタノールを漸増濃度でアッセイに添加する。室温で１時間、５０μｌの結合アッセイ緩衝液でプレソーキングしたマルチスクリーンＦＢフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して結合アッセイを濾過し、そしてフィルターを、１００μｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（氷冷）で二度洗浄する。５０μｌのシンチレーション液をフィルターに添加し、そして結合した放射リガンドを検出するため計数する。

放射リガンド競合アッセイについて、適切な膜を含有する１６０μｌの結合アッセイ緩衝液を、６％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）および異なる濃度の候補競合化合物を含有する結合アッセイ緩衝液２０μｌと混合する。６％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび１μｌの３Ｈ−Ｐ５１８／エタノール（ＮＥＮ、５０ｎＭ）を含有する最終２０μｌの結合アッセイ緩衝液を添加し、結合反応を開始する。放射リガンドの最終濃度は、０．２５ｎＭである。インキュベーション条件は、上記飽和アッセイについて使用したのと同じである。サンプルは、サンプルなしで同じ実験を行った場合と比較して、レセプターに対するリガンドの結合が減少する場合、アゴニストまたはアンタゴニストを含有すると同定され得る。

ネガティブコントロール実験は、リガンドおよびブランク（例えば、水またはアゴニストまたはアンタゴニストでないことが既知の任意の他の物質）と膜を接触させることを含み得る。ポジティブコントロール実験は、リガンドおよびＳＰ９１５５レセプター／リガンド結合をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることが既知の物質と試験細胞を接触させることを含み得る。

本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態により範囲が限定されるべきでない。実際、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の種々の変更が、前述の説明および添付図面から当業者に明らかである。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

特許、特許出願、刊行物、製品説明書、およびプロトコルが、本明細書を通して引用されており、それらの開示は、全ての目的のために、その全体が、参考として援用される。

Claims (13)

1. 配列番号４に示されるアミノ酸配列の１１以上の連続残基を含むポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体であって、該ポリペプチドは、該ペプチドのカルボキシ末端に、−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフを含み、該−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのＲＦＧ（ ^Ｋ ／ _Ｒ ）モチーフにおけるタンパク質分解切断から得られる、抗体。
2. 配列番号１３に示されるアミノ酸配列の１１以上の連続残基を含む単離されたポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体であって、該ポリペプチドは、該ペプチドのカルボキシ末端に、−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフを含み、該−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのＲＦＧ（ ^Ｋ ／ _Ｒ ）モチーフにおけるタンパク質分解切断から得られる、抗体。
3. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
4. モノクローナル抗体である、請求項２に記載の抗体。
5. 組み換え抗体である、請求項１に記載の抗体。
6. 組み換え抗体である、請求項２に記載の抗体。
7. ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
8. ヒト化抗体である、請求項２に記載の抗体。
9. 完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
10. 完全ヒト抗体である、請求項２に記載の抗体。
11. ヒト／マウスキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
12. ヒト／マウスキメラ抗体である、請求項２に記載の抗体。
13. 以下：
    （ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列の１１以上の連続残基を含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、該ペプチドのカルボキシ末端に、−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフを含み、該−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのＲＦＧ（^Ｋ／_Ｒ）モチーフにおけるタンパク質分解切断から得られる、ポリペプチド；および
    （ｂ）配列番号１５〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号５〜１１から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、該ペプチドのカルボキシ末端に−アルギニン−フェニルアラニン−アミドモチーフを含む、ポリペプチド
    からなる群より選択される単離されたポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。